CN111888279B - 一种促进胶原蛋白生产的方法以及相应的药物或化妆品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进胶原蛋白生产的方法以及相应的药物或化妆品。本发明针对皮肤成纤维细胞进行研究时通过多肽库筛选得到能够特异性增强胶原蛋白表达的多肽，该多肽能够增强C0L1A1基因以及Col2al基因的表达来增强胶原蛋白的表达以及透明质酸的分泌的合成，所说多肽在小鼠模型中通过验证证明了其具有较好的增强胶原蛋白合成以及抗皱的功能，同时增强了皮肤的保湿功能，具有较好的应用前景。

Description

一种促进胶原蛋白生产的方法以及相应的药物或化妆品

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种促进胶原蛋白生产的方法以及相应的药物或化妆品。

背景技术

胶原蛋白是一类细胞外基质蛋白，是结缔组织的主要蛋白成分，在维护各种组织的结构完整性方面，具有重要作用。胶原蛋白具有独特的结构，组织分布特异性强，与一些器官的功能直接相关，也关系到衰老过程。由于胶原蛋白良好的生物相容性和广泛的生理功能，独特的纤维状结构及其良好的生物相容性和低抗原性使其成为高档化妆品、功能性保健品和生物医学材料领域的热门研究课题。胶原蛋白能有效地改善皮肤表皮和真皮结构,促进皮肤内胶原的合成。

胶原蛋白应用于化妆品中主要涉及了胶原蛋白的5种特性。(1)营养性。可以补充皮肤层所需的养分,补充17种对人体有益的氨基酸,使皮肤中的胶原蛋白活性增加,保持角质层水分以及纤维结构的完整性,改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢,增强循环,达到滋润皮肤、延缓衰老、美容、消皱、养发的目的。(2)修复性。胶原蛋白具有独特的修复功能,胶原蛋白和周围组织的亲和性好,从而具有修复组织的功能。(3)保湿性。天然保湿因子是保持皮肤水分的重要物质,其主要成分是甘氨酸、羟脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸和丝氨酸等游离的氨基酸。在水解胶原蛋白产品中,甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸和丝氨酸的含量都比较丰富,其质量分数分别达到20％～23％、10％～12％、4％和3％左右。另外,胶原分子外侧亲水基团羧基和羟基等的大量存在,使胶原分子极易与水形成氢键,所以胶原蛋白及多肽具有良好的保水、保湿性能。在相对湿度70％时,胶原及其水解产物仍可保持其自身质量45％的水分,化妆品中添加的胶原蛋白达到一定量时,即能供给皮肤所需的全面水分。(4)配伍性。胶原蛋白可以起到调节并稳定pH、稳定泡沫、乳化胶体的作用,同时,作为一种功能性成分在化妆品中可以减轻各种表面活性剂、酸、碱等刺激性物质对毛发、皮肤的损害。(5)亲和性。胶原蛋白对皮肤和头发表面的蛋白质分子有较大的亲和力,胶原蛋白主要通过物理吸附与皮肤和头发结合,耐漂洗处理。亲和作用大小随相对分子质量增大而增强,相对分子质量较大的分子,结合位置较多,结合力增强,亲和力增大。这些分子可以渗入皮肤表皮和头发,甚至皮质层,达到营养皮肤的作用。

目前，胶原蛋白的制备方法主要包括酸法，氧化法，酶法，混合法等多种途径。当然也有改进的其他方法。CN108066272A中公开了一种具有促进胶原蛋白合成的蜂王浆提取物及其提取方法与它的用途。该提取方法包括浸提、溶解与调节pH等步骤。该蜂王浆提取物在皮肤中吸收利用度高，能直达真皮层，激活胶原蛋白合成。在护肤品等应用中，具有添加方便、用量少、效果明显的优势。但是该方法对于原料的要求较高，成本也较高，并不适宜于大规模推广使用。CN105213230A公开了一种基于不可见光和酶抑制物来促进胶原蛋白再生的方法，包括如下步骤：用温水清洗眼睛周围的皮肤，擦干后均匀涂抹一层抗皱精华液；调整眼罩内部的护眼膜，然后带上眼罩，开启眼罩并选择护理时间；该眼罩内由252个660纳米波长的发光二极管组成，以特定的程序和特定的强度发出总能量输出低于每平方厘米10毫瓦的不可见光；按下5分钟、10分钟、20分钟的任一键后，对应的蓝灯亮起进入倒计时工作状态；计时完毕，关闭眼罩，停止工作。本发明将不可见光、酶抑制剂和胶原蛋白再生小分子进行了完美的结合，促进了胶原蛋白的再生，短时间内可以大幅度消减眼袋、明显减轻眼部皱纹、明显改善黑眼圈，且可长期使用。但是该方法需要特殊的仪器，使用起来并不方便。

本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种适宜大规模推广使用的促进胶原蛋白增多的方法。

发明内容

本发明以方面提供一种能够促进皮肤细胞高产胶原蛋白的肽，JYDB-5多肽其序列如SEQ ID NO：1所示。

更具体地，本发明的肽用于增强通过人皮肤的成纤维细胞的C0L1A1基因以及Col2al基因的表达来增强胶原蛋白的表达以及透明质酸的分泌的合成。

更进一步的，本发明提供一种增强胶原蛋白分泌的化妆品，所述化妆品中含有JYDB-5多肽，其序列为SEQ ID NO：1所示。

更进一步的，本发明提供一种增强胶原蛋白分泌的药物组合物，所述组合物中含有JYDB-5多肽，其序列为SEQ ID NO：1所示。

为了提高对降解的抗性，使用保护形式的本发明肽是必需的。通过用酰基型的R₁基团(R-CO-)取代(其中R基团是饱和或不饱和的C₁到C₃₀烃基链)、优选甲基型的R₁基团或者通过用苯甲酰基、甲苯磺酰基或卞氧羰基型的芳基取代可以保护N-末端氨基酸的伯胺官能。

可以在N-末端或C-末端或在两个末端对序列SEQ ID NO：1所示的本发明的肽进行保护。

可以通过典型化学合成(以固相或液体均相)或通过从组成氨基酸的酶促合成获得本发明的的肽。

本发明的肽可以是天然或合成来源的。优选地，根据本发明，肽是合成来源的，通过化学合成获得。

根据本发明，活性物质可以是肽与本领域已知的其他的混合物。

本发明的肽有利地溶解于一种或多种生理学合适的溶剂中，如水，甘油，乙醇，丙二醇，丁二醇，二丙撑二醇，乙氧基化或丙氧基化二甘醇，环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。

本发明提供的化妆品进一步的以非限制性方式，引用下面的组分类别是可能的：再生、抗衰老、抗皱、滋润、抗自由基、抗糖化、水合、抗菌、抗真菌、角质层分离、肌肉放松、剥落和紧致剂。

更进一步的，所有这些组合物另外包括通常用于规定应用领域的任何添加剂，以及它们配制所需的助剂，如助溶剂(乙醇，甘油，苯甲醇，湿润剂......)，增稠剂，稀释剂，乳化剂，抗氧化剂，着色剂，防晒霜，色素，填料，防腐剂，香料，气味吸附剂，精油，微量元素，必需脂肪酸，表面活性剂，成膜聚合物，化学或矿物过滤物，水合剂或热水等等。

附图说明

图1 JYDB-5多肽对人正常成纤维细胞透明质酸分泌的影响

图2 JYDB-5多肽对C0L1A1基因和Col2al基因的表达结果

有益效果

本发明针对皮肤成纤维细胞进行研究时通过多肽库筛选得到能够特异性增强胶原蛋白表达的多肽，该多肽能够增强C0L1A1基因以及Col2al基因的表达来增强胶原蛋白的表达以及透明质酸的分泌的合成，所说多肽在小鼠模型中通过验证证明了其具有较好的增强胶原蛋白合成以及抗皱的功能，同时增强了皮肤的保湿功能，具有较好的应用前景。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

实施例1多肽对人正常成纤维细胞增殖的影响

将人皮肤成纤维细胞于MEM培养基(含5％胎牛血清)存5％CO₂，湿度95％，恒温37℃的二氧化碳培养箱中培养。取96孔板，按每孔1×103个播种细胞。待细胞附着后，各组中分别加入1、10、100μg/mLJYDB-5多肽溶液10μL，以加入相同体积PBS缓冲液作为空白对照组。在添加多肽溶液后培养细胞72h，从培养箱中取出96孔板，向各孔中加入WST-8溶液10μL，重新放回CO₂培养箱中孵育，进行显色反应。4h后取出，在450nm下测定OD值。结果如表1所示。

表1多肽对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

组别	OD
		空白组(PBS)	0.281±0.031
JYDB-5(1μg/mL)	0.723±0.045*
		JYDB-5(10μg/mL)	0.889±0.052*
JYDB-5(100μg/mL)	0.816±0.044*

与空白对照组比较，*表示有极显著差异p<0.01。

结果如表l所示，人皮肤成纤维细胞的增殖活性明显强于空白对照组，说明多肽对体外培养人皮肤成纤维细胞的增殖活性具有较强的促进作用。

实施例2 JYDB-5多肽对人正常成纤维细胞透明质酸分泌的影响

取96孔板，按每孔1×10³个播种细胞，每3d换液一次。待细胞附着后，各组中分别加入100μg/mL溶液10μL，以加入相同体积PBS缓冲液作为空白对照组。培养7d后，按试剂盒说明书测定透明质酸分泌量。结果如图1所示。

结果见图1所示，多肽组透明质酸分泌量达到162.8±5.5，明显高于空白组，具有著性差异(P<0.05)，说明多肽对体外培养人皮肤成纤维细胞透明质酸的分泌有显著的影响。

实施例3多肽对胶原蛋白基因表达的影响

取96孔板，按每孔1×10³个播种细胞，每3d换液一次。待细胞附着后，各组中分别加入100μg/mL溶液10μL，以加入相同体积PBS缓冲液作为空白对照组。培养7d后，利用Trizol试剂，提取总RNA。加入20％(v/v)氯仿溶液后涡旋30S，并室温静置10min，静置后4℃离心分离(12000r/min，10min)。吸取上层水相(400～500μL)转移至新离心管中，并加人等量异丙醇。轻轻混匀后4℃静置10min，并再次4℃离心分离(12000r/min，10min)。75％(v/v)乙醇和25％(v/v)无核酶水混合液冲洗沉积物，冲洗两次，再次同等条件离心，提取总RNA，并加入无核酶水20μL溶解总RNA提取物。按照Easy Script One-Step g DNA Removal andcDNA synthesisSuper Mix试剂盒说明操作，逆转录合成cDNA。逆转录体系条件：94℃下30S；60℃下10s；70℃下15S进行。RT-PCR依照quantitative RT-PCR with a Green PCRMaster Mix试剂盒说明操作进行。每种cDNA相应的特异性引物在表1列出。荧光定量RT-PCR引物包括β-actin、C0L1A1、Co12al。β-actin作为内参引物。cDNA样品PCR条件为94℃10s；94℃30s；60℃20S；72℃10S，总共40个循环。所有荧光定量RT-PCR进行于PCR系统7900(ABI)。利用

法分析实验结果。具体引物为β-actin-F：ACTCTTCCAGCCTTCCTTCCT，β-actin-R：TCACCTTCACCGTTCCAGTTT；Col2al(collagen，type II alpha 1-F)：CTCAAGTCGCTGAACAACCA；Col2al(collagen，type II alpha 1-R)：GTCTCCGCTCTTCCACTCTG。C0L1A1 F:ACAGAGGCATAAAGGGTCA，C0L1A1R:CAAGGTCACGGTCACGAA。结果如图2所示，JYDB-5多肽能够显著的促进C0L1A1基因的表达，稍弱的促进Col2al基因的表达。

实施例4 JYDB-5多肽对小鼠皮肤胶原蛋白合成的影响

取健康雄性小鼠50只，随机分为正常组、模型组、多肽给药组(125mg/kg)；正常组和模型组给予等体积的CMC-Na；给药同时模型组和各给药组皮下注射5％D-半乳糖0.25mL/10g；正常组皮下注射等体积的生理盐水；连续6周，最后1d灌胃和注射D-半乳糖2h后，处死，取小鼠背部皮肤，8％硫化钠脱毛，用脱脂液(氯仿：乙醇＝2：1)脱脂24h，取出清洗后真空干燥，取少量放入试管中，各样品加入6mol/L盐酸水解，采用分光光度法测定羟脯氨酸(HYP)含量，由于羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特有氨基酸，本领域常以羟脯氨酸的含量换算胶原蛋白的含量。小鼠皮肤中的胶原蛋白含量结果如表2所示。

表2 JYDB-5多肽对小鼠皮肤中胶原蛋白合成的影响

组别	皮肤中胶原蛋白含量(％)
		正常对照组(PBS)	63.8±4.4
模型组(PBS)	57.9±3.9#
		JYDB-5多肽多肽组	71.3±4.3*

#表示模型组与对照组相比差异极显著，P<0.01；*表示多肽组与模型组相比差异显著，P<0.05。

由表2可知，模型组与正常组比较具有极显著差异，说明D-半乳糖所致小鼠皮肤衰老模型表现明的胶原蛋白流失。多肽给药组与模型组相比，具有著差异，说明多肽能有效缓解应衰老所致的皮肤胶原流失，促进真皮中胶原蛋白的合成。

实施例5减轻光老化模型小鼠皮肤皱纹的效应

将小鼠分为1个实验组、1个阳性对照组、1个模型组，每组10只，对于实验组，在小鼠皮肤上涂抹多肽，给药剂量按照125mg/kg制备成为水溶液，阳性对照组施用同样量的乙醇水溶液(乙醇和水的体积比为5︰95)，空白组和模型组仅施用不含活性成分的蒸馏水。实验规程具体如下，采用模拟日光照射脱毛小鼠，照射剂量为2MED(造成皮肤发红的最小剂量的2倍)，每周照射5天共照射10周，照射的同时，每天将各活性成分或溶剂施用于皮肤之上，检查皱纹产生的抑制程度。利用裸眼目视检查施用化合物的区域并对该区域照相。将抑制皱纹产生的程度分为4级，即无效(分值0)、轻微(分值1)、中等(分值2)和强效(分值3)，将化合物处理组和模型组进行比较。实验数据列表于表3。

表3减轻光老化小鼠皮肤皱纹的效应

从表3的结果可以看出，与模型组相比，本发明的多肽活性成分具有明显减轻皱纹的作用。

实施例6皮肤含水量的改善

取30位30多岁和30位40多岁的女性被分为两组，每组20人，以市售的保湿水作为对比例，将所述多肽按照10mg/mL的量加入到保湿水中作为实验组，要求她们每天早晚两次在脸上施用所述制剂，持续12周。然后，使用皮肤水分测定仪(Germany)测定皮肤含水量。结果在表4中给出。

表4皮肤水分测定结果

分组	0周	12周
			对比例	20±3	22±4
实验组	21±5	34±5

从表4的结果可以看出，本发明的多肽可以显著提高皮肤的含水率，具有较好的效果。

实施例7安全性评价结果

通过实施例6的人体试用试验来观察样品对人体皮肤安全性，受试者回访时，仔细询问、检查并记录受试者在使用样品期间所发生的任何不良事件，包括不良事件的表现、发生时间、处理措施及转归，并对不良事件与所使用样品的关系做出判断。结果显示，60名受试者进行12周人体试用试验研究，未见任何皮肤不良反应，参考2015年版《化妆品安全技术规范》中规定的人体试用试验皮肤不良反应分级标准，评定实验组和对照组测试样品具有良好的安全性。

序列表

<110> 北京瀚梅生物科技有限公司

<120> 一种促进胶原蛋白生产的方法以及相应的药物或化妆品

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Trp Phe Val Ala Met Ser Val Gln Tyr Glu Arg Ser Arg Cys Trp

1 5 10 15

Trp Asp Met Ile Phe Tyr Trp Ala Arg Arg

20 25

Claims (7)

1.一种增强皮肤胶原蛋白分泌的化妆品，所述化妆品中含有JYDB-5多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种增强皮肤胶原蛋白分泌的组合物，所述组合物中含有JYDB-5多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

3.氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的JYDB-5多肽在制备增强皮肤胶原蛋白分泌的化妆品中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述多肽用于增强通过人皮肤的成纤维细胞的C0L1A1基因以及Col2al基因的表达来增强胶原蛋白的合成以及透明质酸的分泌。

5.如权利要求3或4任一项所述的用途，其特征在于：在N-末端或C-末端或在两个末端对SEQ ID NO：1所示的多肽进行保护。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述多肽有利地溶解于一种或多种生理学合适的溶剂中。

7.一种能够促进皮肤细胞高产胶原蛋白的JYDB-5多肽，其特征在于氨基酸序列为SEQID NO：1所示。

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