CN111909956A - 阻断或减弱水稻OsNAC092基因表达以提高水稻抗旱性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及提高水稻抗旱性的方法。本发明要解决的技术问题是提高水稻的抗旱性能。本发明要解决技术问题的技术方案是阻断或者减弱水稻中OsNAC092的表达，提高水稻抗旱性能。本发明方法可以提高水稻对干旱的耐受程度，降低干旱引起的减产损失，同时降低农业生产成本，具有重要的经济意义和应用前景。

Description

阻断或减弱水稻OsNAC092基因表达以提高水稻抗旱性的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及通过阻断或减弱水稻OsNAC092基因表达以提高水稻抗旱性的方法。

背景技术

干旱胁迫是植物常常面对的一类重要的非生物胁迫，它是植物生长发育和产量的重要限制因子。随着人类的经济发展和人口膨胀，水资源短缺现象日趋严重，这也直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。干旱是导致农作物产量降低的最大因素，因此，各国科学界都在努力探寻提高植物植物旱胁迫抗性(抗干旱)的方法。

转录因子对植物细胞周期的调控，各种代谢途径的平衡和对胁迫条件的应答等方面都具有重要作用。植物中存在大量的逆境胁迫应答相关的转录因子，如在水稻中，已经鉴定出56个家族共2408个转录因子，这些转录因子包括有MYB转录因子、WRKY转录因子、DREB(dehydration responsive element binding protein)类转录因子、NAC(NAM/ATAF/CUC首字母的缩写)类转录因子、bZIP(basic-domain leucine-zipper)转录因子、锌指蛋白转录因子和TIFY转录因子等。这些转录因子与特定的顺式作用元件结合调控水稻相关基因的表达，可能和水稻对逆境胁迫的反应相关。但是目前在水稻中明确解析与胁迫相关的具体功能的基因尚不多，和干旱相关的基因更是很少。

研究和利用基因功能的基础是得到基因的合适的突变体材料，传统获得突变体的主要途径为自发突变、物理化学诱变、T-DNA插入突变。这些传统的随机诱变过程引起的筛选研究预期的突变效果既费时又昂贵。近几年来，基因编辑技术成为一种新兴的创制突变体的方法。其主要是运用特异的核酸酶定向使目标基因产生DNA双链断裂(double-strandbreak，DSB)，断裂的DNA能够激活细胞内固有的非同源末端连接(Non-homologous-ending-joining，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)两种不同的修复机制对其进行修复，从而实现对基因组的定向编辑。CRISPR/Cas系统已经广泛运用于植物基因组编辑，目前运用CRISPR-Cas系统敲除水稻转录因子基因的报道也还很少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提高水稻的抗旱性能。

本发明解决技术问题的技术方案是提供一种改良水稻抗旱性的方法。该方法通过阻断或者减弱水稻中OsNAC092基因的表达，提高水稻抗旱性。

其中，上述方法中所述的阻断或者减弱水稻中OsNAC092基因的表达可通过敲除水稻OsNAC092基因或者干扰OsNAC092基因表达产物的作用进行。

其中，上述方法中所述的干扰OsNAC092基因表达产物作用的方法包括RNA干扰法、T-DNA插入或CRSPR-Cas法中的至少一种。

其中，上述方法中所述的敲除水稻基因组中的OsNAC092基因的方法包括采用基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种进行。

其中，上述方法中所述的基因组编辑法包括巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。

其中，当上述方法中使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的OsNAC092基因基因时，包括以下步骤：

a、设计针对水稻OsNAC092基因的向导RNA；

b、构建可表达该向导RNA的Cas基因编辑表达载体；

c、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；

d、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsNAC092基因定向编辑突变体种子，即得提高抗旱性的水稻突变体。

其中，上述方法中的用于敲除水稻基因组中的OsNAC092基因的CRISPR-Cas法包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas12b等方法中的至少一种。

进一步的，上述方法中所述的针对水稻OsNAC092基因的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1所示(5’-gaucgcccaauaagccggaa-3’)。该向导RNA用于CRISPR-Cas9基因编辑系统，其对应的基因组序列为5’-gatcgcccaataagccggaa-3’(Seq ID No.8)。

在此基础上，本发明提供了阻断或者减弱水稻中OsNAC092的表达的试剂在提高水稻抗旱性中的用途。

其中，上述用途中所述的阻断或者减弱水稻中OsNAC092的表达的试剂包括敲除水稻OsNAC092编码基因的试剂或者干扰OsNAC092基因表达产物的试剂中的至少一种。

其中，上述用途中所述的干扰OsNAC092表达产物作用的试剂包括使用RNA干扰法、T-DNA插入法、CRISPR-Cas9法或CRISPR-Cas12法中的至少一种以减弱OsNAC092表达产物作用所使用的试剂。

其中，上述用途中所述的RNA干扰法减弱OsNAC092表达产物作用使用的试剂包括针对OsNAC092表达产物的siRNA(小干扰RNA，Small interfering RNA)、T-DNA插入、用于CRISPR-Cas法的向导RNA。

其中，上述用途中所述的降低水稻OsNAC092表达的试剂包括敲除水稻基因组中的OsNAC092编码基因的试剂。

进一步的，上述用途中所述的敲除水稻基因组中的OsNAC092基因的试剂包括针对OsNAC092编码基因的用于巨大核酸酶(Meganuclease)法的巨大核酸酶，用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白，用于CRISPR-Cas法的向导RNA、用于同源重组法的重组DNA片段、或用于随机插入突变法的T-DNA(Transfer DNA，转移DNA)或转座子中至少一种。

进一步的，上述用途中所述的用于CRISPR-Cas9法的向导的核苷酸序列为Seq IDNo.1所示。

同时，本发明也提供了一种针对水稻OsNAC092基因的向导RNA。进一步的，该向导RNA的编码核苷酸序列为5’-gaucgcccaauaagccggaa-3’(Seq ID No.1)。该向导RNA用于CRISPR-Cas9基因编辑系统，其对应的基因组序列为gatcgcccaataagccggaa(Seq IDNo.8)。

同时，本发明提供了装载有上述向导RNA的载体。

进一步的，上述载体为用于CRISPR-Cas基因编辑技术的Cas编辑表达载体。优选的，所述的CRISPR-Cas基因编辑技术为CRISPR-Cas9技术。

本发明的有益效果在于：本发明针对通过针对水稻OsNAC092基因设计特定的sgRNA，构建了用于敲除水稻OsNAC092基因的CRISPR-Cas9基因编辑载体。在此基础上对水稻基因组进行了定向编辑，得到敲除OsNAC092基因的水稻材料。实验表明，本发明方法得到的敲除OsNAC092基因的水稻突变体材料具有到抗干旱能力。说明本发明方法可以提高水稻对干旱的耐受程度，降低干旱引起的减产损失，同时降低农业生产成本，具有重要的经济意义和应用前景。

附图说明

图1.OsNAC092基因定向敲除载体设计。A、外显子的sgRNA位点的设计；B、OsNAC092编辑载体(pZHY988-OsNAC092)T-DNA区域结构示意图。

图2.水稻再生苗转基因阳性鉴定。

图3.OsNAC092-sgRNA01T0代酶切检测图。M，Markers；WT，野生型。

图4.OsNAC092-sgRNA01 T0代中目标位点的Sanger测序结果分析。斜体字母为PAM，下划线为sgRNA位置。

图5.野生型和突变体萌发结果分析。A，MS培养基正常萌发情况；B，MS+150mmmol甘露醇模拟干旱处理下萌发情况。

图6.干旱胁迫处理后OsNAC092突变体表型图。A，干旱胁迫下OsNAC092 T1代突变株的表型；B，存活率统计。

具体实施方式

在本发明前期针对水稻转录因子相关的大量研究工作的基础上，通过基因组编辑技术，在水稻中敲除了编码转录因子NAC092的基因OsNAC092，结果出人意料地发现，得到了具有抗旱性的植株。基于上述的实验，说明了水稻的OsNAC092基因与水稻对干旱胁迫的抗性有密切的相关性，而阻断或者减弱水稻中OsNAC092的表达，能够有效地改良水稻的抗旱性。由此，本发明建立并公开了一种新的提高水稻抗旱性方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中OsNAC092基因的表达，以改良水稻抗旱性。

目前已经知晓，转录因子编码基因在表达过程中会先得到mRNA前体，随后mRNA前体被进一步加工形成成熟mRNA。成熟mRNA分子再进一步翻译成转录因子并发挥其生物学功能。显然，对于OsNAC092基因表达的整个过程中的任何一步施加影响，都可能降低OsNAC092表达产物的作用，改良水稻的抗旱性。而敲除水稻OsNAC092基因，或者干扰OsNAC092基因表达产物的作用，是本领域可用于阻断或者减弱水稻中OsNAC092基因的表达的两种主要方式。

本发明的一个实施方向是从影响OsNAC092基因的转录入手。目前最常用的方法就是从基因组中敲除掉OsNAC092基因，可以采用的技术手段有基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法等。

使用同源重组法时，可以设计特定的重组DNA片段，通过同源重组替换到基因组中，从而使水稻不表达OsNAC092基因。而随机插入突变法可以使用T-DNA(Transfer DNA，转移DNA)插入突变法或转座子插入突变法等方法，也可以达到类似的效果。

而近年来，本领域关注较多的是基因组编辑技术。而目前常用的用于基因敲除的基因组编辑技术有基因组巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN(锌指核酸酶)法、TALEN(Transcription activator-like effectors Nucleases)法以及CRISPR-Cas法。这些方法都可以用于敲除OsNAC092基因的水稻定向编辑突变体的创制，得到抗旱性显著提高的突变植株。

与此同时，本发明也提供了阻断或者减弱水稻中OsNAC092基因的表达的试剂在提高水稻抗旱性中的用途。

这些试剂一方面包括干扰OsNAC092基因表达产物并使其难以正常发挥功能的各类分子，包括且不限于针对OsNAC092基因表达产物设计的RNAi分子、用于CRISPR-Cas法的向导RNA分子。

另一方面则包括可以用于敲除水稻基因组中的OsNAC092基因的试剂。这些试剂包括且不限于针对OsNAC092基因的用于巨大核酸酶(Meganuclease)法的巨大核酸酶，用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白，用于CRISPR-Cas法的向导RNA分子、用于同源重组法的重组DNA片段、或用于随机插入突变法的T-DNA(Transfer DNA，转移DNA)分子或转座子分子。

而用于敲除编码基因的CRISPR-Cas法，目前有CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas12b等多种具体的技术体系，本领域技术人员在实施本发明时，能够容易地根据各项具体技术的要求进行对OsNAC092基因有针对性的编辑工作。

在本发明的一个实施例中，使用一种特别设计的针对水稻OsNAC092基因的向导RNA。其核苷酸序列为5’-gaucgcccaauaagccggaa-3’(SEQ ID No.1)，该向导RNA用于CRISPR-Cas9基因编辑系统对水稻OsNAC092基因进行了基因编辑。当然，本领域技术人员知晓，在CRISPR-Cas9基因编辑系统中，向导RNA分子又叫sgRNA。

在此基础上本发明也开发得到了能表达上述的sgRNA的表达载体。当然，此类sgRNA定向编辑表达载体的骨架载体有很多已报道的可以选择。而对于此条sgRNA来说，在本发明的一个实施例中，本发明选择了pZHY988载体作为骨架载体，取得了好的效果，得到了抗旱性显著改良的水稻OsNAC092基因定向编辑突变体材料。

具体而言，本发明中使用上述的Cas9定向编辑向导sgRNA，以制备敲除水稻OsNAC092基因定向编辑突变体材料，以提高改良抗旱性的方法包括以下主要步骤：

a、制备序列如Seq ID No.1的sgRNA的Cas9基因编辑表达载体；

b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas9基因编辑体系得到转化植株；

c、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsNAC092基因定向编辑突变体种子，即得水稻抗旱性显著改善的水稻OsNAC092基因定向编辑突变体。

其中，上述方法步骤b中所述的转化水稻使用农杆菌介导转化法。

具体而言，本发明技术方案中创制抗旱水稻OsNAC092突变体方法具体步骤如下：

(1)sgRNA靶位点的选择

水稻OsNAC092基因(Os06g0675600)位于基因组的第六号染色体28037569bp-28041881bp。根据CRISPR-Cas9系统对靶位点的识别和剪切规则设计靶位点。将靶位点设计于OsNAC092第二外显子中(第六号染色体28040431bp-28040451bp)。其sgRNA序列如SEQ IDNo.1所示，长度为20nt。PAM位点为AGG。根据sgRNA序列设计合成两条退火形成粘性末端的单链核苷酸序列OsNAC092-sgRNA1-F(其序列如SEQ ID No.2所示，GTGTGATCGCCCAATAAGCCGGAA)和OsNAC092-sgRNA1-R(其序列如SEQ ID No.3所示，AAACTTCCGGCTTATTGGGCGATC)。

(2)Cas9定向编辑表达载体构建

将OsNAC092-sgRNA1-F和OsNAC092-sgRNA1-R分别稀释10倍，各取10μL混合一起，98℃变性5min，自然冷却，退火产物稀释20倍。退火产物通过Golden gate的方式将OsNAC092-sgRNA01组装至载体pZHY988上，构建好的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR检测，获得了针对水稻OsNAC092的定向敲除载体pZHY988-OsNAC092，其主要表达单元如图1B所示。

(3)遗传转化和基因型鉴定

水稻OsNAC092基因定向敲除载体pZHY988-OsNAC092经农杆菌介导的水稻遗传转化、筛选、获得再生转化植株。提取水稻再生苗基因组DNA，用特异引物dcas9-R：(引物序列如SEQ ID No.4，GGGCTGATCCTAAGAAGAAGAGGAA)和dcas9-R(引物序列如SEQ ID No.5，CGCAGTAATGCCAACTTTGTAC)扩增目的片段检测转基因阳性。提取单株DNA进行阳性鉴定后。用设计的特异引物OsNAC092-F(引物序列如SEQ ID No.6，TTTCCTCCTCATACCCCCCCTAAC)和OsNAC092-R(引物序列如SEQ ID No.7，GGCATTCCAGTCGGTCTCCTTC)进行PCR，经PCR-RFLP和Sanger测序验证，获得OsNAC092定向敲除突变体。

(4)突变体干旱胁迫分析

对OsNAC092突变体进行干旱逆境胁迫，观察其与对照(WT)表型差异,验证实验结果。

以下通过具体实施例的描述来对本发明进行更进一步的说明。

实施例1水稻OsNAC092基因敲除载体CRISPR-Cas9的构建

(1)sgRNA设计

从数据库网站RAPDB(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)检索并下载水稻OsNAC092(Os06g0675600)序列基因序列，然后根据CRISPR-Cas9系统对靶位点的识别和剪切规则，在基因编码区进行设计sgRNA；然后利用CRISPR-P网站在线(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)对sgRNA的错配率和脱靶位点进行预测选择最优的sgRNA(SEQ ID No.1)(图1A)。根据本发明所用敲除载体pZHY988的酶切位点，在sgRNA5’端加上BsaI的酶切位点，设计合成两条退火形成粘性末端的单链核苷酸序列OsNAC092-sgRNA1-F(其序列如SEQ ID No.2所示)和OsNAC092-sgRNA1-R(其序列如SEQ ID No.3所示)，交由上海生工公司合成。骨架载体pZHY988具体结构和构建方式可参见中国专利文献CN106367435A。

(2)连接反应

将OsNAC092-sgRNA1-F和OsNAC092-sgRNA1-R单链核苷酸序列分别稀释10倍，各取10μL，98℃，变性5min，自然冷却，退火产物稀释20倍待用。退火产物通过Golden gate的方式将OsNAC092-sgRNA01组装至载体pZHY988上，Golden gate反应体系为：T4 DNA连接酶1μL，T4 DNA连接酶缓冲液(10x)2μL，pZHY988骨架载体质粒1μL(100ng/ul)，限制性内切酶BsaI1μL，sgRNA退火产物2μL，H2O13μL。Golden gate反应程序为：(37℃5min，16℃10min)10个循环，37℃15min，80℃10min。

(3)质粒转化大肠杆菌杆菌感受态

将大肠杆菌DH5α感受态置于冰上融化，加入上述20ul连接产物，混匀，冰浴30min。42℃热激1min，置于冰上冰浴2min。加入500μL LB液体培养基，37℃，200rpm震荡孵育45min。后12000rpm离心2min，弃去400μL上清，用移液枪轻轻吹打重悬菌体。全部菌液涂布于LB固体培养基(含有50mg/L Kan)，37℃正置培养1h后，倒置培养12～16h。

(4)菌落PCR

用灭菌牙签挑取LB平板上的单克隆，置于含50μL ddH₂O水中，取1uL此菌液作为模板进行PCR扩增。采用25uL体系，体系如下：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，OsNAC092-sgRNA1-F 0.5μL，ZY065-RB(SEQ ID No.9，ZY065-RB：

TTCTAATAAACGCTCTTTTCTCT)0.5μL，Taq DNA enzyme 0.2μL，Template 1μL，ddH₂O19.8μL。PCR程序为：94℃，2min→(94℃，30s→55℃，30s→72℃，30s)35个循环→72℃，5min→4℃，10min(Taq DNA enzyme，dNTP等购自天根生物公司)。PCR结束后，加入5μL6×溴酚蓝，在1％琼脂糖凝胶中，130V，30min电泳检测。

(5)质粒提取即测序验证

将菌落PCR验证正确的单克隆，将50μL菌液接种于含有50mg/LKan的LB中摇菌12-16h，提取质粒。质粒DNA的提取按照AXYGEN AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit说明书进行。提取的质粒送擎科生物科技有限公司进行测序验证。获得了针对水稻OsNAC092编码基因的定向编辑表达载体pZHY988-OsNAC092，其T-DNA区域结构示意图如图1B所示。

实施例2农杆菌介导的水稻遗传转化

农杆菌介导转化水稻参考文献Tang X,Lowder LG,Zhang T,Malzahn A,Zheng X,Voytas DF,Zhong Z,Chen Y,Ren Q,Li Q,Kirkland ER,Zhang Y,Qi Y.2017.A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression inplants.Nature Plants,3:17018)中公开的实验方法。

水稻的遗传转化步骤具体为：将水稻(日本晴)成熟种子去壳消毒；将消毒过的种子接种于含0.4％结冷胶的N-6-D固体培养基上面，32℃连续光照培养1～5天；培养的种子通过农杆菌介导的转化方法将质粒pZHY988-OsNAC092转入水稻当中，转化过的水稻种子在诱导选择培养基中连续32℃光照培养2周；增殖产生的愈伤组织转入RE-III培养基中；从愈伤组织产生的幼小植株转移到HF培养基中诱导根的产生。待获得的抗性再生苗长至15cm左右时，清水洗净根部培养基，移栽至营养土中，温室培养。

实施例3水稻OsmiR390突变体的分子鉴定

(1)水稻苗基因组DNA提取

水稻苗DNA提取采用CTAB法，具体操作步骤如下：

CTAB提取液于65℃水浴锅中预热。取单株叶片一片放入带钢珠的2mL的离心管中，放入液氮速冻，后震荡成粉末状。加入500μL预热的CTAB提取液，65℃水浴30～50min，期间充分混匀。加入500μL氯仿：异戊醇(24︰1)，充分颠倒混匀，4℃，10000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇沉淀，-20℃沉淀1h。室温，12000rpm离心10min，收集沉淀。去上清，75％乙醇漂洗，12000rpm离心2min。去掉上清，风干DNA。加入30μL ddH₂O溶解DNA，-20℃冰箱中保存待用。

(2)水稻苗转基因阳性检测

用特异引物dcas9-F(引物序列如SEQ ID No.4)和dcas9-R(引物序列如SEQ IDNo.5)扩增目的片段检测转基因阳性，扩增片段大小为684bp，PCR扩增体系及反应程序同前菌落PCR。结果表明所检测的再生植株均为阳性植株(如图2)。

(3)PCR-ALFP鉴定突变体基因型

将检测所得到的阳性植株用特异引物OsNAC092-F(引物序列如SEQ ID No.6)和OsNAC092-R(引物序列如SEQ ID No.7)进行PCR，扩增片段长度为924bp。PCR扩增体系及反应程序同前。OsNAC092-sgRNA1位点限制性内切酶为HpaII，其酶切体系如下10×FastDigest Green buffer 12.5μL，酶1μL，PCR产物10μL，ddH2O 12μL。酶切条件是37℃，4h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶，130V，30min进行电泳检测。

PCR-ALFP结果(图3)显示：10个T0单株再生苗中有9个植株的为抗性带，即突变体，1个为野生型。突变率为90％。

(4)敲除突变体测序验证

将PCR-ALFP鉴定为突变体中9个单株，OsNAC092-F(引物序列如SEQ ID No.6)和OsNAC092-R(引物序列如SEQ ID No.7)进行PCR扩增，PCR扩增体系及反应程序同前。PCR产物送交成都擎科生物公司测序。测序结果(图4)显示，这9株有5株为纯合突变(OsNAC092-sgRNA01-01，04，06，08，09)，其余4株为双等位点突变。

(5)敲除突变体非生物逆境胁迫分析

本发明前期的生物信息学分析结合qRT-PCR的结果表明水稻NAC转录因子OsNAC092可能会影响水稻生长发育和对于脱水调控的代谢通路比如干旱胁迫进行响应，因此对突变体对干旱胁迫的适应性进行了实验验证。

首先非转基因纯合突变体osnac092_1(A/A)，osnac092_2(-1/-1)及osnac092_3(T/T)在模拟干旱条件下(在MS培养基中添加甘露醇)萌发进行分析。结果发现：在未加甘露醇的情况下，野生型与osnac092突变体植株生长并没有很大的区别。但在添加甘露醇的情况下，突变体的萌发、生长情况(如苗高、根长等)明显比对照好。说明敲除OsNAC092增加了突变体在萌发期的抗旱性(图5)。

另外，对生长10周野生型和突变体植株进行干旱胁迫分析。结果显示：在干旱胁迫初期(0-7天)，所有株系生长并无太大差异。10天后，野生型表现出明显萎蔫，而osnac092突变体株系则能可以保持正常生长。第11天后，野生型开始严重萎蔫，而osnac092突变体株系受到的影响较小。干旱14天后，野生型植株的存活率为20％，突变体存活率超过70％(图6)。表明该OsNAC092突变体抗干旱胁迫明显强于野生型。

实验结果表明，根据本发明设计的sgRNA构建的水稻OsNAC092编码基因定向编辑表达载体，成功构建出水稻OsNAC092突变体。并进一步发现了水稻OsNAC092与干旱胁迫的对应又直接的关系。使用本发明方法，可以有效获得不含OsNAC092编码基因定向编辑突变体水稻植株，其抗旱性较野生型有明显提升。

序列表

<120> 阻断或减弱水稻OsNAC092基因表达以提高水稻抗旱性的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaucgcccaa uaagccggaa 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtgatcgc ccaataagcc ggaa 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacttccgg cttattgggc gatc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggctgatcc taagaagaag aggaa 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcagtaatg ccaactttgt ac 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttcctcctc ataccccccc taac 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcattccag tcggtctcct tc 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcgcccaa taagccggaa 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctaataaa cgctcttttc tct 23

Claims (12)

1.提高水稻抗旱性的方法，其特征在于：通过阻断或者减弱水稻中OsNAC092基因的表达，以提高水稻抗旱性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的阻断或者减弱水稻中OsNAC092基因的表达通过敲除水稻OsNAC092基因或者干扰OsNAC092基因表达产物的作用进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的干扰OsNAC092基因表达产物作用的方法包括RNA干扰法、T-DNA插入或CRISPR-Cas法中的至少一种。所述的敲除水稻基因组中的OsNAC092编码基因的方法为基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种进行；优选的，所述的基因组编辑法包括巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：当使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的OsNAC092基因时，包括以下步骤：

a、设计针对水稻OsNAC092基因的向导RNA；

b、构建可表达该向导RNA的Cas编辑表达载体；

c、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；

d、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsNAC092基因定向编辑突变体种子，即得提高抗旱性的水稻突变体；

优选的，所述的CRISPR-Cas法包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas12b中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤a中所述的针对水稻OsNAC092基因的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

6.阻断或者减弱水稻中OsNAC092的表达的试剂在提高水稻抗旱性中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述阻断或者减弱水稻中OsNAC092的表达的试剂包括敲除水稻OsNAC092编码基因的试剂或者干扰OsNAC092基因表达产物的试剂中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的干扰OsNAC092基因表达产物的试剂包括使用RNA干扰法、反义RNA法、CRISPR-Cas法、靶基因类似物法或短串联靶标类似物法中的至少一种所使用的试剂；优选的，所述干扰OsNAC092表达产物作用的试剂包括针对OsNAC092表达产物的siRNA、针对OsNAC092表达产物的反义RNA、靶基因类似物、短串联靶标类似物、用于CRISPR-Cas法以编辑OsNAC092表达产物的向导RNA中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的敲除水稻基因组中的OsNAC092基因的试剂包括针对OsNAC092基因的用于巨大核酸酶法的巨大核酸酶、用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白、用于CRISPR-Cas法编辑OsNAC092编码基因的向导RNA、用于同源重组法的重组DNA片段、用于随机插入突变法的T-DNA或转座子中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：用于CRISPR-Cas9法的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

11.针对水稻OsNAC092基因的向导RNA；优选的，所述的向导RNA的编码核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

12.装载有权利要求10或11所述的向导RNA的载体；优选的，所述的载体为用于CRISPR-Cas基因编辑技术的Cas编辑表达载体；更优选的，所述CRISPR-Cas基因编辑技术为CRISPR-Cas9技术。

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