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CN112105639A - 抗PHF-tau抗体及其用途 - Google Patents

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CN112105639A CN201980030595.6A CN201980030595A CN112105639A CN 112105639 A CN112105639 A CN 112105639A CN 201980030595 A CN201980030595 A CN 201980030595A CN 112105639 A CN112105639 A CN 112105639A
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Abstract

本发明描述了单克隆抗tau抗体及其抗原结合片段。还描述了编码抗体的核酸、包含抗体的组合物、产生抗体以及使用抗体治疗或预防病症诸如tau蛋白病变的方法。本发明的抗体还可用于定量生物样品中的tau。

Description

抗PHF-tau抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗PHF-tau抗体及其制备和使用方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是退行性脑障碍，其特征在于渐进性的记忆、认知、推理、判断和情感稳定性的丧失，该丧失逐渐导致极度精神衰退和最终的死亡。AD是老年人中进行性精神障碍(痴呆)的非常常见的病因，并且被认为是美国第四大最常见的医学死因。AD已在全世界的种族群体中观察到，并且代表目前和未来的主要公共健康问题。
患有AD的个体的脑表现出称作老年(或淀粉样蛋白)斑块、淀粉样蛋白血管病(淀粉样蛋白在血管中沉积)和神经原纤维缠结的特征性病变。一般在患有AD的患者中对于记忆和认知功能重要的人脑几个区域中发现大量的这些病变，特别是淀粉样斑块和成对螺旋细丝的神经原纤维缠结。
AD和若干种其他神经退化性疾病中的神经原纤维变性的主要蛋白质组分是高度磷酸化形式的微管相关蛋白tau。开发预防或清除tau聚集的治疗剂一直关注多年，但是候选药物(包括抗聚集化合物和激酶抑制剂)只是刚刚进入临床测试(Brunden等人，Nat RevDrug Discov 8:783-93,2009)。
近来，在转基因tau小鼠模型中已产生tau的主动和被动免疫接种可具有治疗潜能的临床前证据(Chai等人，J Biol Chem 286:34457-67,2011；Boutajangout等人，JNeurochem 118:658-67,2011；Boutajangout等人，J Neurosci 30:16559-66,2010；Asuni等人，J Neurosci 27:9115-29,2007)。tau蛋白病变(tauopathy)传播和蔓延假设近来已得到描述，并且基于人脑中的tau蛋白病变发展的Braak阶段和在临床前tau模型中的tau聚集体注射后的tau蛋白病变蔓延(Frost等人，J Biol Chem 284:12845-52,2009；Clavaguera等人，Nat Cell Biol 11:909-13,2009)。因此，需要预防tau聚集和tau蛋白病变发展以治疗AD及其他神经退化性疾病的治疗剂。
发明内容
在一个总的方面，本发明涉及分离的抗体，优选分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段结合PHF-tau，优选人PHF-tau。
在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段具有重链，该重链包含SEQ ID NO:1或7的HCDR1；SEQ ID NO:2、8、10、12、13或14的HCDR2；以及SEQ ID NO:3的HCDR3。在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体具有轻链，该轻链包含SEQ ID NO:4、9或11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3。在其他实施方案中，本发明的单克隆抗体包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中的任一者的CDR具有至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的CDR。
在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:15、17、19、21、23和24中的任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:16、18、20、22和25中的任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段还包含恒定区，诸如人或小鼠重链IgG恒定区，以及人或小鼠抗体轻链κ或λ恒定区。
在另一个总的方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。
在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的宿主细胞。
在另一个总的方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和本发明的分离的抗体或其抗原结合片段。
在另一个总的方面，本发明涉及减少对其有需要的受治疗者中病理性tau聚集或tau蛋白病变蔓延的方法，包括向受治疗者施用本发明的药物组合物。tau蛋白病变包括但不限于选自以下的一者或多者：阿尔茨海默病(包括家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)、17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合症、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病和拳击员痴呆症(拳击疾病)。
优选地，tau蛋白病变是阿尔茨海默病(包括家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)、FTDP-17或进行性核上性麻痹。
最优选地，tau蛋白病变是阿尔茨海默病(包括家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)。
在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从细胞或细胞培养物回收抗体或其抗原结合片段。
在另一个总的方面，本发明涉及产生包含本发明的抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。
在另一个总的方面，本发明涉及检测受治疗者中PHF-tau的存在的方法或诊断受治疗者中tau蛋白病变的方法，其通过使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测受治疗者中PHF-tau的存在。
根据以下公开内容，包括本发明的详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，本发明的其他方面、特征和优点将显而易见。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。
图1A-图1C示出了通过表面等离振子共振(SPR)分析的重组表达的PT82 mAb或其Fab片段与PHF-tau和可溶性tau的结合，其中抗体或Fab的浓度在相应的传感图旁边指示(75nM；15nM；3nM；0.6nM)。示出了(A)mAb与PHF，(B)Fab与PHF以及(C)Fab与2N4R Tau的结合。
图2示出了来自杂交瘤上清液的PT82和重组表达的PT82与重组2N4R Tau的结合，该结合通过ELISA使用两种包被浓度的2N4R Tau以10ng/mL或1ng/mL进行分析。
图3A-图3B示出了PT82 mAb在FRET测定中阻断tau聚集体形成的能力。(A)示出了所使用的细胞模型中的FRET测定的图。(B)示出了与阴性对照mAb(CNTO1037/C18A抗体)相比，PT82在FRET测定中的功效。
图4A-图4C示出了PT82 mAb在免疫耗竭测定中阻断tau聚集体形成的能力。(A)示出了所使用的免疫耗竭测定的图，其中PT82 mAb用于免疫耗竭来自人AD脑或P301S小鼠脊髓提取物的匀浆。PT82 mAb可减少AD脑和P301S脊髓提取物两者中的tau种子，如通过(B)FRET测定和(C)Tau聚集选择性MSD测定所测定的。
图5A-图5B示出了当分析(A)总匀浆或(B)不溶性级分时，在体内ePHF注射模型中与AT180和PT3抗体相比PT82的功效。
图6A-图6D示出了与(B)抗体和PHF颅内共注射相比，在(A)抗体的外周给药(IP注射)时PT82和PT3的功效。在(C)总匀浆和(D)不溶性级分中分析功效。
图7示出了使用PT82的线性肽作图的表位作图数据。
图8示出了通过ELISA测量的与可溶性tau结合的人源化PT82 mAb。
具体实施方式
如本文所用，术语“抗体”广义地意指并且包括免疫球蛋白或抗体分子(包括多克隆抗体)、单克隆抗体(包括鼠科动物、人、人适应的、人源化和嵌合单克隆抗体和抗体片段)。
一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
术语“抗体片段”意指完整抗体的一部分。抗体片段的示例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、CDR、抗原结合位点、重链或轻链可变区、双抗体、单链抗体分子和由至少两种完整抗体或其片段形成的多特异性抗体。
免疫球蛋白轻或重链可变区由被“抗原结合位点”间断的“框架”区组成。抗原结合位点使用如下各种术语定义：(i)互补决定区(CDR)基于序列可变性(Wu和Kabat，J Exp Med132:211-50,1970)。一般来讲，抗原结合位点在每个可变区具有三个CDR(重链可变区(VH)中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链可变区(VL)中的LCDR1、LCDR2和LCDR3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的区域，这些区域是结构高变的，如由Chothia和Lesk(Chothia和Lesk，J Mol Biol196:901-17,1987)所定义的。一般地，抗原结合位点具有在每个VH(H1、H2、H3)和VL(L1、L2、L3)中的三个高变区。Chothia和Lesk将结构上保守的HV称为“规范结构”。CDR和HV的编号系统以及注释近来已由Abhinandan和Martin(Abhinandan和Martin，Mol Immunol 45:3832-9,2008)修订。(iii)形成抗原结合位点的区域的另一定义已通过Lefranc(Lefranc等人，Dev Comp Immunol 27:55-77,2003)基于免疫球蛋白和T细胞受体的V结构域的比较提出。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库提供了这些区的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT划分之间的对应性在Lefranc等人，出处同上中描述。(iv)抗原结合位点还可基于特异性决定残基使用(SDRU)(Almagro，J Mol Recognit 17:132-43,2004)进行划分，其中特异性决定残基(SDR)是指直接涉及抗原接触的免疫球蛋白的氨基酸残基。
“框架”或“框架序列”是在抗体的可变区之内除限定为抗原结合位点序列的那些之外的剩余序列。因为抗原结合位点的确切定义可通过如上所述的多种划分来确定，所以确切的构架序列取决于抗原结合位点的定义。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)意指从基本上均质抗体的群体获得的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异性的，通常针对单一抗原决定簇。
如本文所用，术语“表位”意指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸、磷酸化氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位在性质上可以是线性的或可以是不连续表位，例如构象表位，其通过抗原的非邻接氨基酸之间的空间关系而不是氨基酸的线性系列形成。构象表位包括由抗原折叠得到的表位，其中来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸在三维空间中紧密靠近。
tau是具有多种众所周知的同种型的丰富的中枢神经系统和外周神经系统蛋白质。在人CNS中，由于可变剪接，存在大小在352至441范围内的六种主要tau同种型(Hanger等人，Trends Mol Med 15:112-9,2009)。这些同种型通过0-2个N末端插入片段的调节内含物和3或4个串联排列的微管结合重复序列而彼此不同，并且被称为0N3R(SEQ ID NO:26)、1N3R(SEQ ID NO:27)、2N3R(SEQ ID NO:28)、0N4R(SEQ ID NO:29)、1N4R(SEQ ID NO:30)和2N4R(SEQ ID NO:31)。如本文可互换地使用，术语“对照tau”和“可溶性tau”是指SEQ IDNO:31的tau同种型，其缺乏磷酸化及其他翻译后修饰。
tau结合微管且调节货物通过细胞的转运，该转运是可通过tau磷酸化调节的过程。在AD和相关障碍中，tau的异常磷酸化是普遍的，并且被认为领先于和/或触发tau聚集成称为成对螺旋细丝(PHF)的原纤维。PHF的主要组分是高度磷酸化的tau。如本文所用，术语“成对螺旋细丝-tau”或“PHF-tau”是指成对螺旋细丝中的众所周知的tau聚集体。PHF结构中的两个主要区在电子显微镜中较为明显，即绒毛状外壳和芯细丝；绒毛状外壳对蛋白水解作用敏感并且位于细丝外部，并且细丝的耐蛋白酶芯形成PHF的主链(Wischik等人，Proc Natl Acad Sci USA 85:4884-8,1988)。
如本文所用，“结合PHF-tau的抗体”是指如在蛋白质印迹上评估的结合PHF-tau的抗体。通常，抗体与PHF-tau的结合可在5％(w/v)脱脂乳粉(NFDM)TBS-T，0.05％Tween-20中的1小时封闭后，在约500ng PHF-tau的考马斯染色后进行评估。当在其中对照tau和PHF-tau两者通过tau抗体相等检测的抗原负载条件下进行测试时，如通过蛋白质印迹测量的，结合PHF-tau的抗体任选地不结合对照tau(SEQ ID NO:31)，该tau抗体对PHF-tau表位无优先(例如，抗体HT7(ThermoScientific,Rockford,IL)(Mercken等人，J Neurochem 58:548-53,1992)。此类示例性抗原负载条件是500ng PHF-tau和200ng对照tau。
本文使用常规的众所周知的单字母和三字母氨基酸代码。
物质的组成
本发明涉及抗PHF-tau抗体和此类抗体的用途。此类抗PHF-tau抗体可具有结合PHF-tau上的磷酸化表位或结合至PHF-tau上的非磷酸化表位的特性。抗PHF-tau抗体可用作治疗剂，以及用作研究或诊断试剂，以检测生物样品例如组织或细胞中的PHF-tau。
在优选的实施方案中，本发明的抗体具有表1中所示的序列。PT82为小鼠单克隆抗体，并且PT1B778、PT1B779、PT1B780、PT1B781和PT1B782为PT82的人源化型式。CDR在可变区序列中带下划线。人源化单克隆抗体的CDR中的粗体氨基酸指示相比于PT82 CDR序列的替换。
表1
Figure BDA0002762961890000071
Figure BDA0002762961890000081
Figure BDA0002762961890000091
在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段具有重链，该重链包含SEQ ID NO:1或7的HCDR1；SEQ ID NO:2、8、10、12、13或14的HCDR2；以及SEQ ID NO:3的HCDR3。在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体具有轻链，该轻链包含SEQ ID NO:4、9或11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3。
在优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:1的HCDR1；SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ IDNO:4的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:8的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ IDNO:9的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ IDNO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:12的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ IDNO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:13的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ IDNO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；或者
SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:14的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ IDNO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3。
在其他实施方案中，本发明的结合PHF-tau的单克隆抗体包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中的任一者的CDR具有至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的一个或多个CDR。
在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:15、17、19、21、23和24中的任一者的重链可变区以及具有SEQ ID NO:16、18、20、22和25中的任一者的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:15的重链可变区和包含SEQ ID NO:16的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:17的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:19的重链可变区和包含SEQ ID NO:20的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:21的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:23的重链可变区和包含SEQ ID NO:20的轻链可变区；或者
包含SEQ ID NO:24的重链可变区和包含SEQ ID NO:25的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明的结合PHF-tau的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:15、17、19、21、23和24中的任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:16、18、20、22和25中的任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，CDR区如表1所述，使得氨基酸变化在可变区的非CDR区中。
在另一个实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段与包含人tau蛋白的119-126的表位结合，其中氨基酸的编号参考SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列。
尽管实施例中所示的实施方案包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单个可变区可用于筛选能够形成能够例如与PHF-tau结合的二结构域特异性抗原结合片段的可变结构域。可以通过噬菌体展示筛选方法，使用例如PCT公布WO92/01047中所公开的分级双重组合方法来完成筛选。在该方法中，使用含有H或L链克隆的单个菌落来感染编码另一条链(L或H)的克隆的完整文库，并且根据所述噬菌体展示技术选择所得的双链特异性抗原结合结构域。
本发明的另一个实施方案是结合PHF-tau的分离的抗体，该分离的抗体包含抗原结合位点，该抗原结合位点具有SEQ ID NO:15、17、19、21、23和24中的任一者的重链可变区(VH)和/或包含SEQ ID NO:16、18、20、22和25中的任一者的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包含具有IGHV6-3*01的IMGT种系标识符的VH(Barbie和Lefranc，1998,Exp.Clin.Immunogenet,15:171-183)，以及具有IGKV6-13*01的IMGT种系标识符的VL。
在前述实施方案中的任一个实施方案中，结合PHF-tau的分离的抗体可为人源化的。
本发明的抗体可通过多种技术产生，例如杂交瘤方法(Kohler和Milstein，Nature256:495-7,1975)。可通过美国专利4,816,567中所公开的方法制备嵌合mAb，其含有源自供体抗体(通常为鼠科动物)的轻链和重链可变区和与之相结合的源自受体抗体(通常为另一种哺乳类物种，诸如人)的轻链和重链恒定区。可以通过本领域技术人员已知的技术(诸如美国专利5,225,539中公开的技术)来制备具有源自非人供体免疫球蛋白(通常为鼠科动物)的CDR以及源自一种或多种人免疫球蛋白的分子的其余免疫球蛋白衍生的部分的CDR移植的mAb。缺乏任何非人序列的完全人mAb可通过以下文献中提及的技术从人免疫球蛋白转基因小鼠制备(Lonberg等人，Nature 368:856-9,1994；Fishwild等人，Nat Biotechnol14:845-51,1996；Mendez等人，Nat Genet 15:146-56,1997)。还可从噬菌体展示文库制备和优化人mAb(Knappik等人，J Mol Biol 296:57-86,2000；Krebs等人，J Immunol Methods254:67-84,2001；Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010)。
抗体人源化可使用众所周知的方法来完成，该方法诸如特异性决定残基表面重建(SDRR)(美国公布2010/0261620)、表面重建(Padlan等人，Mol.Immunol.28:489-98,1991)、超人源化(国际专利公布WO04/006955)和人字符串内容优化(美国专利7,657,380)。可用于移植/人源化的人框架序列可由本领域的技术人员从有关数据库中选择。还可通过诸如Queen等人(Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-33,1989)或美国公布2011/0092372中所公开的那些的技术，将所选择的框架修饰成保留或增强结合亲和力。
可以使用任何合适的技术来完成待用作免疫抗原或从噬菌体展示文库分离抗体的PHF-tau的制备。在示例性方法中，使用众所周知的方案从患有AD的患者的脑中分离PHF-tau，诸如Greenberg和Davies(Greenberg和Davies，Proc Natl Acad Sci USA 87:5827-31,1990)中所述。PHF-tau可与阿尔茨海默病患者的解剖皮质分离。用已知与PHF-tau反应的抗体表征分离的PHF-tau的纯度和高度磷酸化状态。在典型的PHF-tau制备中，在蛋白质印迹(Spillantini和Goedert，Trends Neurosci 21:428-33,1998)中以约60kDa、64kDa、68kDa和72kDa迁移的高度磷酸化带通过AT8抗体检测，该AT8抗体特异性结合高度磷酸化的PHF-tau，但不结合去磷酸化的PHF-tau。
本发明的抗体可具有不结合SEQ ID NO:31的对照tau的特性。此类抗体可以使用上述方法生成，并在蛋白质印迹中测试抗体缺乏与对照tau的结合，然后如上所述进行考马斯染色。对照tau可使用标准方法重组表达和纯化。
还可例如使用对对照和AD脑切片的免疫组织化学来评价本发明的抗体或其抗原结合片段的特异性。
本发明的抗体可以以小于或等于约10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的解离常数(KD)对PHF-tau具有亲和力。给定分子对PHF-tau的亲和力可使用任何合适的方法通过实验确定。此类方法可利用本领域技术人员已知的Biacore、ProteOn或KinExA仪器、ELISA或竞争性结合测定。
本发明的另一个方面是与单克隆抗体竞争PHF-tau结合的分离的抗体或抗原结合片段，该单克隆抗体包含抗原结合位点，该抗原结合位点具有SEQ ID NO:15、17、19、21、23和24中的任一者的重链可变区和包含SEQ ID NO:16、18、20、22和25中的任一者的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的另一个方面是与单克隆抗体竞争PHF-tau结合的分离的抗体或抗原结合片段，该分离的抗体或抗原结合片段包含抗原结合位点，该抗原结合位点具有SEQ ID NO:15的重链可变区和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区；SEQ ID NO:17的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区；SEQ ID NO:19的重链可变区和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区；SEQ ID NO:21的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区；SEQ ID NO:23的重链可变区和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区；或者SEQ ID NO:24的重链可变区和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区。
可使用众所周知的方法在体外测定与PHF-tau结合之间的竞争。例如，MSD Sulfo-TagTMNHS-酯标记的抗体与PHF-tau在未标记抗体的存在下的结合可使用免疫测定法，随后通过电化学发光检测来评估。
可以采用除了竞争性结合之外的若干众所周知的方法来确定本发明的抗体的结合表位。例如，当两种个体组分的结构已知时，可以进行硅片蛋白-蛋白对接以鉴定相容的相互作用位点。可以用抗原和抗体复合物进行氢-氘(H/D)交换，以对抗原上可被抗体结合的区域进行作图。抗原的区段诱变和点诱变可以用来定位对抗体结合重要的氨基酸。使用抗体-抗原复合物的共晶体结构来识别对表位和互补位有贡献的残基。
本发明的抗体可以是IgG、IgD、IgA或IgM同种型的单克隆抗体。本发明的抗体可为双特异性或多特异性的。示例性双特异性抗体可结合PHF-tau上的两个不同表位或者可结合PHF-tau和β淀粉样蛋白(Aβ)。另一个示例性双特异性抗体可结合PHF-tau和内源性血脑屏障胞转作用受体，诸如胰岛素受体、转铁蛋白受体、胰岛素样生长因子-1受体和脂蛋白受体。示例性抗体具有IgG1类型。
本发明的抗体的免疫效应子特性可通过本领域的技术人员已知的技术通过Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。例如，Fc区可含有具有消除效应子功能的取代的人IgG4 Fc区。因此，分离抗体还包含具有修饰人IgG4Fc区的Fc区，这种Fc区含有以下取代中的一个或多个：在残基233处用脯氨酸取代谷氨酸、在残基234处用丙氨酸或缬氨酸取代苯丙氨酸以及在残基235处用丙氨酸或谷氨酸取代亮氨酸(EU编号，Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.of Health and Human Services,Bethesda,Md.,NIH出版号91-3242)。通过在残基297(EU编号)处用Ala取代Asn来去除IgG4 Fc区中的N-键合糖基化位点是确保消除残余效应子活性的另一种方式。药代动力学特性还可通过使Fc结构域中延长抗体半衰期的残基突变得到增强(Strohl，Curr Opin Biotechnol 20:685-91,2009)。
另外，本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂化)的过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可以与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学性质。缀合可通过本领域的技术人员已知的技术来进行。已经证实治疗性抗体与PEG的共轭增强药效学而不干扰功能(Knight等人，Platelets 15:409-18,2004；Leong等人，Cytokine 16:106-19,2001；Yang等人，Protein Eng 16:761-70,2003)。
本发明的另一个实施方案是编码本发明的抗体或其补体或其片段的分离的多核苷酸。示例性分离的多核苷酸为编码多肽的多核苷酸，该多肽包含免疫球蛋白重链，该免疫球蛋白重链包含SEQ ID NO:1或7的HCDR1；SEQ ID NO:2、8、10、12、13或14的HCDR2；以及SEQID NO:3的HCDR3，并且具有轻链，该轻链包含SEQ ID NO:4、9或11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3。附加的示例性分离的多核苷酸为编码多肽的多核苷酸，该多肽包含SEQ ID NO:15、17、19、21、23和24中的任一者的重链可变区和包含SEQ ID NO:16、18、20、22和25中的任一者的氨基酸序列的轻链可变区。
鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性而编码本发明的抗体的其他多核苷酸也在本发明的范围之内。本发明的分离的核酸可使用众所周知的重组技术或合成技术进行制备。使用本领域已知的方法，容易分离且测序编码单克隆抗体的DNA。在杂交瘤生成的情况下，此类细胞可用作此类DNA的来源。作为另外一种选择，使用其中编码序列和翻译产物连接在一起的展示技术，诸如噬菌体或核糖体展示文库，简化了对结合剂和核酸的选择。在噬菌体选择后，可将来自噬菌体的抗体编码区分离并用于产生全抗体，包括人抗体或任何其他期望的抗原结合片段，并在任何期望的宿主中表达，该宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。
本发明的另一个实施方案是包含本发明的至少一种多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、基于转座子的载体或任何其他适用于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。
本发明的另一个实施方案是包含本发明的多核苷酸中的任一种的宿主细胞。此类宿主细胞可为真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性真核细胞可为哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCCCRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTCCRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括源自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系，诸如CHO-K1SV(Lonza Biologics)、CHO-K1(ATCC CRL-61，Invitrogen)或DG44。
本发明的另一个实施方案是制备结合PHF-tau的抗体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞并回收由宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。
治疗方法
本发明的抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段(包括Fab、(Fab’)2、scFv片段或包含本发明的抗体的抗原结合位点的抗体)可用于治疗、减少或预防患有神经退化性疾病的患者的症状，该神经退化性疾病涉及tau在脑内的病理聚集。
待由本发明的方法治疗的疾病(tau蛋白病变)包括但不限于选自以下的一者或多者：阿尔茨海默病(包括家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)、17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合症、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病和拳击员痴呆症(拳击疾病)。
优选地，疾病(tau蛋白病变)是阿尔茨海默病(包括家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)、FTDP-17或进行性核上性麻痹。
最优选地，疾病(tau蛋白病变)是阿尔茨海默病(包括家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过减少病理性tau聚集(例如，通过防止聚集和/或通过减少已经发生的聚集)并因此减少脑中PHF-tau的量来发挥其有益效果。本发明的抗体或其抗原结合片段可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的示例包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于制备用于治疗AD的药剂，其中药剂被制备成以本文定义的剂量施用。
本发明的另一个实施方案是减少对其有需要的患者的tau聚集的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体或其抗原结合片段，持续足以减少tau聚集的时间。
本发明的另一个实施方案是治疗或减轻涉及患者的tau聚集的神经退化性疾病的症状的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体或其抗原结合片段，持续足以治疗或减轻神经退化性疾病的症状的时间。
在上述实施方案中的任一个实施方案中，涉及tau聚集的神经退化性疾病是tau蛋白病变。
如本文使用，“tau蛋白病变”涵盖涉及脑之内的tau病理性聚集的任何神经退化性疾病。除家族性和散发性AD之外，其他示例性tau蛋白病变是17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合症、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、脑炎后帕金森综合征和慢性创伤性脑病诸如拳击员痴呆症(拳击疾病)。(Morris等人，Neuron 70:410-26,2011)。
tau蛋白病变相关的行为表型包括认知损害、早期人格改变和失控、冷漠、意志缺乏、缄默症、失用症、持续言语、刻板的动作/行为、口部过度活动(hyperorality)、混乱、无法计划或组织顺序任务、自私/无情、反社会特性、缺乏同理心、踌躇、无语法的讲话伴频繁语义错误但相对保存完好的理解、受损的理解和选词障碍、缓慢渐进的步态不稳、后冲、僵直、经常跌倒、非左旋多巴响应的轴向僵化、核上性凝视麻痹、方波跳动、缓慢垂直扫视、假性延髓麻痹、肢体失用症、肌张力障碍、皮质感觉丧失和震颤。
顺应治疗的患者包括处于AD或其他tau蛋白病变危险中的无症状个体，以及目前示出症状的患者。顺应治疗的患者包括具有已知AD遗传危险诸如AD家族史或基因组中存在遗传危险因素的个体。示例性危险因素是淀粉样前体蛋白(APP)中的突变，尤其是在第717位以及第670和671位处的突变(分别为哈迪和瑞典型突变)。其他危险因素是在早老蛋白基因、PS1和PS2以及ApoE4中的突变、高胆固醇血症或动脉粥样硬化的家族史。目前患有AD的个体可通过上述危险因素的存在的特征性痴呆进行识别。此外，多个诊断测试可用于鉴定患有AD的个体。这些包括测量脑脊髓液tau和Aβ42水平。升高的tau和减小的Aβ42水平预示AD的存在。患有AD的个体也可通过AD和相关障碍协会(Related Disorders Association)标准来诊断。
施用/药物组合物
本发明的抗PHF-tau抗体或其抗原结合片段适合作为用于治疗或预防神经退化性疾病的治疗剂和预防剂两者，该神经退化性疾病涉及tau的病理性聚集，诸如AD或其他tau蛋白病变。在无症状患者中，治疗可在任何年龄(例如在约10、15、20、25、30岁)时开始。然而，通常，直到患者达到约40、50、60或70岁时才需要开始治疗。治疗通常需要经过一段时间的多个剂量。治疗可通过随着时间过去测定针对治疗剂的抗体、或活化T细胞或B细胞响应进行监控。如果响应下降，则指示加强剂量。
在预防应用中，将药物组合物或药剂施用于对AD或其他tau蛋白病变敏感或者另外处于AD或其他tau蛋白病变危险中的患者，其量足以消除或减少危险，减轻严重性，或延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病的发展期间存在的中间病理学表型。在治疗应用中，将组合物或药剂施用于怀疑患有或已患有此类疾病的患者，其量足以减少、阻止或延迟疾病的症状中的任一种(生物化学、组织学和/或行为)。治疗剂的施用可减少或消除患者的轻度认知损害，该患者仍未发展障碍的特征性病理学。足以实现治疗性或预防性治疗的量定义为治疗或预防有效剂量。在预防方案和治疗方案两者中，组合物或药剂通常以若干剂量施用，直到实现足够的免疫响应。
本发明的抗PHF-tau抗体或其片段可与有效治疗相关神经退化性疾病的其他试剂联合施用。
在本发明的方法中，治疗或改善tau蛋白病变症状的抗体的“治疗有效量”可通过标准研究技术确定。例如，抗体的剂量可通过将试剂施用于本领域众所周知的相关动物模型来确定。
此外，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员基于对多种因素的考量(例如，经由临床试验)来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员已知的其他因素。在制剂中待使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。
本发明的抗体的治疗用途的施用模式可以是将该试剂递送至宿主的任何合适途径。这些抗体的药物组合物可用于肠胃外施用，例如真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内，或者它们可施用到脑或脊柱的脑脊髓液中。
本发明的抗体或其抗原结合片段可被制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗体或片段作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指与抗体一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药物媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如，过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体的浓度可广泛改变，即从按重量计小于约0.5％，通常为或至少约1％到多达15％或20％，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。
治疗可在单剂量时间表或作为多剂量时间表给予，在该多剂量时间表中，初步治疗过程可使用1-10个分离的剂量，随后为维持和/或增强响应所需的在后续时间间隔给予的其他剂量，例如对于第二剂量在1-4个月时，并且如果需要，在几个月之后的一个或多个后续剂量。合适的疗程的示例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起预期会减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的期望响应的疗程。
因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可制备成含有1ml无菌缓冲水，以及约1ng至约100mg、约50ng至约30mg或约5mg至约25mg的本发明的抗体。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可被制成含有约250ml无菌林格氏溶液和约1mg至约30mg或约5mg至约25mg的本发明的抗体。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法是众所周知的，并且在例如“Remington's Pharmaceutical Science”，第15版，Mack Publishing Company,Easton,PA中更详细地描述。
可将本发明的抗体及其片段低压冻干用于储存，并在使用之前在合适的载体中复原。该技术已示出对抗体及其他蛋白质制剂有效，并且可采用本领域已知的冻干和重构技术。
诊断方法和试剂盒
本发明的抗体可用于诊断受治疗者中的AD或其他tau蛋白病变的方法中。该方法涉及使用诊断试剂诸如本发明的抗体或其片段检测受治疗者中PHF-tau的存在。
通过使生物样品与诊断抗体试剂接触，并且检测诊断抗体试剂与来自受治疗者的样品中的PHF-tau的结合，可在来自受治疗者的生物样品(例如，血液、尿液、脑脊髓液)中检测PHF-tau。用于进行检测的测定包括众所周知的方法，诸如ELISA、免疫组织化学、蛋白质印迹或体内成像。
诊断抗体或类似试剂可通过静脉内注射到患者体内，或通过任何合适途径直接注射到脑中进行施用，所述任何合适途径将该试剂递送至宿主，如以上所例示。抗体的剂量应在与治疗方法相同的范围之内。通常，抗体被标记，尽管在一些方法中，对PHF-tau具有亲和力的一抗是未标记的，并且第二标记试剂用于结合至一抗。标记的选择取决于检测方法。例如，荧光标记适用于光学检测。顺磁性标记的使用适用于无需手术干预的断层摄影检测。放射性标记也可使用PET或SPECT进行检测。
诊断通过比较来自受治疗者的样品或受治疗者中的标记PHF-tau、tau聚集体和/或神经原纤维缠结的数目、大小和/或强度与对应基线值来执行。基线值可代表未患病个体群体中的平均水平。基线值还可代表在相同受治疗者中确定的先前水平。
通过在治疗之前、期间或之后检测受治疗者中PHF-tau的存在，上文描述的诊断方法也可用于监控受治疗者对治疗的响应。相对于基线值的降低发出针对治疗的正响应的信号。随着病理性tau从脑中清除，值还可在生物学流体中瞬时增加。
本发明还涉及用于执行上述诊断和监控方法的试剂盒。通常，此类试剂盒含有诊断试剂诸如本发明的抗体和任选的可检测标记。诊断抗体自身可含有可检测标记(例如荧光分子、生物素等)，其可直接检测或可经由次级反应(例如与链霉抗生物素蛋白反应)检测。作为另外一种选择，可使用含有可检测标记的第二试剂，其中该第二试剂对一抗具有结合特异性。在适用于测量生物样品中的PHF-tau的诊断试剂盒中，该试剂盒的抗体可与固相诸如与微量滴定皿的孔预结合提供。
本专利申请中所有引用的参考文献的内容(包括参考文献、公布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)在此明确地以引用方式并入。
实施例1
成对螺旋细丝-tau(PHF-tau)的纯化
通过Greenberg和Davies(Greenberg和Davies，Proc Natl Acad Sci USA87:5827-31,1990)的改良方法部分纯化PHF-tau。简而言之，对从组织学确认的阿尔茨海默病患者获得的来自皮质的解剖组织进行部分纯化。通常，使用玻璃/Teflon Potter组织均化器(IKA Works,Inc；Staufen,Germany)以1000rpm在10体积冷缓冲剂Buffer H(10mM Tris、800mM NaCl、1mM EGTA和10％蔗糖/pH7.4)中将5mg额叶皮质均化。将均化的材料在Sorvall转子SS34中以27000g离心20min。弃去沉淀物，并且将上清液调节至1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸和1％(v/v)2-巯基乙醇的最终浓度，并在37℃下温育2h。随后将上清液以108000g在20℃下在Beckman 60Ti转子中离心35min。将沉淀物小心地在PBS中洗涤并悬浮于PBS中。如所述将上清液第二次离心，并将最终的沉淀物溶解，等分并在-80℃下冷冻。在具有抗tau抗体AT8和HT7(ThermoScientific,Rockford,IL)的12％SDS-PAGE和蛋白质印迹上评价PHF-tau制剂的质量。良好质量的PHF-tau制剂由4个带构成，该带在蛋白质印迹上具有约60kDa、64kDa、66kDa和72kDa的分子量，该蛋白质印迹用与高度磷酸化的PHF-tau反应的抗体诸如AT8检测。由相同的脑样品制备具有可比质量和纯度的两种单独的PHF-tau制剂。制剂1用于免疫。
实施例2
抗PHF-tau的单克隆抗体的产生
使用标准杂交瘤技术在正常Balb/c小鼠中产生抗PHF-tau抗体(Kohler和Milstein，Nature 256:495-7,1975)。将所获得的杂交瘤播种在96孔板中，并且在10天后在25ng/孔包被的PHF-tau上在直接ELISA中进行筛选，如下所述。在包被有在大肠杆菌(E.Coli)BL21细胞中表达的对照tau(SEQ ID NO:31)并通过热处理和硫酸铵沉淀纯化的10ng/孔上测试阳性细胞的交叉反应性。发现PT82与PHF tau和对照tau(SEQ ID NO:31)两者结合。
立即亚克隆阳性细胞，并将阳性克隆在液氮中冷冻。所有杂交瘤在Dulbecco改良的Eagle培养基中生长，该培养基补充有10％胎牛血清(Hyclone,Europe)、杂交瘤融合克隆补充剂(2％)(Roche,Brussels,Belgium)、2％HT(Sigma,USA)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺和青霉素(100U/ml)以及链霉素(50mg/ml)。
将抗体可变区从所选杂交瘤细胞克隆到小鼠IgG1/IgG2/κ背景上，并且使用常规方法表达和纯化。简而言之，将PT/82杂交瘤细胞在RLT缓冲剂(Qiagen目录号79216)中裂解并在-70℃下冷冻。将裂解物在37℃下解冻，并且使用RNeasy96试剂盒(Qiagen目录号74182)分离RNA。
RNA的等分试样用于使用基因特异性反向引物混合物来合成cDNA，该反向引物混合物使用被设计为重组成小鼠IgG重链、小鼠κ轻链和小鼠λ轻链的恒定区的引物。cDNA的等分试样与被设计为扩增IgG重链可变区、κ轻链可变区或λ轻链可变区的小鼠引物集一起用于PCR反应中。正向引物由被设计为重组成框架1的多种引物组成，并且反向引物被设计为重组成恒定区。PCR产物的等分试样在2％琼脂糖凝胶上运行，并且重链和κPCR产物示出正确大小的可见带。
使用被设计为重组成相应恒定区的重链或κ轻链反向引物对重链和κ轻链PCR产物进行测序(桑格法)。分析并比对序列以识别最匹配的小鼠种系。使用匹配种系序列替换重链和κ链框架1序列的前十个氨基酸。IgG重链和κ可变区氨基酸序列被密码子优化和合成。合成密码子优化的IgG重链和κ轻链可变区，并将片段克隆到小鼠IgG2a同种型重链和κ轻链同种型表达载体中。
从所选杂交瘤细胞克隆抗体可变区，使用标准方法测序，并且亚克隆到mAb和Fab的表达载体中。Mab在小鼠IgG2a/κ背景上产生并通过亲和色谱法(蛋白质A)表达和纯化。Fab作为嵌合型式产生，其中小鼠可变结构域融合至人IgG1/κ恒定结构域并且在重链的C末端处有His标签。Fab在HEK293F细胞中瞬时表达并通过亲和色谱法(HisTrap)纯化。
实施例3
表面等离振子共振(SPR)的结合评估
PT82及其具有PHF和可溶性(2N4R)tau的Fab片段与PHF-tau和重组tau的相互作用通过SPR在ProteOn XPR36(Bio-Rad,Hercules,CA)或Biacore T200(Biacore,Uppsala,Sweden)仪器上进行评估。表2示出了PT82及其具有PHF-tau和可溶性tau的Fab的亲和力评估的代表性结果。
表2：对PT82及其Fab的SPR亲和力
mAb/Fab PHF-tau K<sub>D</sub>(pM) Sol-tau K<sub>D</sub>(pM)
PT82mAb 2853±281 NT
PT82Fab 5006±626 1841(1410-2270)
PT82及其Fab两者与PHF-tau结合。而PT82的Fab片段也与可溶性Tau结合(还参见图1)。该研究的结果表明PT82结合PHF-tau和可溶性Tau。
实施例4
用于抗体选择的直接ELISA
将25ng/孔PHF-tau在4℃下在NUNC Maxisorp(Life Technologies)平底高结合96孔微量滴定板中在50μl/孔包被缓冲剂(10mM Tris、10mM NaCl和10mM NaN3，pH8.5)中包被过夜。第二天，在室温下用75μl/孔的在PBS中的0.1％酪蛋白封闭板60min。接下来，添加50μl杂交瘤上清液，并且在37℃下温育1h。在洗涤后，用50μl/孔的与辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗小鼠IgG(Amersham-Pharmacia Biotech)在37℃下检测结合的单克隆抗体1小时。两种试剂均在0.1％酪蛋白/PBS中稀释。洗涤板，并且添加50μl的0.42mM 3,5,3’,5’-四甲基-联苯胺、0.003％(v/v)H2O2在100mM柠檬酸和100mM磷酸氢二钠(pH4.3)中的溶液作为底物。反应可在室温下在板振荡器上进行最多15min，此后用50μl/孔的2N H2SO4停止显色，并且在微量滴定板读取器(Thermomax,Molecular Devices)上在450nm处读取该板。
实施例5
结合至重组WT(2N4R；SEQ ID NO:31)tau通过ELISA进行分析，其中将全长Tau蛋白(1ng/mL或10ng/mL)直接包被至板并与不同浓度的重组PT82抗体或杂交瘤产生的PT82抗体一起温育(图2)。在用抗体温育之后，将板再次洗涤并添加每孔50μL的HRPO标记的抗小鼠抗体(GE Healthcare)(用封闭缓冲剂以1:10000稀释)。在另一洗涤步骤之后，根据制造商的说明书，用“一步”TMB(Thermo Scientific)来执行检测。在
Figure BDA0002762961890000241
2102 Multilabel读取器(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)中分析板。结合曲线使用GraphPad Prism7.0软件生成。如所预期的，Tau的较低包被浓度导致较低的最大值(例如，将红色曲线与绿色曲线进行比较，其中示出了重组抗体分别与1ng/mL或10ng/ml的结合)。在重组抗体和杂交瘤产生的抗体的结合曲线之间未观察到显著差异。
实施例6
脊髓共温育测定(FRET测定)
由含有聚集转基因人tau的22至23周龄P301S转基因动物的脊髓组织产生用于共温育的含有tau种子的匀浆(图3A)。测定中使用的受体细胞是稳定表达K18/P301L-YFP和K18/P301L-CFP的HEK细胞(Holmes等人，Proc Natl Acad Sci USA.111(41):E4376-85,2014)。将含有tau种子的匀浆与阴性对照或PT82抗体共温育72h并且将该混合物添加到受体含发色团-K18的HEK细胞中。K18聚集体的形成通过FACS计数FRET阳性细胞进行测量。
PT82在低至3nM的浓度下封闭Tau聚集体诱导(图3B)。
实施例7
免疫耗竭细胞测定
为了研究最大百分比抑制值是否与种子上表位的密度或含有PT82表位的种子数相关，执行免疫耗竭测定(图4A)。在免疫耗竭测定中，将tau种子与阴性对照或PT82抗体一起温育并且用蛋白G珠从溶液中移除。在含发色团-K18的HEK细胞中测试耗竭上清液的残余播种能力，并且如前所述通过FACS进行分析(Holmes等人，Proc Natl Acad Sci USA.111(41):E4376-85,2014)，或使用聚集选择性Tau测定来测试聚集tau的水平。
由22至23周龄P301S转基因动物的脊髓或冷冻保存的人AD脑组织生成用于免疫耗竭的含有tau种子的匀浆。在人AD脑免疫耗竭测定中，在转染试剂Lipofectamine2000的存在下测试耗竭之后的上清液，以获得可接受的测定窗口。
tau播种潜能(在FRET测定中测量；图4B)和tau聚集水平(通过聚集tau选择性MSD测定来测量；图4C)可耗尽来自人AD脑的脊髓提取物和总匀浆中的PT82。PT82抑制源自人AD脑和TgP301S脊髓裂解物两者的tau种子。在脊髓提取物中，tau播种可几乎完全耗尽PT82。
实施例8
鼠科动物PT82在ePHF注射模型中的体内功效
已经建立了转基因P301L小鼠注射模型，其中将tau的前聚集片段，诸如合成K18原纤(Li和Lee，Biochemistry.45(51):15692-701,2006)或源自人AD脑的PFH-tau种子在细胞自主性聚集尚未开始的年龄的P301L转基因小鼠模型的皮质区或海马区中进行注射。注射模型旨在模拟tau蔓延的关键细胞外播种组分。注射的K18或PHF-tau种子在注射部位，且在较小程度上在连接的对侧区诱导tau蛋白病变(Peeraer等人，Neurobiol Dis.73:83-95,2015)。当与源自AD脑的PHF-tau种子或K18原纤共注射时，模型允许能测试抗体(诸如本发明的抗tau抗体)的抗播种潜能(Iba等人，2015,J Neurosci.33(3):1024-37,2013；Iba等人，Acta Neuropathol.130(3):349-62)。皮质注射的解剖AD脑的十二烷基肌氨酸钠不溶性级分触发tau聚集的缓慢逐步增加。在注射的半球中，第一信号在注射之后1个月测量，并且在注射之后3个月进一步发展。在注射之后五个月，一些动物开始形成P301L突变所驱动的缠结(Terwel等人，2005，同上)。AT8染色水平在1和3个月之间提高(参考PT3专利)，因此在共注射之后2个月分析抗体功效实验。另外，海马注射的解剖AD脑的十二烷基肌氨酸钠不溶性级分触发tau聚集的剂量依赖性逐步增加，如通过注射的半球的十二烷基肌氨酸钠不溶性级分的MesoScale Discoveries(MSD)分析测量的。
动物处理和颅内注射
对于注射研究，3个月龄的表达具有P301L突变的最长人tau同种型(tau-4R/2N-P301L)的转基因tau-P301L小鼠(Terwel等人，2005，同上)用于外科手术。所有实验按照医院伦理委员会所批准的方案来执行。对于立体定向手术，在存在或不存在单克隆抗体的情况下，小鼠在海马体(AP-2.0，ML+2.0(来自前囟)，DV1.8mm(来自硬脑膜))中接收单侧(右半球)注射3μl(速度0.25μl/min)解剖AD组织的十二烷基肌氨酸钠不溶性制剂(富集成对螺旋细丝，ePHF)。处死小鼠进行解剖(颅内注射后2个月)。
提取程序
对来自注射的半球的小鼠组织称重并且在6体积的均化缓冲剂(10mM Tris HCl(pH7.6)；0.8M NaCl；10％w/v蔗糖；1mM EGTA；PhosStop磷酸酶抑制剂混合物；完全不含EDTA的微型蛋白酶抑制剂)中均化。使匀浆以28000×g离心20分钟，并在从所得上清液(总匀浆)获取等分试样之后，添加1％N-月桂酰肌氨酸。在90分钟(900rpm，37℃)之后，将溶液以184000×g再次离心1小时。上清液保持为十二烷基肌氨酸钠可溶性级分，而含有十二烷基肌氨酸钠不溶性材料的沉淀物重悬于均化缓冲剂中。
生物化学分析
将包被抗体(AT8)用PBS(1μg/ml)稀释并且等分到MSD板(每孔30uL)(L15XA,Mesoscale Discoveries)中，将其在4℃下温育过夜。在用5×200μl的PBS/0.5％Tween-20洗涤之后，将板用含0.1％酪蛋白的PBS封闭并用5×200μl的PBS/0.5％Tween-20再次洗涤。在添加样品和标准物(两者用含0.1％酪蛋白的PBS稀释)之后，将板在4℃下温育过夜。随后，将板用5×200μl的PBS/0.5％Tween-20洗涤，并且添加溶于含0.1％酪蛋白的PBS中的SULFO-TAGTM缀合的检测抗体(AT8)，并且在室温下温育2小时，同时在600rpm下振荡。在最终洗涤之后(5×200μl的PBS/0.5％Tween-20)，添加150μl的2×缓冲剂T，并且用MSD成像器读取板。原始信号针对由解剖AD脑的十二烷基肌氨酸钠不溶性制剂(ePHF)的16个稀释液组成的标准曲线进行规一化，并且表示为任意单位(AU)ePHF。用GraphPad棱镜软件并用“内部”开发的自动分析应用程序进行统计分析(带有Bonferroni事后测试的ANOVA)。
结果
将小鼠PT82(重组表达为IgG2a)在海马共注射模型下的活性与一项研究中AT180和PT3的活性进行比较(图5，表3)。将抗体(4.5皮摩尔)与ePHF tau(0.6皮摩尔)共注射到皮质中。每组使用十五只动物。根据P301L小鼠中减弱的ePHF诱导的tau聚集共注射PT82(图5A和图5B)。在总匀浆(图5A)和十二烷基肌氨酸钠不溶性匀浆(图5B)中观察到该效应。
表3：注射模型中功能测试的结果汇总
Figure BDA0002762961890000271
*使用Bonferroni校正通过单向ANOVA进行统计学分析以进行多重比较。
在后续研究中，比较了颅内注射PHF(图6A)和颅内共注射抗体+PHF(图6B)后外周给药(20mg/kg；2x/周)抗体时PT3和PT82的功效。外周给药在颅内注射PHF之前2周开始，并且在实验的生命阶段期间持续。表4示出了实验中所用抗体的量。与第一项研究一致，PT3和PT82两者的共同施用减少了十二烷基肌氨酸钠不溶性级分(图6C和表5)和总脑匀浆(图6D和表5)中ePHF诱导的聚集信号。除此之外，抗体的外周给药显著抑制了由ePHF诱导的播种。
表4：所用试剂的量
Figure BDA0002762961890000272
表5：注射模型中功能测试的结果汇总
Figure BDA0002762961890000273
Figure BDA0002762961890000281
*使用Bonferroni校正通过单向ANOVA进行统计学分析以进行多重比较。
实施例9
阵列肽的合成
为了重建靶分子的表位，合成了覆盖Tau 441序列的肽文库(具有18个氨基酸的重叠的20-聚体)。通过用专有的亲水性聚合物制剂移植，然后使用二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)与叔丁氧羰基-己二胺(BocHMDA)反应，并且随后使用三氟乙酸(TFA)裂解Boc-基团，获得氨基官能化的聚丙烯载体。标准的Fmoc-肽合成用于通过定制的改性的JANUS液体处理站(Perkin Elmer)在氨基官能化的固体载体上合成肽。结构模拟物的合成使用Pepscan专有的支架上化学连接肽(CLIPS)技术来完成(Timmerman P，PuijkWC，Meloen RH，(2007)Functional reconstruction and synthetic mimicry of aconformational epitope using CLIPS technology.J Mol Recognit 20:283-299.10.1002/jmr.846[doi])。CLIPS技术允许将肽构建成单环、双环、三环、片状折叠、螺旋状折叠以及它们的组合。CLIPS模板偶联到半胱氨酸残基。肽中的多个半胱氨酸的侧链偶联到一个或两个CLIPS模板。例如，将P2 CLIPS(2,6-双(溴甲基)吡啶)的0.5mM溶液溶解于碳酸氢铵(20mM，pH7.8)/乙腈(1:3(v/v))中。将该溶液添加到肽阵列上。CLIPS模板将结合至存在于肽阵列的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧链(455孔板，具有3μl孔)。将肽阵列在溶液中轻轻振荡30分钟至60分钟，同时完全覆盖在溶液中。最后，用过量的H2O充分洗涤肽阵列，并在70℃下在含有PBS(pH7.2)中的1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的破坏缓冲剂中超声处理30分钟，然后在H2O中再超声处理45分钟。以类似的方式制备携带肽的T3CLIPS，但现在使用三个半胱氨酸。
Elisa筛选
在基于pepscan的ELISA中测试抗体(重组表达为IgG2a)与合成肽中的每个合成肽的结合。将肽阵列与一抗溶液一起温育(在4℃下过夜)。在洗涤后，将肽阵列与适当抗体过氧化物酶缀合物(SBA)的1/1000稀释液在25℃下温育一小时。在洗涤后，添加过氧化物酶底物2,2'-联氮-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和20μl/ml的3％H2O2。在一小时后，测量显色。用电荷耦合器件(CCD)-照相机和图像处理系统对显色进行定量。
结果
图7中的数据示出了从Tau441序列中的残基103开始直到残基140，PT82与一系列肽的结合。对于这些抗体，未观察到与其他Tau肽的结合。详细的作图表明PT82与具有共同基序119AGHVTQ124(SEQ ID NO:32)的肽结合。
实施例10
PT82的人源化
为了寻找人源化重链和轻链的最佳组合，选择几种人V区序列进行测试。人种系和J区的选择仅基于框架(FR)区中与小鼠抗体的总体序列相似性。在该选择中既不考虑CDR序列，也不考虑它们的长度或规范结构。
HFA中使用的CDR定义在(Fransson J等人，J.Mol.Biol.2010；398:214-231)中有所描述并且对应于Martin的定义(Abhinandan KR和Martin AC.，Mol.Immunol.2008；45:3832-3839)。CDR定义如下(使用Chothia编号方案[Chothia C和Lesk，A，J.Mol.Biol.1987；196:901-917])。在已知对VL/VH配对和CDR构象重要的框架位置处，氨基酸在二元残基文库中变化以掺入人到小鼠反突变以保持人源化V区的结合亲和力。对于PT82，将CDR移植到人HV3-72*01a种系基因中。VH：人/小鼠二元组合文库包括位置37:I,V；78:V,L；93:T,A；94:R,G。对于轻链，CDR在位置4:L,M和78:L,M处用VL：人/小鼠二元组合文库移植到人KV1-9*01a基因中。
另外，VH和VL中的若干位置在噬菌体展示文库中随机化，以帮助改善人源化PT82的亲和力(表6)。
表6：亲和力成熟文库位置
Figure BDA0002762961890000291
Figure BDA0002762961890000301
在重叠PCR中使用简并寡核苷酸生成人源化/成熟文库。然后将VH或VL文库DNA片段克隆到pCNTO噬菌粒中(Shi等人，J.Mol.Biol.397:385-396,2010；国际专利公布WO2009/085462；美国专利公布US2010/0021477；美国专利公布US2012/0108795)与互补小鼠V区组合。将文库连接纯化并转化到MC1061F细胞中。使细胞在2xYT(Carb)中生长直到实现对数期生长(OD600nm≈0.6)。添加辅助噬菌体，并将培养物在37℃下温育30分钟。将卡那霉素和IPTG添加到每个培养物中至最终浓度分别为35ug/mL和1mM，并在30℃振荡下生长过夜。使用PEG/NaCl沉淀来自细菌培养基的噬菌体，并将其重悬于PBS中。
对于亲和力成熟淘选，将Bt-Tau肽捕获在50μl的SA包被的磁珠上。第1轮抗原浓度为10nM，第2轮抗原浓度为0.1nM，并且第3轮抗原浓度为0.1nM。用PBST对小珠进行6次洗涤并用PBS洗涤一次，然后如上所述进行大肠杆菌感染。在噬菌体展示选择后，从感染的MC1061F细胞分离噬菌粒DNA并用限制性酶消化以移除编码pIX的序列，并将线性化的质粒DNA从琼脂糖凝胶中切除和纯化。然后用T4 DNA连接酶自连接该DNA。将连接的DNA电穿孔到MC1061F细胞中并接种于LB(Carb/葡萄糖)琼脂板上。
挑选来自该电穿孔的菌落以用于ELISA筛选和Fab表达的评估。简而言之，Maxisorp 96孔板包被有可溶性Tau蛋白。Fab菌落在2xYT培养基中生长并用IPTG诱导Fab表达。洗涤ELISA板，并且将分泌到大肠杆菌培养基中的Fab添加到每个ELISA板。洗涤板，并将抗Fab’2:HRP(Jackson ImmunoResearch)添加到ELISA板。洗涤板并添加化学发光检测试剂，并且在Perkin Elmer EnVision板读取器上读取板的发光性。
在VH和VL两者中对阳性克隆进行测序。VH和VL序列在表1中列出。将独特的序列克隆到IgG基因表达构建体中以作为全长IgG1分子表达和纯化。将IgG构建体转染到CHO-Expi细胞中，并且使用MabSelectSure树脂纯化IgG蛋白。然后在ELISA中使用抗人Fc:HRP(Jackson ImmunoResearch)测试抗体与可溶性Tau的结合，以检测IgG结合。该数据在图8中示出。与PT82和可溶性tau的结合相比，人源化基本上不影响与可溶性tau的结合。
如针对Fab所述进行ELISA，不同的是抗体以PGS中从5μg/mL开始的五倍5倍稀释进行测试，并且抗人Fc:HRP(Jackson ImmunoResearch)用于检测IgG结合。
尽管本发明结合其具体实施方案进行了详细描述，但对于本领域的普通技术人员来说将显而易见的是，可以在不脱离本发明的实质和范围的情况下进行各种变化和修改。
Figure IDA0002762961940000011
Figure IDA0002762961940000021
Figure IDA0002762961940000031
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Figure IDA0002762961940000171

Claims (14)

1.一种与PHF-tau结合的分离的抗体或其抗原结合片段，包含具有互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)以及具有互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3的轻链可变区(VL)，其中：
(a)所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的HCDR1；SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQID NO:3的HCDR3以及SEQ ID NO:4的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
(b)所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:8的HCDR2和SEQID NO:3的HCDR3以及SEQ ID NO:9的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
(c)所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ ID NO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
(d)所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:12的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ ID NO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；
(e)SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:13的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ IDNO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3；或者
(f)所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:14的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3以及SEQ ID NO:11的LCDR1；SEQ ID NO:5的LCDR2；以及SEQ ID NO:6的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，包含：
(a)包含与SEQ ID NO:15具有至少95％同一性的序列的重链可变区以及包含与SEQ IDNO:16具有至少95％同一性的序列的轻链可变区；
(b)包含与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性的序列的重链可变区以及包含与SEQ IDNO:18具有至少95％同一性的序列的轻链可变区；
(c)包含与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性的序列的重链可变区以及包含与SEQ IDNO:20具有至少95％同一性的序列的轻链可变区；
(d)包含与SEQ ID NO:21具有至少95％同一性的序列的重链可变区以及包含与SEQ IDNO:22具有至少95％同一性的序列的轻链可变区；
(e)包含与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的序列的重链可变区以及包含与SEQ IDNO:20具有至少95％同一性的序列的轻链可变区；或者
(f)包含与SEQ ID NO:24具有至少95％同一性的序列的重链可变区以及包含与SEQ IDNO:25具有至少95％同一性的序列的轻链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或抗原结合片段，包含
(a)包含SEQ ID NO:15的重链可变区和包含SEQ ID NO:16的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:17的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:19的重链可变区和包含SEQ ID NO:20的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:21的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:23的重链可变区和包含SEQ ID NO:20的轻链可变区；或者
(f)包含SEQ ID NO:24的重链可变区和包含SEQ ID NO:25的轻链可变区。
4.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
5.一种载体，所述载体包含根据权利要求4所述的分离的核酸。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求4所述的核酸或根据权利要求5所述的载体。
7.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段。
8.一种在对其有需要的受治疗者中减少病理性tau聚集或tau蛋白病变蔓延的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用根据权利要求7所述的药物组合物。
9.一种在对其有需要的受治疗者中治疗tau蛋白病变的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用根据权利要求7所述的药物组合物。
10.一种在对其有需要的受治疗者中治疗tau蛋白病变的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述tau蛋白病变选自阿尔茨海默病(包括家族性阿尔茨海默病和散发性阿尔茨海默病)、17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合症、格-施-沙氏病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病和拳击员痴呆症(拳击疾病)。
11.一种产生根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在产生所述抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码所述抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或细胞培养物回收所述抗体或抗原结合片段。
12.一种产生药物组合物的方法，所述药物组合物包含根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体或抗原结合片段，所述方法包括将所述抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
13.一种在来自受治疗者的生物样品中检测PHF-tau的存在的方法，所述方法包括使所述生物样品与根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，以及检测所述抗体或抗原结合片段与来自所述受治疗者的所述样品中PHF-tau的结合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物样品是血液、尿液或脑脊髓液样品。
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