CN111855861B - 伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及伴随蛋白/肽，包括保守序列肽、保守序列蛋白、短序列肽和短序列蛋白中的一种或多种，保守序列肽为极亲水性多肽或极疏水性多肽，保守序列蛋白是多个保守序列肽连接而成的蛋白，短序列肽的氨基酸个数为Q，Q大于等于1且小于4，短序列蛋白为多个短序列肽连接而成蛋白。本发明还提供了伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率中的应用。本发明的伴随蛋白/肽可以减少蛋白质组实验中各步骤的样本的损失，同时液质联用质谱信号的采集数据不受到伴随蛋白/肽的影响；此外，本发明的伴随蛋白/肽可以兼容目前所有的蛋白质组实验方法和应用，从而有效提高了蛋白质组实验效率。

Description

伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率中的应用

技术领域

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率中的应用。

背景技术

蛋白质组学是以蛋白质为基本研究对象，用系统生物学的方法，研究生物体的细胞、组织的组成和变化规律的科学。经过二十来年的发展，基于质谱的蛋白质组学已经大规模地应用于生物研究领域，并开始进入临床研究领域。由于临床样本的珍贵性，以及生物研究的特殊需求，少量(痕量)样本的蛋白质组学研究如单细胞蛋白组学等等，在成为研究热点的同时，也面临较大的技术挑战。

基于质谱的蛋白质组实验方法中最常用的是自下而上的(bottom-up)蛋白质组学，其实验方法中涉及多步样本的前处理，来提取用于分析的多肽。当样本量偏少时，不仅蛋白的提取难度增大，各步骤的损失也变得显著，因此往往难以获得足够质量的多肽用于分析。目前，大多数样本制备方法是根据减小反应体积、减少转移步骤的思路来尽可能地降低损失，如Jeroen Krijgsveld将蛋白富集在磁珠表面、进行蛋白质各项反应的SP3方法(Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology，Molecular System Biology，2014，10:757)；浙江大学方群教授研究团队等通过微流控系统处理皮升级别的试剂，在液滴内提取蛋白质的方法(Nanoliter-Scale Oil-Air-DropletChip-Based Single Cell Proteomic Analysis，Analytical Chemistry，2018，90，8，5430–5438)；Nikolai Slavov通过兼容和优化自动化样本制备系统，结合使用多肽体外标记(tandem mass tag)技术(SCoPE-MS:mass spectrometry of single mammalian cellsquantifies proteome heterogeneity during cell differentiation，Genome Biology，2018，19，161)，通过减少人工操作步骤来降低干扰，减轻损失。但是，这些方法依然存在技术变量多、仪器设备需求门槛高、依赖操作者经验等问题，不适用于大多数实验室进行相关的课题研究以及多元化的生物应用。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率中的应用，目的是为了解决现有改善蛋白质组实验里难以获得足够质量的多肽用于分析的方法中，依然存在技术变量多、仪器设备需求门槛高、依赖操作者经验等问题，不适用于大多数实验室进行相关的课题研究以及多元化的生物应用的技术问题。

本发明提供的伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽中的应用，具体技术方案如下：

提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽，包括保守序列肽、保守序列蛋白、短序列肽和短序列蛋白中的一种或多种，所述保守序列肽为极亲水性多肽或极疏水性多肽，所述保守序列蛋白是多个保守序列肽连接而成的蛋白，所述短序列肽的氨基酸个数为Q，所述Q大于等于1且小于4，所述短序列蛋白为多个短序列肽连接而成蛋白。

在某些实施方式中，所述保守序列肽的结构为(A)x(B)y(C)z···(α)β，其中A，B，C，···，α表示为任一种氨基酸，且A，B，C，···，α的亲疏水性质相同亲，所述x，y，z，···，β表示个数，所述x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数。

在某些实施方式中，所述保守序列蛋白的结构为<seq1>(γ)x<seq2>(γ)y···<seqN>(γ)β，其中<seq1>，<seq2>，···，<seqN>表示任一个保守序列肽，γ为任一个作为酶解位点的氨基酸，x，y，z，···，β表示个数，x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数，所述x，y，z，···，β的总和大于等于2。

在某些实施方式中，所述短序列肽的结构为(δ)w(ε)x(θ)y(λ)z，其中，δ，ε，θ，λ表示任一种氨基酸，w，x，y，z表示个数，w，x，y，z均为任一个大于等于0的整数，所述w，x，y，z相加的总和为Q。

在某些实施方式中，短序列蛋白的结构为<SEPⅠ>(γ)x<SEPⅡ>(γ)y···<SEPm>(γ)β，其中<SEPⅠ>，SEPⅡ>，···，<SEPm>表示任一个短序列肽，γ为任一个作为酶解位点的氨基酸，x，y，z，···，β表示个数，x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数，所述x，y，z，···，β的总和大于等于2。

在某些实施方式中，包括如下步骤：

S1，设计和合成伴随蛋白/肽；

S2，获取目标样本，将步骤S1中的伴随蛋白/肽与目标样本进行混合，获得样本混合物；

S3，将步骤S2中的样本混合物进行蛋白提纯处理，获得待测蛋白；

S4，对步骤S3中的待测蛋白联用液相质谱进行分析。

本发明具有以下有益效果：1、伴随蛋白/肽可以减少蛋白质组实验中各步骤的损失。伴随蛋白/肽在样本制备时混入，在液相色谱上样后才被分离，反应体系实际上一直是伴随蛋白/肽和样本的混合物。因此，吸附和转移过程中造成的样本损失被大部分地分配到伴随蛋白/肽中去，这尤其适用于对于少量样本的蛋白质组实验，减少了样本损失的风险、降低了操作难度。

2、伴随蛋白/肽不影响液质联用质谱信号的采集。由于伴随蛋白/肽难以在实验中的液相色谱上保留，不会进入质谱、或者不在质谱信号的采集范围内，因此不会掺入到采集结果中，质谱结果即是拟分析的样本结果，因此不需要对数据做进一步处理，可靠性强。

3、伴随蛋白/肽可以兼容目前所有的蛋白质组方法和应用。无论是实验体系(微流控体系、胶内反应体系等)还是技术方法(多肽体外标记、离子交换色谱等)都可以引入伴随蛋白/肽。由于伴随蛋白/肽一方面在不改变操作流程的同时减少了样本的损失，另一方面不会影响质谱结果，所以对提高样本回收率和增强反应效率有很大帮助，方法适用性广、易接受。

附图说明

图1是本发明伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的应用流程图；

图2是本发明保守序列肽\保守序列蛋白形态示意图；

图3是本发明保守序列肽\保守序列蛋白的色谱峰图；

图4是本发明保守序列肽\保守序列蛋白的质谱峰图；

图5是本发明短序列肽\短序列蛋白形态示意图；

图6是本发明短序列肽\短序列蛋白的色谱峰图；

图7是本本发明短序列肽\短序列蛋白的质谱峰图；

图8是实施例1中利用伴随蛋白/肽进行提高蛋白质组实验效率的测试的质谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1-8，对本发明进一步详细说明。

本发明提供的提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽，具体技术方案如下：

提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽，包括保守序列肽、保守序列蛋白、短序列肽和短序列蛋白中的一种或多种，保守序列肽为极亲水性多肽或极疏水性多肽，保守序列蛋白是多个保守序列肽连接而成的蛋白，短序列肽的氨基酸个数为Q，Q大于等于1且小于4，短序列蛋白为多个短序列肽连接而成蛋白。

其中，保守序列肽的结构为(A)x(B)y(C)z···(α)β，其中A，B，C，···，α表示为任一种氨基酸，且A，B，C，···，α的亲疏水性质相同亲，x，y，z，···，β表示个数，x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数。

保守序列蛋白的结构为<seq1>(γ)x<seq2>(γ)y···<seqN>(γ)β，其中<seq1>，<seq2>，···，<seqN>表示任一个保守序列肽，γ为赖氨酸、精氨酸或者其他任一个作为酶解位点的氨基酸，x，y，z，···，β表示个数，x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数，x，y，z，···，β的总和大于等于2。

短序列肽的结构为(δ)w(ε)x(θ)y(λ)z，其中，δ，ε，θ，λ表示任一种氨基酸，w，x，y，z表示个数，w，x，y，z均为任一个大于等于0的整数，w，x，y，z相加的总和为Q。

短序列蛋白的结构为<SEPⅠ>(γ)x<SEPⅡ>(γ)y···<SEPm>(γ)β，其中<SEPⅠ>，SEPⅡ>，···，<SEPm>表示任一个短序列肽，γ为赖氨酸、精氨酸或者其他任一个作为酶解位点的氨基酸，x，y，z，···，β表示个数，x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数，x，y，z，···，β的总和大于等于2。

本发明还提供了伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的应用，将上述的伴随蛋白/肽与目标蛋白样品进行混合，对混合物进行串联质谱分析，如图1所示，包括如下步骤：

S1，设计和合成伴随蛋白/肽：

依据实验体系和目的进行设计。如图2-4所示，保守序列肽即人工合成的、序列已知的多肽，如：对于大多数在溶液内进行反应、在液相质谱检测时使用反相亲和液相色谱(reverse phase liquid chromatography，RPLC)进行多肽分离的体系，可设计极亲水性多肽(如PPPPPPPP,P为脯氨酸；PPPPHHHH,H为组氨酸)等；对于在液相质谱检测时使用亲水作用液相色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)进行多肽分离的体系。可设计极疏水性多肽(如LLLLLLLL，L为亮氨酸；LLLIIIII,I为异亮氨酸)等。保守序列蛋白即人工合成的、序列已知的蛋白，设计思路与保守序列肽一致；也可以引入酶解位点，以伴随目标样本进入酶解反应。如：设计极亲水性的伴随蛋白PPPPPPKHHHHHHHHKPPPPPPPPK…HHHHHK，K为赖氨酸，不同的保守序列肽或保守序列蛋白可以混合使用。

如图5-7所示，短序列肽即序列长度较短、一般小于四个氨基酸的多肽或单个氨基酸。如：对于目的减少样本损失的实验、需要投入大量伴随蛋白/肽的体系，可选择短序列肽(如L、LL、KL，L为亮氨酸、K为赖氨酸)等。短序列蛋白即短序列肽连接而成的蛋白，并在连接处引入酶解位点，酶解位点的氨基酸可以是赖氨酸或者精氨酸，以伴随目标样本进入酶解反应。如：设计短序列蛋白PPKPPPKHHKHHHKPPPKPPPKPPK…HHKHHHK。

保守序列肽、保守序列蛋白、短序列肽和短序列蛋白可以在同一实验中同时使用。对于伴随蛋白/肽的合成制备，可以采用多肽固相合成法等多种技术。没有相应条件的研究者可以通过试剂公司订购。

S2，获取目标样本，将步骤S1中的伴随蛋白/肽与目标样本进行混合，获得样本混合物：

目标样本可以进行如下预处理步骤：目标样本为福尔马林固定、石蜡包埋等组织样本，可以进行脱蜡，去交联，组织裂解等处理，得到蛋白悬液；目标样本为单个或少量细胞等样本，可以先做裂解处理、得到蛋白悬液；对于尿液、血浆等液态样本，可以作蛋白沉等。将伴随蛋白/肽加入经过预处理后的目标样本中，如将伴随蛋白/肽混入去除上清的血浆蛋白沉淀。若目标样本未做预处理，也可将目标样本加入混有伴随蛋白/肽的反应体系，如通过流式细胞术将分选的细胞投入加有伴随蛋白/肽的容器。

伴随蛋白/肽的量应根据实际实验的体系和目的来确定。如：对于目标样本蛋白含量少、而反应体系步骤繁多的实验，可适量增加伴随蛋白/肽的量、以补足至足够的多肽量以确保反应效率、并避免在反应中各操作带来的损失。而对于采用未知序列的短肽作为伴随蛋白/肽的实验，可适量减少伴随蛋白/肽的量、以避免在数据采集时由于离子抑制导致的目标样本多肽离子化效率降低。

S3，将步骤S2中的样本混合物进行蛋白提纯处理，获得待测蛋白；

样本混合物可以进行裂解、蛋白质孵化、蛋白质酶解、纯化四个步骤进行提纯处理，裂解步骤通过破碎或溶解细胞膜，使目标样本细胞内和细胞壁的蛋白暴露。可以通过机械裂解法(研磨、压力循环、超声加热、反复冻融热休克等)、化学裂解法(SDS-碱裂解液法、尿素/硫脲裂解法等)或酶裂解法(溶菌酶处理等)等进行处理。对于已经预处理的样本，此步骤可以省略。

蛋白质孵化将来自目标样本的蛋白中二硫键打开，以破环其二级结构，为充分酶解做准备。常用的还原化试剂有非硫醇还原剂(三(2-羧乙基)膦盐酸盐等)、硫醇类还原剂(二硫苏糖醇等)等；烷基化试剂有碘乙酰胺等。在部分实验条件(如在裂解步通过机械应力已经打开二硫键)和要求(如研究对象包括蛋白中的二硫键)下，蛋白质的孵化步骤可以省略。

蛋白质酶解将目标样本的蛋白按序列的特点位点进行水解。而伴随肽的序列不受水解反应的影响，而伴随蛋白的序列中若有特点位点也会被水解、成为伴随肽。根据实验目的，可以选用如：胰蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C或其他可有效处理特异性氨基酸序列位点的水解酶，也可能有多种酶的联用。得到的产物是目标样本的多肽和伴随蛋白/肽的混合物。

脱盐将样本中引入的盐分和杂质除去。一般情况下，使用多肽脱盐柱或滤膜进行处理；也可以在第五步使用的液相色谱系统中采用线上除盐的方案。若反应体系中未引入或仅少量引入盐分和杂质，该步骤可以省略。

S4，对步骤S3中的待测蛋白联用液相质谱进行分析：

通过液相色谱对待测蛋白进行梯度分离和洗脱后、采用质谱进行信号数据采集。液相色谱可以采用预柱-分析柱串联模式或分析柱模式，可以采用根据实验所需的任何梯度、流动相、流速和填充材料等。洗脱后通过离子源进入质谱的多肽带电离子，通常采用串联质谱采集，可以采用根据实验所需的任何采集模式、分辨率等。在使用保守序列肽形式的伴随蛋白/肽时，质谱采集建议在液相系统上样完毕、多肽分离开始后再开启。在使用短肽形式的伴随蛋白/肽时，扫描范围的下限建议设为大于短肽的相对分子质量。

混合的目标样本多肽和伴随蛋白/肽同时进入液相体系，但质谱只采集来自目标样本多肽的信息。如：对于保守序列肽形式，其保留能力差，在液相系统上样(sampleloading)、液相分离未开始或开始的前段便被洗脱，从而实现保守序列肽和目标样本多肽的分离；此时质谱尚未开启采集，保留序列肽进入质谱后产生的信号未被记录，因此不造成对目标样本质谱结果的干扰；对于短序列肽形式，其质荷比数值低于目标样本多肽，且不处在质谱采集范围内，因此其信号也没有被记录，不影响目标样本的质谱结果。

研究者可以根据实验要求进行数据分析，伴随蛋白/肽的引入对数据分析不构成影响。本发明提供的伴随蛋白/肽也可适用微流控系统。

实施例1

本实施例利用伴随蛋白/肽进行提高蛋白质组实验效率的测试，具体步骤如下：

(1)设计和制作序列为SSK、SSR、SSSK、SSSR、SSSSK、SSSSR、SGSGK的伴随肽。它们的性质为亲水，分子质量依次为320.34，348.36，407.42，435.44，494.5，522.52，434.44。它们都属于保守序列肽，其中SSK和SSR也属于短序列肽。

(2)将7种伴随肽溶解在配制的质谱缓冲液A(98％水，2％乙腈，0.1％甲酸)中。按照等物质的量比进行混合，稀释至浓度为50ng/μL。

(3)使用Eksigent NanoLC 400液相系统和TripleTOF 6600质谱系统进行液相质谱数据采集。具体参数为：质谱缓冲液A同上，质谱缓冲液B是98％乙腈，2％水，0.1％甲酸。15min液相梯度，使用的是反相亲和液相色谱，流速：300nL/min。0min：100％A；5min：95A，5％B；15min：65％A,35％B.一级质谱采集范围为100-1500m/z，以包含伴随肽离子的可能质荷比。其余条件根据默认设定。质谱结果如图8所示，分析发现，质谱在有效梯度的前段，即反相亲和液相色谱的亲水段，无肽段信号流出。这说明伴随肽不会出现在质谱结果中，不影响液质联用质谱信号的采集。

上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽中的应用，其特征在于，将伴随蛋白/肽与目标蛋白样品进行混合，对混合物进行串联质谱分析，所述伴随蛋白/肽包括保守序列肽、保守序列蛋白、短序列肽和短序列蛋白中的一种或多种，所述保守序列肽为极亲水性多肽或极疏水性多肽，所述保守序列蛋白是多个保守序列肽连接而成的蛋白，所述短序列肽的氨基酸个数为Q，所述Q大于等于1且小于4，所述短序列蛋白为多个短序列肽连接而成蛋白。

2.根据权利要求1中所述的伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽中的应用，其特征在于，所述保守序列肽的结构为(A)x(B)y(C)z···(α)β，其中A，B，C，···，α表示为任一种氨基酸，且A，B，C，···，α的亲疏水性质相同亲，所述x，y，z，···，β表示个数，所述x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数。

3.根据权利要求2中所述的伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽中的应用，其特征在于，所述保守序列蛋白的结构为<seq1>(γ)x<seq2>(γ)y···<seqN>(γ)β，其中<seq1>，<seq2>，···，<seqN>表示任一个保守序列肽，γ为任一个作为酶解位点的氨基酸，x，y，z，···，β表示个数，x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数，所述x，y，z，···，β的总和大于等于2。

4.根据权利要求1中所述的伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽中的应用，其特征在于，所述短序列肽的结构为(δ)w(ε)x(θ)y(λ)z，其中，δ，ε，θ，λ表示任一种氨基酸，w，x，y，z表示个数，w，x，y，z均为任一个大于等于0的整数，所述w，x，y，z相加的总和为Q。

5.根据权利要求4中所述的伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽中的应用，其特征在于，短序列蛋白的结构为<SEPⅠ>(γ)x<SEPⅡ>(γ)y···<SEPm>(γ)β，其中<SEPⅠ>，SEPⅡ>，···，<SEPm>表示任一个短序列肽，γ为任一个作为酶解位点的氨基酸，x，y，z，···，β表示个数，x，y，z，···，β均为任一个大于等于0的整数，所述x，y，z，···，β的总和大于等于2。

6.根据权利要求1所述的伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率的伴随蛋白/肽中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1，设计和合成伴随蛋白/肽；

S2，获取目标样本，将步骤S1中的伴随蛋白/肽与目标样本进行混合，获得样本混合物；

S3，将步骤S2中的样本混合物进行蛋白提纯处理，获得待测蛋白；

S4，对步骤S3中的待测蛋白液相质联用谱进行分析。

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