CN111902543A

CN111902543A - 精制糖液的制造方法

Info

Publication number: CN111902543A
Application number: CN201980022135.9A
Authority: CN
Inventors: 小松志绪美; 旭裕佳; 平松绅吾; 栗原宏征; 山田胜成
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2020-11-06
Also published as: JPWO2019189651A1; RU2020133489A3; RU2020133489A; WO2019189651A1; EP3778913A1; EP3778913A4

Abstract

本发明的课题是提供通过从来自木薯糟粕和/或甜菜废粕的糖液中除去半乳糖醛酸来制造精制糖液的制造方法，为了解决该课题提供了一种以木薯糟粕和/或甜菜废粕作为原料来制造精制糖液的制造方法，包含以下工序(1)和工序(2)，工序(1)是将木薯糟粕和/或甜菜废粕用至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶分解而制造含有半乳糖醛酸的糖化液的工序；工序(2)是使所述糖化液从截留分子量为150～1000的分离膜通过而过滤，从非透过侧分离除去半乳糖醛酸，从透过侧回收精制糖液的工序。

Description

精制糖液的制造方法

技术领域

本发明涉及来源于木薯糟粕和/或甜菜废粕的精制糖液的制造。

背景技术

从环境保护的角度，以取代化石燃料作为目标，研究了以生物质作为原料来制造糖液，以得到的糖液作为发酵原料来制造化学品。但是，在来源于生物质的糖液中，除了可以作为发酵原料利用的糖以外，有时还包含会阻碍发酵的物质。这样的发酵阻碍物质已知有羟甲基糠醛、糠醛、香草醛、香豆酸、香豆酸酰胺等，已经研究了将来源于生物质的糖液纯化，除去发酵阻碍物质的方法。

专利文献1中公开了将多糖类生物质水解处理，将得到的生成物用分离膜处理，从而将单糖浓缩，除去羟甲基糠醛、糠醛、香草醛等的发酵阻碍物质的方法。专利文献2中公开了将含有纤维素的生物质水解，从纳米过滤膜透过，从而将香豆酸酰胺、香豆酸等发酵阻碍物质从分离膜的透过侧除去而制造精制糖液的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2009/110374号

专利文献2:国际公开第2010/067785号

发明内容

发明要解决的课题

本发明人使用了各种来源于生物质的糖液，尝试通过发酵法来制造化学品，结果发现、在来源于木薯糟粕、甜菜废粕那样的含有大量果胶的生物质的糖液中含有作为果胶的主要分解物的半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是引起发酵速度降低的发酵阻碍物质。半乳糖醛酸造成的发酵阻碍是前所未知的，迄今为止还没有对从糖液中除去半乳糖醛酸的方法进行过研究。

于是本发明的目的在于提供从来源于木薯糟粕和/或甜菜废粕的糖液中除去半乳糖醛酸来制造精制糖液的方法。

解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现，通过使将木薯糟粕和/或甜菜废粕用酶分解而得到的糖化液从截留分子量为150～1000的分离膜通过而过滤，从非透过侧分离除去半乳糖醛酸，能够制造精制糖液。

即、本发明包括以下方案[1]～[9]。

[1].一种精制糖液的制造方法，以木薯糟粕和/或甜菜废粕作为原料，包含以下工序(1)和工序(2)，

工序(1)是将木薯糟粕和/或甜菜废粕用至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶分解而制造含有半乳糖醛酸的糖化液的工序；

工序(2)是使所述糖化液从截留分子量为150～1000的分离膜通过而过滤，从非透过侧分离除去半乳糖醛酸，从透过侧回收精制糖液的工序。

[2].如[1]所述的精制糖液的制造方法，所述糖化液中含有的半乳糖醛酸的浓度为8g/L以上.

[3].如[1]或[2]所述的精制糖液的制造方法，所述糖化酶还含有纤维素酶和/或淀粉酶。

[4].如[1]～[3]的任一项所述的精制糖液的制造方法，所述精制糖液含有葡萄糖和/或木糖。

[5].如[1]～[4]的任一项所述的精制糖液的制造方法，所述分离膜的截留分子量为300～800。

[6].如[1]～[5]的任一项所述的精制糖液的制造方法，作为所述工序(1)之后且所述工序(2)之前的工序，包含以下工序：

使所述糖化液从截留分子量为2000～100000的范围的分离膜通过而过滤，从非透过侧回收至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶，从透过侧回收糖化液。

[7].如[1]～[6]的任一项所述的精制糖液的制造方法，所述精制糖液中含有以所述精制糖液的重量作为基准为2重量％以上的葡萄糖、和相对于所述葡萄糖的重量的重量比率为0.078以下的半乳糖醛酸。

[8].一种化学品的制造方法，含有通过[1]～[7]的任一项所述的方法得到精制糖液的工序、和以通过该工序得到的精制糖液作为发酵原料来制造化学品的工序。

[9].一种微生物的发酵用原料，含有来源于木薯糟粕的糖液，并且含有以所述发酵用原料的重量作为基准为2重量％以上的葡萄糖、和相对于所述葡萄糖的重量的重量比率为0.078以下的半乳糖醛酸。

具体实施方式

以下、对本具体实施方式进行说明。

本发明中最新发现，如果在含有半乳糖醛酸的培养基中培养微生物，来制造化学品，则发酵受到阻碍、发酵速度降低。半乳糖醛酸引起的发酵阻碍，培养基中含有的半乳糖醛酸的浓度越高，则发酵越是被阻碍，特别是在含有半乳糖醛酸8g/L以上的培养基中培养时，发酵速度显著降低。本发明中，通过将半乳糖醛酸浓度高的糖液从截留分子量150～1000的分离膜通过而过滤，将半乳糖醛酸从非透过侧分离除去，能够制造半乳糖醛酸低于8g/L的精制糖液。

半乳糖醛酸是构成果胶的物质。已经知道，果胶是以由半乳糖醛酸通过α-1,4键连接而成的聚半乳糖醛酸为主成分的复合多糖类，在植物的细胞壁等中广泛存在。还已知果胶会受热而凝胶化，成为粘度上升的原因，所以优选在糖化时果胶也同样分解。但是、在将木薯糟粕、甜菜废粕之类果胶含量高的生物质通过至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶分解时，则可以得到含大量半乳糖醛酸的糖化液，如果使用含有半乳糖醛酸的糖化液作为发酵原料，则发酵受到阻碍。

本发明可以使用木薯糟粕和/或甜菜废粕作为原料，进而优选木薯糟粕。

木薯糟粕是从木薯的根茎(木薯芋头)制造淀粉时的副产物，是取出淀粉后排出的残渣。作为从木薯芋头制造淀粉的方法，可以列举出例如以下的方法。一开始先将木薯芋头清洗、剥皮、粗粉碎。然后使用磨碎机将组织粉碎分散。磨碎分散后、筛分分离出淀粉部分和纤维部分。该纤维部分是木薯糟粕。木薯糟粕有残留着水分的状态的湿品、和将湿品干燥后的干品，本发明中可以使用任一种。此外，可以使用其中的仅一种，也可以将两种混合使用。在用于本发明时还可以通过进行粉碎处理等来调整粒子尺寸。木薯糟粕，既可以买入木薯芋头用前述的方法制造，也可以从木薯糟粕排出从业者买入，或作为市售的饲料买入。

甜菜废粕是从甜菜(beet)制造蔗糖时的副产物，是取出蔗糖后排出的残渣。作为从甜菜制造甜菜废粕的方法，可以列举出例如以下方法。将甜菜磨碎，挤出含有糖分的汁液，回收纤维糟粕。接下来，将得到的纤维糟粕用醇等冲洗后干燥，就得到了甜菜废粕。在本发明中使用时，可以进而进行粉碎处理等来调整粒子尺寸。获得的方法，既可以购买甜菜以前述的方法制造，也可以从甜菜废粕排出从业者买入，或者作为市售的饲料买入。

糖化液中含有的半乳糖醛酸的浓度通过以下的方法测定。

柱：Shim-Pack SPR-H、Shim-Pack SCR-101H(株式会社岛津制作所)

柱温：45℃

检测法：后柱pH缓冲化电导率检测法

流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/min)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris(即、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷)、0.1mMEDTA·2Na

流速：0.8mL/min

检测方法：电导率

温度：45℃

以下对本发明的精制糖液的制造方法一个工序一个工序地进行说明。

[工序(1)：将木薯糟粕和/或甜菜废粕用至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶分解，而制造含有半乳糖醛酸的糖化液的工序]

本发明中使用的具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶是具有将果胶的主要构成成分即聚半乳糖醛酸的α-1,4键分解的活性的糖化酶，聚半乳糖醛酸分解活性通过以下方法测定。

向1.5mL的管中添加10μL的1M乙酸缓冲液(pH5.2)、20μL的1％(w/v)聚半乳糖醛酸、60μL超纯水，在50℃恒温5分钟。接下来，加入10μL的被适当稀释的酶液，在50℃反应30分钟，然后加入100μL的二硝基水杨酸试剂，煮沸5分钟进行还原糖的显色，在冰水中骤冷。接下来，加入400μL的超纯水，测定535nm下的吸光度。另行准备535nm下的半乳糖醛酸标准液的标准线，通过该标准线求出半乳糖醛酸的生成量，算出1分钟内生成相当于1μmol的D-半乳糖醛酸的还原糖时的酶量作为酶1单位(1U)。在不加入酶液的情况下与上述同样地进行处理直到添加二硝基水杨酸试剂，然后添加酶液进行还原糖的显色，使用所得样品作为测定的空白样。标准线中，使用向0～2.0g/L的范围的D-半乳糖醛酸标准液中加入二硝基水杨酸试剂，与上述同样进行显色了的样品。酶1单位(1U)是在上述反应条件下1分钟内生成相当于1μmol的D-半乳糖醛酸的还原糖时的酶量。

本发明中使用的具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶，在上述活性测定中优选使用每1mg蛋白质具有0.1U以上活性的糖化酶。蛋白质浓度可以通过Bradford法等已知的方法测定。

作为本发明中使用的至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶，可以使用果胶酶。果胶酶是能够将果胶分解的酶的总称，有多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶(pectinesterase)、果胶裂解酶(pectin lyase)、果胶甲酯酶(pectinmethylesterase)等种类。其中，多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶具有聚半乳糖醛酸分解活性。本发明中只要是至少具有聚半乳糖醛酸分解活性，就都可以很好地使用任一种酶，可以将至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的酶、与作为上述果胶酶列举出的酶混合使用。此外，作为至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶使用市售的酶制剂利，这样很方便，所以优选，但可以直接使用酶生产微生物的培养液，也可以使用纯化酶，也可以将多种酶混合使用。作为市售的酶制剂的例子，可以列举出来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的果胶酶(シグマアルドリッチジャパン合同会社制)、果胶酶PL「アマノ」(天野エンザイム株式会社制)等。该市售果胶酶，作为聚半乳糖醛酸分解活性具有每1mg蛋白质为0.1U以上的活性，所以优选。

具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶的添加量，只要是可以根据使用的酶适当设定有效果的且经济上妥当的范围即可，作为含有果胶的生物质的平均每1g干燥重量所具有的聚半乳糖醛酸分解活性优选为0.01U以上、进而优选为0.05U以上、更优选为0.1U以上。上限没有限定，但从经济性的观点优选为例如100U以下。

生物质的干燥重量，是从生物质的重量(Wa(g))减去生物质中含有的水分的重量后得到的重量。具体的地，可以通过使用红外线水分计测定水分比例Rw(重量％)，通过下式(1)计算，使用所得计算值。红外线水分计使用FD-720(株式会社ケツト科学研究所制)，以在干燥温度105℃下30秒钟的水分变化量变为0.05％以下就停止测定的自动停止模式进行测定，使用所得值。

干燥重量(g)＝Wa-Wa×Rw (式1)

通过酶进行的分解反应的优选温度条件为30～60℃。

通过酶进行的分解反应的优选pH值为例如pH4～7。pH调整剂使用现有的酸或碱即可。酸可以列举出例如盐酸、硫酸等。碱可以列举出例如氢氧化钠、氨等。

通过酶进行分解反应的优选处理时间，只要是设定在使通过酶进行的分解反应充分进行的范围即可，例如为1～24小时、优选2～12小时、更优选3～8小时。如果少于1小时，则反应进行不充分，如果长于24小时，则会导致污染。

作为糖化酶，除了具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶以外，还可以加入其它糖化酶。例如、如果是淀粉多的生物质则可以加入淀粉酶，如果是纤维素多的生物质，则可以添加纤维素酶，如果含有果胶的生物质的分解反应进行，则糖化液中含有的糖量增加，所以优选。这些酶处理既可以分开实施，也可以按照酶处理条件同时实施。如果添加淀粉酶进行分解反应，则糖化液中含有的葡萄糖量增加。如果添加纤维素酶进行分解反应，则糖化液中含有的木糖、葡萄糖的量增加。

作为淀粉酶的具体例，有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-グルコシダーゼ等存在，优选用至少含有葡萄糖淀粉酶的1种以上的酶处理。此外，在这种情况，通过预先将含有果胶的生物质加热到60℃以上等，能够促进淀粉的水和反应，所以优选。

作为葡萄糖淀粉酶的添加量，含有果胶的生物质的每1g干燥重量的蛋白质浓度优选0.001mg以上、进而优选0.01mg以上、更优选0.02mg以上。上限没有限制，但从经济性的观点可以为例如10mg以下。

淀粉酶使用市售的酶制剂，这样简便，所以优选，但也可以直接使用能够生产酶的微生物的培养液，也可以使用精制酶，还可以将多种酶混合使用。作为市售的酶制剂的例子，作为葡萄糖淀粉酶可以列举出来自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶(Amyloglucosidase fromAspergillusniger)(シグマアルドリッチジャパン合同会社制)、グルクザイムAF6(天野エンザイム株式会社制)、グルクザイムNL4.2(天野エンザイム株式会社制)、淀粉葡萄糖苷酶(MEGAZYME社制)等。

作为纤维素酶使用市售的酶制剂，这样简便，所以优选，但也可以直接使用能够生产酶的微生物的培养液，也可以使用精制酶，也可以将多种酶混合使用。作为市售的酶制剂的例子，可以列举出木聚糖酶(cellulosin TP25)(エイチビイアイ株式会社制)、支顶孢属(Acremonium)纤维素酶(Meiji Seikaファルマ株式会社制)、来自绿色木霉的酶(Meicelase)(Meiji Seikaファルマ株式会社制)等。

作为将木薯糟粕和/或甜菜废粕通过至少具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶分解之前的工序，可以进行用于提高酶的反应性的前处理。前处理的方法采用公知的生物质的前处理方法即可，可以列举出使用硫酸、乙酸等进行的酸处理，采用氢氧化钠、氨等进行的碱处理、水热处理、亚临界水处理、蒸煮处理等。这些处理方法既可以单独实施一种，也可以将多种处理方法组合实施。

[工序(2)：将所述糖化液从截留分子量150～1000的分离膜通过而过滤，从非透过侧分离除去半乳糖醛酸，从透过侧回收精制糖液的工序]

如果使工序(1)得到的糖化液从截留分子量150～1000的范围的分离膜通过而过滤，则能够从非透过侧分离除去半乳糖醛酸，从透过侧回收精制糖液。

由本发明的方法得到的糖化液中，除了半乳糖醛酸以外，还含有来自生物质的糖。作为能够通过截留分子量150～1000的范围的分离膜的过滤而与半乳糖醛酸分离开的糖，优选分子量比半乳糖醛酸的分子量194小的己糖、己酮糖和戊糖等的单糖。具体的可以列举出木糖：分子量150、核糖：分子量150、阿拉伯糖：分子量150、来苏糖：分子量150、葡萄糖：分子量180、甘露糖：分子量180、半乳糖：分子量180、果糖：分子量180等，在这些中优选含有葡萄糖和/或木糖。

上述己糖、己酮糖和戊糖与半乳糖醛酸结构类似，是与半乳糖醛酸分子量大小程度相同的物质，但如果使含有它们的糖化液从截留分子量150～1000的范围的分离膜通过而过滤，则能够从透过侧选择性得到己糖、己酮糖和戊糖，在非透过侧半乳糖醛酸被选择性浓缩。

关于从这样的分离膜透过的物质的透过率的差别，可以通过计算出对象物质的阻止率的值来评价。本发明中、对象物质的阻止率通过式(2)计算。在分离膜的处理面积大、交叉流过滤下的非透过侧从分离膜通过前与后的对象物质的浓度有差别的情况，「膜非透过侧的对象物质的浓度」是指从分离膜通过前和后的浓度的平均值。此外，阻止率，是为了与过滤浓度相比较，是与供给分离膜的重量基准的物质平衡不同的值。

对象物质的阻止率(％)＝100-(膜透过侧的对象物质的浓度/膜非透过侧的对象物质的浓度)×100 (式2)

本发明中，在将至少含有半乳糖醛酸的糖化液从截留分子量150～1000的范围的分离膜通过而过滤的情况，半乳糖醛酸的阻止率显示出高于糖化液中含有的糖的阻止率的值。也就是说如果在过滤的前后比较各糖的、膜的非透过侧的比例，则显示高阻止率的半乳糖醛酸的比例比过滤前的比例提高，显示低阻止率的各糖的比例比过滤前的比例降低。结果，随着过滤进行，能够从非透过侧得到半乳糖醛酸浓缩液。此外，可以从透过侧得到半乳糖醛酸含有率低的精制糖液。此外，如果使用截留分子量300～800的范围的分离膜，则能够从透过侧得到糖比例高的精制糖液，所以进而优选。

本发明中的半乳糖醛酸的优选阻止率为20％以上100％以下，进而优选40％以上100％以下、更优选50％以上100％以下、特优选为60％以上100％以下。

此外，单糖的阻止率优选是比半乳糖醛酸的阻止率低4％以上的值，进而优选是低10％以上的值，更优选是低20％以上的值。

本发明中的分离膜的截留分子量是指以溶质的分子量作为横轴、以阻止率作为纵轴，将数据绘图而得到截留分子量曲线，将曲线中溶质的阻止率为90％时对应的分子量作为膜的截留分子量。

本发明中的使用分离膜的过滤方法没有特殊限定，优选相对于膜面引起水平方向的流动的交叉流过滤。这是由于截留分子量150～1000的范围的分离膜，膜孔径极小，所以如果没有与膜面水平方向的流动，则会在膜面附着堆积物等，膜会很快堵塞的缘故。作为水平方向的流动、即膜面线速度的值优选为5cm/秒以上50cm/秒以下、进而优选为10cm/秒以上30cm/秒以下。

作为截留分子量150～1000的分离膜的原材料，可以使用乙酸纤维素系聚合物、聚酰胺、聚酯、聚酰亚胺、乙烯基聚合物等的高分子材料，并不限于由上述1种材料构成的膜，可以是含有多种膜材料的膜。

作为本发明中使用的分离膜的具体例有フィルムテック社制的NF270、Synder社制的NFX、NFW、NFG、XT、GEW&PT社制的DESALG系列GE(G-5)型、DK系列、DL系列、HL系列等。

关于通过截留分子量150～1000的分离膜进行过滤时所述糖化液的温度，只要是膜的耐热温度的范围即可，没有特殊限定，但优选调整到50℃以下的温度。此外，关于通过截留分子量150～1000的分离膜进行过滤时的所述糖化液的pH值，只要是分离膜和装置的范围就没有特殊限定，但优选为pH4～10、进而优选pH5～8。

作为工序(1)的后工序且工序(2)的前工序，可以使含有半乳糖醛酸的糖化液从截留分子量2000～100000的分离膜通过而过滤，将透过液供给工序(2)。此外，由于通过该过滤会减少从透过侧得到的糖化液中的固体量，所以能够减少对工序(2)中使用的分离膜的负荷。在这种情况，可以从非透过侧回收在工序(1)中用于调制糖化液的糖化酶。可以将回收得到的糖化酶再次利用，具体的可以被再用于反复进行工序(1)的情况、或者是连续进行工序(1)和(2)的情况。

截留分子量2,000～100,000的分离膜的优选截留分子量的范围，是截留分子量5,000～100,000的范围、进而优选截留分子量5,000～50,000的范围。

作为截留分子量2,000～100,000的分离膜的原材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等。但是在通过生物质的酶处理调制所述糖化液的情况，有时会在酶剂中含有与纤维素分解有关的酶群，由于再生纤维素、纤维素、纤维素酯会被分解，所以优选使用以PES、PVDF等的合成高分子作为原材料的分离膜。

作为本发明中使用的截留分子量2,000～100,000的分离膜的具体例，有GEW&PT社制DESAL品牌的M系列、P系列、G系列的GH(G-10)型、GK(G-20)型、GM(G-50)型、“DURATHERM”(注册商标)系列的HWSUF型、STD UF型、Synder社制的VT、MT、ST、SM、MK、MW、LY、BN、BY、旭化成株式会社制的“マイクローザ”(注册商标)UF系列、日东电工株式会社制的NTR-7410、NTR-7450等。

此外，可以在通过截留分子量2,000～100,000的分离膜进行过滤之前，使糖化液从精密过滤膜通过而过滤，来除去颗粒。精密过滤膜优选使用平均细孔径在0.01～10μm程度的分离膜。

此外，为了提高经截留分子量150～1000的分离膜纯化了的精制糖液的糖浓度，也可以再次浓缩。作为浓缩的方法，没有特殊限定，可以是膜浓缩，也可以是蒸发浓缩，还可以是这些的组合，但从经济性的观点优选膜浓缩。作为浓缩中使用的分离膜，只要是在非透过侧将单糖选择性浓缩，就没有特殊限定，优选截留分子量小于150的分离膜。从单糖损失的观点，进而优选截留分子量为100以下。

本发明中得到的糖液，单糖浓度高，此外，作为发酵阻碍物质的半乳糖醛酸的浓度降低了，所以能够很好地用作微生物的发酵用原料。在使用本发明中得到的精制糖液作为微生物的发酵用原料的情况，从发酵效率的观点优选在发酵用原料中含有葡萄糖2重量％以上，并且半乳糖醛酸的含量相对于葡萄糖为0.078以下的重量比率、更优选为0.055以下。此外，半乳糖醛酸的含量相对于发酵用原料优选为0.8重量％以下。

这里已经知道的是，在木薯糟粕中特别是含有大量淀粉，平均每单位重量的干燥木薯糟粕的约40～50重量％由淀粉构成。因此通过将淀粉分解，虽然在来源于木薯糟粕的糖液中含有大量微生物容易发酵的葡萄糖，但半乳糖醛酸的重量比率比葡萄糖的重量比率高，在将其作为发酵原料使用时，发酵受到阻碍、发酵速度降低。这里，如果使用本发明的方法，则即使是来源于木薯糟粕的糖液，也能够降低半乳糖醛酸的浓度，降低半乳糖醛酸相对于葡萄糖的重量比率，很好地作为发酵原料使用。

为了调制该比率的糖液。可以使用截留分子量150～1000的分离膜反复进行过滤，来降低半乳糖醛酸的含有比率。

可以使用得到的精制糖液作为发酵原料来制造化学品。通过本发明，能够除去来源于含有果胶的生物质的糖化液中含有的半乳糖醛酸，所以发酵微生物的生育阻碍得到解除，发酵速度提高。

在使用由本发明的方法得到的精制糖液作为发酵原料制造化学品时所利用的微生物可以列举出，面包酵母等酵母、大肠杆菌、棒状杆菌等细菌、丝状菌、放线菌等。微生物可以是从自然环境中分离出来的，此外，也可以是通过突然变异或转基因而改变了部分性质的。对于容易受到半乳糖醛酸导致的发酵阻碍的微生物没有特殊限定，可以列举出酵母、特别是属于酵母菌(Saccaromyces)属的酵母。

作为通过发酵得到的化学品，只要是微生物、培养细胞能够生产的物质就没有特殊限定。作为具体例，可以列举出醇、有机酸、氨基酸、核酸等发酵工业中大量生产的物质。例如、作为醇可以列举出乙醇、丁醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丙三醇等，作为有机酸可以列举出乙酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸等，作为氨基酸可以列举出赖氨酸、谷氨酸等，作为核酸可以列举出次黄苷酸、鸟苷酸、肌苷、鸟嘌呤核苷等。此外，还可以用于酶等的蛋白质、抗生素等物质的生产。因此，本发明可以用于制造这些各种化学品。

实施例

(参考例1)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖的分析方法

葡萄糖、木糖、阿拉伯糖各自的浓度，通过下述所示的HPLC条件，与标准品进行比较来定量。

柱：Shodex HILICpak VG-50 4E SH1011(昭和电工株式会社)

柱温：40℃

检测法：差示折射计检测器

检测器温度：40℃

流动相：水:乙腈＝25:75

流速：0.6mL/min

(参考例2)半乳糖醛酸的分析方法

半乳糖醛酸通过下述所示的HPLC条件，与标准品进行比较来定量。

柱：Shim-Pack SPR-H、Shim-Pack SCR-101H(株式会社岛津制作所)

柱温：45℃

检测法：后柱pH缓冲化电导率检测法

流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/min)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris(即双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷)、0.1mMEDTA·2Na

流速：0.8mL/min

检测方法：电导率

温度：45℃

(参考例3)以木薯糟粕作为原料进行的糖化液调制

向木薯糟粕(含水率11％)1.5kg中加入纯净水(RO水)6.5L、作为α-淀粉酶的热稳定型淀粉酶(シグマアルドリッチジャパン合同会社制)1g，混合后放入90℃高压釜中2小时。用6N硫酸(和光纯药株式会社制)调整pH到5.0后，加入作为葡萄糖淀粉酶的来自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶(Amyloglucosidase from Aspergillusniger)(シグマアルドリッチジャパン合同会社)1g、作为具有聚半乳糖醛酸分解活性的糖化酶的来自棘孢曲霉的果胶酶(シグマアルドリッチジャパン合同会社)，平均每1g木薯糟粕干燥重量加入1U，搅拌下50℃进行酶反应8小时而得到糖化液。将得到的糖化液固液分离后除去残渣，回收液体部分。将液体部分使用ザルトポア2(ザウトリウスジャパン株式会社制)进行精密过滤。接下来使用超滤膜SPE50(截留分子量50000、Synder filtration社制)，在操作温度35℃、膜面线速度20cm/sec的条件下一边控制操作压力使流通量固定在0.1m/Day一边进行过滤。膜处理后的pH是4.8。对从透过侧回收得到的木薯糟粕的糖化液的葡萄糖浓度和半乳糖醛酸浓度进行分析，将结果示于表1。

表1

(参考例4)乙醇的分析方法

用下述所示HPLC条件通过与标准样品进行比较来定量培养液中的乙醇。

柱：Shodex Sugar系列SH1011(昭和电工)

柱温：65℃

检测法：差示折射检测器

检测器温度：40℃

流动相：0.005M H₂SO₄

流速：0.6mL/min

(参考例5)通过添加了半乳糖醛酸的培养基进行的乙醇发酵试验

作为乙醇发酵微生物利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(OC-2株)。在5mL的YPD培养基中接种，30℃下培养16时间(前培养)。向表2所示组成的培养基中分别添加半乳糖醛酸0g/L(培养基1)、1g/L(培养基2)、2g/L(培养基3)、4g/L(培养基4)、8g/L(培养基5)、16g/L(培养基6)，将它们从过滤器(ステリカップ0.22μm、メルクミリポア)通过而过滤。量取培养基1～6各10mL到试管中，添加前培养液使浊度为0.5。30℃下进行培养，用参考例4的方法测定24小时后的乙醇浓度，算出乙醇的生产速度。结果如表3所示。

根据这些结果可以知道，如果培养基中的半乳糖醛酸浓度高，则所制造的乙醇浓度降低，乙醇的发酵速度也降低。尤其是含有半乳糖醛酸浓度8g/L以上的培养基，发酵速度显著降低。

表2

培养基成分	成分浓度(g/L)
		酵母提取物(Yeast extract)	10
细菌蛋白胨(bacto pepton)	20
		葡萄糖	140

表3

(比较例1)使用截留分子量65的膜进行的来源于木薯糟粕糖化液的膜分离

作为分离膜使用膜A：UTC-70(截留分子量65、东丽株式会社)，将用参考例3所述的方法调制出的2L糖化液过滤。膜分离装置使用“SEPA”(注册商标)CF-II(有效膜面积140cm²、GE W&PT)，设定操作温度为35℃、膜面线速度为20cm/sec，以过滤压3MPa的条件进行过滤处理直至非透过侧的液量达到0.5L。回收非透过液，用参考例1的方法得到葡萄糖浓度，用参考例2的方法得到半乳糖醛酸浓度，依照式(2)计算出半乳糖醛酸的阻止率，将结果示于表4。

(比较例2)使用截留分子量10000的膜进行的来源于木薯糟粕的糖化液的膜分离

作为分离膜使用膜F：“DURATHERM”(注册商标)HWS UF型(截留分子量10000、GEW&PT)，对用参考例3所述的方法调制出的2L糖化液进行过滤。膜分离装置使用“SEPA”(注册商标)CF-II(有效膜面积140cm²、GE W&PT)，在操作温度35℃、膜面线速度20cm/sec、过滤压0.1MPa的条件下进行过滤处理直至非透过侧的液量变为0.5L。回收非透过液，用参考例1的方法得到葡萄糖浓度，用参考例2的方法得到半乳糖醛酸浓度，依照式(2)计算出半乳糖醛酸的阻止率，将结果示于表4。

(实施例1)使用截留分子量150～1000的膜进行的来源于木薯糟粕的糖化液的膜分离

作为分离膜使用膜B：NFX(截留分子量150-300、Synder)、膜C：NFW(截留分子量300-500、Synder)、膜D：NFG(截留分子量600-800、Synder)、膜E：SPE1(截留分子量1000、Synder)，对用参考例3所述的方法调制出的2L糖化液进行过滤。膜分离装置使用“SEPA”(注册商标)CF-II(有效膜面积140cm²、GE W&PT)，在操作温度35℃、膜面线速度20cm/sec、过滤压0.5MPa的条件下进行过滤处理直至非透过侧的液量变为0.5L。回收非透过液，用参考例1的方法得到葡萄糖浓度，用参考例2的方法得到半乳糖醛酸浓度，依照式(2)计算半乳糖醛酸的阻止率，将结果示于表4。

由这些结果可以知道，用分离膜A即截留分子量小于150的分离膜对糖化液过滤的结果是，在透过液中几乎检测不到葡萄糖和半乳糖醛酸，不能将葡萄糖和半乳糖醛酸分离。此外，用分离膜F即截留分子量大于1000的分离膜对糖化液过滤的结果是，透过液中含有的葡萄糖和半乳糖醛酸的浓度与过滤前相比几乎没有变化，不能将葡萄糖和半乳糖醛酸分离开。

使用膜B、C、D、E即截留分子量150～1000的范围的分离膜进行过滤的结果是，从透过液侧回收得到的精制糖液中含有的葡萄糖的比例增加，半乳糖醛酸的比例降低。即、根据实施例1的结果可以知道，使用截留分子量150～1000的范围的分离膜进行过滤的情况，能够从非透过侧选择性除去半乳糖醛酸，从透过侧回收除去了半乳糖醛酸的精制糖液。此外可以知道，使用分离膜C、D即截留分子量300～800的范围的分离膜对糖化液过滤时，能够得到半乳糖醛酸被除去、且葡萄糖浓度高的精制糖液。

表4

(实施例2)来源于木薯糟粕精制糖液的浓缩

将实施例1中使用膜B、C或D得到的精制糖液1.5L分别用比较例1中使用的膜A过滤，进行精制糖液的浓缩直至非透过液的葡萄糖浓度变为120g/L左右。过滤操作以与比较例1同样的条件进行。回收非透过液，用参考例1的方法分析葡萄糖浓度，用参考例2的方法分析半乳糖醛酸浓度，将结果示于表5。

根据结果可以知道，通过本操作可以提高精制糖液中的糖浓度，容易作为发酵原料使用。

(比较例3)来源于木薯糟粕的精制糖液的浓缩

将实施例1中使用膜F得到的精制糖液1.5L用比较例1中使用的膜A过滤，进行精制糖液的浓缩直至非透过液的葡萄糖浓度为120g/L左右。过滤操作以与比较例1同样的条件进行。回收非透过液，用参考例1的方法分析葡萄糖浓度，用参考例2的方法分析半乳糖醛酸浓度，将结果示于表5。

表5

(实施例3)使用来源于木薯糟粕精制糖液的乙醇发酵

使用在实施例1中将参考例3的糖化液用分离膜B、C、D、E过滤而得到的4种精制糖液作为发酵原料，通过微生物的发酵来制造乙醇，对比乙醇的发酵速度。作为乙醇发酵微生物使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(OC-2株)。在5mL的YPD培养基中接种，在30℃培养16小时(前培养)。在试管中量取将上述4种精制糖液分别从过滤器(ステリカップ0.22μm、メルクミリポア)通过而过滤得到的液体各9mL，进而添加调整到20重量％的玉米浆(王子コーンスターチ株式会社)1mL并混合。向各试管中添加前培养液直至浊度为0.5。30℃下进行培养，用参考例4的方法测定7小时后、和12小时后的乙醇浓度。将乙醇的发酵速度的结果示于表6。

(比较例4)使用来源于木薯糟粕的精制糖液进行的乙醇发酵

除了使用参考例3中调制出的来源于木薯糟粕的糖化液以外，以与实施例3同样的条件·操作进行培养，用参考例4的方法测定7小时后、和12小时后的乙醇浓度。将乙醇的发酵速度的结果示于表6。

(比较例5)使用来源于木薯糟粕的精制糖液进行的乙醇发酵

除了使用比较例2中利用膜F得到的糖液以外，以与实施例3同样的条件·操作进行培养，用参考例4的方法测定7小时后、和12小时后的乙醇浓度。将乙醇的发酵速度的结果示于表6。

根据这些结果可以知道，由膜B处理得到的糖化液，与由膜C～F处理得到的糖化液相比，葡萄糖浓度低，12小时后的发酵速度与比较例相比几乎没有变化，但在7小时后的发酵速度中可以确认到比比较例的生产速度提高的效果。由此可知，实施例3的乙醇发酵速度的值高于比较例4或比较例5的乙醇发酵速度的值，通过从糖化液除去半乳糖醛酸，乙醇的生产速度提高。

表6

(实施例4)使用来源于木薯糟粕的精制糖液的浓缩液进行的乙醇发酵

除了使用实施例2中得到的精制木薯糟粕浓缩糖液以外，以与实施例3同样的条件·操作进行培养，用参考例4的方法测定23小时后的乙醇浓度。将乙醇的发酵速度的结果示于表7。

(比较例6)使用来源于木薯糟粕的精制糖液的浓缩液进行的乙醇发酵

除了使用比较例3中得到的精制木薯糟粕浓缩糖液以外，以与实施例3同样的条件·操作进行培养，用参考例4的方法测定23小时后的乙醇浓度。将乙醇的发酵速度的结果示于表7。

可以知道，实施例4的乙醇发酵速度的值高于比较例6的乙醇发酵速度的值，通过从糖化液除去半乳糖醛酸，乙醇的生产速度提高。

表7

(参考例6)以甜菜废粕作为原料进行的糖化液调制

向甜菜废粕(含水率10％)1.0kg中加入纯净水(RO水)7.0L、具有聚半乳糖醛酸分解活性且含有纤维素酶的作为糖化酶的支顶孢属(Acremonium)纤维素酶(MeijiSeikaファルマ株式会社制)，使平均每1g甜菜废粕干燥重量加入1U，搅拌下50℃进行酶反应23小时而得到糖化液。将得到的糖化液固液分离、除去残渣，回收液体部分。将液体部分使用ザルトポア2(ザウトリウスジャパン株式会社制)进行精密过滤。接下来使用超滤膜SPE50(截留分子量50000、Synderfiltration社制)在操作温度35℃、膜面线速度20cm/sec的条件下一边控制操作压力使流通量固定在0.1m/Day一边进行过滤。膜处理后的pH为4.5。对从透过侧回收得到的甜菜废粕糖化液的单糖浓度和半乳糖醛酸浓度进行分析，将结果示于表8。

表8

(比较例7)使用截留分子量65的膜进行的来源于甜菜废粕的糖化液的膜分离

作为分离膜使用膜A：UTC-70(截留分子量65、东丽株式会社)，将用参考例6所述的方法调制出的2L糖化液用与比较例1同样的方法进行过滤。回收非透过液，用参考例1的方法分析单糖浓度，用参考例2的方法分析半乳糖醛酸浓度，依照式(2)计算半乳糖醛酸的阻止率，将结果示于表9。

(比较例8)使用截留分子量10000的膜进行的来源于甜菜废粕的糖化液的膜分离

作为分离膜使用膜F：“DURATHERM”(注册商标)HWS UF型(截留分子量10000、GE W&PT)，用与比较例2同样的方法对用参考例6所述的方法调制出的2L糖化液进行过滤。回收非透过液，用参考例1的方法分析单糖浓度，用参考例2的方法分析半乳糖醛酸浓度，依照式(2)计算出半乳糖醛酸的阻止率，将结果示于表9。

(实施例5)使用截留分子量150～1000的膜进行的来源于甜菜废粕的糖化液的膜分离

作为分离膜使用膜B：NFX(截留分子量150-300、Synder)、膜C：NFW(截留分子量300-500、Synder)、膜D：NFG(截留分子量600-800、Synder)、膜E：SPE1(截留分子量1000、Synder)，将用参考例6所述的方法调制出的2L糖化液用与实施例1同样的方法进行过滤。回收非透过液，用参考例1的方法分析单糖浓度，用参考例2的方法分析半乳糖醛酸浓度，依照式(2)计算半乳糖醛酸的阻止率，将结果示于表9。

表9

由这些结果可以知道，与木薯糟粕糖化液同样，如果对来自甜菜废粕的糖化液使用截留分子量150～1000的范围的分离膜进行过滤，则可以得到半乳糖醛酸被除去、且单糖浓度高的精制糖液。

(参考例7)回收酶液的聚半乳糖醛酸分解活性测定

向1.5mL的管中添加10μL的1M乙酸缓冲液(pH5.2)、20μL的1％(w/v)聚半乳糖醛酸、60μL的超纯水，在50℃恒温5分钟。接下来，加入10μL的适当被稀释了的回收酶液，在50℃反应30分钟，然后添加100μL的二硝基水杨酸试剂，煮沸5分钟使还原糖显色，在冰水中骤冷。接下来，加入400μL的超纯水，测定535nm下的吸光度。另行准备535nm下的半乳糖醛酸标准液的标准线，根据该标准线求出半乳糖醛酸的生成量，计算出1分钟内生成相当于1μmol的D-半乳糖醛酸的还原糖时的酶量作为酶1单位(1U)。在测定的空白样中不加入酶液，与上述同样地进行处理直至添加二硝基水杨酸试剂，然后添加酶液进行还原糖的显色，使用显色了的。标准线使用在0～2.0g/L的范围的D-半乳糖醛酸标准液中加入二硝基水杨酸试剂，与上述同样显色了的。酶1单位(1U)是在上述反应条件下1分钟内生成相当于1μmol的D-半乳糖醛酸的还原糖时的酶量。

(实施例6)通过超滤膜进行的酶回收

从参考例3的超滤膜SPE50的非透过侧的液体中回收被超滤膜阻止了的酶。将其作为回收酶液用参考例7的方法测定平均每mL的回收酶液中的聚半乳糖醛酸分解活性(U)，将结果示于表10。根据本结果可以知道，通过作为半乳糖醛酸和单糖的膜分离前工序进行超滤膜过滤，能够将回收得到的酶再利用，降低酶成本。

表10

(实施例7)pH4-8的条件下的膜分离

作为分离膜使用膜C：NFW(截留分子量300-500、Synder)，用参考例3所述的方法对以pH4、5、6、7，8调制出的各2L的糖化液进行过滤。膜分离装置使用“SEPA”(注册商标)CF-II(有效膜面积140cm²、GE W&PT)，在操作温度为35℃、膜面线速度为20cm/sec、过滤压0.5MPa的条件下进行过滤处理直至非透过侧的液量为0.5L。回收非透过液，用参考例1的方法分析葡萄糖浓度，用参考例2的方法分析半乳糖醛酸浓度，依照式(2)计算半乳糖醛酸的阻止率，进而用参考例1的方法分析葡萄糖浓度，依照式(2)计算出葡萄糖的阻止率，求出半乳糖醛酸的阻止率7与葡萄糖的阻止率之差，将结果示于表11。

根据这些结果可以确认，能够将pH4～8的糖化液中的葡萄糖与半乳糖醛酸分离。此外，pH为5以上时，葡萄糖和半乳糖醛酸的阻止率之差大于10％，确认能够进一步提高分离性能。

表11

Claims

1.一种精制糖液的制造方法，以木薯糟粕和/或甜菜废粕作为原料，包含以下工序(1)和工序(2)，

2.如权利要求1所述的精制糖液的制造方法，所述糖化液中含有的半乳糖醛酸的浓度为8g/L以上.

3.如权利要求1或2所述的精制糖液的制造方法，所述糖化酶还含有纤维素酶和/或淀粉酶。

4.如权利要求1～3的任一项所述的精制糖液的制造方法，所述精制糖液含有葡萄糖和/或木糖。

5.如权利要求1～4的任一项所述的精制糖液的制造方法，所述分离膜的截留分子量为300～800。

6.如权利要求1～5的任一项所述的精制糖液的制造方法，作为所述工序(1)之后且所述工序(2)之前的工序，包含以下工序：

7.如权利要求1～6的任一项所述的精制糖液的制造方法，所述精制糖液中含有以所述精制糖液的重量作为基准为2重量％以上的葡萄糖、和相对于所述葡萄糖的重量的重量比率为0.078以下的半乳糖醛酸。

8.一种化学品的制造方法，含有通过权利要求1～7的任一项所述的方法得到精制糖液的工序、和以通过该工序得到的精制糖液作为发酵原料来制造化学品的工序。

9.一种微生物的发酵用原料，含有来源于木薯糟粕的糖液，并且含有以所述发酵用原料的重量作为基准为2重量％以上的葡萄糖、和相对于所述葡萄糖的重量的重量比率为0.078以下的半乳糖醛酸。