CN111876351A

CN111876351A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用

Info

Publication number: CN111876351A
Application number: CN202010714630.0A
Authority: CN
Inventors: 尹承苗; 闫助冰; 毛志泉; 陈学森; 沈向; 胡艳丽
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: CN111876351B

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用，该菌株已于2020年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为：CGMCC NO.20057。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌XC1是一种极具开发潜力的新型生防菌，其对尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌均具有较强的抑制效果，其中对尖孢镰孢菌的抑制率最高，达到79.83％。该菌株还能高产蛋白酶、纤维素酶等拮抗酶；降低土壤中根皮苷、根皮素、阿魏酸、肉桂酸等酚酸类物质含量；促进苹果树植株生长；在减轻苹果树连作障碍方面具有优异的效果，为苹果连作障碍的生物防治提供了理论依据。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用。

背景技术

随着品种更新换代和种植面积的增加，我国有大规模的老果园需更新改造，老果园更新时面临的连作障碍现象非常普遍。王功帅(2018)和王晓宝等(2018)研究表明，镰孢菌属有害真菌是造成环渤海湾和西北黄土高原地区苹果连作障碍发生的主要病原菌；徐文凤(2011)和刘志(2013)分别从环渤海湾苹果产区的老龄苹果园土壤中分离到大量的尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、串珠镰孢菌(F.moniliforme)、腐皮镰孢菌(F.solani)和层出镰孢菌(F.proliferatum)，并验证其对平邑甜茶幼苗具有强致病性，王功帅(2018)通过接种试验发现这四种镰孢菌对平邑甜茶具有强烈的致病性，接种后都出现了生长停滞，叶片黄化、脱落的现象，接种病原菌2个月后死亡率超过50％以上。因此，我们认为这四种镰孢菌是引起苹果连作障碍的致病菌。连作障碍会导致苹果果实产量和品质下降、病虫害加重、树势衰弱甚至死亡，对果农造成严重的经济损失。因此，研究出一种高效、环保的防控措施来减轻苹果连作障碍具有非常重要的意义。

生物防治是利用有益微生物抑制土壤中病原菌的一种安全、环保、经济效益高且长效的防治措施，已成为当今研究的一大热点。杜淑涛等(2010)发现，贝莱斯芽孢杆菌对白菜黑斑病致病菌芸薹链格孢有较高拮抗活性，田间试验病指防效达到79.07％。Liu等(2017)报道，B.velezensis LS69对胡萝卜软腐病果胶杆菌和梨火疫病菌有着强烈的抑菌效果。同时，某些植物根际促生菌可降解土壤自毒物质，酚酸类物质是导致苹果连作障碍的主要自毒物质，接种有益微生物分解连作土壤中的酚酸类物质，有利于农业的可持续发展，是一项经济有效的生防措施。祁国振等(2016)从根际土中分离出降解苹果自毒物质的降解菌，有利于改善连作苹果园土壤环境，钱娜等(2019)筛选分离出苯甲酸降解菌，并研究其降解特性，为利用降解菌缓解花生连作障碍提供资源保障和科学依据。然而，目前少有芽孢杆菌在防治苹果连作障碍方面的研究。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，从连作苹果园健康果树根际土中分离得到一株贝莱斯芽孢杆菌XC1，该菌株对尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌均具有拮抗作用，能够高产蛋白酶和纤维素酶，对土壤中的酚酸类物质具有优异的降解效果，可以促进苹果植株生长和减轻苹果连作障碍。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1，该菌株已于2020年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.20057。

所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1分离自连作苹果园健康果树根际土壤，具有如下特征：

在LB培养基上培养24h后，菌落乳白色，不透明，形状最初为圆形，边缘整齐，继而边缘开始褶皱不整齐，向四周呈云雾状扩散，菌落中间有凸起，挑开菌落后有粘液状分泌物。在LB液体培养基中静止培养后有菌膜形成，好氧。菌体呈杆状，有芽孢，革兰氏染色阳性。

本发明的第二方面，提供贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液。

所述发酵液具体可为如下方法制备的发酵液：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)XC1接种到LB液体培养基中，37℃，180r·min^-1摇床发酵培养48h。

所述菌悬液具体可为如下方法制备的菌悬液：将发酵液离心后，菌体沉淀用无菌水重悬，获得菌悬液。

所述上清液具体可为如下方法制备的上清液：将发酵液离心后，取上清，过滤，获得上清液。

本发明的第三方面，提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在如下(1)-(4)至少一项中的应用：

(1)抑制植物病原菌；

(2)制备用于抑制植物病原菌的产品；

(3)防治由植物病原菌所致病害；

(4)制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品。

优选的，所述植物病原菌为尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌。

本发明的第四方面，提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在生产蛋白酶和/或纤维素酶中的应用。

本发明的第五方面，提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在降低土壤中酚酸类物质含量中的应用。

优选的，所述酚酸类物质为根皮苷、根皮素、阿魏酸和肉桂酸。

本发明的第六方面，提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在促进果树生长中的应用。

本发明的第七方面，提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在如下(1)或(2)任一项中的应用：

(1)减轻苹果树连作障碍；

(2)制备减轻苹果树连作障碍的生防制剂。

上述应用中，所述生防制剂是以贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液为活性成分。生防制剂的剂型为可湿性粉剂、水分散剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。

作为优选，生防制剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂中的一种或多种。本发明对于所述农药学上可接受的辅料的来源没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

本发明的第八方面，提供一种减轻苹果树连作障碍的方法，包括如下步骤：

将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezens is)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液施于苹果树植株的根际土壤。

本发明的有益效果：

本发明首次从连作苹果园健康果树根际土中分离得到一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1，该菌株是一种极具开发潜力的新型生防菌，其对尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌均具有较强的抑制效果，其中对尖孢镰孢菌的抑制率最高，达到79.83％。该菌株还能高产蛋白酶、纤维素酶等拮抗酶；降低土壤中根皮苷、根皮素、阿魏酸、肉桂酸等酚酸类物质含量；促进苹果树植株生长；在减轻苹果树连作障碍方面具有优异的效果，为苹果连作障碍的生物防治提供了理论依据。

附图说明

图1：XC1菌落(A)及革兰氏染色形态(B)。

图2：XC1菌株16S rDNA序列的系统发育树(A)以及gyrA基因的系统发育树(B)。

图3：XC1菌株与4种镰孢菌的对峙试验(PDA培养基)；图中，A:层出镰孢菌Fusariumproliferatum；B:串珠镰孢菌Fusarium moniliforme；C:尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum；D:腐皮镰孢菌Fusarium solani.

图4：XC1菌株产拮抗酶活性；图中，A.产蛋白酶Protease production；B.产纤维素酶Cellulase production。

图5：XC1菌株对根皮苷的降解情况；图中，A为XC1菌株在根皮苷筛选培养基上的生长情况；B为XC1菌株对根皮苷的降解率。

图6：不同处理对平邑甜茶幼苗生长的影响；图中，CK1表示连作对照；XC1表示菌株XC1处理。

图7：不同处理对尖孢镰孢菌基因拷贝数的影响；菌株XC1处理后的尖孢镰孢菌的基因拷贝数比连作对照降低了76.3％，这说明XC1的抑菌效果明显，在土壤中对病原菌也有很好的抑制效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，连作障碍会导致苹果果实产量和品质下降、病虫害加重、树势衰弱甚至死亡，对果农造成严重的经济损失。目前关于芽孢杆菌在防治苹果连作障碍方面的研究还很少见有报道。

基于此，本发明从连作苹果园健康果树根际土中分离得到一株细菌XC1，根据形态学、生理生化特征检测和基于16S rDNA、gyrA基因的系统发育分析，鉴定该菌为贝莱斯芽孢杆菌。与现有报道的贝莱斯芽孢杆菌不同的是，本发明筛选分离的贝莱斯芽孢杆菌XC1是一种极具开发潜力的新型生防菌，其集抑菌、产拮抗酶、降解连作土壤中的酚酸类物质、促进果树生长、减轻苹果树连作障碍等多种功效于一体。本发明采用滤纸片法研究其对尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰孢菌的抑制效果，芽孢杆菌XC1对四种镰孢菌均表现出较强的抑制作用，其中对尖孢镰孢菌的抑制率最高，达到79.83％。且XC1产蛋白酶、纤维素酶等拮抗酶。摇瓶培养7天后，贝莱斯芽孢杆菌XC1对根皮苷的降解率达51.55％。盆栽试验结果表明菌株XC1处理后平邑甜茶幼苗的株高、地径、鲜重、干重分别比连作对照提高了39.25％、43.75％、148.88％、151.82％；与连作对照处理相比，XC1菌肥显著促进了连作平邑甜茶幼苗根系生长，其根长、根表面积、根体积、根尖数分别增加了192.93％、326.34％、497.60％、120.58％；与连作对照相比，溴甲烷熏蒸处理和菌肥载体处理对土壤中酚酸类物质含量变化的影响不大，XC1菌肥处理则显著降低了土壤中酚酸类物质的含量，其中根皮苷、根皮素、阿魏酸、肉桂酸分别降低了62.6％、64.9％、69.8％、77.9％；土壤中四种镰孢菌的基因拷贝数量均显著性下降。综上，贝莱斯芽孢杆菌XC1可以显著促进平邑甜茶幼苗生长，降低土壤中酚酸类物质的含量，并显著抑制土壤中四种镰孢菌的生长，说明XC1菌株在减轻连作障碍方面具有良好效果。目前菌株XC1已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.20057。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

酵母膏蛋白胨琼脂培养基LB：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH 7。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，pH 7。

改良PDA培养基：马铃薯200.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。

无机盐液体培养基：NH₄Cl 0.5g，NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.3g，MgSO₄ 0.4g，蒸馏水1000mL。

根皮苷筛选培养基(2mmol/L)：向1L无机盐液体培养基中加入0.96g根皮苷和20g琼脂，液体根皮苷筛选培养基不加琼脂。

需氧性测定培养基、葡萄糖氧化发酵培养基、淀粉水解培养基、硝酸盐还原培养基、V-P培养基、M.R.培养基，均按《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英编著)的方法配制。

脱脂奶粉培养基：脱脂奶粉10g，琼脂20g，1 000mL水，pH自然。

纤维素酶检测培养基：蛋白胨10g，酵母粉10g，梭甲基纤维素钠10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 1g，琼脂20g，1 000mL水，pH 7.0。

实施例1：菌株的分离和鉴定

1.菌株的分离纯化：

采用改良的稀释涂布平板法分离根际细菌，从烟台市西城镇(XC)、湾头村(WT)及凤毛寨(FM)3个连作苹果园根际土壤中取新鲜土样过直径3～4mm的筛子，去除土壤中的杂质。称取5g根际土壤，加入盛有45mL无菌水的三角瓶中(带玻璃珠)，180rpm振荡30min，静置5min后，用无菌水系列稀释至1×10^-4，将梯度稀释的上清液取100μL涂布于LB平板上，重复三次，于28℃恒温培养箱中倒置培养。待平板内长出单菌落后，挑取不同形态的单菌落于新的LB平板上划线纯化。同时，将纯化的菌株接种于液体LB培养基中，在28℃下以180rpm恒定振荡12h，4℃下以10000r离心10min后倒掉上清液加入15％的甘油，-80℃储存。

2.菌株的筛选：

菌株的初筛采用平板对峙法，将从土壤中分离的菌株与活化后的病原菌在PDA平板上进行对峙试验。用直径5mm打孔器在病原菌边缘打取菌块，接种到PDA平板中央，在距离病原菌菌块2cm处的3个对接点接种土壤中分离的菌株，另一个点不接菌株作为空白对照，每个处理重复3次，28℃培养，7d后选出有抑菌圈的菌株，进行复筛。复筛得到一株对4种病原菌抑菌率最高的拮抗细菌，命名为XC1。

通过稀释涂布平板法，从烟台市西城镇(XC)、湾头村(WT)及凤毛寨(FM)3个连作苹果园根际土壤中检测到146株细菌，分离纯化后进行平板对峙实验，其中37株细菌对镰孢菌具有抑制作用，在其周围形成抑菌圈，复筛后最终确定抑菌率最高的细菌XC1为供试拮抗菌株(图1A)。

3.菌株的鉴定：

(1)形态学及生理生化鉴定：

将分离获得的XC1菌株在LB培养基上28℃培养24h，待出现单菌落，观察菌落形态特征。采用结晶紫进行革兰氏染色，并利用尼康荧光显微镜BX-51观察细菌的形态和大小，扫描电子显微镜样品制备过程参见林英等的方法。生理生化特性分析按照《伯杰氏细菌鉴定手册(第二版)》和《常用细菌系统鉴定手册》的方法进行鉴定，每项指标检测3次，试验重复2次。

如图1所示，XC1菌株在LB培养基上培养24h后，单菌落菌落乳白色，不透明，形状最初为圆形，边缘整齐，继而边缘开始褶皱不整齐，向四周呈云雾状扩散，菌落中间有凸起，挑开菌落后有粘液状分泌物(图1A)；在LB液体培养基中静止培养后有菌膜形成，好氧。荧光显微镜100×/1.30油镜下观察，细孢呈短杆状，革兰氏染色呈阳性(图1B)。

对XC1菌株进行10项生理生化指标检测，结果如表1所示。

表1：XC1菌株的生理生化特征

注：“+”代表阳性反应或可利用；“－”代表阴性反应.

结果表明：V-P试验、淀粉水解试验、接触酶试验、硝酸盐还原、动力学试验、明胶液化试验为阳性；吲哚测定、甲基红试验、H₂S试验为阴性；可利用葡萄糖。根据XC1菌株以上生理生化结果，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步推测XC1菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus spp.)

(2)16S rDNA片段的扩增、序列分析及系统发育分析：

将XC1菌株接种于液体LB培养基中，在28℃下以200r/min的速度振荡培养12h，采用细菌基因组提取试剂盒抽提菌株全基因组DNA。用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行扩增，采用特异性引物gyrA-F(5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’)gyrA-R(5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’)扩增gyrA保守基因序列。50μL PCR反应体系为：总DNA含量3μL，引物各1μL，d NTP 1μL，10×PCR buffer 5μL，Taq DNA聚合酶0.6μL，ddH₂O 38.4μL。PCR反应条件为：预变性94℃，4min；变性94℃，1.5min；退火55℃，1min；延伸72℃，1.5min；共30个循环，总延伸72℃，10min。扩增产物送往上海生工生物工程技术有限公司进行测序，测序结果通过国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸数据库进行BLAST比对，用MEGA 5软件，采用邻接法N-J聚类分析对分离的拮抗菌进行序列分析并构建系统发育树，自展值(bootstrapvalue)1000次重复检验。

XC1菌株16S rDNA基因序列长度为1454bp，GenBank登录号为MT672576，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。经NCBI Blast进行同源性比对并用MEGA5.0建立系统发育树，结果如图2A所示。从图中可以看出XC1的16S rDNA序列XC1的16S rDNA序列与暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)聚在一起，不能完全区分，初步将XC1归为解淀粉芽孢杆菌操作组(图2A)。XC1菌株gyrA基因序列长度为950bp，GenBank登录号为MT683381，其gyrA序列如SEQ IDNO.2所示，系统发育树如图2B所示，XC1的gyrA序列与贝莱斯芽孢杆菌SCGB 574(CP023431.1)的gyrA基因聚为一支，同源性为93％(图2B)。结合以上分析表明XC1菌株为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis。

基于上述对XC1菌株的形态学及生理生化鉴定和16S rDNA序列同源性分析结果，将分离得到的XC1菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

菌株编号：XC1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020.6.10

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.20057。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的功能鉴定

1.抑菌效果：

采用滤纸片法评估XC1的抑菌效果，将XC1菌株接种于LB液体培养基中，37℃，180r·min^-1摇床培养24h，用直径5mm打孔器在病原菌边缘打取菌块，接种到PDA平板中央，在距离病原菌菌块2cm处的4个对接点放上无菌滤纸片并注入10μL XC1菌液，预扩散2h后28℃培养，以不接菌液的病原菌为对照，随时观察，待对照长满板后用游标卡尺采用十字交叉法测量真菌菌落直径，以直径表示抑菌率的大小。重复上述操作3次。

抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌直径)/对照菌落直径]×100％

对峙试验结果表明，XC1菌株对4种病原镰孢菌菌丝的生长有极强的抑制作用(图3，表2)。其中对尖孢镰孢菌的抑制率较高，在改良PDA培养基上抑制率达到79.83％；对腐皮、层出和串珠镰孢菌的抑制作用次之，在改良PDA培养基上抑制率分别达到68.20％，72.95％和70.53％。

表2：XC1菌株对4种镰孢菌的抑制率

2.产拮抗酶：

将菌株XC1点接到脱脂奶粉培养基，每处理重复四次，28℃恒温培养5d，观察有无透明圈产生；将XC1点接到纤维素酶检测培养基，每处理重复四次，28℃恒温培养5d后向平板中加入适量1mg·mL^-1刚果红溶液，染色1h，弃去染液，加入适量1mol·L^-1NaCl溶液洗涤1h，观察有无透明圈产生。

培养5天后，XC1在脱脂奶粉培养基和纤维素酶检测培养基上形成透明圈(图4)，表明XC1能分泌蛋白酶和纤维素酶，如表3，培养5天后，菌株蛋白酶水解圈直径大于40mm，纤维素酶水解圈大于25mm，XC1有较强的产酶活性。

表3：拮抗菌XC1产酶活性

3.降解根皮苷：

将XC1接种到以根皮苷为唯一碳源的根皮苷筛选培养基上，37℃倒置培养，观察发现XC1可在根皮苷筛选培养基上生长，证明XC1菌株可以根皮苷为碳源，有降解根皮苷的能力(图5A)。将XC1接种到以根皮苷为唯一碳源的基础无机盐培养基中，37℃，180r·min^-1摇床培养，并定期取滤去菌体的培养液，使用紫外分光光度计在根皮苷最大吸收波长325nm处测吸光度，发现7天后XC1对高浓度根皮苷(2mmol/L)的降解率达51.55％(图5B)。降解率＝(未接菌培养液吸光度-接菌培养液吸光度)/未接菌培养液吸光度×100％。

实施例3：盆栽试验

1.试验设计：

盆栽试验于2019年3-10月在山东农业大学南校区国家苹果工程实验中心及苹果重茬与微生物实验室进行，盆栽试验供试植株为平邑甜茶(Malus hupeheusis Rehd.)实生苗，将平邑甜茶种子于4℃层积30d左右，种子露白后播种于装有育苗基质的培养钵中进行育苗。待幼苗长至6片真叶时选取长势一致、无病虫害植株，于5月1日移栽至装有6.5kg不同处理土壤的泥瓦盆中(上直径25cm、下直径为17cm、高18cm)，9月中旬取样，测定相关实验指标。

盆栽试验用土取自山东省泰安市满庄滩清湾32年生老苹果园，自距树干80.00cm，深5.00～40.00cm的区域，多点随机取土，混匀。土壤类型为砂土，有机质含量为13.97g/kg，速效氮35.76mg/kg，速效钾116.64mg/kg，速效磷20.42mg/kg，土壤pH为5.059。

盆栽试验所用XC1菌肥，由中国德州创迪微生物资源有限公司负责制作，制作方法为：将XC1菌株的发酵液按10％的接种量(即每100g菌肥载体接种10mL XC1发酵液)接种到菌肥载体基质(牛粪：秸秆＝1：3，重量比)中，37℃发酵一周。

所制备的XC1菌肥为黑灰色粉末状固体，活菌数为2.10×10⁹cfu/g。

试验共设置4个处理，分别为：连作土壤(CK1)，溴甲烷熏蒸的连作土壤(CK2)，菌肥载体处理(CK3)，XC1菌肥处理(T)，每处理20盆，每盆定植2棵幼苗，统一肥水管理。T处理组的菌肥施用量和CK3处理组的菌肥载体的使用量均为土壤质量的1％，栽植前将连作土与菌肥充分混匀。

菌肥载体具体为牛粪和秸秆的混合物(牛粪：秸秆＝1：3)，由中国德州创迪微生物资源有限公司提供。

2.测定指标：

用卷尺、游标卡尺和电子秤分别测定幼苗株高、地径和干鲜重。

用专业版Win RHIZO(2007年版)根系分析系统分析处理样品图像，记录根系总长度、根系表面积、根体积和根尖数。

取0.5g过筛的新鲜土壤，按

土壤DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA，采用CFX96TMThermal Cycler(Bio-Rad)对土壤中尖孢镰孢菌的基因拷贝数进行实时荧光定量分析，验证XC1菌株在土壤中对尖孢镰孢菌抑制效果，特异性引物及反应步骤参考李家家的方法(李家家，相立，潘凤兵，陈学森，沈向，尹承苗，毛志泉.2016.平邑甜茶幼苗与葱混作对苹果连作土壤环境的影响.园艺学报，43(10)：1853-1862.)。

3.XC1菌株对平邑甜茶幼苗的促进生长作用：

由表4可以看出，与老果园土壤处理(CK1)相比，XC1菌肥处理(T)显著促进了连作平邑甜茶幼苗的株高、地径、鲜重、干重，分别增加了39.25％、43.75％、148.88％、151.82％，且XC1菌肥处理后连作平邑甜茶幼苗的株高、地径、鲜重、干重，分别是菌肥载体处理(CK3)的1.29倍、1.43倍、1.78倍、1.93倍。可见，XC1菌肥处理可显著促进平邑甜茶幼苗的生长。

表4：XC1菌肥对平邑甜茶幼苗生物量的影响

注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著(Duncan’s检测)。

4.XC1菌肥处理对平邑甜茶幼苗根系形态的影响

由表5可以看出，XC1菌肥处理(T)促进了平邑甜茶幼苗根系生长，显著高于连作对照(CK1)和菌肥载体处理(CK2)。与连作对照(CK1)相比，XC1菌肥处理的根长、根表面积、根体积、根尖数分别增加了192.93％、326.34％、497.60％、120.58％。可见，XC1菌肥处理可显著促进平邑甜茶幼苗根系的生长(图6)。

表5：XC1菌肥处理对平邑甜茶幼苗根系生长的影响

5.土壤中XC1菌株对镰孢菌的抑制效果：

通过实时荧光定量PCR技术对土壤中的尖孢镰孢菌进行测定(图7)，可以看出，4个处理中连作对照(CK1)的尖孢镰孢菌基因拷贝数最高，与菌肥载体处理(CK3)未达到显著性差异，溴甲烷熏蒸(CK2)和XC1菌肥处理(T)分别比对照降低了83.3％、76.3％，均与对照差异显著。可见，菌株XC1在土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果。

6.XC1菌肥处理对土壤酚酸含量的影响：

如表6，溴甲烷熏蒸处理(CK2)和菌肥载体处理(CK3)与连作对照(CK1)的土壤酚酸类物质含量相差不大，说明溴甲烷熏蒸处理和菌肥载体处理对土壤中酚酸类物质含量的影响不明显；与连作对照(CK1)相比，XC1菌肥处理(CK3)的根皮苷、根皮素、阿魏酸、肉桂酸含量分别降低了58.33％、64.29％、42.67％、50.00％，XC1菌肥处理可显著降低土壤中酚酸类物质含量。

表6：不同质地连作土壤对土壤酚酸类物质的影响

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用

<130> 2020

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> XC1菌株

<400> 1

tgtggggcgt gcctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1260

tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc cagccgccga 1440

aggtgaaccc agat 1454

<210> 2

<211> 950

<212> DNA

<213> XC1菌株

<400> 2

tgagcgttat cgtatcccgg gcgcttccgg atgtgcgtga cggtctgaag ccggttcaca 60

gacggatttt gtacgcaatg aatgatttag gcatgaccag tgacaaacca tataaaaaat 120

ctgcccgtat cgtcggtgaa gttatcggta agtaccaccc gcacggtgac tcagcggttt 180

acgaatcaat ggtcagaatg gcgcaggatt ttaactaccg ctacatgctt gttgacggac 240

acggcaactt cggttcggtt gacggcgact cagcggccgc gatgcgttac acagaagcga 300

gaatgtcaaa aatcgcaatg gaaattctgc gtgacattac gaaagacacg attgactatc 360

aagataacta tgacggttca gaaagagagc ctgccgtcat gccttcgaga tttccgaatc 420

tgctcgtaaa cggggctgcc ggtattgcgg tcggaatggc gacaaacatt cctccccatc 480

agcttggaga agtcattgaa ggcgtgcttg ccgtaagtga gaatcctgag attacaaacc 540

aggagctgat ggaatacatc ccgggcccgg attttccgac tgctggtcag attttgggcc 600

ggagcggcat ccgcaaggca tatgaatccg gacggggatc aatcacaatc cgggctaagg 660

ctgaaatcga agagacatca tcaggaaaag aaagaattat tgttacggaa cttccttatc 720

aggtgaacaa agcgagatta attgaaaaaa tcgcagatct tgtccgggac aaaaaaatcg 780

aaggaattac cgacctgcga gacgaatccg accgtaacgg aatgagaatc gtcattgaga 840

tccgccgtga cgccaatgct cacgtcattt tgaataacct gtacaaacaa acggccctgc 900

agacgtcttt cggaatcaac ctgctggcgc tcgtgacgga cagccgaagt 950

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caaggtaatg ctccaggcat tgct 24

Claims

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1，其生物保藏号为：CGMCCNO.20057。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在如下(1)-(4)至少一项中的应用：

(1)抑制植物病原菌；

(2)制备用于抑制植物病原菌的产品；

(3)防治由植物病原菌所致病害；

(4)制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌为尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌。

5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在生产蛋白酶和/或纤维素酶中的应用。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在降低土壤中酚酸类物质含量中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酚酸类物质为根皮苷、根皮素、阿魏酸和/或肉桂酸。

8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在促进果树生长中的应用。

9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液在如下(1)或(2)任一项中的应用：

(1)减轻苹果树连作障碍；

(2)制备减轻苹果树连作障碍的生防制剂。

10.一种减轻苹果树连作障碍的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1或者权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XC1的发酵液、菌悬液和/或上清液施于苹果树植株的根际土壤。