CN111961636B

CN111961636B - 一种外泌体的提取试剂及其应用

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Publication number: CN111961636B
Application number: CN202010642250.0A
Authority: CN
Inventors: 孙益军; 韩斌; 王雪根; 张峰; 李阳; 孔科
Original assignee: Jiangsu Keygen Biotech Corp ltd
Current assignee: Jiangsu Keygen Biotech Corp ltd
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-07-06
Also published as: CN111961636A

Abstract

本发明公开一种外泌体提取试剂，所述试剂包括10‑200 mM的PEG4000、10‑50 mM的β‑环糊精、10‑50 mM的咪唑、10‑50 mM的硫酸铜及10‑50 mM的HEPES。本发明还公开了上述试剂在分离细胞培养液外泌体的应用。本发明试剂与Invitrogen试剂盒法以及SBI试剂盒法对比，提取的外泌体数量更多，粒径分布更集中，电镜形态背景更清晰。同时本发明提供的外泌体制备试剂，操作简单，成本低，得率高，纯度高，可用于外泌体蛋白、核酸、电镜及粒镜分析。

Description

一种外泌体的提取试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体属于一种分离细胞培养液外泌体的试剂及方法。

背景技术

外泌体是一种直径为30-150nm的具有双层脂质分子包裹的囊性小泡，是由活细胞选择性包装并释放，在人体液中含量丰富。外泌体内含有种类不同的脂质、核酸以及蛋白质等，这些物质能够随体液运输到特定的靶器官以及相关的靶细胞，从而发挥其相应的生物学功能。相关的研究已经表明，外泌体在细胞间通讯以及生理和病理过程中均发挥着巨大的作用。

近年来，随着人们对外泌体的研究和认识加深，外泌体检测作为一种新型的液体活检热点技术已被许多临床科研机构广泛地应用于肿瘤和疾病的无创诊断、治疗和监测；如何高效地提取外泌体是实现这项新兴液体活检技术临床常规化应用的关键。

目前外泌体提取的标准依然是超高速离心法。超高速离心法的典型的不足之处为操作复杂、所需仪器设备昂贵，很难获得足够量的外泌体用于后续的实验分析。同时，对超速离心机的设备要求以及操作程序的培训大大提高了提取成本，无法实现临床的常规化应用。由于国内有关外泌体提取试剂的缺乏，我国对外泌体的研究还基本依赖于过程繁琐的超速离心和进口提取试剂盒，因此，严重阻碍了我国在外泌体的研究和临床应用上的发展。所以，急需要一种操作方便、易于获得高纯度外泌体的方法。

发明内容

发明目的：为解决现有技术的不足，本发明提供一种成本低、操作方便的适用于细胞培养液中高纯度外泌体提取的提取试剂及其分离方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种外泌体提取试剂，所述试剂包括10-200mM的PEG4000、10-50mM的β-环糊精、10-50mM的咪唑、10-50mM的硫酸铜及10-50mM的HEPES。

优选地，所述试剂包括100-200mM的PEG4000、20-50mM的β-环糊精、10-20mM的咪唑、20-50mM的硫酸铜及20-50mM的HEPES。

在一个优选的实施方式中，所述试剂包括100mM的PEG4000、40mM的β-环糊精、10mM的咪唑、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES。

本发明进一步提出了上述试剂在分离细胞培养液外泌体的应用。

具体地，在应用过程中包括如下步骤：

(1)先将细胞培养液离心，取上清液；

(2)再将权利要求1所述的试剂与步骤(1)得到的上清液混合均匀，静置过夜；次日，再次离心，弃上清，所得沉淀即为高纯度的外泌体。

其中，步骤(1)中，离心条件为在4℃，3000-5000g条件下离心10-20min。

优选地，步骤(2)中，试剂：上清液体积比为1：1～1：10。

进一步优选地，步骤(2)中，离心条件为4℃，5000-10000g条件下离心30-60min。

在一个优选的实施方式中，采用如下技术方案分离外泌体：先将细胞培养液在4℃，3000g条件下离心10min；再将上述试剂按照1：1-1：10(试剂：细胞培养液)的体积比加入到细胞培养液中，混匀；4℃，静置过夜：次日，4℃，5000g条件下离心60min，弃上清，所得沉淀即为高纯度的外泌体。

有益效果：本发明试剂与Invitrogen试剂盒法以及SBI试剂盒法对比，提取的外泌体数量更多，粒径分布更集中，电镜形态背景更清晰。同时本发明提供的外泌体制备试剂，操作简单，成本低，得率高，纯度高，可用于外泌体蛋白、核酸、电镜及粒镜分析。

附图说明

图1为不同细胞培养液样本使用本发明试剂制备外泌体后，通过Western Blot进行外泌体标志物HSP70和CD63蛋白检测的结果；

图2为不同细胞培养液样本使用本发明试剂制备外泌体后，进行粒径(NTA)检测的结果；

图3为不同细胞培养液样本使用本发明试剂制备外泌体后，进行电镜成像检测的结果；

图4为本发明试剂与Invitrogen试剂盒法以及SBI试剂盒法制备外泌体后，通过Western Blot对外泌体标志物蛋白HSP70和CD63进行检测的结果；

图5为本发明试剂与Invitrogen试剂盒法以及SBI试剂盒法制备外泌体后，进行粒径(NTA)检测的结果；

图6为本发明试剂与Invitrogen试剂盒法以及SBI试剂盒法制备外泌体后，进行电镜成像检测的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例中列举出的细胞培养液类型及试剂组合方式，将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例，在实际应用中不限制细胞培养液类型。

本发明采用的材料、设备和方法均为本技术领域的常规材料、设备和方法，其中PEG4000、β-环糊精、咪唑、硫酸铜及HEPES采购于国药集团化学试剂有限公司；Anti-Hsp70antibody[EPR16892](ab181606)及Anti-CD63 antibody-Late Endosome Marker(ab216130)采购于Abcam公司。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1使用不同浓度的PEG4000溶液分别对A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液进行外泌体提取.

1)配制浓度分别为10mM、100mM和200mM的PEG4000溶液，编号依次为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；

2)分别取A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液样本，4℃，3000g，离心10min，取上清，每种细胞分别装于4个离心管中，各1mL，4种细胞共计需要16个离心管。编号依次为A549Ⅰ，A549Ⅱ，A549Ⅲ，A549未处理；K562Ⅰ，K562Ⅱ，K562Ⅲ，K562未处理；HepG2Ⅰ，HepG2Ⅱ，HepG2Ⅲ，HepG2未处理；HeLaⅠ，HeLaⅡ，HeLaⅢ，HeLa未处理。然后分别对应编号加入PEG4000溶液250μL(未处理组不加)，混匀；将上述混匀液4℃，静置12h；然后4℃，5000g，离心60min；弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

3)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表1所示。

表1

由实验结果可知，当PEG4000浓度在100mM以下时，浓度越高对细胞培养液中外泌体提取量越大，但当PEG4000浓度达到100mM以上时，浓度越高对细胞培养液中外泌体提取量提升的不明显。

实施例2使用不同浓度的β-环糊精溶液分别对A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液进行外泌体提取.

1)配制浓度分别为10mM、20mM和40mM的β-环糊精溶液，编号依次为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；

2)分别取A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液样本，4℃，3000g，离心10min，取上清，每种细胞分别装于4个离心管中，各1mL，4种细胞共计需要16个离心管。编号依次为A549Ⅰ，A549Ⅱ，A549Ⅲ，A549未处理；K562Ⅰ，K562Ⅱ，K562Ⅲ，K562未处理；HepG2Ⅰ，HepG2Ⅱ，HepG2Ⅲ，HepG2未处理；HeLaⅠ，HeLaⅡ，HeLaⅢ，HeLa未处理。然后分别对应编号加入β-环糊精溶液250μL(未处理组不加)，混匀；将上述混匀液4℃，静置12h；然后4℃，5000g，离心60min；弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

3)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表2所示。

表2

由实验结果可知，当β-环糊精浓度在40mM以下时，浓度越高对细胞培养液中外泌体提取量越大。

实施例3使用不同浓度的咪唑溶液分别对A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液进行外泌体提取。

1)配制浓度分别为10mM、30mM和50mM的咪唑溶液，编号依次为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；

2)分别取A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液样本，4℃，3000g，离心10min，取上清，每种细胞分别装于4个离心管中，各1mL，4种细胞共计需要16个离心管。编号依次为A549Ⅰ，A549Ⅱ，A549Ⅲ，A549未处理；K562Ⅰ，K562Ⅱ，K562Ⅲ，K562未处理；HepG2Ⅰ，HepG2Ⅱ，HepG2Ⅲ，HepG2未处理；HeLaⅠ，HeLaⅡ，HeLaⅢ，HeLa未处理。然后分别对应编号加入咪唑溶液250μL(未处理组不加)，混匀；将上述混匀液4℃，静置12h；然后4℃，5000g，离心60min；弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

3)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表3所示。

表3

由实验结果可知，咪唑对细胞培养液中外泌体提取基本没有影响。

实施例4使用不同浓度的硫酸铜溶液分别对A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液进行外泌体提取。

1)配制浓度分别为10mM、20mM和40mM的硫酸铜溶液，编号依次为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；

2)分别取A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液样本，4℃，3000g，离心10min，取上清，每种细胞分别装于4个离心管中，各1mL，4种细胞共计需要16个离心管。编号依次为A549Ⅰ，A549Ⅱ，A549Ⅲ，A549未处理；K562Ⅰ，K562Ⅱ，K562Ⅲ，K562未处理；HepG2Ⅰ，HepG2Ⅱ，HepG2Ⅲ，HepG2未处理；HeLaⅠ，HeLaⅡ，HeLaⅢ，HeLa未处理。然后分别对应编号加入硫酸铜溶液250μL(未处理组不加)，混匀；将上述混匀液4℃，静置12h；然后4℃，5000g，离心60min；弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

3)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表4所示。

表4

4)由实验结果可知，硫酸铜对细胞培养液中外泌体提取基本没有影响。

实施例5使用不同浓度的HEPES溶液分别对A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液进行外泌体提取。

1)配制浓度分别为10mM、20mM和40mM的HEPES溶液，编号依次为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；

2)分别取A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液样本，4℃，3000g，离心10min，取上清，每种细胞分别装于4个离心管中，各1mL，4种细胞共计需要16个离心管。编号依次为A549Ⅰ，A549Ⅱ，A549Ⅲ，A549未处理；K562Ⅰ，K562Ⅱ，K562Ⅲ，K562未处理；HepG2Ⅰ，HepG2Ⅱ，HepG2Ⅲ，HepG2未处理；HeLaⅠ，HeLaⅡ，HeLaⅢ，HeLa未处理。然后分别对应编号加入HEPES溶液250μL(未处理组不加)，混匀；将上述混匀液4℃，静置12h；然后4℃，5000g，离心60min；弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

3)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表5所示。

表5

由实验结果可知，HEPES对细胞培养液中外泌体提取基本没有影响。

实施例6使用不同组合的试剂分别对A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液进行外泌体提取。

1)配制不同组合的试剂：100mM的PEG4000、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅰ；40mM的β-环糊精、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅱ；10mM的咪唑、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅲ；100mM的PEG4000、40mM的β-环糊精、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅳ；100mM的PEG4000、10mM的咪唑、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅴ；40mM的β-环糊精、10mM的咪唑、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅵ；

2)分别取A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液样本，4℃，3000g，离心10min，取上清，每种细胞分别装于7个离心管中，各1mL，4种细胞共计需要28个离心管。编号依次为A549Ⅰ，A549Ⅱ，A549Ⅲ，A549Ⅳ，A549Ⅴ，A549Ⅵ，A549未处理；K562Ⅰ，K562Ⅱ，K562Ⅲ，K562Ⅳ，K562Ⅴ，K562Ⅵ，K562未处理；HepG2Ⅰ，HepG2Ⅱ，HepG2Ⅲ，HepG2Ⅳ，HepG2Ⅴ，HepG2Ⅵ，HepG2未处理；HeLaⅠ，HeLaⅡ，HeLaⅢ，HeLaⅣ，HeLaⅤ，HeLaⅥ，HeLa未处理。然后分别对应编号加入试剂250μL(未处理组不加)，混匀；将上述混匀液4℃，静置12h；然后4℃，5000g，离心60min；弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

3)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表6所示。

表6

实施例1-6结果表明，PEG4000有一定的吸附外泌体的作用，β-环糊精有轻微吸附外泌体的作用，咪唑、硫酸铜及HEPES单独使用，几乎没有吸附外泌体的作用。但当PEG4000、β-环糊精、咪唑、硫酸铜及HEPES中的几种物质联合使用时，会对外泌体产生明显的吸附作用。

实施例7使用不同浓度配比的本发明试剂分别对A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液进行外泌体提取。

1)配制不同浓度配比的本发明试剂：10mM的PEG4000、20mM的β-环糊精、10mM的咪唑、10mM的硫酸铜及10mM的HEPES，记为试剂Ⅰ；50mM的PEG4000、40mM的β-环糊精、10mM的咪唑、20mM的硫酸铜及10mM的HEPES，记为试剂Ⅱ；100mM的PEG4000、40mM的β-环糊精、10mM的咪唑、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅲ；100mM的PEG4000、40mM的β-环糊精、20mM的咪唑、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES，记为试剂Ⅳ；100mM的PEG4000、50mM的β-环糊精、20mM的咪唑、30mM的硫酸铜及30mM的HEPES，记为试剂Ⅴ；200mM的PEG4000、50mM的β-环糊精、50mM的咪唑、50mM的硫酸铜及50mM的HEPES，记为试剂Ⅵ；

3)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表7所示。

表7

4)选取试剂Ⅲ提取所得外泌体重悬液，各取20μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解以及蛋白提取，并通过Western Blot进行外泌体标志物HSP70和CD63蛋白检测，检测结果如图1所示。

5)选取试剂Ⅲ提取所得外泌体重悬液，各取20μL 100倍稀释后，进行粒径(NTA)检测，检测结果如表8及图2所示。

表8

编号	A549Ⅲ	K562Ⅲ	HepG2Ⅲ	HeLaⅢ
					平均粒径(nm)	94.2	122.7	87.9	106.9
粒子浓度(个/mL)	4.55×10<sup>11</sup>	6.62×10<sup>9</sup>	5.13×10<sup>12</sup>	3.29×10<sup>12</sup>

6)选取试剂Ⅲ提取所得外泌体重悬液，各取10μL，进行透射电镜的相关检测，采用磷钨酸负染法，具体包括以下流程：吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，2％的磷钨酸10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液,然后将铜网放在滤纸上常温干燥数分钟，100KV进行电镜检测成像，检测结果如图3所示。

实验结果表明，本发明优选试剂Ⅲ组合：100mM的PEG4000、40mM的β-环糊精、10mM的咪唑、20mM的硫酸铜及20mM的HEPES。本发明提供的试剂以及相关的实验方法，可适用于不同细胞培养液样本外泌体的提取，操作简单，获取的外泌体纯度较高。

实施例8本发明试剂与Invitrogen试剂以及SBI试剂提取细胞培养液外泌体浓度和纯度对比

1)分别取A549、K562、HepG2、HeLa的细胞培养液样本，4℃，3000g，离心10min，取上清，每种细胞分别装于4个离心管中，各1mL，4种细胞共计需要16个离心管。编号依次为A549Ⅰ，A549Ⅱ，A549Ⅲ，A549未处理；K562Ⅰ，K562Ⅱ，K562Ⅲ，K562未处理；HepG2Ⅰ，HepG2Ⅱ，HepG2Ⅲ，HepG2未处理；HeLaⅠ，HeLaⅡ，HeLaⅢ，HeLa未处理。

2)Ⅰ组细胞培养液按照实施例7中本发明试剂Ⅲ组合进行提取，提取流程参照实施例7所述方法，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬；

3)Ⅱ组细胞培养液按照Invitrogen试剂盒标准流程进行操作，向细胞培养液中加入提取试剂1mL，混匀；4℃，静置12h；4℃，10000g，离心60min，弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

4)Ⅲ组细胞培养液按照SBI试剂盒标准流程进行操作，向细胞培养液中加入提取试剂200μL，混匀；室温静置60min；4℃，静置12h；4℃，1500g，离心30min，弃上清，所得外泌体沉淀用100μLPBS重悬。

5)未处理组不添加提取试剂，4℃，静置12h；然后4℃，5000g，离心60min；弃上清，所得外泌体沉淀用100μL PBS重悬。

6)所得外泌体重悬液各取10μL，加入等体积RIPA裂解液进行裂解，通过BCA法对所得的外泌体蛋白含量进行检测，检测结果如表9所示。

表9

7)选取三种方法提取K562细胞培养液所得外泌体重悬液，各取20μL加入等体积RIPA裂解液进行裂解以及蛋白提取，并通过Western Blot对外泌体标志物蛋白HSP70和CD63进行检测，检测结果如图4所示。

8)选取三种方法提取K562细胞培养液所得外泌体重悬液，各取20μL 100倍稀释后，进行粒径(NTA)检测，检测结果如表10及图5所示。

表10

编号	K562Ⅰ	K562Ⅱ	K562Ⅲ
				平均粒径(nm)	99.0	143.0	146.5
粒子浓度(个/mL)	4.18×10<sup>12</sup>	6.06×10<sup>11</sup>	7.62×10<sup>8</sup>

9)选取三种方法提取K562细胞培养液所得外泌体重悬液，各取10μL，进行透射电镜的相关检测，采用磷钨酸负染法，具体包括以下流程：吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，2％的磷钨酸10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液,然后将铜网放在滤纸上常温干燥数分钟，100KV进行电镜检测成像，检测结果如图6所示。

本发明试剂与Invitrogen试剂盒法以及SBI试剂盒法对比，细胞培养液外泌体标志物的含量更高，同时所得的粒子数也是最多的。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种外泌体提取试剂，其特征在于，所述试剂包括10-200 mM的PEG4000、10-50 mM的β-环糊精、10-50 mM的咪唑、10-50 mM的硫酸铜及10-50 mM的HEPES。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括100-200 mM的PEG4000、20-50 mM的β-环糊精、10-20mM的咪唑、20-50 mM的硫酸铜及20-50 mM的HEPES。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括100 mM的PEG4000、40 mM的β-环糊精、10 mM的咪唑、20 mM的硫酸铜及20 mM的HEPES。

4.权利要求1所述的试剂在分离细胞培养液外泌体中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）先将细胞培养液离心，取上清液；

（2）再将权利要求1所述的试剂与步骤（1）得到的上清液混合均匀，静置过夜；次日，再次离心，弃上清，所得沉淀即为高纯度的外泌体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，离心条件为在4℃，3000 -5000g条件下离心10-20 min。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，试剂：上清液体积比为1：1~1：10。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，离心条件为4℃，5000-10000 g条件下离心30-60 min。