CN111849892A

CN111849892A - 一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞（til）的体外扩增方法及用途

Info

Publication number: CN111849892A
Application number: CN202010646970.4A
Authority: CN
Inventors: 吴丁兰
Original assignee: Shenzhen Hospital of Southern Medical University
Current assignee: Shenzhen Hospital of Southern Medical University
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111849892B

Abstract

本发明实施例公开了一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途，属于细胞培养技术领域。所述方法包括：TIL细胞的预培养；TIL细胞的培养与扩增。本发明在不分离胶质瘤浸润淋巴细胞的情况下直接诱导培养TIL细胞后再进行大量扩增TIL细胞，操作程序较为简单且耗时短，能够明显提高TIL细胞扩增数量和细胞活性，具有良好的杀伤胶质瘤肿瘤细胞的效果。本发明在TIL细胞培养和扩增步骤中，采用低浓度的细胞因子复合营养培养基，既保证TIL细胞培养扩增的需要，也降低了后续治疗过程中细胞因子风暴的潜在危险。

Description

一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途

技术领域

本发明实施例涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途。

背景技术

胶质瘤是源发于脑神经上皮最常见的原发性颅内肿瘤，难根治，易复发是其主要特点。目前主要的治疗方法是手术治疗、放疗和化疗等。高级别胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤的5年生存期小于10％。

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是从肿瘤组织中分离出的淋巴细胞。现有的TIL细胞培养技术，是使用机械处理和/或酶消化的方法，从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，加入高剂量白细胞介素-2(IL-2，6000U/mL)进行体外培养。研究表明，经IL-2活化的TIL与来自自身外周血单个核细胞(PBMC)的LAK相比，具有更高的杀瘤活力和更好的靶向性。

TIL细胞作为一种特异性免疫细胞，其用于肿瘤治疗已有20多年的历史，在多种肿瘤中已有相关的研究。目前常用的TIL体外扩增技术是先从肿瘤组织中分离出TIL细胞后再进行TIL诱导培养，并已证实体外培养的TIL细胞具有抗肿瘤的作用。但现有扩增TIL细胞需要先分离TIL细胞，存在扩增速度慢，获得淋巴细胞数量少等缺陷，并且为了快速获得更多的效应细胞，细胞因子(如IL-2)剂量较高，在治疗过程中容易使患者产生因子风暴，因此不利于治疗，甚至对患者产生生命危险。

检索现有技术尚未见胶质瘤TIL的相关报道，因此，开发出一种新的高效体外扩增胶质瘤TIL的方法有着重要的意义。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法及用途，以解决现有TIL细胞扩增方法存在的操作程序繁杂、耗时长、活性不高以及IL-2使用量较高的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法，所述方法包括以下步骤：

(1)TIL细胞的预培养

胶质瘤组织用PBS冲洗后切成1-3mm³大小的组织块，采用预培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，使组织块毛细血管中的PBMC充分释放出来；

(2)TIL细胞的培养与扩增

步骤(1)得到的胶质瘤组织，采用TIL细胞培养基Ⅰ中，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，每2～3天换液一次，培养6-8天后，添加TIL细胞培养基Ⅱ，继续培养6-8天后，在800-1000rpm/min下离心5-8min，弃去上清液，用预培养液重悬浮和洗涤细胞，分离纯化收集TIL细胞以备下一步实验使用。

进一步地，所述预培养液的组成如下：在RMPI 1640培养基的基础上，添加1％P/S(青霉素/链霉素)。

进一步地，所述TIL细胞培养基Ⅰ的组成如下：在GMP DC培养基的基础上，添加5％human A/B serum、1％人血小板裂解物、1％P/S、2mM L-glutamine、1×MEM-Eagle、1mMSodium pyruvate、10mM HEPES、1×β-mercaptoethanol、500U/mL IL-2、50U/mL IL-15、50U/mL IL-21。

进一步地，所述TIL细胞培养基Ⅱ的组成如下：在GMP DC培养基的基础上，添加10％human A/B serum、1％人血小板裂解物、1％P/S、2mM L-glutamine、1×MEM-Eagle、1mMSodium pyruvate、10mM HEPES、1×β-mercaptoethanol、1000U/mL IL-2、100U/mL IL-15、100U/mL IL-21。

进一步地，步骤(1)中，将胶质瘤组织接种于100mm细胞培养皿中。

进一步地，步骤(1)中，所述培养时间为30min。

进一步地，步骤(2)中，将胶质瘤组织接种于24孔板上，2块/孔。

根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供上述的体外扩增方法得到的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在胶质瘤治疗中的用途。

本发明实施例具有如下优点：

1、本发明在不分离胶质瘤浸润淋巴细胞的情况下直接诱导培养TIL细胞后再进行大量扩增TIL细胞，操作程序较为简单且耗时短，能够明显提高TIL细胞扩增数量和细胞活性，具有良好的杀伤胶质瘤肿瘤细胞的效果。

2、本发明在TIL细胞培养和扩增步骤中，采用低浓度的细胞因子复合营养培养基，既保证TIL细胞培养扩增的需要，也降低了后续治疗过程中细胞因子风暴的潜在危险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明的胶质瘤原代肿瘤细胞培养图；

图2为本发明的TIL细胞培养图；

图3为本发明的TIL的流式细胞仪检测结果(包括CD45、CD3、CD4、CD8含量的检测)；

图4为本发明的TIL的流式细胞仪检测结果(包括CD19、CD127、CD4、CD8含量的检测)；

图5为本发明的TIL细胞对胶质瘤肿瘤组织细胞杀伤过程示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

胶质瘤肿瘤组织细胞的培养

取部分胶质瘤肿瘤组织，碾磨，消化，去除红细胞，800rpm/min离心5min收集细胞，丢弃上清液，然后用培养液于37℃，5％CO₂培养箱内进行细胞培养。其中，培养液的组成如下：在DMEM/F12培养基的基础上，添加10％FBS、1％P/S(青霉素/链霉素)、2mM L-glutamine、1×MEM-Eagle、1mM Sodium pyruvate(丙酮酸钠)、10mM HEPES。培养1-3代后，把细胞消化下来，800rpm/min离心5min收集细胞，加入培养基重悬浮和洗涤细胞后保存或进行下一步实验。胶质瘤原代肿瘤细胞培养结果见图1。

实施例2

胶质瘤肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法

(1)TIL细胞的预培养

内装有含1％P/S的RMPI 1640培养基的收集管置于冰上，并快速将手术室中收集的胶质瘤组织放入收集管内，有利于在运输途中保存组织的活性。

取出胶质瘤组织用1×PBS冲洗3遍后切成1-3mm³的组织块，将组织块接种于含有1％P/S的RMPI 1640培养基的100mm细胞培养皿中，置于5％CO₂，37℃培养箱内培养30min，使组织块毛细血管中的PBMC充分释放出来。

(2)TIL细胞的培养与扩增

步骤(1)得到的胶质瘤组织接种于含有TIL细胞培养基Ⅰ的24孔板上，2块/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，每2天换液一次，培养8天后，添加TIL细胞培养基Ⅱ，继续培养8天，在1000rpm/min下离心5min，弃去上清液，用培养基重悬浮和洗涤细胞。

其中，TIL细胞培养基Ⅰ的组成如下：在GMP DC培养基的基础上，添加5％human A/Bserum、1％人血小板裂解物、1％P/S、2mM L-glutamine、1×MEM-Eagle、1mMSodiumpyruvate、10mM HEPES、1×β-mercaptoethanol、500U/mL IL-2、50U/mL IL-15、50U/mL IL-21。

TIL细胞培养基Ⅱ的组成如下：在GMP DC培养基的基础上，添加10％humanA/Bserum、1％人血小板裂解物、1％P/S、2mM L-glutamine、1×MEM-Eagle、1mMSodiumpyruvate、10mM HEPES、1×β-mercaptoethanol、1000U/mLIL-2、100U/mL IL-15、100U/mL IL-21。

TIL细胞培养结果见图2。

实施例3

TIL细胞成分分析

采用流式细胞分析对经实施例2的扩增方法得到的胶质瘤组织块所释放的TIL细胞中的CD3⁺-T，CD4⁺-T，CD8⁺-T，CD19⁺-T，及CD127⁺-T进行检测，结果见图3、图4及表1。

表1TIL细胞的各成分含量及其扩增量(包括CD4和CD8)

结果显示，TIL细胞的体外扩增培养中，CD8⁺-T细胞的比例处于稳定高水平，且CD8⁺-T细胞比例在缓慢扩增期不断增高，在快速扩增期处于稳定高水平。

实施例4

TIL细胞对胶质瘤肿瘤组织细胞的体外杀伤活性

收集实施例2培养的TIL细胞(称为效应细胞)，与实施例1培养的胶质瘤肿瘤组织细胞(称为靶细胞)进行混合培养，效应细胞与靶细胞的比例设置为1:1、2:1、5:1以及10:1。采用不同时间段拍照(混合培养后分别在第2,4,6天进行拍照检测)检测实施例2获得的TIL细胞对胶质瘤肿瘤组织细胞的杀伤效果，结果如图5所示，可以看到，培养扩增的TIL细胞于体外能够杀死几乎所有胶质瘤肿瘤细胞，结果显示扩增的TIL细胞具有高效杀伤能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)TIL细胞的预培养

(2)TIL细胞的培养与扩增

步骤(1)得到的胶质瘤组织，采用TIL细胞培养基Ⅰ，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，每2～3天换液一次，培养6-8天后，添加TIL细胞培养基Ⅱ，继续培养6-8天，在800-1000rpm/min下离心5-8min，弃去上清液，用预培养液重悬浮和洗涤细胞，分离纯化收集TIL细胞以备下一步实验使用。

2.根据权利要求1所述的体外扩增方法，其特征在于，所述预培养液的组成如下：在RMPI 1640培养基的基础上，添加1％P/S。

3.根据权利要求1所述的体外扩增方法，其特征在于，所述TIL细胞培养基Ⅰ的组成如下：在GMP DC培养基的基础上，添加5％humanA/B serum、1％人血小板裂解物、1％P/S、2mML-glutamine、1×MEM-Eagle、1mM Sodium pyruvate、10mM HEPES、1×β-mercaptoethanol、500U/mL IL-2、50U/mL IL-15、50U/mLIL-21。

4.根据权利要求1所述的体外扩增方法，其特征在于，所述TIL细胞培养基Ⅱ的组成如下：在GMP DC培养基的基础上，添加10％humanA/B serum、1％人血小板裂解物、1％P/S、2mML-glutamine、1×MEM-Eagle、1mM Sodium pyruvate、10mM HEPES、1×β-mercaptoethanol、1000U/mL IL-2、100U/mL IL-15、100U/mLIL-21。

5.根据权利要求1所述的体外扩增方法，其特征在于，步骤(1)中，将胶质瘤组织接种于100mm细胞培养皿中。

6.根据权利要求1所述的体外扩增方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养时间为30min。

7.根据权利要求1所述的体外扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，将胶质瘤组织接种于24孔板上，2块/孔。

8.权利要求1所述的体外扩增方法得到的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在胶质瘤治疗中的用途。