CN111801419A - 免疫刺激性寡核苷酸 - Google Patents
免疫刺激性寡核苷酸 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111801419A CN111801419A CN201880089469.3A CN201880089469A CN111801419A CN 111801419 A CN111801419 A CN 111801419A CN 201880089469 A CN201880089469 A CN 201880089469A CN 111801419 A CN111801419 A CN 111801419A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- tlr21
- sequence
- cpg
- guanine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 398
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 103
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 186
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 64
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 16
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 190
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 158
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 100
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 97
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 84
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 41
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 38
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims description 25
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 7
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 212
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 167
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 76
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 68
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 66
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Natural products C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 58
- 101500027983 Rattus norvegicus Octadecaneuropeptide Proteins 0.000 description 52
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 50
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 48
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 42
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 41
- 108091081406 G-quadruplex Proteins 0.000 description 40
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 38
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 34
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 34
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 description 29
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 27
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 24
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 24
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 24
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 22
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 21
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 20
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 17
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 16
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 14
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Substances OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229940035437 1,3-propanediol Drugs 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 14
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 10
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 10
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 10
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 9
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 9
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 9
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 7
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- 101000800479 Homo sapiens Toll-like receptor 9 Proteins 0.000 description 6
- 101100260758 Mus musculus Tlr9 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 102000045710 human TLR9 Human genes 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 5
- -1 cholesterol modified oligonucleotides Chemical class 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 4
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 4
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 3
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- ALVZNPYWJMLXKV-UHFFFAOYSA-N 1,9-Nonanediol Chemical compound OCCCCCCCCCO ALVZNPYWJMLXKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-dihydro-1H-pyrimidin-4-one Chemical compound N1CNC=C(C1=O)C KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMVDTXSRLFAIKI-UHFFFAOYSA-N 7h-purine Chemical compound C1=NC=C2NC=NC2=N1.C1=NC=C2NC=NC2=N1 YMVDTXSRLFAIKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- BBJQPKLGPMQWBU-UHFFFAOYSA-N Palmitinsaeurecholesterylester Natural products C12CCC3(C)C(C(C)CCCC(C)C)CCC3C2CC=C2C1(C)CCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C2 BBJQPKLGPMQWBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001841 cholesterols Chemical group 0.000 description 2
- BBJQPKLGPMQWBU-JADYGXMDSA-N cholesteryl palmitate Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H]([C@H](C)CCCC(C)C)CC[C@H]3[C@@H]1CC=C1[C@]2(C)CC[C@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C1 BBJQPKLGPMQWBU-JADYGXMDSA-N 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diol Chemical compound OCCCCCCO XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDWFDOFTPHDNJL-TUBOTVQJSA-N odn-2006 Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(S)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)[C@@H](O)C1 KDWFDOFTPHDNJL-TUBOTVQJSA-N 0.000 description 2
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- YMXFJTUQQVLJEN-UHFFFAOYSA-N pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1.C1=CN=CN=C1 YMXFJTUQQVLJEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 229940043375 1,5-pentanediol Drugs 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010069941 DNA receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000856513 Homo sapiens Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100025509 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000574441 Mus musculus Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000248501 Oxytricha Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,1-diol Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)O GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 229940051250 hexylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N oxytetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N pentane-1,2-diol Chemical compound CCCC(O)CO WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000000135 prohibitive effect Effects 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/31—Combination therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本文公开了免疫刺激性寡核苷酸及其组合物和使用方法。更具体地，公开了免疫刺激性寡核苷酸，优化寡核苷酸的免疫刺激性特性的方法以及使用所述免疫刺激性寡核苷酸引发toll‑样受体21(TLR21)‑介导的免疫应答的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求各自在2017年12月15日提交的欧洲专利申请号EP17207740.6、EP17207746.3和EP17207750.5(其公开内容以其整体通过引用并入本文)的优先权和益处。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2018年11月30日创建，命名为BHC_168028_SL.txt，且大小为78,795字节。
发明领域
本文公开了免疫刺激性寡核苷酸及其组合物和使用方法。更具体地，公开了免疫刺激性寡核苷酸，优化寡核苷酸的免疫刺激性特性的方法以及使用所述免疫刺激性寡核苷酸引发toll-样受体21 (TLR21)-介导的免疫应答的方法。
发明背景
微生物的一些分子属性，包括微生物表面上的蛋白和其他抗原，以及内部组成，诸如微生物的基因组内包含的某些基序(例如，未甲基化的CpG基序)，可以被宿主生物体的免疫系统识别，并且引发免疫应答。这些分子属性或病原体相关分子模式(PAMP)和宿主的同源病原体识别受体之间的相互作用可以引发参与免疫应答的细胞信号传导级联。Toll-样受体21 (TLR21)是能够识别未甲基化的CpG基序的哺乳动物toll-样受体9 (TLR9)和PAMP受体的鸡功能同源物。具有这些CpG基序的核酸对TLR21的活化已经显示活化参与对微生物感染的免疫应答的细胞信号。
对TLR21在鸡的免疫应答中的作用的理解没有导致家禽业中的疾病预防或治疗的偏移。由于固有的拥挤和非无菌环境，在孵卵设施中圈养的大量家禽在生命的各个阶段处于微生物感染的增加风险中，但目前可用的预防性组合物和感染后治疗通常不引发PAMP介导的免疫应答。反而，大规模生产设施依靠市售的疫苗和抗生素来预防或减少感染性爆发。尽管由于对抗性的关注以及食用处理的肉类的意想不到的后果，抗生素正变得不受欢迎，但在许多农业环境中，包括大规模孵卵场中，抗生素施用仍然是标准的操作程序，并且采用新方法成本过高且负担繁重。采用TLR21激动剂作为预防性措施或感染的治疗的一个障碍包括与筛选大量候选化合物相关的效率低下，这有效地阻碍鉴定此类激动剂的研究。
因此，需要TLR21刺激性组合物，鉴定它们以及优化组合物的免疫刺激性特性的方法。公开的方法和组合物针对这些和其他重要需求。
发明概述
本文公开了寡核苷酸，其包含至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的(“鸟嘌呤富集的”)序列。
本文还公开了寡核苷酸，其包含5'-胆固醇基修饰与至少一个CpG基序且有或没有所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
还提供了刺激toll-样受体21 (TLR21)的方法，其包括向有此需要的受试者施用免疫刺激性寡核苷酸，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
还公开了用于增加具有至少一个CpG基序的寡核苷酸的TLR21-刺激活性的方法，其包括将所述寡核苷酸的5'末端融合至鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
本文提供了用于引发受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用寡核苷酸，所述寡核苷酸具有至少一个CpG二核苷酸基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
附图简述
当结合附图阅读时，进一步理解概述以及以下详述。为了举例说明公开的组合物和方法的目的，在附图中显示所述组合物和方法的示例性实施方案；然而，所述组合物和方法不限于公开的具体实施方案。在附图中：
图1是pcDNATM3.1(+)的质粒图。
图2比较TNF-α-刺激的HEK293-NFκB细胞和HEK293-NFκB-bsd-cTLR21的剂量应答曲线。
图3A和图3B图示描绘2006-PTO和2006-PDE对HEK293-bsd和HEK293-bsd-cTLR21细胞的刺激作用。
图4A和图4B图示描绘增加在2006-PDE寡核苷酸的3’末端的鸟嘌呤残基的数目的刺激作用。
图5A和图5B图示描绘增加在2006-PDE寡核苷酸的5’末端的鸟嘌呤残基的数目的刺激作用。
图6举例说明在其3’或5’末端具有递增数目的鸟嘌呤残基的2006-PDE寡核苷酸的半最大有效浓度(pEC50)的负对数(log10)。
图7A和图7B分别举例说明在其5’和3’末端具有递增数目的鸟嘌呤的2006-PDE寡核苷酸的聚集。
图8A和图8B图示描绘在其5’末端具有六个连续的鸟嘌呤(5dG6)、腺嘌呤(5dA6)、胞嘧啶(5dC6)或胸腺嘧啶(5dT6)残基的2006-PDE寡核苷酸的刺激作用。
图9A和图9B图示描绘CpG基序的破坏对寡核苷酸对TLR21的刺激的作用。
图10A和图10B图示描绘分别在具有磷酸二酯或硫代磷酸酯主链的寡核苷酸的3'和5'末端的鸟嘌呤延伸的刺激作用。
图11A和图11B举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5'末端上的六个鸟嘌呤延伸内的单个腺嘌呤取代对TLR21刺激的作用，而图11C和图11D举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5'末端上的六个鸟嘌呤延伸内的两个腺嘌呤取代对TLR21刺激的作用。
图12A和图12B举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5'末端上的六个鸟嘌呤延伸内的单个胞嘧啶取代对TLR21刺激的作用，而图12C和图12D举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5'末端上的六个鸟嘌呤延伸内的两个胞嘧啶取代对TLR21刺激的作用。
图13A和图13B举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5’末端上的六个鸟嘌呤延伸内的单个胸腺嘧啶取代对TLR21刺激的作用，而图13C和图13D举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5’末端上的六个鸟嘌呤延伸内的两个胸腺嘧啶取代对TLR21刺激的作用。
图14表明在具有多个CpG基序的寡核苷酸(SEQ ID NO:272)的5’末端上的六个鸟嘌呤延伸内的单个核苷酸取代对TLR21刺激的位置作用。
图15表明在具有多个CpG基序的寡核苷酸(SEQ ID NO:272)的5’末端上的六个鸟嘌呤延伸内的两个核苷酸取代对TLR21刺激的位置作用。
图16A和图16B举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5’末端上的四个鸟嘌呤延伸内的单个腺嘌呤取代对TLR21刺激的作用。
图17A和图17B举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5’末端上的四个鸟嘌呤延伸内的单个胞嘧啶取代对TLR21刺激的作用。
图18A和图18B举例说明在具有多个CpG基序的寡核苷酸的5’末端上的四个鸟嘌呤延伸内的单个胸腺嘧啶取代对TLR21刺激的作用。
图19表明在具有多个CpG基序的寡核苷酸(SEQ ID NO:273)的5’末端上的四个鸟嘌呤延伸内的单个核苷酸取代对TLR21刺激的位置作用。
图20A – 20K举例说明融合文献中牵涉的含有CpG的寡脱氧核苷酸序列的3’末端上的五个鸟嘌呤延伸、五个引发末端上的四个鸟嘌呤延伸和5’末端上的六个鸟嘌呤延伸的作用。图20A图示举例说明ODN 1668、1668-3dG5、1668-5dG4和1668-5dG6的TLR21刺激活性。图20B图示举例说明ODN 1826-3dG5、1826-5dG4和1826-5dG6的TLR21刺激活性。图20C图示举例说明ODN BW006、BW006-3dG5、BW00-65dG4和BW006-5dG6的TLR21刺激活性。图20D图示举例说明ODN D-SLO1、D-SLO1-3dG5、D-SLO1-5dG4和D-SLO1-5dG6的TLR21刺激活性。图20E图示举例说明ODN M362、M362-3dG5、M362-5dG4和M362-5dG6的TLR21刺激活性。图20F图示举例说明ODN 2395、2395-5dG4和2395-5dG6的TLR21刺激活性。图20G图示举例说明ODN2007-PDE、2007-PDE -3dG5、2007-PDE -5dG4和2007-PDE -5dG6的TLR21刺激活性。图20H图示举例说明ODN CPG-685和CPG-685-5dG6的TLR21刺激活性。图20I图示举例说明ODN CPG-202和CPG-202-5dG6的TLR21刺激活性。图20J图示举例说明ODN CPG-2000和CPG-2000-5dG6的TLR21刺激活性。图20K图示举例说明ODN CPG-2002和CPG-2002-5dG6的TLR21刺激活性。
图21A图示描绘将已知的端粒序列融合至2006-PDE和2006-PDE-T4的影响；图21B和图21C图示描绘将端粒或启动子序列融合至2006-PDE-T4的影响。
图22A和图22B举例说明将已知的端粒序列融合至2006-PDE的影响。
图23A和图23B分别显示具有G-四联体序列的寡核苷酸的四聚体的碱基配对排列和包含该四聚体的寡核苷酸(作为SEQ ID NO:265公开的"TGGGGT")的取向；图23C举例说明当形成G-四联体或G-线构象(SEQ ID NO:257)时寡核苷酸的相互作用；图23D是G-线构象(SEQ ID NO:257)的图像。
图24A和图24B描绘通过向具有CpG基序的寡核苷酸的5'末端添加鸟嘌呤核苷酸富集的序列对TLR21刺激的作用。
图25描绘具有G-线序列的聚集的寡脱氧核苷酸的存在。
图26A、图26B和图26C图示描绘与CpGpA基序紧邻的核苷酸的刺激影响。图26A描绘基础寡核苷酸的TLR21刺激活性。图26B描绘具有额外5' dG6序列的相同寡核苷酸。图26C描绘具有额外5' G线2序列的基础寡核苷酸。
图27A、图27B和图27C图示描绘与CpGpG基序紧邻的核苷酸的刺激影响。图27A描绘基础寡核苷酸的TLR21刺激活性。图27B描绘具有额外5' dG6序列的相同寡核苷酸。图27C描绘具有额外5' G线2序列的相同寡核苷酸。
图28A、图28B和图28C图示描绘与CpGpC基序紧邻的核苷酸的刺激影响。图28A描绘基础寡核苷酸的TLR21刺激活性。图28B描绘具有额外5' dG6序列的相同寡核苷酸。图28C描绘具有额外5' G线2序列的相同寡核苷酸。
图29A、图29B、图29C和图29D图示描绘与CpGpT基序紧邻的核苷酸的刺激影响。图29A描绘基础寡核苷酸的TLR21刺激活性。图29B描绘具有额外5' dG6序列的相同寡核苷酸。图29C和图29D描绘具有额外5' G线2序列的相同寡核苷酸。
图30举例说明破坏具有5' G线序列的寡核苷酸中唯一的CpG基序的刺激影响。
图31举例说明5' G线序列和CpG基序之间的距离的刺激影响。
图32举例说明修改具有5' G线2序列和CpG基序的寡核苷酸的3'末端的胸苷5'-单磷酸核苷酸的数目的刺激影响。
图33A和图33B比较具有不同的5' G-线序列的寡核苷酸的免疫刺激性特性。
图34描绘具有5' G线2序列的寡核苷酸的结构-活性。图以出现顺序分别公开SEQID NO 189、269和270。
图35A和图35B比较具有5' G线2序列和CpG基序的寡核苷酸的3’附近具有单个、双重或三重GCGT序列元件的寡核苷酸的免疫刺激能力。
图36A和图36B比较具有5' G线2序列和CpG基序的寡核苷酸的3'附近具有单个、双重或三重GCGA序列元件的寡核苷酸的免疫刺激能力。
图37A和图37B比较具有5' G线2序列和CpG基序的寡核苷酸的3'附近具有单个、双重或三重ACGC序列元件的寡核苷酸的免疫刺激能力。
图38A和图38B比较具有5' G线2序列和CpG基序的寡核苷酸的3'附近具有单个、双重或三重TCGC序列元件的寡核苷酸的免疫刺激能力。
图39A和图39B比较具有5' G线2序列和CpG基序的寡核苷酸的3'附近具有单个、双重或三重CCGC序列元件的寡核苷酸的免疫刺激能力。
图40比较具有G线2序列和CpG基序的寡核苷酸的3'附近具有单个、双重或三重GCGG序列元件的寡核苷酸的免疫刺激能力。
图41A和图41B比较在寡核苷酸中的两个CpG基序之间插入一至四个胸腺嘧啶核苷酸的免疫刺激作用。
图42A和图42B举例说明两个CpG基序之间的单核苷酸分隔或两个CpG基序之间的无碱基间隔基的刺激作用。
图43A至43E描绘寡核苷酸中的CpG元件之间的不同结构桥。图43A描绘T1间隔基的结构。图43B描绘T3间隔基的结构。图43C描绘无碱基间隔基的结构。图43D描绘1,3-丙二醇间隔基的结构。图43E描绘六乙二醇间隔基的结构。
图44A和图44B显示在CpG基序之间插入C3和C18间隔基的刺激影响。
图45A和图45B描绘增加包含5'-G线2基序的寡核苷酸中的CpG基序的数目的免疫刺激影响，所述CpG基序被C3间隔基分隔。
图46A和图46B图示举例说明具有在5'末端的TGGGGT-序列(SEQ ID NO:265)和一至五个CpG基序(各自被C3间隔基分隔)的寡核苷酸对TLR21的免疫刺激。
图47描绘基于无碱基二醇的间隔基。
图48描绘C8间隔基、基础间隔基和无碱基脱氧核糖桥间隔基。
图49A和图49B图示展示具有GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257) 5'末端序列和CpG基序的寡核苷酸的TLR21刺激，且其中所述CpG基序被丙二醇或无碱基脱氧核糖桥分隔。
图50A和图50B举例说明具有CpG基序和G-线序列的寡核苷酸的TLR21刺激能力，其中所述CpG基序被乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇和己二醇分隔。
图51举例说明CpG元件之间不同的基于二醇的间隔基对TLR21的刺激的影响。
图52A和图52B描绘暴露于具有通过丙二醇或六乙二醇分隔的ACGC或CCGC CpG序列元件和G-线 5'末端序列的寡核苷酸之后的TLR21刺激。
图53A和图53B描绘暴露于具有通过丙二醇分隔的ACGC或CCGC CpG序列元件和TGGGGT (SEQ ID NO:265) 5'末端序列的寡核苷酸之后的TLR21刺激。
图54A和图54B描绘暴露于具有G-线 5'末端序列和通过丙二醇或六乙二醇分隔的CpG基序的寡核苷酸之后的TLR21刺激。
图55举例说明通过己二醇接头连接至3'脱氧核糖部分的胆固醇部分的化学结构。
图56A和图56B比较来自具有多个CpG基序和5' G线2序列的寡核苷酸的TLR21刺激与来自具有3'胆固醇基的相同寡核苷酸的TLR21刺激。
图57A和图57B比较具有TGGGGT (SEQ ID NO:265) 5'末端序列、多个CpG基序和3'胆固醇基的两种寡核苷酸。
图58A和图58B描绘对两种不同脱氧核苷酸的5'胆固醇修饰。
图59A和图59B举例说明由具有TGGGGT-5'末端序列(SEQ ID NO:265)、多个CpG基序以及具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸引起的TLR21刺激。
图60A和图60B举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激，其中胆固醇衍生物获得自不同的供应商(Sigma Aldrich)。
图61A和图61B举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激。
图62A和图62B举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激。
图63A和图63B举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激。
图64举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激。
图65A和图65B举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激。
图66A和图66B举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激。
图67举例说明通过具有或不具有5'胆固醇修饰的寡核苷酸的TLR21刺激。
图68A和图68B分别图示描绘在小鼠和人细胞中，通过增加寡核苷酸的5'末端上的鸟嘌呤核苷酸的数目修饰的寡核苷酸的免疫刺激作用。
图69A和图69B分别图示描绘在小鼠和人细胞中，通过增加寡核苷酸的3'末端上的鸟嘌呤核苷酸的数目修饰的寡核苷酸的免疫刺激作用。
图70描绘在接种疫苗后(pv)第14天(上小图)和第21天(下小图)，ODN1 (GCGT3-TG4T-5Chol)的平均血凝抑制(HI)滴度(Log2)(与标准偏差)结果。星号指示显著性的水平(*=显著至****=高度显著)。
图71描绘整个研究期间ODN1 (GCGT3-TG4T-5Chol)的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。
图72描绘在接种疫苗后第14天(上小图)和第21天(下小图)，ODN2 (GCGT3-TG4T)的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。星号指示显著性的水平(*=显著至****=高度显著)。
图73描绘整个研究期间ODN2 (GCGT3-TG4T)的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。
图74描绘在接种疫苗后第14天(上小图)和第21天(下小图)，ODN3 (2006-PTO)的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。星号指示显著性的水平(*=显著至****=高度显著)。
图75描绘整个研究期间ODN3 (2006-PTO)的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。
图76描绘在接种疫苗后第14天(上小图)和第21天(下小图)，阳性和阴性对照测试物品的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。星号指示显著性的水平(*=显著至****=高度显著)。
图77描绘整个研究期间阳性和阴性对照测试物品的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。
图78描绘与单独的NDV疫苗相比，整个研究期间ODN的最佳浓度下的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。
图79描绘与单独的NDV疫苗相比，pv第14天(上小图)和第21天(下小图)，ODN的最佳浓度下的平均HI滴度(Log2)(与标准偏差)结果。
说明性实施方案的详述
通过参考结合附图采用的以下详述，可以更容易地理解公开的组合物和方法，所述附图形成本公开的一部分。应理解，公开的组合物和方法不限于本文描述和/或显示的具体组合物和方法，并且本文使用的术语是为了仅通过实例的方式描述具体实施方案的目的，并且不意欲限制请求保护的组合物和方法。
除非另有特别说明，否则关于可能的作用机制或模式或改进原因的任何描述仅仅意在是说明性的，并且公开的组合物和方法不应受任何此类建议的作用机制或模式或改进原因的正确性或不正确性的约束。
在整个该文本中，描述涉及组合物和使用所述组合物的方法。在本公开描述或请求保护与组合物相关的特征或实施方案的情况下，这种特征或实施方案同样适用于使用所述组合物的方法。同样，在本公开描述或请求保护与使用组合物的方法相关的特征或实施方案的情况下，这种特征或实施方案同样适用于所述组合物。
当表达值的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。此外，对范围内陈述的值的提及包括该范围内的各个和每个值。所有范围都是包括性的和可组合的。当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解具体值形成另一个实施方案。对具体数值的提及至少包括该具体值，除非上下文另外清楚地指出。
应理解，为了清楚起见本文在分开的实施方案的上下文中描述的公开的组合物和方法的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了清楚起见在单个实施方案的上下文中描述的公开的组合物和方法的各种特征也可以分开或以任何子组合提供。
如本文所用，单数形式 “一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数。
如本文所用，“融合(fuse)”或“融合(fusing)”是指在两个化学反应性种类之间产生化学键。在本公开的上下文中，融合最经常是指将特定元件并入寡核苷酸中。例如，可以将一系列的胸腺嘧啶核苷酸融合至寡核苷酸的3'末端。
如本文所用，“G-四联体序列”是指在寡核苷酸的5'末端附近的一段连续的鸟嘌呤残基，其使得所述寡核苷酸能够与其他G-四联体序列相互作用以形成G-四联体。所述G-四联体增强核酸的免疫刺激性特性。例如，包含G-四联体序列的寡核苷酸可以相互作用，产生G-四联体。在基因的启动子区域中出现的G-四联体序列可以形成参与调节基因的表达的四级结构。尽管G-四联体序列不限于任何特定序列，但G-四联体序列的实例是TGGGGT (SEQID NO:265)。
如本文所用，“G-线序列(G-wire sequence)”、“G线序列(G wire sequence)”、“G线序列(Gwire sequence)”和相关术语是指至少四个连续的鸟嘌呤核苷酸中的多个，最经常两个。位于寡核苷酸的5'末端处或附近的多个鸟嘌呤核苷酸被两个或更多个非鸟嘌呤核苷酸(即，胸腺嘧啶核苷酸)分隔。G-线序列能够与其他G-线序列相互作用以形成G-线结构。G-线结构可以增强核酸的免疫刺激性特性。示例性G-线序列是GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257)或GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO:258)。
如本文所用，术语“鸟嘌呤核苷酸富集的序列”、“鸟嘌呤富集的序列”等是指这样的核酸序列，其包含一段连续的鸟嘌呤核苷酸，通常4至6个鸟嘌呤核苷酸，或核酸的区域，通常在具有比腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸更多的鸟嘌呤核苷酸的寡核苷酸的5'末端处或附近。如本文所公开的鸟嘌呤核苷酸富集的序列可以增强寡核苷酸的免疫刺激性特性。G-四联体和G-线序列是两种类型的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
如本文所用，“插入”是指在寡核苷酸的合成期间在特定位置添加特定的核苷酸。
如本文所用，“平行取向”是指不同寡核苷酸之间的定向相互作用。例如，图23B中的圆圈图示表明具有平行取向的四个寡核苷酸，因为寡核苷酸的四聚体彼此平行定位。在一些方面，各个寡核苷酸可以以相同的5'至3'方向定向。
如本文所用的术语“受试者”意指任何动物，包括任何类型的禽类、哺乳动物或水生物种，且尤其是鸡。可以使用公开的方法和用公开的组合物治疗受试者。
术语“TLR21测试”或其变体，是指向实施例2中所述的HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞系施用寡核苷酸，以确定所述寡核苷酸是否刺激TLR21。
在整个说明书和权利要求中使用涉及说明书的各方面的各种术语。向此类术语给予其在本领域中的普通含义，除非另外指出。其他特别定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。
本文公开了包含杀稻瘟菌素抗性基因和合成的SEAP报告基因构建体(“NFκB-SEAP”)的重组HEK293细胞系以及用NFκB-SEAP构建体和鸡TLR21构建体共转染的稳定细胞系(HEK293-NFκB-bsd-cTLR21)。这后一种细胞系可用于测试候选化合物的TLR21-介导的免疫刺激性特性。如实施例中所表明，HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞系可用于鉴定能够引发TLR21-介导的免疫应答的寡核苷酸。
本文还提供了寡核苷酸及其用于活化或以其他方式刺激TLR21的方法。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一种病原体相关分子标志物(PAMP)，特别是未甲基化的二核苷酸CpG基序，其与宿主生物体中表达的病原体识别受体相互作用。在一些实施方案中，所述寡核苷酸还具有鸟嘌呤核苷酸富集的序列。这些序列可以促进DNA链折叠成四级结构，或者在寡核苷酸的情况下，促进一种或多种包含该序列的寡核苷酸的聚集。本文表明，如果具有CpG二核苷酸基序的寡核苷酸进一步包含鸟嘌呤核苷酸富集的序列，则可以增强所述寡核苷酸的免疫原性。鸟嘌呤核苷酸富集的序列不必仅由鸟嘌呤核苷酸构成，但其必须是富集的。如上所述并且如在整个这些公开内容中所例举的鸟嘌呤富集的序列是寡核苷酸的区段，其包含比任何其他残基(即腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶核苷酸)更多的鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，对寡核苷酸序列和结构的额外操纵可以进一步增强所述寡核苷酸刺激TLR21的能力。因此，本公开的一个实施方案包括寡核苷酸，其包含至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
先前已经显示，向含有CpG的寡核苷酸的3'末端添加脱氧鸟嘌呤(dG)核苷酸在体外增强TLR9活化。因为TLR9是鸡TLR21的哺乳动物功能等效物，预期3' dG延伸还将提高经设计以活化TLR21的寡核苷酸的免疫原性。令人惊讶地，对于TLR21活化中的3'鸟嘌呤核苷酸富集的序列并非如此。具有两个或更多个dG的3'延伸的寡核苷酸不能活化TLR21(图4A和4B)，而向含有CpG的寡核苷酸的5'末端添加dG延伸显著提高所述寡核苷酸的免疫原性。
不仅在所述寡核苷酸中的鸟嘌呤核苷酸富集的序列的位置影响TLR21活化的增强，而且序列的内容物也具有作用。由于该原因，在本公开的一些实施方案中，所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含第一多个连续的鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含两至八个鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含两个鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含三个鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含四个鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含五个鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含六个鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含七个鸟嘌呤核苷酸。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含八个鸟嘌呤核苷酸。在还有其他方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含多于八个鸟嘌呤核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、92、93、96、97、100、102、104、106、108或143。在一些实施方案中，所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)。在还有其他实施方案中，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
dG的单一延伸不是唯一可以增强TLR21刺激的5'修饰。例如，也可以将腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶核苷酸富集的序列添加至具有至少一个CpG基序的寡核苷酸的5'末端，并且导致增强的TLR21刺激，尽管少于在所述寡核苷酸的5'末端的鸟嘌呤富集的序列引发的TLR21刺激(参见图8A和8B)。尽管在所述寡核苷酸的5'末端的单一多个鸟嘌呤残基可以引发TLR21刺激，但在鸟嘌呤核苷酸富集的序列中的额外多个鸟嘌呤核苷酸可以进一步增强所述寡核苷酸的刺激特性。因此，在一些方面，本公开的寡核苷酸包含在所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述至少一个CpG基序之间的第二多个鸟嘌呤核苷酸。
在一些方面，所述多个鸟嘌呤核苷酸包含G-四联体序列。在一些实施方案中，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸、所述第二多个鸟嘌呤核苷酸或两者包含G-四联体序列。如上所定义的G-四联体序列允许寡核苷酸之间的相互作用。不受理论的束缚，所述寡核苷酸经由G-四联体序列的相互作用允许CpG二核苷酸基序的浓缩和TRL21识别的相应增加的概率。G-四联体序列还为多种TLR21受体相互作用(增强亲和力)和受体交联提供了机会。在一些实施方案中，所述免疫刺激性组合物进一步包含具有G-四联体序列的至少一个额外寡核苷酸，其中所述寡核苷酸和所述至少一个额外寡核苷酸在四级结构中具有平行取向。在一些方面，所述G-四联体序列包含TGGGGT (SEQ ID NO:265)。
G-线序列是另一种鸟嘌呤核苷酸富集的序列，其可被添加至具有CpG基序的寡核苷酸的5'。在本公开的一些方面，所述第一和第二多个鸟嘌呤核苷酸包含G-线序列。在一些方面，所述G-线序列包含SEQ ID NO:257或258。在还有其他方面，所述G-线序列包含SEQ IDNO:141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203或GCGT-G线3。两种多个鸟嘌呤核苷酸可以被非鸟嘌呤核苷酸、核苷酸类似物或任何其他间隔基或接头分隔。例如，在本公开的一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述第二多个鸟嘌呤核苷酸被至少一个核苷酸分隔。如本文所用，术语“间隔基”是指相似的核苷酸基序之间、即两个CpG基序之间或两个鸟嘌呤核苷酸富集的序列基序之间的化学键，而术语“接头”是指不同的核苷酸基序之间、即鸟嘌呤核苷酸富集的序列和另一个核苷酸基序(例如CpG基序)之间的化学键。为了清楚起见，术语“间隔基”和“接头”用于描述正在讨论的寡核苷酸的方面。然而，本领域技术人员将理解，本文对于间隔基公开的结构可与本文对于接头公开的结构互换，且反之亦然。
不受任何特定理论的束缚，G-线序列可能使得寡核苷酸与具有G-线序列的其他寡核苷酸相互作用并聚集。寡核苷酸及其CpG基序的这种聚集可以导致TLR21的刺激增强。
寡核苷酸内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列可以通过核苷酸、核苷酸类似物或其他接头与CpG核苷酸基序分隔。因此，在本公开的一些实施方案中，所述寡核苷酸进一步包含所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列和下游至少一个CpG基序之间的接头。所述接头不需要与所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列或CpG基序直接相邻，但所述接头必须位于两个序列基序之间，而不管所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列和所述接头之间以及所述CpG基序和所述接头之间的间插序列。在本公开的一些实施方案中，所述接头包含至少三个核苷酸。在一些实施方案中，所述接头可以不包含含氮碱基。例如，在一些方面，所述接头是六乙二醇、丙二醇、三乙二醇或其衍生物。在其他实例中，具有接头的寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
存在于本公开的寡核苷酸中的二核苷酸CpG基序据信是在鸡中被TLR21识别的PAMP。尽管甚至单个CpG基序可以刺激TLR21，但寡核苷酸上存在的多个CpG可以增加刺激的TLR21信号强度。由于该原因，在本发明的一些方面，所述至少一个CpG基序包含两个、三个、四个或五个CpG基序。在一些方面，所述至少一个CpG基序包含六个或更多个CpG基序。在一些方面，所述至少一个CpG基序包含两个CpG基序。在一些方面，所述至少一个CpG基序包含三个CpG基序。在一些方面，所述至少一个CpG基序包含四个CpG基序。在一些实施方案中，所述至少一个CpG基序包含四个CpG基序。
在本公开的寡核苷酸的一些实施方案中，每个CpG基序可以通过至少一个核苷酸或核苷酸类似物与其他CpG基序分隔。在一些方面，所述至少一个核苷酸是二至三个胸腺嘧啶核苷酸。在其他方面，所述至少一个核苷酸是一至四个核苷酸，尽管间插核苷酸的数目可以根据间插核苷酸的序列而不同。在一些方面，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:217、218、219或220。与CpG基序相邻的核苷酸 - 连同CpG基序本身 - 构成CpG序列元件(例如，XCGX，其中X = 任何核苷酸)。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸包含CpG序列元件，其是GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其任何组合。
在本公开的一些实施方案中，所述CpG基序包含具有四个核苷酸的CpG序列元件。在一些方面，所述寡核苷酸包含至少两个CpG序列元件。在一些方面，所述寡核苷酸包含至少三个CpG序列元件。在一些方面，所述寡核苷酸包含至少四个CpG序列元件。在一些方面，所述寡核苷酸包含至少五个CpG序列元件。在一些方面，所述寡核苷酸包含至少六个CpG序列元件。在一些方面，所述寡核苷酸包含多于八个、十个、十五个或甚至二十个CpG序列元件。
在本公开的寡核苷酸的其他实施方案中，所述CpG基序各自通过间隔基或间隔基和至少一个核苷酸的组合与其他CpG基序彼此分隔。在一些方面，至少一个CpG基序通过间隔基或间隔基和至少一个核苷酸的组合与最接近的其他CpG基序分隔，而至少两个其他CpG基序与彼此相邻。尽管分隔的CpG基序可以增强设计的寡核苷酸的免疫刺激能力，但承认的是，与彼此相邻的CpG基序仍然可以刺激TLR21。
用于线性分隔CpG基序的间隔基可以是在CpG基序之间桥接所述寡核苷酸的至少一部分的任何连接。所述间隔基可以包括，但不必限于，脱氧核糖磷酸酯桥、多碳链或重复的化学单元。间隔基的一种基本特性是与所述寡核苷酸的核苷酸主链形成化学键的能力。因此，在一些实施方案中，所述间隔基是脱氧核糖磷酸酯桥。在一些方面，所述脱氧核糖磷酸酯桥可以包含含氮碱基，而在其他方面，所述脱氧核糖磷酸酯桥是无碱基的。在一些方面，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:221，其包含无碱基的脱氧核糖磷酸酯桥。
在本公开的其他实施方案中，所述间隔基包含碳链。所述碳链可以包含2至12个碳原子。可以使用包含碳链的二醇，因为末端醇基团可以与寡核苷酸的末端醇和/或磷酸酯基团反应。在一些实施方案中，所述碳链包含两个碳原子，且在一些方面，所述碳链衍生自乙二醇。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2是乙二醇。
本公开的其他实施方案提供了包含三个碳原子的碳链。在这些实施方案的一些方面，所述碳链衍生自1,3-丙二醇。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含CG-Gw2X2、CG-Gw2X2-2或ODN-X3、CG-Gw2X2-1、CG-Gw2X2-3、CG-Gw2X2-4、CG-Gw2X2-5、CG-G4T16X2-1、CG-G4T16X2-2、CG-G4T16X2-3、CG-G4T16X2-4或CG-G4T16X2-5，其中X2是三碳链；2006-PDE5dG4-X2，其中X2是衍生自1,3-丙二醇的三碳链；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4是衍生自1,3-丙二醇的三碳链。
在本公开的还有其他实施方案中，所述寡核苷酸包含碳链间隔基，其中所述碳链包含四个碳原子。在这些实施方案的一些方面，所述碳链衍生自1,4-丁二醇。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4是衍生自1,4-丁二醇的四碳链。
在本公开的还有其他实施方案中，所述寡核苷酸包含具有重复的化学单元的间隔基。例如，在一些实施方案中，所述重复的化学单元是乙二醇。所述重复的化学单元可以重复两次至十二次。在一些实施方案中，乙二醇重复六次。因此，在一些方面，所述寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，其中X1是衍生自六乙二醇的间隔基。
尽管在寡核苷酸的3'末端上的dG延伸导致很少(如果有的话)TLR21刺激，但其他核苷酸延伸可以为寡核苷酸赋予增强的免疫原性。具体地，在本公开的一些方面，所述寡核苷酸可以进一步包含三胸腺嘧啶核苷酸3'末端。在一些方面，所述寡核苷酸包含SEQ IDNO:204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
对于本文公开的每种寡核苷酸，本领域技术人员将知道核苷酸可以取代为核苷酸类似物。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含磷酸二酯主链，尽管本文公开的寡核苷酸的其他实施方案包括硫代磷酸酯主链。
在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸可以包含脂质部分，其可以导致寡核苷酸的免疫原性增加。免疫原性增加的一种可能解释是脂质部分可以发挥功能以增强寡核苷酸的生物利用度。在一些实施方案中，所述脂质部分在所述寡核苷酸的5’末端处或附近。该脂质“帽”可以防止降解，增加溶解度，提高寡核苷酸在药物组合物中的稳定性，可以经由胶束或其他聚集体形成或其任何组合导致多齿配体。在一些方面，所述脂质部分是胆固醇。
因为公开的寡核苷酸经由TLR21刺激增强的免疫应答，所以本公开的其他实施方案包括通过向有此需要的受试者施用本文公开的免疫刺激性寡核苷酸来预防或治疗疾病的方法。
还提供了免疫刺激性组合物，其包含本文公开的免疫刺激性寡核苷酸。尽管这些免疫刺激性组合物包含如本文所述的寡核苷酸，但该组合物还可以包括影响该组合物的免疫原性、有效性和效力的其他组分。例如，在一些方面，所述免疫刺激性组合物包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体使组合物适应通过选自以下的途径施用：静脉内、肌肉内、乳房内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通过气溶胶、卵内(in ovo)、黏膜、经皮、通过浸入、口服、眼内、气管内、鼻内、肺、直肠或本领域技术人员已知的其他方式。一种或多种药学上可接受的载体可以是与免疫刺激性组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油，芝麻油等。例如，可以使用0.4%盐水和0.3%甘氨酸。这些溶液是无菌的，且通常不含颗粒物质。它们可以通过常规的众所周知的灭菌技术(例如，过滤)进行灭菌。所述组合物可含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在这种药物制剂中本发明的分子的浓度可以宽泛地变化，即按重量计从小于约0.5%，通常至至少约1%至高达15或20%，并且将主要基于需要的剂量、流体体积、粘度等根据所选的特定施用方式进行选择。包括其他人蛋白、例如人血清清蛋白的合适的载体和制剂，例如描述于例如Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 第21版, Troy, D.B.编, Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia,PA 2006, 第5部分, Pharmaceutical Manufacturing第691-1092页，尤其参见第958-989页。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸和所述载体是连接的。如用于描述寡核苷酸和载体之间的关系，“连接的”是指寡核苷酸和载体的物理缔合。当寡核苷酸和载体彼此结合，彼此相互作用，或组合，偶联，或以其他方式结合时，它们可以被认为是连接的。
在一些实施方案中，本文所述的免疫刺激性组合物进一步包含半抗原。在一些方面，免疫刺激性寡核苷酸连接至半抗原。所述半抗原可以引发针对特定微生物(诸如，但不限于，大肠杆菌(E. coli)或沙门氏菌属(Salmonella))的免疫应答，而免疫刺激性寡核苷酸引发由TLR21与寡核苷酸相互作用介导的非特异性免疫应答。这些和其他感染性微生物在居住者的感染风险增加的大规模孵卵场中引起特别担忧。
所述免疫刺激性组合物的一些实施方案提供了用于预防或治疗感染性疾病的疫苗，其包含本文所述的免疫刺激性寡核苷酸中的至少一种。为了寡核苷酸引发任何免疫应答，必须将其有效地递送至其靶标，无论靶标是细胞培养物，鸡，还是其他脊椎动物。因此，本公开的一个方面提供了包含本文所述的免疫刺激性寡核苷酸的载体。
可以通过其半最大有效浓度(EC50)来测量所述免疫刺激性寡核苷酸和因此仅包含所述寡核苷酸作为活性成分的免疫刺激性组合物的功效。EC50是诱导如下应答的免疫刺激性组合物的浓度的量度，所述应答是通过施用所述组合物可获得的最大应答的一半。该浓度越低，寡核苷酸越有效。在本公开的一些方面，所述免疫刺激性组合物可以具有pM范围内的EC50。在一些方面，所述EC50为约0.1至100 pM。在一些方面，所述EC50为约100至200 pM。在一些方面，所述EC50为约200至300 pM。在一些方面，所述EC50为约300至400 pM。在一些方面，所述EC50为约400至500 pM。在一些方面，所述EC50为约500至600 pM。在一些方面，所述EC50为约600至700 pM。在一些方面，所述EC50为约700至800 pM。在一些方面，所述EC50为约800至900 pM。在一些方面，所述EC50为约900 pM至1 nM。在还有其他方面，所述EC50小于约100 pM。
关于免疫刺激性组合物中寡核苷酸的浓度，在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约0.1至10 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约10至20 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约20至30 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约30至40 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约40至50 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约50至60 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约60至70 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约70至80 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约80至90 nM。在一些方面，所述寡核苷酸的浓度为约90至1 µM。在还有其他方面，所述寡核苷酸的浓度小于约20 nM。
在本公开的一些实施方案中，所述免疫刺激性组合物可以进一步包含至少一种具有G-线序列的额外寡核苷酸。因为G-线序列促进具有相同或相似G-线序列的其他寡核苷酸的聚集，所以免疫刺激性组合物的一个方面进一步包含至少一种具有G-线序列的额外寡核苷酸。在其中所述免疫刺激性组合物包含具有G-线序列的多个寡核苷酸的一些方面，所述寡核苷酸和至少一个额外寡核苷酸具有G-线构象。
本文还提供了刺激toll-样受体21 (TLR21)的方法，其包括向有此需要的受试者施用寡核苷酸，所述寡核苷酸具有至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。还提供了用于引发受试者中的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用免疫刺激性寡核苷酸，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个CpG二核苷酸基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的至少一个鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
所述寡核苷酸可以如上所述的免疫刺激性组合物的形式施用。所述免疫刺激性组合物可以进一步包含如上所述的半抗原、药学上可接受的载体或两者。在一些方面，施用所述免疫刺激性组合物可以静脉内、肌肉内、乳房内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通过气溶胶、卵内、粘膜、经皮、通过浸入、口服、眼内、气管内或鼻内进行。需要施用的受试者是动物。在一些方面，所述受试者是禽类物种的成员。例如，本文公开的免疫刺激性组合物可以卵内施用于有胚的鸡蛋或肌肉内施用于孵化的小鸡或者甚至成年禽类。
本文还提供了用于增加具有至少一个CpG基序的寡核苷酸的TLR21-刺激活性的方法，其包括将所述寡核苷酸的5'末端融合至鸟嘌呤核苷酸富集的序列。在一些方面，所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列是G-四联体序列。在一些方面，所述G-四联体序列包含第一多个鸟嘌呤核苷酸。该第一多个鸟嘌呤核苷酸可以包含TGGGGT序列(SEQ ID NO:265)的部分。在一些方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含三至八个鸟嘌呤核苷酸。在还有其他方面，所述G-四联体序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)。
本公开的其他实施方案提供了鸟嘌呤核苷酸富集的序列以包含第一和第二多个鸟嘌呤核苷酸。在其他方面，所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含G-线序列。在一些方面，所述G-线序列包含SEQ ID NO:257或258。在该方法的还有其他方面，所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述第二多个鸟嘌呤核苷酸被至少一个核苷酸分隔。
在一些实施方案中，如本文所公开的方法可以进一步包括在所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述至少一个CpG基序之间插入接头。所述接头已经在上面描述，并且可以包含，但不限于，至少三个核苷酸或六乙二醇。
根据本发明的一些方面，可以通过增加寡核苷酸中CpG基序的数目来进一步增强寡核苷酸刺激TLR21的能力。在一些方面，至少一个CpG基序是多个CpG基序，并且多个CpG基序包含两个、三个、四个或五个CpG基序。CpG基序之间的距离可以影响寡核苷酸的TLR21刺激特性。由于该原因，公开的方法的一些方面提供了在CpG基序之间插入至少一个核苷酸或核苷酸类似物。所述至少一个核苷酸可以是二至三个胸腺嘧啶核苷酸。
该方法的其他实施方案提供了在每个CpG基序之间插入间隔基。所述间隔基必须能够与一条相邻核苷酸链的3'末端键合，并且与另一核苷酸链的5'末端键合。在一些方面，所述间隔基是脱氧核糖磷酸酯桥，其在一些方面可以是无碱基的。
在一些方面，所述间隔基可以包含碳链。在一些实施方案中，所述碳链包含两个碳原子。在一些方面，所述碳链衍生自乙二醇。其他实施方案提供了包含三个碳原子的碳链。在一些方面，所述碳链衍生自1,3-丙二醇。在一些实施方案中，所述碳链包含四个碳原子，并且在一些方面，所述碳链衍生自1,4-丁二醇。在还有其他实施方案中，所述间隔基包含重复的化学单元。在一些方面，所述重复的化学单元是乙二醇，并且在一些方面，所述间隔基衍生自六乙二醇。
在增强寡核苷酸的TLR21刺激特性的方法中还设想在寡核苷酸中并入至少一个核苷酸类似物或脂质部分。在一些方面，所述脂质部分在所述寡核苷酸的5'末端处或附近。该方法的还有其他实施方案包括修饰与CpG基序相邻的核苷酸。
实施例
提供以下实施例以进一步描述本文公开的一些实施方案。所述实施例意欲举例说明而非限制公开的实施方案。
实施例1：NFκB途径报告基因HEK293细胞系的生成
pNifTy2-SEAP (Invivogen)和其他市售质粒载体通常用于生成NFκB途径报告基因细胞系。pNifTy2-SEAP的市售形式包含用于细菌和哺乳动物选择的博莱霉素抗性基因，这需要大量的这种细胞抑制剂(最多达400 µg/ml)，并且该选择有时不可靠。因此，开始生成具有更好选择标记、优选杀稻瘟菌素抗性的报告质粒。
以人密码子-优化的形式合成编码pNifty2-SEAP-编码的(分泌的胚胎碱性磷酸酶)SEAP基因的开放阅读框。还合成了pNifty2-SEAP中的ATG起始密码子上游的284 bp区域，其涵盖5个NFκB识别位点和内皮-白细胞粘附分子(ELAM)启动子位点，并进行以下修饰：在紧临ATG起始密码子上游构建KpnI位点(插入序列“GGTA”)，并且进一步在上游，引入由5'至3'的EcoRV、MluI和NdeI位点组成的序列。此外，在终止密码子的下游，引入NheI位点和第二个EcoRV位点。注意避免在SEAP开放阅读框中存在这些位点。
NFκB-SEAP(人密码子优化的)(SEQ ID NO:1)(下划线显示用于亚克隆的限制性酶位点(MluI和NdeI)。起始ATG和终止TAA密码子以粗体强调。)
该合成的SEAP基因构建体(“NFκB-SEAP”)通过MluI/NheI双重消化从克隆载体切出，并通过连接引入pcDNA3.1(+)载体中(图1)，用MluI/NheI预切割并凝胶纯化以除去CMV启动子区域。自制版本的pcDNA3.1(+)(其中新霉素抗性基因(NeoR/KanR)已被杀稻瘟菌素抗性基因(bsd → pcDNA3.1(+)-bsd)或嘌呤霉素抗性基因(puro → pcDNA3.1(+)-puro)替换)以相同方式处理，并与NFκB-SEAP构建体连接。
从该组构建体，选择含有bsd的质粒pcDNA3.1(+)-bsd-NFκB-SEAP用于HEK293转染。为此，通过标准转染方法，将PvuI-线性化形式引入细胞，并用10 µg/ml杀稻瘟菌素选择具有基因组整合的构建体的细胞。针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的SEAP产生测试抗性细胞合并物，并且通过单细胞克隆，选择具有尤其有利的信噪比的一个克隆细胞系(HEK293-NFκB-SEAP-bsd或HEK293-NFκB-bsd)用于进一步研究。人TNF-α对于该细胞系的EC50为3.2ng/ml(图2)。
实施例2：鸡TLR21转基因细胞系的生成
鸡toll-样受体21 (TLR21)是一种非甲基化的CpG DNA受体，其与哺乳动物TLR9在功能上是同源的，但不是直系同源的(Brownlie等人 2009, Keestra等人 2010)。基于Genbank登录号NM_001030558的推导蛋白序列，并通过朝向人密码子使用进行优化，合成编码鸡TLR21的基因。在起始密码子ATG的上游，引入包括Kozak序列的KpnI位点，而在终止密码子的下游，添加NotI位点和EcoRV位点。将TLR21基因通过KpnI/NotI双重消化从克隆载体切出，凝胶纯化，并连接至KpnI/NotI-切割的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中。将该pcDNA3.1(+)-cTLR21用PvuI线性化，并与PvuI-线性化的pcDNA3.1(+)-bsd-NFκB-SEAP一起转染至HEK293中，产生HEK293-NFκB-bsd-cTLR21或HEK293–bsd-cTLR21。
通过同时应用杀稻瘟菌素和G418选择细胞合并物，通过TNF-α针对功能性NFκB途径进行测试，并且通过硫代磷酸酯寡核苷酸2006-PTO (SEQ ID NO:3)针对活性cTLR21进行测试。单细胞克隆产生响应于2006-PTO，具有优异信噪比的克隆细胞系。克隆的HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞系显示优异的TNF-α敏感性(EC50 = 1.4 ng/ml)，这类似于对于HEK293-NFκB-bsd所观察到的结果(图2)。
原鸡TLR21-Gen(基于NM_001030558) (SEQ ID NO:2)(通过加下划线强调起始ATG和终止TAG密码子)：
已知硫代磷酸酯(PTO)寡脱氧核苷酸(ODN) 2006-PTO (ODN 2006)活化TLR21。Keestra, A.M., de Zoete, M.R., Bouwman, L.I., van Putten, J.P., 2010. ChickenTLR21 is an innate CpG DNA receptor distinct from mammalian TLR9. J. Immunol.185, 460-467。在该研究的克隆的TLR21细胞系(HEK293-NFκB-bsd-cTLR21)中，2006-PTO也是活性的，其中活化的EC50为~ 8.5 nM。相反，HEK293-NFκB-bsd未显示任何SEAP分泌(图3A)。这表明该ODN的特异性相互作用对TLR21是特异性的。2006-PDE，2006-PTO的磷酸二酯键合形式，其对TLR21的刺激活性弱得多。其EC50的估计值为> 250 nM，与2006-PTO相比，最大刺激低得多(图3B)。
实施例3：包含形成5' G-四联体的序列的ODN增强TLR21活性
3'脱氧鸟嘌呤(dG)添加对2006-PDE(ODN2006，磷酸二酯形式)的TLR21识别的影响
使用2006-PTO的磷酸二酯键合版本，2006-PDE，作为基础，以研究3'-dG修饰对实施例2中描述的HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞系中的TLR21-刺激活性的影响。为此，在20 nM开始，用15个稀释步骤(1:2)，达到近似1 pM作为最终稀释度，进行滴定实验。具体地，将HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞以10,000个细胞/孔接种至384孔板中的45 µl生长培养基中。将这些细胞暴露于溶解在生长培养基中的寡核苷酸，并在37℃下孵育3-4天。将每孔10µl培养物上清液转移至384孔板中，并添加90 µl的50 mM NaHCO3/Na2CO3、2 mM MgCl2、5mM对硝基苯基磷酸酯(pNP) pH 9.6，并通过动力学测量405nM处的光密度的时间变化(mOD405nm/min)来测定反应速率。
表1：ODN序列(小写：PTO键，大写PDE键)
尽管如所预期，2006-PTO在纳摩尔浓度范围内刺激TLR21，但2006-PDE显示没有显著的TLR21-刺激活性。在3'末端添加一个dG导致在nM范围内的一些显著的TLR21-刺激活性，其在第二(dG2)和第三(dG3) dG添加的情况下仍然存在，尽管弱得多。第4、第5、第6、第7和第8 dG (dG4-dG8)的添加导致TLR21无活性的ODN (图4A)。在最高达0.33 nM (330 pM)的浓度范围内，所述ODN无一显示TLR21活性(图4B)。
5'dG添加对2006-PDE(ODN2006，磷酸二酯形式)的TLR21识别的影响
使用2006-PTO的磷酸二酯键合版本，2006-PDE，作为基础，以研究5'-dG修饰对TLR21-刺激活性的影响。为此，在20 nM开始，用15个稀释步骤(1:2)，达到近似1 pM作为最终稀释度，进行滴定实验。
表2：ODN序列(小写：PTO键，大写PDE键)
2006-PTO在纳摩尔浓度范围内刺激TLR21，并且2006-PDE显示没有显著的TLR21-刺激活性。在2006-PDE的5'-末端增加一个dG和两个G，导致在两位数nM范围内的一些小的TLR21-刺激活性。第三dG (dG3)导致TLR21活性急剧增加，其中计算的EC50为513皮摩尔浓度(pM)(表3)。第4 dG的添加使活性进一步增加14倍(计算的EC50为36 pM，表3)，而第5、第6、第7和第8 dG (dG4-dG8)导致进一步EC50增加和具有在17.1和22.2 pM之间的EC50的TLR21刺激平台。综上所述，看起来在5'末端添加3个dG、而不是两个dG之后，在ODN结构中发生一些根本变化，其导致TLR21活性从几乎无活性至强烈的皮摩尔浓度活性的大大增加，其通过额外的5' dG进一步增加。在3'末端等同dG添加没有导致高活性，对应的ODN衍生物在很大程度上是无活性的(比较图4A-B、5A-B和6，以及表3)。
表3：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
| ODN | EC<sub>50</sub>皮摩尔浓度(pM) | Vmax milliOD 405nm/min (mOD405/min) |
| 2006-PDE | 很大程度上无活性 | 很大程度上无活性 |
| 2006-PTO | 22463 | 1223 |
| 2006-PDE3dG1 | 35072 | 1121 |
| 2006-PDE3dG2 | 很大程度上无活性 | 很大程度上无活性 |
| 2006-PDE3dG3 | 很大程度上无活性 | 很大程度上无活性 |
| 2006-PDE3dG4 | 无活性 | 无活性 |
| 2006-PDE3dG5 | 无活性 | 无活性 |
| 2006-PDE3dG6 | 无活性 | 无活性 |
| 2006-PDE3dG7 | 无活性 | 无活性 |
| 2006-PDE3dG8 | 无活性 | 无活性 |
| 2006-PDE5dG1 | 弱 | 弱 |
| 2006-PDE5dG2 | 很大程度上无活性 | 很大程度上无活性 |
| 2006-PDE5dG3 | 513 | 589 |
| 2006-PDE5dG4 | 36.0 | 559 |
| 2006-PDE5dG5 | 22.2 | 553 |
| 2006-PDE5dG6 | 17.1 | 549 |
| 2006-PDE5dG7 | 22.2 | 555 |
| 2006-PDE5dG8 | 21.9 | 559 |
为了研究在TLR21上测试的ODN的电泳迁移行为，进行16% TBE聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后进行亚甲基蓝染色。在2006-PDE-5dG0-8的情况下，更高阶结构的出现(图7A、7B)和高TLR21刺激活性之间存在明显的相关性。可能看起来，更高阶结构通过如下形成：生成已知经常由连续G形成的G-四联体结构，并且可能涉及DNA的同一链(“分子内G-四联体”)或不同链(“分子间G-四联体”)。Williamson JR, G-Quartet Structures in Telomeric DNA,Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23: 703-730 (1994); Simonsson T, G- Quadruplex DNA Structures – Variations on a Theme, Biol. Chem. 382: 621-628(2001)。然而，在2006-PDE-3dG0-8寡核苷酸中观察到相同的聚集，所述2006-PDE-3dG0-8对TLR21的活性不佳或没有活性。这表明单独的聚集对于强烈的TLR21刺激活性是不够的。连续鸟嘌呤至5'末端的定位看起来影响TLR21刺激活性。
使用实例2006-PDE-5dG6进一步检查有效的TLR21刺激对5'鸟嘌呤延伸的依赖性。
挑取2006-PDE-5dG6作为实例，因为其看起来在2006-PDE的5'dGn扫描中形成TLR21刺激活性的平台(参见图5A、5B、6和表3)。5'-dG6延伸被dA6、dT6或dC6替换(表4)。
表4：
当2006-PDE在5'末端用dN6修饰时，每个碱基均聚物产生TLR21活性的一些增加，改进顺序如下：dA6 < dC6 < dT6 <<<<<<<< dG6 (表8A)。5'-dG6的改进明显比其他碱基的改进高几个数量级(特别是在低浓度下可见，图8B)，表明由具有G-四联体形成潜能的这种修饰赋予的特殊品质。
使用实例2006-PDE-5dG6检查通过5'-dG-修饰的2006-PDE的有效TLR21刺激对CpG元件的存在的依赖性。
挑取2006-PDE-5dG6作为实例，因为其看起来在2006-PDE的5'dGn扫描中形成TLR21刺激活性的平台(参见图5A、5B、6和表3)。CpG基序对TLR21刺激活性的影响通过如下研究：1)用5-甲基-胞苷替换四个CpG基序中的每个胞苷来合成该ODN；2)将每个CpG基序倒置为GpC，和3)用腺嘌呤替换CpG基序中的每个鸟嘌呤，用胸腺嘧啶替换每个胞嘧啶，和分别用胸腺嘧啶和腺嘌呤同时替换胞嘧啶和鸟嘌呤。使用HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞测试所得寡核苷酸的刺激TLR21的能力，如实施例3中所述。
表5：
在此研究的干扰2006-PDE-5dG6中的CpG基序的完整性的每种修饰都导致活性的大幅丧失(图9A)，其在低ODN浓度下变得尤其明显(图9B)。
检查2006-PTO的3'-和5'-dG6修饰对TLR21刺激活性的影响，并与2006-PDE中的等同变化进行比较。
为了研究通过dG延伸添加改进TLR21-刺激活性是否也适用于具有硫代磷酸酯主链的寡脱氧核苷酸(PTO-ODN)，合成2006-PDE、2006-PDE-3dG5和2006-PDE-5dG6的PTO同类物(表6)，并且将它们如实施例3中所述，使用HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞刺激TLR21的能力与彼此以及它们的PDE-版本进行比较(表7，图10A和10B)。
表6：ODN序列PTO与PDE (PTO小写)
表7：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
| ODN | EC<sub>50</sub>皮摩尔浓度(pM) | Vmax milliOD 405nm/min (mOD405/min) |
| 2006-PDE | 很大程度上无活性 | - |
| 2006-PDE3dG5 | 很大程度上无活性 | - |
| 2006-PDE5dG6 | 17.1 | 556 |
| 2006-PTO | 22463 | |
| 2006-PTO3dG5 | 106775 | 2162 |
| 2006-PTO5dG6 | 42.7 | 655 |
在5'dG残基不存在的情况下，与PDE版本相比，PTO修饰为ODN赋予高得多的活性(表7，图10A和10B)。与其PTO版本相比，这对于5'dG6-修饰的2006-PDE是不同的。在此，PDE确实赋予甚至略微更高的活性(EC50)，这是出乎意料的(表7，图10A和10B)。
检查2006-PDE-5dG6的5dG6延伸中的dA替换对TLR21刺激活性的影响。
基于2006-PDE的5'的连续dG序列形成赋予TLR21-刺激活性的G-四联体的假设，预期有望破坏G-四联体形成的dG6延伸中的dA替换，应当(取决于位置)具有对TLR21刺激活性的负面影响。为此，使用本领域技术人员熟悉的方法合成单一和双重dA替换2006-PDE-5dG6ODN，并如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试其刺激TLR21的能力(表8和9，图11A-D)。
表8：ODN序列，A替换
表9：有效浓度50% (EC50)和最大信号(Vmax)
| ODN | EC<sub>50</sub>皮摩尔浓度(pM) | Vmax milliOD 405nm/min (mOD405/min) |
| 2006-PDE | 很大程度上无活性 | 很大程度上无活性 |
| 2006-PDE5dG6 | 17.1 | 556 |
| 2006-PDE5dG6-A1 | 29.0 | 593 |
| 2006-PDE5dG6-A2 | 97.1 | 570 |
| 2006-PDE5dG6-A3 | 206 | 584 |
| 2006-PDE5dG6-A4 | 318 | 568 |
| 2006-PDE5dG6-A5 | 47.0 | 559 |
| 2006-PDE5dG6-A6 | 22.6 | 549 |
| 2006-PDE5dG6-A12 | 69.1 | 551 |
| 2006-PDE5dG6-A23 | 11705 | 460 |
| 2006-PDE5dG6-A34 | 7849 | 760 |
| 2006-PDE5dG6-A45 | 113 | 539 |
| 2006-PDE5dG6-A56 | 35.0 | 500 |
一般而言，dG6延伸内的所有dA替换都导致Vmax (即，在比较实验中获得的最大报告基因读出值)的很小变化，而EC50相当大地变化，最高达超过两个数量级(表9和图11A和11B)。第1和第6位置中的单一替换对EC50非常轻微，而第2和第5位置中的单一替换导致更明显的增加。对于第3和第4位置观察到最强烈的变化，这导致EC50增加超过10倍。在双重dA替换的情况下(表9，图11C和11D)，连续的第1和第2以及第5和第6导致相对轻微的EC50增加，而第4和第5导致更强的增加。第2和第3以及第3和第4位置的双重dA替换导致EC50分别增加685倍和459倍。考虑到在该研究之前已经将3个连续dG鉴定为有效TLR21活性的最小数目并且以dG3、dG4至dG5的顺序注意到EC50增加(此后从dG5-dG8观察到EC50平台(比较图5A、5B、6和表3))的事实，这些数据进一步支持以下观念：在2006-PDE的5'的G-四联体的无干扰形成是强烈TLR21刺激的先决条件。
检查2006-PDE-5dG6的5dG6延伸中的dC替换对TLR21刺激活性的影响。
基于2006-PDE的5'的连续dG序列形成赋予TLR21-刺激活性的G-四联体的假设，预期有望破坏G-四联体形成的dG6延伸中的dC替换，应当(取决于位置)具有对TLR21刺激活性的负面影响。为此，合成单一和双重dC替换2006-PDE-5dG6 ODN，并测试它们刺激TLR21的能力，如实施例3中所解释。(表10，表11，图12A-D)。
表10：ODN序列，C替换
表11：半最大有效浓度(EC50)和最大信号(Vmax)
| ODN | EC<sub>50</sub>皮摩尔浓度(pM) | Vmax milliOD 405nm/min (mOD405/min) |
| 2006-PDE | 很大程度上无活性 | 很大程度上无活性 |
| 2006-PDE5dG6 | 17.1 | 556 |
| 2006-PDE5dG6-C1 | 35.7 | 498 |
| 2006-PDE5dG6-C2 | 43.5 | 494 |
| 2006-PDE5dG6-C3 | 295 | 546 |
| 2006-PDE5dG6-C4 | 301 | 531 |
| 2006-PDE5dG6-C5 | 44.0 | 480 |
| 2006-PDE5dG6-C6 | 35.9 | 480 |
| 2006-PDE5dG6-C12 | 83.5 | 486 |
| 2006-PDE5dG6-C23 | 2738 | 473 |
| 2006-PDE5dG6-C34 | 5176 | 578 |
| 2006-PDE5dG6-C45 | 813 | 552 |
| 2006-PDE5dG6-C56 | 62.6 | 544 |
一般而言，dG6延伸内的所有dC替换都导致Vmax (即，在比较实验中获得的最大报告基因读出值)的很小变化，而EC50相当大地变化，最高达超过两个数量级(表11和图12A和12B)。所述寡核苷酸的第1和第6位置中的单一替换对EC50非常轻微，如同所述寡核苷酸的第2和第5位置一样。对于所述寡核苷酸的第3和第4位置观察到最强烈的变化，这导致EC50增加超过10倍。在双重dC替换的情况下(表11以及图12C和12D)，所述寡核苷酸的连续的第1和第2以及第5和第6位置导致相对轻微的EC50增加，而第4和第5位置导致更强的增加。所述寡核苷酸的第2和第3位置以及第3和第4位置的双重dC替换导致EC50分别大大增加160倍和303倍。考虑到在该研究中已经将3个连续dG鉴定为有效TLR21活性的最小数目并且以dG3、dG4至dG5的顺序注意到EC50增加(此后从dG5-dG8观察到EC50平台(比较图5A-B、6和表3))，这些数据进一步支持以下观念：在2006-PDE的5'的G-四联体的无干扰形成是强烈TLR21刺激的先决条件。
检查2006-PDE-5dG6的5dG6延伸中的dT替换对TLR21刺激活性的影响。
基于2006-PDE的5'末端的连续dG序列形成赋予TLR21-刺激活性的G-四联体的假设，预期有望破坏G-四联体形成的dG6延伸中的dT替换，应当(取决于位置)具有对TLR21刺激活性的负面影响。为此，合成单一和双重dT替换2006-PDE-5dG6 ODN，并且在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试它们刺激TLR21的能力，如实施例3中所述(表12，表13，图13A-D)。
表12：ODN序列，T替换
表13：半最大有效浓度(EC50)和最大信号(Vmax)
| ODN | EC<sub>50</sub>皮摩尔浓度(pM) | Vmax milliOD 405nm/min (mOD405/min) |
| 2006-PDE | 很大程度上无活性 | 很大程度上无活性 |
| 2006-PDE5dG6 | 17.1 | 556 |
| 2006-PDE5dG6-T1 | 17.6 | 495 |
| 2006-PDE5dG6-T2 | 36.9 | 500 |
| 2006-PDE5dG6-T3 | 128 | 521 |
| 2006-PDE5dG6-T4 | 138 | 539 |
| 2006-PDE5dG6-T5 | 16.4 | 511 |
| 2006-PDE5dG6-T6 | 26.7 | 562 |
| 2006-PDE5dG6-T12 | 37.1 | 536 |
| 2006-PDE5dG6-T23 | 30459 | 629 |
| 2006-PDE5dG6-T34 | 10639 | 636 |
| 2006-PDE5dG6-T45 | 572 | 565 |
| 2006-PDE5dG6-T56 | 31.2 | 514 |
一般而言，dG6延伸内的所有dT替换都导致Vmax的很小变化，而EC50相当大地变化，最高达超过三个数量级(表13以及图13A和13B)。所述寡核苷酸的第1和第6位置中的单一替换对EC50非常轻微，如同所述寡核苷酸的第2和第5位置一样。对于所述寡核苷酸的第3和第4位置观察到最强烈的变化，这导致EC50增加超过6倍。在双重dT替换的情况下(表13以及图13C和13D)，所述寡核苷酸的连续的第1和第2以及第5和第6位置导致相对轻微的EC50增加，而第4和第5位置导致更强的增加。所述寡核苷酸的第2和第3位置以及第3和第4位置的双重dT替换导致EC50分别大大增加1781倍和622倍。考虑到在该研究中已经将3个连续dG鉴定为有效TLR21活性的最小数目并且以dG3、dG4至dG5的顺序注意到EC50增加(此后从dG5-dG8观察到EC50平台(比较图5A、5B、6和表3))，这些数据进一步支持以下观念：在2006-PDE的5'的G-四联体的无干扰形成是强烈TLR21刺激的先决条件。
图14举例说明在所述寡核苷酸的位置1和6的dG替换相当温和。相反，在所述寡核苷酸的位置3和4的任何替换确实具有TLR21刺激潜能的显著负面作用。还看起来在所述寡核苷酸的位置1和2以及5和6的相邻dGdG双重替换是温和的。相反，图15举例说明在所述寡核苷酸的位置2和3以及位置3和4，用任何同型二核苷酸(dCdC，dAdA，尤其是dTdT)替换相邻的dGdG导致TLR21刺激活性的显著丧失。在所述寡核苷酸的位置4和5的相邻dGdG双重替换是更轻微的，但也导致活性丧失。
这些数据表明，连续的四个dG的延伸对于高TLR21刺激活性是必不可少的，并且任何其他核苷酸对四个dG的延伸的破坏都导致活性的急剧丧失。
检查2006-PDE-5dG4的5dG4延伸中的dA替换对TLR21刺激活性的影响。
为了更严格地测试5'-dG4对赋予2006-PDE高水平刺激活性是必要和足够的假设，将2006-PDE-5dG4中的dG部分用dA系统地替换，并且在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试各种衍生物刺激TLR21的能力，如实施例3中所述(表14，表15，图16A和16B)。
表14：ODN序列，A替换
表15：半最大有效浓度(EC50)和最大信号(Vmax)
dG4延伸内的所有dA替换都导致TLR21刺激活性的丧失。有点令人惊讶的是，在位置1注意到TLR21刺激活性的显著变化，达到无法计算EC50的程度(表15以及图16A和16B)。在2006-PDE5dG4的第2和第3位置中的单一dA替换也导致EC50分别大大增加342和471倍。在dG4延伸中在位置4的dA替换中观察到最轻微的活性损失，其中EC50增加16倍(表15以及图16A和16B)。这些数据进一步支持以下观念：在2006-PDE的5'的G-四联体的无干扰形成是强烈TLR21刺激的先决条件。
检查2006-PDE-5dG4的5dG4延伸中的dC替换对TLR21刺激活性的影响。
为了更严格地测试5'-dG4对赋予2006-PDE高水平刺激活性是必要和足够的假设，将2006-PDE-5dG4中的dG部分用dC系统地替换，并且在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试各种衍生物刺激TLR21的能力，如实施例3中所述(表16，表17，图17A和17B)。
表16：ODN序列，C替换
表17：半最大有效浓度(EC50)和最大信号(Vmax)
dG4延伸内的所有dC替换都导致TLR21刺激活性的丧失。在位置1中注意到TLR21刺激活性的显著丧失，其中EC50增加89倍(表17以及图17A和17B)。在第2和第3位置中的单一dC替换也导致EC50分别大大增加831和545倍。在dG4延伸中在位置4的dC替换中发现最轻微的活性损失，其中EC50增加15倍(表17以及图17A和17B)。这些数据进一步支持以下观念：在2006-PDE的5'末端的G-四联体的无干扰形成是强烈TLR21刺激的先决条件。
检查2006-PDE-5dG4的5dG4延伸中的dT替换对TLR21刺激活性的影响。
为了更严格地测试5'-dG4基序对赋予2006-PDE高水平刺激活性是必要和足够的假设，将2006-PDE-5dG4中的dG部分用dT系统地替换，并且在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试各种衍生物刺激TLR21的能力，如实施例3中所述(表18，表19，图18A和18B)。
表18：ODN序列，A替换
表19：半最大有效浓度(EC50)和最大信号(Vmax)
dG4延伸内的所有dT替换都导致TLR21刺激活性的丧失。在位置1观察到TLR21刺激活性的有点令人惊讶且显著的变化，达到无法计算EC50的程度(表19以及图18A和18B)。在第2和第3位置中的单一dA替换也导致EC50分别大大增加92和265倍。在dG4延伸中在位置4的dT替换中发现最轻微的活性损失，其中EC50增加5倍(表19以及图18A和18B)。这些数据进一步支持以下观念：在2006-PDE的5'的G-四联体的无干扰形成是强烈TLR21刺激的先决条件。
如图19中所举例说明，dG4延伸中的任何dG替换都不利于TLR21刺激活性，这与高活性需要四个连续的dG的观点是一致的。有趣的是，尽管保留三个连续的dG，但位置1中的任何替换都消除TLR21活性，而同样保留三个连续dG的位置4 dG的替换是相对温和的。dG2或dG3的替换均匀地不利于TLR21活性。
向含有CpG的PDE-ODN添加5'-dG4和5'-dG6对赋予TLR21刺激活性的影响。
选择文献中暗示为对于哺乳动物TLR9刺激性的11种含有CpG的寡脱氧核苷酸序列(但大多描述为PTO版本)用于合成为PDE衍生物(表20)。对于所有这些PDE ODN，TLR21相互作用都是未知的。对于这些PDE ODN中的五种，还合成它们的3'-dG5-、5'-dG4-和5'-dG6-版本。对于一种ODN，合成其5'-dG4-和5'-dG6-版本；对于另一种，合成3'-dG5-和5'-dG6-版本；而对于其他4种，仅合成对应的5'-dG6-版本(表20)。如实施例3中所述，对这些ODN进行TLR21刺激测试(表21，图20A-I)。
表20：用于dGn附接的ODN
表21：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
| ODN | EC<sub>50</sub>皮摩尔浓度(pM) | Vmax milliOD 405nm/min (mOD405/min) |
| 1668 | 无活性 | - |
| 1668-3dG5 | 无活性 | - |
| 1668-5dG4 | 15140 | 71 |
| 1668-5dG6 | 6328 | 45 |
| 1826 | 较小活性 | - |
| 1826-3dG5 | 无活性 | - |
| 1826-5dG4 | 866 | 309 |
| 1826-5dG6 | 478 | 373 |
| BW006 | 较小活性 | - |
| BW006-3dG5 | 无活性 | - |
| BW006-5dG4 | 20.3 | 378 |
| BW006-5dG6 | 76 | 311 |
| D-SLO1 | 一些活性 | - |
| D-SLO1-3dG5 | 无活性 | - |
| D-SLO1-5dG4 | 174 | 372 |
| D-SLO1-5dG6 | 129 | 372 |
| M362 | 无活性 | - |
| M362-3dG5 | 无活性 | - |
| M362-5dG4 | 6832 | 609 |
| M362-5dG6 | 38480 | 1214 |
| 2395 | 无活性 | - |
| 2395-5dG4 | 121 | 410 |
| 2395-5dG6 | 1092 | 475 |
| 2007 | 较小活性 | - |
| 2007-3dG5 | 无活性 | - |
| 2007-5dG6 | 20.3 | 637 |
| 202 | 无活性 | - |
| 202-5dG6 | 92.2 | 446 |
| 685 | 无活性 | - |
| 685-5dG6 | 97.4 | 451 |
| 2000 | 无活性 | - |
| 2000-5dG6 | 530 | 727 |
| 2002 | 无活性 | - |
| 2002-5dG6 | 61.6 | 833 |
在未修饰的PDE ODN的TLR21活化测试中(表20)，仅1826、BW006、D-SLO1和2007显示一些较小活性(表21，图20B、20C、20D、20G)。所有其他PDE ODN在测试的浓度下都不显示TLR21刺激活性(表21，图20A、20E、20F、20H、20I、20J和20K)。具有3'dG5添加的6种ODN衍生物没有表现出TLR21活性(表21)。这与2006-PDE的早期观察一致。对于具有较小TLR21刺激信号的四种ODN (1826、BW006、D-SLO1和2007)，3'dG5添加杀死它们的活性(图20B、20C、20D、20G)。
相比之下，5'dG4(六种ODN)或5'dG6(十一种ODN)的添加导致在每种情况下TLR21刺激活性增加，包括在五种情况下的纳摩尔浓度EC50，十三种其他情况下皮摩尔浓度(pM)EC50(表21)。考虑到起点接近零，六种甚至具有两位数pM EC50(低至20 pM)，这是高度显著的。总之，数据表明有效的TLR21活性可以通过将dG延伸附接至先前活性不佳或无活性的含有CpG的PDE-ODN的5'-末端(而不是3'-末端)来实现。
此处呈现的数据还表明，活性获得与通过G-四联体DNA超结构的5'dGn-修饰的ODN的分子间形成有关。
5'dG添加对2006-PDE的小鼠TLR9识别的影响
使用2006-PTO的磷酸二酯键版本，2006-PDE，作为基础，以研究5'-dG修饰对鼠TLR9和人TLR9的刺激活性的影响。在2000 nM或5000 nM ODN浓度开始，进行15个稀释步骤(1:2)，达到近似100 pM或500 pM作为最终稀释度，进行滴定实验。2006-PTE的衍生物ODN描述于表21-2中。
表21-2：2006-PDE的衍生物ODN(PTO键小写)
2006-PTO在纳摩尔浓度范围内刺激小鼠和人TLR9。2006-PDE仅显示较小的小鼠或人TLR9-刺激活性(图68A和68B)。在2006-PDE的5'-末端添加1至8个dG导致小鼠TLR9的活性没有增加或仅较小增加(图68A)。在人HEKBlue细胞中，在2006-PDE的5'末端添加1至6 dG导致刺激活性没有增加或甚至减少。在具有CpG基序的寡核苷酸的5'末端添加dG7和dG8导致人TLR9的活性的一些较小增加(图68B)。总之，该图与以下观察形成鲜明对照：通过在所述寡核苷酸的5'末端添加3至8个dG，大大加强2006-PDE的鸡TLR21刺激活性。
3'dG添加对2006-PDE的小鼠和人TLR9识别的影响
在2006-PDE的3'末端添加一至三个dG导致小鼠TLR9的活性的较小进行性增加(图69A)。在所述寡核苷酸的3'末端添加第四个dG导致小鼠TLR9刺激活性的强烈增加，其在将第5、第6、第7或第8 3' dG添加至所述寡核苷酸的3'末端后略微改进或保留(图69A)。
为了刺激人TLR9，相对于亲本2006-PDE，在2006-PDE的3'末端添加一至三个dG导致刺激活性的显著进行性增加。在所述寡核苷酸的3'末端添加第四个dG，导致人TLR9刺激活性的强烈增加。添加第5、第6、第7或第8 3' dG后，这种刺激作用稍微改进或保留(图69B)。
总之，该图与以下观察形成鲜明对照：通过在3'末端添加3-8个dG，2006-PDE的鸡TLR21刺激活性没有加强或甚至降低。总之，与鸡(和大概禽类) TLR21相比，在2006-PDE上添加5'-dG和3'-dG关于TLR刺激活性的结构-活性关系对于小鼠和人(和大概哺乳动物)TLR9是根本不同的。这可以反映以下事实：TLR21只是禽类中TLR9的功能性、但不是真正的遗传直向同源物。
实施例4：当与在很大程度上无活性的2006-PDE的5'末端连接时，已知或怀疑形成G-四联体结构的序列赋予TLR21刺激活性。
测试阶段I。向2006-PDE的5'末端添加许多具有提出的G-四联体形成潜能的端粒和启动子序列元件。另外，使用5' T4-修饰的2006-PDE (2006-PDE-T4)来测定HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞刺激TLR21的能力，如实施例3中所述(表22)。
表22：ODN序列(加下划线指示被认为参与G-四联体形成的序列)
表23：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
人端粒序列与2006-PDE和2006-PDE-T4的融合产生能够以纳摩尔浓度(nM) EC50或甚至皮摩尔浓度(pM)活性活化TLR21的ODN(表23，图21A)。酵母端粒序列赋予高TLR21活性，其中EC50低至152 pM。测试的c-myc-启动子-来源的序列也能够活化朝向TLR21刺激2006-PDE-T4，一种衍生物产生两位数pM活性(表23，图21B和21C)。
合成与尖毛虫属物种(Oxytricha. Spp.)端粒(用于端粒研究和用于G-四联体结构研究的优选早期模型物种)的序列元件的2006-PDE融合体(表22)并测试它们的TLR21刺激潜能(表24，图22A和22B)。在该研究中，融合的序列包含以下：TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)。
表24：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
尖毛虫属物种端粒序列元件为无活性的2006-PDE赋予高度有效的TLR21活性。所得衍生物是此时鉴定的最有效的衍生物。
测试阶段II。选择显示或预测涉及G-四联体形成的20种不同的启动子元件，并且合成包含2006-PDE和启动子元件的5'融合构建体(表25)，用于在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试以测定其刺激TLR21的能力。
表25：ODN序列(加下划线指示被认为参与G-四联体形成的序列)
表26：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
TLR21测定揭示，所有测试元件都为无活性2006-PDE赋予活性。测试的20种元件中的11种显示超过TLR21激动剂2006-5dG6的功效的功效，其中EC50值低于30 pM，且低至15.6pM(表26)。
实施例5：新序列元件的鉴定、应用和优化以及为CpG-ODN赋予TLR21刺激活性的生物物理原理。
G-四联体(图23A)可以分子内或分子间并以平行或反平行取向形成(图23B，23C)。基于G-四联体-介导的ODN的聚集通过生成具有TLR21的多个结合位点的配体变体(导致相互作用亲合力获得和受体聚类)而导致TLR21刺激活性增加的假设，进一步假设优化取向和结合位点多样性应当进一步增强活性。
测试阶段I。将具有提出的G-四联体-形成潜能的许多端粒和启动子序列元件融合至2006-PDE和2006-PDE-T4的5'末端，用于在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中进行测试以测定其刺激TLR21的能力(表27)。
在这方面特别令人感兴趣的是由ODN单体形成被称为G-线的聚合G-四联体结构(图23C和23D)，因为它确实具有生成聚合的TLR21配体的潜能。Marsh TC, Vesenka J,Henderson E, A New DNA Nanostructure, the G-wire, Imaged by Scanning Probe Microscopy, Nucl. Acid Res., 23: 696-700 (1995)。具体地，具有融合至其5'末端的序列GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257)的2006-PDE看起来具有形成此类结构的倾向(表27)。因为CpG-ODN“活性剂”太接近由5' GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257)形成的这种聚合物的排列可能导致空间问题，诸如受体相互作用，还合成具有dT4间隔基的衍生物(表27)。
据先前报道，富含G的六核苷酸TGGGGT (SEQ ID NO:265)优先形成平行取向的四聚的G-四联体结构(Phillips K, Dauter Z, Murchie AI, Lilley DM, Luisi BJ, The Crystal Structure of a Parallel-Stranded Guanine Tetraplex at 0.95 Å Resolution, J. Mol Biol. 273: 171-182 (1997)), (图23B)。预期通过5'-平行的G-四联体连接的含有CpG的ODN的这种四聚的排列为TLR21提供了有利的配体排列。合成2006-PDE的这种衍生物(表27)，并且连同上述衍生物一起进行测试，与2006-PDE-5dG4和2006-PDE-5dG6进行比较(表28，图24A和24B)。
表27：ODN序列(加下划线指示被认为参与G-四联体形成的序列)
表28：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
| ODN | EC<sub>50</sub>皮摩尔浓度(pM) | Vmax milliOD 405nm/min (mOD405/min) |
| 2006-PDE | 无活性 | - |
| 2006-PDE-5dG4 | 58.0 | 692 |
| 2006-PDE-5dG6 | 29.4 | 603 |
| 2006-PDE-G线1 | 108 | 662 |
| 2006-PDE-G线2 | 19.2 | 593 |
| 2006PDE5dG4-T1-6 | 12.1 | 583 |
向TLR21-无活性的2006-PDE (2006-PDE-G线1)的5'末端添加GGGGTTGGGG (SEQID NO:257)导致具有pM EC50的ODN，但其活性达不到2006-PDE-5dG4和2006-PDE-5dG6的EC50，所述2006-PDE-5dG4和2006-PDE-5dG6在本研究中用作基准(表28，图24A和24B)。然而，在G-线序列和2006-PDE之间引入4个dT核苷酸(2006-PDE-G线2)将EC50提高5倍，并且产生优于基准的活性(表28，图24A和24B)。向2006-PDE的5'末端添加TGGGGT (SEQ ID NO:265)导致ODN，其具有此时对TLR21最低的EC50 (表28，图24A和24B)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳证明通过5'G-线修饰形成更高阶结构(图25)。
综上，在该研究中鉴定了两种导致2006-PDE的有效TLR21刺激活性的优异的据推测G-四联体序列元件。不受理论的束缚，GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257)的有效TLR21活化能力可能与其形成所谓的G-线结构的已知潜能有关(图23C和23D)，从而提供具有有利取向的多齿配体。TGGGGT (SEQ ID NO:265)的有效TLR21活化能力也可能与其已知的形成平行四聚体分子间G-四联体的潜能有关，从而提供具有有利取向的四齿配体(图23B)。
测试阶段II。测试基准序列GGGGGG的TLR21刺激增强活性的潜能，并将其与在先前研究中被证明是优异的G-线序列GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO:258)进行比较。为此，设计具有通用序列TTTTTTTXCGXTTT (SEQ ID NO:259)(其中X代表任何碱基)的16种寡核苷酸(表29)。dT用于生成可接受长度(14个碱基)的寡核苷酸，以将四核苷酸CpG“弹头(warhead)”包裹在ODN背景中，因为它在合成中不产生问题，并且因为其形成不想要的二级结构的倾向很低。预期仅具有一个CpG元件且具有PDE键的此类短ODN预期具有低TLR21刺激活性。因此，在TLR21上进行测试的起始浓度从20 nM增加50倍至1000 nM。还合成具有5'-GGGGGG末端和5'-GGGGTTGGGGTTTT (G线2; SEQ ID NO:258)末端的这16种ODN(表29)，并在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试它们刺激TLR21的能力。
表29：ODN序列(加下划线指示被认为参与G-四联体形成和/或G-线形成的序列)
包含具有中央CpG的四核苷酸的所有可能排列的16种14-聚体ODN在最高达1000nM浓度下在很大程度上对TLR21无活性，除了含有ACGC和含有CCCC的种类(分别为ODN 9和11)，其分别在最高浓度下显示可检测信号。
在大多数情况下，向基础ODNs (SEQ ID NO:144-159)的5'末端添加dG6 (GGGGGG)导致了一些TLR21刺激活性，除了CCGA (ODN 19)、CCGG (ODN 23)、GCGC (ODN 26)和CCGT(ODN 31)(图26B、27B、28B和29B)。这证实5'-GGGGGG为CpG ODN赋予TLR21活性的潜能，尽管除了GCGG (ODN 22)、ACGA (ODN 25)和TCGC (ODN 28)之外，各自的信号强度都微弱(图27B和28B)。
向基础ODN (SEQ ID NO:144-159)的5'末端添加G线2 (GGGGTTGGGGTTTT (SEQ IDNO:258))在其中5dG6成功的所有情况下都导致TLR21刺激活性，并且对于CCGA (ODN 35)、CCGG (ODN 39)和GCGC (ODN 42)也导致TLR21刺激活性，而CCGT (ODN 47)保持耐受性(图26C、27C、28C、29C和29D)。然而，用G线2附接获得的信号强度远高于用5dG6所见的信号强度。这对于GCGA (ODN 18对比ODN 34(分别为图26B和26C)、GCGG (ODN 22对比ODN 38(分别为图27B和27C))、ACGC (ODN 25对比ODN 41(分别为图28B和28C))、CCGC (ODN 27对比ODN43(分别为图28B和28C))、TCGC (ODN 28对比ODN 44(分别为图28B和28C))和GCGT (ODN 30对比ODN 46(分别为图29B和29C)特别明显。后一种ODN，46，GCGT-G线2是最值得注意的种类：其在皮摩尔浓度下已经表现出出色的TLR21刺激活性，并且EC50可以被测定为接近2 nM(图29D)。
先前在TLR21活化的背景下没有描述含有CpG的序列元件GCGA、GCGG、ACGC、CCGCGCGT，以及可能还有TCGC。
XCGA系列。来自XCGA系列的14-聚体无一在最高达1000 nM显示任何TLR21活性。5'-dG6的添加导致GCGA>ACGA>TCGA的一些活性，而CCGA保持无活性。最值得注意的是，5'-G线2的添加导致所有四种衍生物的TLR21活性。对于GCGA，注意到TLR21活性的急剧增加，而其他具有以相对顺序TCGA>ACGA>CCGA增加的活性(图26A-C)。
XCGG系列。来自XCGG系列的14-聚体中的两种在1000 nM下显示较小的(如果有的话) TLR21活性(GCGG，TCGG)，而其他两种寡核苷酸无活性。5'-dG6的添加导致GCGG>ACGG>=TCGG的一些活性，而CCGG保持无活性。最值得注意的是，5'-G线2的添加导致所有四种衍生物的TLR21活性。对于GCGG，注意到TLR21活性的急剧增加，而其他具有以相对顺序TCGG>ACGG>CCGG增加的活性(图27A-C)。
XCGC系列。来自XCGC系列的14-聚体中的两种在1000和500 nM下显示较小的(如果有的话) TLR21活性(ACGC，CCGC)，而其他两种无活性。5'-dG6的添加导致TCGC>ACGC>CCGC的强烈活性，而GCGC保持无活性。最值得注意的是，5'-G线2的添加再一次导致所有四种衍生物的TLR21活性。对于TCGC>ACGC>CCGC(以该活性顺序)，注意到TLR21活性的大大增加，而GCGC保持微弱(图28A-C)。
XCGT系列。来自XCGT系列的14-聚体无一在最高达1000 nM显示任何TLR21活性(图29A)。5'-dG6的添加导致所有四种的一些活性，活性顺序为TCGT>GCGT>ACGT> CCGT (图29B)。最值得注意的是，5'-G线2的添加导致GCGT的TLR21活性的急剧增加，并且TCGT的活性也大于对于TCGT-5dG6所指出的(图29C)。G线2-修饰的ACGT和CCGT的活性不大于5dG6衍生物的活性(图29C和29D)。附接至基础ODN的单独的G线2 14聚体ODN (GGGGTTGGGGTTTT (SEQID NO:258))对TLR21无活性(参见表49，图29)。
实施例6：最有效序列的主链是GCGT-G线2：结构-活性关系(SAR)
GCGT-G线2的SAR的研究包括通过倒置(GC)和嘧啶-嘧啶(TG)以及嘌呤-嘌呤(CA)交换修饰中央CpG元件(表30)。如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试这些衍生物刺激TLR21的能力，揭示这些操作后活性的完全丧失(表31，图30)，证实GCGT-G线2的有效TLR21刺激活性关键取决于该单个CpG元件的存在。
表30：ODN序列
G线2元件和GCGT元件之间的dT的数目也减少(表30)，并测试对应的ODN：
表31：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
来自GCGT-G线2上缺失T1-T4的结果导致Vmax变化很小，并且除了T3，EC50值在很大程度上类似。然而，T5和T6缺失导致EC50增加，并且特别是Vmax降低，表明固有活性丧失(表31，图31)。
对于第三项SAR研究，侧接ODN的3'-末端的GCGT元件的T的数目减少(表30)，并且测试对应的ODN。作用是立即显而易见的。尽管损失一个T (eT1)导致Vmax降低而EC50保留，但损失两个T(eT2)导致EC50增加且Vmax显著降低，损失三个dT完全消除该活性(表31，图32)。
在第四项实验中，研究并入额外的GGGGTT基序(GCGT-G线3，表30)对GCGT-G线2的固有TLR21-刺激活性的影响。GCGT-G线3的活性优于亲本GCGT-G线2的活性(表31，图33A和33B)。EC50低8倍，且Vmax也增加(表31)。图34中举例说明免疫刺激性GCGT-G线2寡核苷酸的初步SAR结果。
实施例7：CpG元件拷贝数对选择的XCGX-G线2种类的TLR21刺激活性的影响
表32：ODN序列(加下划线指示XCGX元件。)
表33：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
GCGT-G线2显示预期的纳摩尔浓度EC50。在3'-末端添加第二个GCGTTTT元件(GCGT-G线2-do，表32)导致EC50的大大提高(~65倍)和Vmax的增加(表33，图35A和35B)。进一步添加GCGTTTT元件(GCGT-G线2-tri，表32)导致EC50另外降低3倍(135复合倍)和Vmax的略微增加(表33，图35A和35B)。
GCGA-G线2显示预期的纳摩尔浓度EC50。在3'-末端添加第二个GCGATTT元件(GCGA-G线2-do，表32)导致EC50的强烈提高(~24倍)和Vmax的增加(表33，图36A和36B)。进一步添加GCGATTT元件(GCGT-G线2-tri，表32)导致EC50另外降低2倍(48复合倍)和Vmax的略微增加(表33，图36A和36B)。
ACGC-G线2显示预期的纳摩尔浓度EC50。在3'-末端添加第二个ACGCTTT元件(ACGC-G线2-do，表32)导致EC50的轻微提高(~8倍)和Vmax的增加(表33，图37A和37B)。进一步添加ACGCTTT元件(ACGC-G线2-tri，表32)导致EC50另外降低8倍(64复合倍)和Vmax的略微增加(表33，图37A和37B)。
TCGC-G线2显示预期的纳摩尔浓度EC50。在3'-末端添加第二个TCGCTTT元件(TCGC-G线2-do，表32)导致EC50的强烈提高(~12倍)和Vmax的增加(表33，图38A和38B)。进一步添加TCGCTTT元件(TCGC-G线2-tri，表32)导致EC50另外降低7倍(84复合倍)和Vmax的略微增加(表33，图38A和38B)。
CCGC-G线2显示预期的纳摩尔浓度EC50。在3'-末端添加第二个CCGCTTT元件(CCGC-G线2-do，表32)导致EC50的大大提高(~50倍)以及Vmax的增加(表33，图39A和39B)。进一步添加CCGCTTT元件(CCGC-G线2-tri，表32)导致EC50另外降低17倍(850复合倍)和Vmax的略微增加(表33，图39A和39B)。
GCGG-G线2在所考虑的低浓度范围内仅显示弱信号。在3'-末端添加第二个GCGGTTT元件(GCGG-G线2-do，表32)导致EC50以及Vmax的大大提高(~51倍)(表33，图40)。进一步添加GCGGTTT元件(GCGG-G线2-tri，表32)导致EC50另外降低4倍(204复合倍)和Vmax的略微增加(表33，图40)。
总之，显示向具有G线2序列和单个CpG元件的寡核苷酸添加另外的含有CpG的TLR21刺激性序列元件导致EC50从8倍至55倍的提高，而Vmax通常翻倍。第三元件的添加也进一步均匀地提高TLR21刺激活性。看起来，这是从初始简单的低活性命中物生成高活性的通用方法。
实施例8：获得具有合成/商品成本优势的高活性TLR21-刺激性ODN：a)在含有CpG的序列元件之间，和b)在G-四联体形成部分内及其与含有CpG的序列元件的边界处，添加烷基和乙二醇间隔基或用烷基和乙二醇间隔基替换核苷酸
使用5'-G线2-技术(GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO:258))来研究以下概念上简单的潜在刺激序列的TLR21刺激潜能：被在5'-末端的四个dT和在3'末端的三个dT包裹的三个连续的CpG(表34 CG-Gw2-T0)。通过在三个CpG元件之间逐步插入一个、两个、三个和四个dT (产生CG-Gw2-T1 - CG-Gw2-T4，表34)，来研究CpG元件的间距对TLR21刺激活性的影响。如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中进行TLR21刺激测定，以确定表34中的ODN刺激TLR21的能力，并计算EC50和Vmax值(表35，图41A和41B)。
表34：ODN序列
表35：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
值得注意的是，CG-Gw2-T0在所考虑的浓度范围内(最高达20 nM)对TLR21完全无活性，而CpG之间的一个间隔dT已经导致强烈刺激的ODN，其具有皮摩尔浓度范围内的EC50。CpG之间的第二个dT没有提高活性，但dT3和dT4分别导致16.6和11.3 pM的EC50(表35，图41A和41B)。这表明纯粹的CpG元件的存在对于活性是不够的；它们需要在正确的环境中。
TLR21刺激活性需要在间隔基团中的碱基吗
合成在CpG之间具有脱氧核糖磷酸酯桥(“无碱基位点”)而不是dT的ODN(CG-Gw2-无碱基)。如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试该ODN和亲本CG-Gw2-T1刺激TLR21的能力(表36，图42A和42B)。
表36：ODN序列
表37：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
令人惊讶地，CG-Gw2-无碱基(图43)显示对TLR21的功效(EC50 = 34 pM)甚至比CG-Gw2-T1 (EC50 = 133 pM)有点更高，而Vmax有点更低(表37，图42A和42B)。该结果显示CG-Gw2-T1 ODN中的间隔核苷酸中的碱基不仅不是TLR21刺激所需的，而且对EC50具有负面影响。
线性间隔基团对CG-Gw2 ODN的TLR21活性的影响
在该研究中，CG-Gw2-T1中间隔两个CpG的dT核苷酸被“C18”六乙二醇接头或“C3”丙二醇接头替换(表38)。在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试这些ODN刺激TLR21的能力，如实施例3中所述。
表38：ODN序列
表39：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
*取自先前的研究。
尽管由六乙二醇当插入CG-Gw2的CpG元件之间时形成的C18间隔基(表36，图43)导致TLR21-无活性的ODN(表39，图44A)，但具有C3间隔基的相同修饰(1,3-丙二醇，CG-Gw2X2，表38，图43)不仅保留，而且甚至稍微提高亲本CG-Gw2-T1就EC50而言的效力(表39，图44B)。鉴于C3间隔基结构与核苷酸相比的简单性(图43)，这是最显著的结果。考虑到像C3间隔基一样的无碱基位点在两个磷酸二酯键之间包含三个连接的碳原子，C3可能是高活性无碱基位点结构的简化形式(参见图43)，并且还有效地支持TLR21的活化。
对G-线和TGGGGT (SEQ ID NO:265)-活化的C3间隔基连接的CpG结构的TLR21刺激活性的研究
在该研究中，将GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257) G-线 (CG-Gw2X2-1)或TGGGGT (SEQ IDNO:265)元件(CG-G4T16X2-1)连接至TTTTTTTTCG-X2-CGTTT (SEQ ID NO. 271)(表40)，并且评价TLR21刺激功效。然后，通过连续添加与CpG基序连接的C3-间隔基进一步修饰两种ODN，产生具有三个、四个和五个CpG基序的ODN，每个CpG基序都被C3分隔(表40)。还在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中评价它们对TLR21的活化效力，如实施例3中所解释(表41，图45和46)。
表40：ODN序列
表41：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
在G-线活化中，具有两个被C3分隔的CpG基序的第一ODN已经显示皮摩尔浓度活性(EC50 = 312 pM)，尽管在三位数范围内。第三个C3-分离的CpG得到78.5 pM的EC50，其与对于第二个分开合成的批次测定的96.5 pM相当一致(参见表39)。添加第四个C3-分离的CpG基序使功效再增加10倍(EC50 = 7.4 pM)。添加第五和第六个C3-分离的CpG基序保留高功效，并且甚至导致较小的提高。这些单位数皮摩尔浓度功效是迄今为止对TLR21看到的最高活性，这对于像磷酸丙二醇酯分隔的CpG基序一样简单的结构元件是显著且出乎意料的壮举(表41，图44A和44B)。用已知促进平行分子间G-四联体结构的GTTTTG元件替换X2-1至X2-5系列中的G-线元件(表40)，导致具有相似、部分甚至优异的功效的ODN(表41，图46A和46B)。
研究间隔基长度和详细的化学结构对G-线-活化的C3间隔基-连接的CpG基序的TLR21刺激活性的影响。
在该研究中，将GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257) G-线连接至TTTTTTTTCG-X-CGXCGTTT (SEQ ID NO:260)(表42)，并评价TLR21刺激功效。X是用于分隔CpG基序的一系列烷基二醇-磷酸酯(表42，图47)，其中ODN-X3是CG-Gw2X2(参见表38)和CG-Gw2X2-2(参见表40)的重复合成。此外，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中针对TLR21刺激测定包含无碱基间隔基(表42，图49；参见CG-Gw2-无碱基(表36中的SEQ ID NO:221))以及三乙二醇衍生物间隔基(“C8”接头，图49)的寡核苷酸，如实施例3中所述。
表42：ODN序列
表43：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
*取自先前的研究。
在结构上，CG-Gw2-T1中一个CpG元件的3'-磷酸酯与下一个CpG元件的5'-磷酸酯之间的间隔是经由5'C至4'C至3'C的三个连接的碳原子(图49)。当使用无碱基位点时，维持相同的距离，因为碱基的缺乏不改变脱氧核糖部分。在ODN-X3中维持非常相同的排列，其中三个亚甲基(-CH2-)基团在3'-和5'-磷酸酯基团之间形成间隔基(图47)。有趣的是，如通过EC50测定的它们对TLR21的功效高度相似(分别为133 pM、127 pM和149 pM；表43)，表明物理距离比详细的化学结构(例如，碱基的存在，脱氧核糖部分的完整性)更重要，因为部分维持脱氧核糖几何形状的最简单的可想到的接头1,3-丙二醇似乎不是不利的(表43，图49A和49B)。
基于在先前的实验(表36-39)中已经提出的发现，即1,3-丙二醇作为间隔基与脱氧胸腺嘧啶(dT)或无碱基位点是等效的(参见表43)，我们研究间隔基长度对TLR21活性的影响。
与1,3-丙二醇衍生物ODN-X3(表42，图47)相比，较短的衍生物乙二醇(ODN-X2，表42，图47)的TLR21刺激活性要弱超过两倍(表43，图50A和50B)。相比之下，在1,4-丁二醇衍生物ODN-X4(表42，图47)中的间隔基赋予稍微更高的活性(表43，图50A和50B)，而通过两个额外的甲基(1,6-己二醇，ODN-X6)或5个额外的亚甲基(1,9-壬二醇，ODN-X9)的进一步延长(表42，图47)，将TLR21刺激功效分别急剧降低89和138倍(表43，图50A和50B)。具有12个亚甲基的间隔基(1,12, 十二烷二醇，ODN-X12)(表42，图47)在所考虑的浓度范围内是完全无活性的(表43，图50A和50B)。还研究三乙二醇(TEG)接头(ODN-XtrEG，表42，图48)。该衍生物在空间上对应于C8接头。因此，值得注意的是，其TLR21 EC50显著低于1,9-壬二醇衍生物ODN-X9的TLR21 EC50，并且仍低于1,6-己二醇衍生物ODN-X6的EC50(参见表43，图51)。
C3间隔基原理也对含有CpG的四核苷酸结构发挥功能吗
检查具有含有CpG的四核苷酸结构的含有C3间隔基-(1,3-丙二醇)的TLR21-活性ODN。为此，在第一项实验中，合成含有5'-G-线序列的ACGC-Gw2X1、ACGC-Gw2X2、CCGC-Gw2X1和CCGC-Gw2X2，并在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试其刺激TLR21的能力，如实施例3中所述(表44)。这随后是含有5'-G4T16的ACGC-G4T16X2和CCGC-G4T16X2的合成和TLR21测试(表44)。
表44：ODN序列
表45：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
CpG四核苷酸序列的C3间隔显然能够刺激TLR21。ACGC-Gw2X2和CCGC-Gw2X2(表44)展示在先前对于CG-Gw2X2/ODN-X3观察到的范围内的TLR21 EC50 (表45，图52A和52B)(比较表39和43)。如先前对于CG-Gw2X1所观察(表39)以及如通过结构-活性关系所预测，六乙二醇(HEG，“C18”)衍生物ACGC-Gw2X1和CCGC-Gw2X1分别是无活性的或非常弱的(表45，图52A和52B)。用我们先前鉴定的其他特权5'-结构(TGGGGT(SEQ ID NO:265)，G4T16)替换5'-G-线序列产生两种衍生物ACGC-G4T16-X2和CCGC-G4T16-X2，其具有进一步提高的EC50(表45，图53A和53B)。
在TLR21-活化ODN的5'-G-富集序列处/中的C3和C18接头的影响
研究C3间隔基(1,3-丙二醇)或C18间隔基(六乙二醇，HEG)当置于CpG基序和G-四联体序列之间时或当位于G-四联体序列中时，是否可以提高TLR21-活性的含有5’-G-四联体的ODN的活性。合成两种基于2006-PDE5dG4的ODN。一种具有在dG4序列下游的3’的C18接头(2006-PDE5dG4-X1)，且一种具有在相同位置的C3接头(2006-PDE5dG4-X2)(表46)。此外，通过用C18接头(2006-5dG4-X3)或C3接头(2006-5dG4-X4)替换GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257)序列中的T来修饰2006-G-线1。在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中测试所有这些衍生物刺激TLR21的能力，如实施例3中所述(表47)。
表46：ODN序列
表47：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
在2006-PDE5dG4中，在dG4和2006-PDE之间添加C18间隔基将TLR21活性提高6倍，如通过EC50所测量(表47，图54A)。在相同位置的C3间隔基将TLR21刺激提高2倍(表47，图54A)。在2006-PDE-G-线1中，用C18间隔基替换G-线序列中的两个T将TLR21活性提高约5倍，如通过EC50所测量(表47，图54B)。在相同位置的C3间隔基将TLR21刺激提高4倍(表47，图54B)。总之，数据表明TLR21活化特性没有受到C18或C3接头的存在的损害，并且它们导致甚至更加提高的活性。
实施例9：ODN的5'-胆固醇、但不是3'-胆固醇修饰导致TLR21刺激活性强烈增加
检查经典3'-胆固醇修饰和更罕见使用的5'-胆固醇修饰对中度和高度活性ODN种类的TLR21刺激潜能的影响。
3'- 胆固醇修饰
将通常应用的3'-胆固醇修饰(图55)应用于两种高TLR21活性的ODN，2006-G线2和2006-T4-5dTG4T(表48)。更具体地，包含3'胆固醇部分的ODN购自Eurofins。胆固醇部分的结构基于www_linktech_co_uk/products/modifiers/hydrophobic_group_cholesterol_palmitate_ modification/969_3-cholesterol-synbase-cpg-1000-110中显示的3'Cholesterol SynBaseTM。进行如实施例3中所解释的TLR21刺激测试。
表48：ODN序列
表49：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
结果表明，两种ODN的TLR21-刺激活性在3'-胆固醇修饰后没有提高(表49，图56A、56B、57A、57B)。3'-胆固醇-修饰的ODN的EC50甚至增加(表49)，表明TLR21刺激活性的略微损失。
包含3'胆固醇部分的ODN购自Eurofins。胆固醇部分的结构基于www_linktech_co_uk/products/modifiers/hydrophobic_group_cholesterol_palmitate_modification/969_3-cholesterol-synbase-cpg-1000-110中显示的3' CholesterolSynBaseTM。
5'-胆固醇修饰(I)
将应用少得多的5'-胆固醇修饰(图58A和58B)合成至在我们研究的过程中鉴定的高度TLR21-活性的ODN GCGT3-TG4T上(表50)。更具体地，包含5'胆固醇部分的ODN订购自Genelink，并且这些ODN的脂质部分的结构基于www_genelink_com/newsite/products /MODPDFFILES/26-6602.pdf中显示的结构。包含5'胆固醇部分的其他ODN订购自SigmaAldrich。这些ODN的脂质部分的结构基于www_sigmaaldrich_com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/custom-oligonucleotide-modifications-guide.pdf，第85/86页显示的结构。包含5'胆固醇部分的其他ODN订购自IBA Lifesciences，并且具有基于在www_iba-lifesciences_com/Services_custom_oligos_custom_DNa _Non-fluorescent_5-modifications.html显示的结构的结构。在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中进行TLR21刺激测试，如实施例3中所述。
表50：ODN序列(大写：PDE键，小写PTO键)
表51：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
两次独立测量的结果表明，通过5'-胆固醇修饰，GCGT3-TG4T的TLR21-刺激活性被大大提高(表51，图59A、59B)。与其未修饰的版本相比，两种测定中的EC50均降低超过两个数量级(分别为147和152倍，表51)。5'-胆固醇基-修饰的GCGT3-TG4T是迄今为止鉴定的活性最高的TLR21-刺激性ODN。
包含5'胆固醇部分的ODN订购自Genelink，并且这些ODN的脂质部分的结构基于www_genelink_com/newsite/products/MODPDFFILES/26-6602.pdf中显示的结构。包含5'胆固醇部分的其他ODN订购自Sigma Aldrich。这些ODN的脂质部分的结构基于www_sigmaaldrich_com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/ custom-oligonucleotide-modifications-guide.pdf，第85/86页显示的结构。包含5'胆固醇部分的其他ODN订购自IBA Lifesciences，并且具有基于在www_iba-lifesciences_com/Services_ custom_oligos_custom_DNa_Non-fluorescent_5-modifications.html显示的结构的结构。
5'-胆固醇修饰(I)
将5'-胆固醇修饰(图58A和58B)合成至在我们研究的过程中鉴定的两种高TLR21活性的ODN GCGT-3-TG4T和GCGT-3-Gw2上(表52)，并且如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中进行TLR21刺激测试。
表52：ODN序列(Sigma)
表53：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
两次独立测量的结果表明，通过5'-胆固醇修饰，GCGT-3-TG4T和GCGT-3-Gw2两者的TLR21-刺激活性被大大提高(表53，图60A、60B、61A、61B)。与其未修饰的版本相比，在两种测定中的EC50均降低约1个数量级(分别地，对于GCGT-3-TG4T-5Chol降低10和13倍，且对于GCGT-3-Gw2-5Chol降低30和24倍(表51))。5'-胆固醇基-修饰的ODN GCGT-3-TG4T和GCGT-3-Gw2是迄今为止鉴定的活性最高的TLR21-刺激性ODN，表现出飞摩尔浓度EC50值。
5'-胆固醇修饰(II)
将5'-胆固醇修饰(图58A和58B)合成至在我们研究的过程中鉴定的两种高TLR21活性的ODN GCGT-3-TG4T和GCGT-3-Gw2上(表54)，并且如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中进行TLR21刺激测试。
表54：ODN序列(Sigma)
表55：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
两次独立测量的结果表明，通过5'-胆固醇修饰，GCGT-3-TG4T和GCGT-3-Gw2两者的TLR21-刺激活性提高(表55，图62A、62B、63A、63B)。与其未修饰的版本相比，在两种测定中的EC50均降低约5至10倍(对于GCGT3-TG4T-5Chol降低近似5倍，且对于GCGT3-Gw2-5Chol降低近似10倍(表55))。在该研究中还显示，5'-dG序列不是5'-胆固醇的活性-增强作用所需的，因为GCGT3-5Chol的活性比其未修饰的同类物高近似17倍(表55，图64)。
5'-胆固醇修饰(III)
由另一供应商将5'-胆固醇修饰(图58A和58B)合成至GCGT3-TG4T上(表56)，并且如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中进行TLR21刺激测试。
表56：ODN序列(IBA GmbH)
表57：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
GCGT3-TG4T的5'-胆固醇基修饰的形式显示高度有效的TLR21刺激活性，其具有单位数pM EC50值(表57，图65A和65B)。相比之下，不含5'-胆固醇基的GCGT3-TG4T形式，就EC50而言，功效降低近1500倍，表明5'脂质修饰的重要性(表57，图65A和65B)。
5'-胆固醇修饰(IV)
将5'-胆固醇修饰(图58A和58B)合成至在我们研究的过程中鉴定的具有不同的CpG-四核苷酸核心的另一种高TLR21-活性的ODN CCGC3-Gw2上(表58)，并且如实施例3中所述，在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21细胞中进行TLR21刺激测试。
表58：ODN序列(Sigma)
表59：半最大有效浓度(EC50)和最大信号速度(Vmax)
两次独立测量的结果表明，通过5'-胆固醇修饰，CCGC3-Gw2的TLR21-刺激活性被提高(表59，图66A、66B)。与未修饰的版本相比，两种测定中的EC50降低约3至5倍(表59)。该研究中还显示，5'-dG序列不是5'-胆固醇的活性增强作用所需的：CCGC3-5Chol的活性比其未修饰的同类物高近似33倍(表59，图67)。
总之，据信这是关于由于5'-胆固醇基修饰而使ODN对TLR21的固有活性增加的首次报道。在由三个不同的供应商合成的三个不同批次中，对于GCGT3-TG4T(本研究系列中新鉴定的ODN)已显示这一点。TLR21活性-增加作用是除了由于5'-G-四联体形成序列(诸如G线2或TG4T)的活化以外的，但不需要它们(参见GCGT3)。对于本研究系列中鉴定的另一种CpG-ODN：CCGC3-G线2和CCGC3，也已经表明TLR21活性-增强作用。3'-胆固醇基修饰不具有TLR21活性-增强作用。看起来5'胆固醇基衍生化可能也具有针对核酸酶降解的稳定作用。可以推测胆固醇基胶束组装有助于多齿TLR21配体的形成。5'位置(而不是3'位置)可能是CpG基序的正确取向所需的。此外，5'胆固醇基衍生化可能对体内生物利用度具有修饰作用。
本领域技术人员将理解，可以对本发明的优选实施方案进行多种改变和修改，并且可以在不脱离本发明的精神的情况下进行此类改变和修改。因此，所附权利要求意欲覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有此类等同变化。
在本文件中引用或描述的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此以其整体通过引用并入本文。
实施例10：免疫刺激剂在鸡新城疫接种疫苗模型中的效力的体内研究
为了确定ODN1、ODN2和ODN3作为免疫刺激剂的适用性和效力，各自以三种不同的浓度进行测试。
研究以下免疫刺激剂：
ODN1: [CholTEG]-TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3-TG4T-5Chol”)(SEQ ID NO:252) ([CholTEG]=5'-三乙二醇连接的胆固醇基修饰)，
ODN2: TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3-TG4T”) (SEQ ID NO:252),
ODN3: tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt (“2006-PTO”) (SEQ ID NO:3)。
根据表61，将每种免疫刺激剂添加至含有次优浓度的灭活新城疫病毒(NDV)的油乳剂中。对于次优NDV疫苗的制备，将NDV抗原批次在NDV-阴性尿囊液(AF)中稀释50倍。在SPF级鸡(Leghorn)中测试ODN1、ODN2和ODN3与次优剂量的新城疫疫苗组合的效力。测量血清学应答并将其与没有免疫刺激剂的类似次优NDV疫苗进行比较。在接种疫苗后的不同时间点测定抗体滴度，以研究免疫刺激剂的添加是否导致较早的免疫应答。为了确定三种ODN的最佳剂量，各自以100 ng、1000 ng和5000 ng的三种不同剂量补充至次优NDV疫苗，产生9个免疫刺激剂组。除了这9个免疫刺激剂组以外，本研究中并入5个对照组，其由以下组成：无免疫刺激剂的次优NDV疫苗组，未稀释的NDV疫苗组，阴性对照组(免疫刺激剂与佐剂的组合)和具有两种不同浓度的聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)的两个阳性对照组(表60)。
测试了以下参数：鸡的健康(数据未显示)和通过血凝抑制(HI)测定的血清学。
表 60：研究设计
*对于与佐剂(Stimune)组合的每种免疫刺激剂，分配3只动物作为对照。一只动物仅接受佐剂。
所有动物都在3周龄时到达。
所有动物都在5周龄时接种疫苗。在第0天通过肌肉内注射进行所有疫苗接种。
在第0天(接种疫苗前)、第7天、第14天和第21天进行血液采样/血清学分析。
每天进行所有动物的临床评分。
根据研究设计，处理组T01-T14中纳入的鸡接受测试物品或对照项。在T13和T14组中，由于在研究开始前丢失两只动物，所以每组九只鸡而不是十只鸡接种疫苗。
分配至处理组T01、T02、T03、T04、T05、T06、T07、T08和T09的鸡用次优NDV悬浮液接种疫苗，所述悬浮液含有3种不同的免疫刺激剂(ODN)之一，每种呈3种不同的浓度(100、1000、5000 ng/剂)。为了制备油包水乳剂，将NDV抗原悬浮液和免疫刺激剂(水相)与佐剂Stimune(油相)以4:5的比率一起配制(表61)。
表61：测试物品和对照项的制备。
分配至T10的对照组的鸡用在佐剂(Stimune)中没有免疫刺激剂的次优NDV悬浮液(比率为4:5)接种疫苗。
分配至T11的对照组的鸡用在佐剂(Stimune)中没有免疫刺激剂的未稀释的NDV悬浮液(比率为4:5)接种疫苗。
分配至T12组的鸡用佐剂(Stimune)中的免疫刺激剂1 (3只鸡)、免疫刺激剂2 (3只鸡)或免疫刺激剂3 (3只鸡)(比率为4:5)接种疫苗。一只鸡用佐剂(Stimune)中的稀释缓冲液接种疫苗。
分配至T13 (n=9)和T14 (n=9)的对照组的鸡用在佐剂(Stimune)中与两种浓度(10,000 ng和100 µg)的聚I:C组合的次优NDV悬浮液(比率为4:5)接种疫苗。
测试物品或对照项施用
将在-70℃下储存的灭活的NDV菌株Ulster悬浮液解冻，并在阴性尿囊液中稀释50倍，以产生次优的疫苗剂量。根据研究设计添加免疫刺激剂。根据表61中显示的接种疫苗制备方案，将所得的水相与Stimune以4:5的比率混合。在制备期间，将除了Stimune佐剂以外的所有疫苗成分置于融冰中。制备后直接注射(0.5 ml，肌肉内注射)配制的疫苗。
从到达之日直至研究结束，每天由经验丰富的生物技术人员监测总体健康。
血清采血
在研究的第0天(接种疫苗前)、第7天、第14天和第21天从所有鸡收集血液样品用于血清学分析。血液样品用研究编号、独特的样品标识和采集日期标记。根据抽取的血液体积量，将血清等分成两个近似0.5 ml的等份试样，并储存在-20±5℃。
血凝抑制(HI)测定
简而言之，将稀释的血清系列与8 HAU(血凝单位)的NDV菌株Ulster在室温下孵育60分钟。在每次测定之前，将HAU滴定。其后，添加鸡红细胞并在4℃下孵育45分钟后对凝集进行评分。每种测定中都包括阴性对照血清和具有低、中和高抗体滴度的三种阳性对照血清。
HI滴度结果表示为完全抑制凝集的最高血清稀释度的倒数，将其对数转化为最终的Log2滴度。
统计学
每只动物总结对数转化的HI结果(参见表62-65)。每个处理组，计算抗体滴度的平均值和标准偏差。用非参数Mann-Whitney t-检验进行统计分析。
结果
在任何组中均未观察到与接种疫苗相关的临床症状或不良事件。在整个研究时段期间，所有鸡都看起来健康。
然而，由于啄食行为，两只鸡被评分为具有轻伤，这在研究开始前6天开始。在接种疫苗当天，将这些鸡分配至聚I:C组T13 (#11658)和T14 (#11676)。恢复在接种疫苗后一周内发生。
ODN1, GCGT3-TG4T-5Chol
在表62中指示100 ng、1000 ng和5000 ng ODN1剂量组的表示为Log2滴度的个体HI结果。与稀释的NDV疫苗组的平均滴度相比，在图70(接种疫苗后(pv)第14天和第21天)和图71(所有数据)中指示这些组的平均HI滴度和标准偏差。
与稀释的NDV疫苗(平均HI滴度：4.8 Log2/SD 1.0)相比，GCGT3-TG4T-5Chol组显示显著更高的HI滴度。在pv第14天时，所有三种剂量都是如此；100 ng：平均HI滴度 6.2Log2/SD 1.4 (p=0.0214)，1000 ng：平均HI滴度 6.9 Log2/SD 1.1 (p=0.0003)和5000ng：平均HI 5.9 Log2/SD 0.7 (p=0.0243)。
然而，在pv第21天时，当与NDV疫苗；HI滴度 6.2 Log2/ SD1.0相比时，对于所有浓度均未观察到显著差异；100 ng：平均HI滴度 6.9 Log2 /SD 0.8 (p=0.1995)；1000 ng：平均HI滴度 7.3 Log2/SD 0.9 (p=0.0527)；和5000 ng：平均HI 6.7 Log2/SD 0.9 (p=0.4523)，尽管1000 ng浓度非常接近于显著性(图70)。
表62：
ODN2, GCGT3-TG4T
在表63中指示100 ng、1000 ng和5000 ng ODN1剂量组的表示为Log2滴度的个体HI结果。与稀释的NDV疫苗组的平均滴度相比，在图72(pv第14天和第21天)和图73(所有数据)中指示这些组的平均HI滴度和标准偏差。
与稀释的NDV疫苗(平均HI滴度：4.8 Log2/SD 1.0)相比，ODN2，GCGT3-TG4T组显示显著更高的HI滴度。在接种疫苗后第14天，对于所有三种疫苗都是如此；100 ng：平均HI滴度 7.1 Log2/SD 1.2 (p=0.0003)，1000 ng：平均HI滴度6.4 Log2/SD 0.7 (p=0.0027)和5000 ng：平均HI滴度6.1 Log2/SD 1.1 (p=0.0236)。在第21天，当与NDV疫苗(HI滴度6.2Log2/SD 1.0)相比时，仅在100 ng剂量下观察到显著差异，其中平均HI滴度为7.6 Log2/SD0.8 (p=0.0083)。1000 ng和5000 ng的平均HI滴度分别为7.1 Log2/0.6 (p=0.0696)和7.2Log2/SD 1.0(p=0.0956)(图72)。
表63：
ODN3, 2006-PTO
在表64中指示测量的100 ng、1000 ng和5000 ng ODN1剂量组的表示为Log2滴度的个体HI结果。在进行三次重复HI测定期间，在第21天观察到动物11570的异常结果，这最可能由移液错误(未添加足够的AF)引起，且因此从最终分析忽略该结果(表64中突出显示)。因此，对于该动物和日期，平均HI滴度基于二次重复测量。
与稀释的NDV疫苗组的平均滴度相比，在图74(pv第14天和第21天)和图75(所有数据)中指示这些组的平均HI滴度和标准偏差。
与稀释的NDV疫苗(平均HI滴度：4.8 Log2/SD 1.0)相比，ODN3，2006-PTO组显示显著更高的HI滴度。在接种疫苗后第14天，对于两种疫苗都是如此；1000 ng：平均HI滴度：6.3Log2/SD 1.2 (p=0.0081)和5000 ng：平均HI滴度：6.2 Log2/SD 0.8 (p=0.0059)。100 ng剂量的平均HI滴度为5.3 Log2/SD 0.5 (p=0.2090)。在pv第21天，仅在5000 ng测量到显著差异：平均HI滴度 7.3 Log2/SD 0.6 (p=0.0296)。当与NDV疫苗；HI滴度6.2 Log2/SD 1.0相比时，在100 ng和1000 ng剂量没有观察到显著差异，其中平均HI滴度分别为6.6 Log2/SD 0.5 (p=0.7183)和6.8 Log2/SD 1.1 (p=0.1685) (图74)。
表64：
对照组
在表65中指示10 µg和100 µg聚I:C剂量组、稀释和未稀释的NDV疫苗以及阴性对照组的表示为Log2滴度的个体HI结果。与稀释的NDV疫苗组的平均滴度相比，在图76(pv第14天和第21天)和图77(所有数据)中指示这些组的平均HI滴度和标准偏差。
当与NDV疫苗(6.2 Log2/SD 1.0)相比时，对于聚I:C阳性对照组，仅在100 µg剂量观察到显著更高的HI滴度：在第21天的HI滴度7.5 Log2/SD 0.4 (p=0.0053)。10 µg和100µg剂量组的pv第14天的平均HI滴度分别为5.8 Log2/SD 1.3 (p=0.1859)和5.5 Log2/SD0.8 (p=0.1609)。在pv第21天的10 µg剂量组的平均HI滴度为6.4 Log2/SD 1.3 (p=0.7273)。在接种疫苗后第14天和第21天，与稀释的NDV组(分别为4.8/SD 1.0和6.2 Log2/SD 1.0)相比，未稀释的NDV疫苗(8.3/SD 0.5和8.5 Log2/SD 0.7)和阴性对照组之间观察到显著差异(p< 0.0001)(图76)。
表65：
结论
目的是研究三种不同的免疫刺激剂的佐剂活性。通过用含次优浓度的灭活NDV和不同浓度的三种不同免疫刺激剂之一的油乳剂疫苗接种疫苗后测量血清学应答来测试这一点。
研究以下免疫刺激剂：
ODN1: [CholTEG]-TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3-TG4T-5Chol”)(SEQ ID NO:252) ([CholTEG]=5’-三乙二醇连接的胆固醇基修饰)，
ODN2: TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3-TG4T”) (SEQ ID NO:252)，
ODN3: tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt (“2006-PTO”) (SEQ ID NO:3)。
ODN1和ODN2免疫的主链是磷酸二酯连接的，而ODN3的主链是硫代磷酸酯连接的。在补充至次优NDV疫苗的三种不同剂量(100 ng、1000 ng和5000 ng)下测定每种ODN的效力。
在疫苗接种后第0天(疫苗接种前)、第7天、第14天和第21天测定血清学应答，以研究这些免疫刺激剂的添加是否也可以导致较早的免疫应答。在接种疫苗后(pv)第0天和第7天，未检测到针对NDV的抗体水平，除了在第7天未稀释NDV疫苗组中的一只动物(#11618)。
表示为Log2 HI滴度的血清学应答显示了在pv第14天和第21天，未稀释和次优NDV疫苗之间的显著差异(p<0.0001)，指示50倍的稀释倍数足以产生次优疫苗剂量。
阴性对照组在整个研究期间保持阴性，表明没有NDV疫苗的免疫刺激剂不导致非特异性免疫应答。
在第21天，与未经NDV疫苗处理相比，阳性对照聚I:C 100 µg剂量组显示显著更高的HI滴度(p=0.0053)，表明该剂量组充当有效的阳性对照组。
对于所有三种剂量，在pv第14天，与稀释的NDV疫苗相比，GCGT3-TG4T-5Chol(ODN1)组显示显著更高的HI滴度；100 ng (p=0.0214)，1000 ng (p=0.0003)和5000 ng (p=0.0243)。然而，在pv第21天，均未观察到显著差异。
对于所有三种剂量，在pv第14天，与稀释的NDV疫苗相比，GCGT3-TG4T (ODN2)组显示显著更高的HI滴度；100 ng (p=0.0003)，1000 ng (p=0.0027)和5000 ng (p=0.0236)。在第21天，仅在100 ng剂量组测量到显著差异(p=0.0083)。
对于两种剂量，在pv第14天，与稀释的NDV疫苗相比，2006-PTO (ODN3)组显示显著更高的HI滴度；1000 ng (p=0.0081)和5000 ng (p=0.0059)。在pv第21天，仅在5000 ng剂量组测量到显著差异(p=0.0296)。
总之，在100 ng GCGT3-TG4T (ODN2)剂量组，观察到最高的平均HI滴度，7.1 Log2(pv第14天)和7.6 Log2 (pv第21天)，表明在pv第14天和第21天，当与未经NDV疫苗处理相比时，滴度分别增加2.3 Log2和1.4 Log2。
在pv第14天和第21天的1000 ng GCGT3-TG4T-5Chol (ODN1)剂量组的滴度(6.9Log2和7.3 Log2)分别与ODN2组几乎相似。在pv第14天，在ODN1和ODN2组之间未观察到显著差异(p=0.7513)。
在pv第14天和第21天，5000 ng 2006-PTO (ODN3)剂量组的滴度分别为6.2 Log2和7.3 Log2。在pv第14天时，ODN3组与ODN1和ODN2组两者均显著不同(p=0.0300)(图78和图79)。
在pv第21天，未显示所有ODN组之间的显著差异。
因此，这些结果表明，所有ODN都能够显著增加血清学应答，特别是在接种疫苗后的第14天，也表明免疫开始较早。
实施方案
为了进一步举例说明，本公开的额外非限制性实施方案在下面阐述。
例如，实施方案1是免疫刺激性寡核苷酸，其包含至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
实施方案2是实施方案1的寡核苷酸，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含第一多个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案3是实施方案2的寡核苷酸，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含三至八个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案4是实施方案3的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、92、93、96、97、100、102、104、106、108、143或252。
实施方案5是实施方案1至3中任一项的寡核苷酸，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC、TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)或TGGGGT (SEQ ID NO:265)。
实施方案6是实施方案1至3中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ IDNO:110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
实施方案7是前述实施方案1-6中任一项的寡核苷酸，其进一步包含在所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述至少一个CpG基序之间的第二多个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案8是实施方案2至7中任一项的寡核苷酸，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸、所述第二多个鸟嘌呤核苷酸或两者包含G-四联体序列。
实施方案9是实施方案8的寡核苷酸，其中所述G-四联体序列是其他G-四联体序列的相互作用位点。
实施方案10是实施方案9的寡核苷酸，其中所述G-四联体序列包含TGGGGT (SEQID NO:265)。
实施方案11是实施方案7的寡核苷酸，其中第一和第二多个鸟嘌呤核苷酸包含G-线序列。
实施方案12是实施方案11的寡核苷酸，所述G-线序列是其他G-线序列的相互作用位点。
实施方案13是实施方案10或11的寡核苷酸，其中所述G-线序列包含SEQ ID NO:257或258。
实施方案14是实施方案11或12的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-G线3。
实施方案15是实施方案7至14中任一项的寡核苷酸，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述第二多个鸟嘌呤核苷酸被至少一个核苷酸分隔。
实施方案16是实施方案1至3中任一项的寡核苷酸，其进一步包含在所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述至少一个CpG基序之间的接头。
实施方案17是实施方案16的寡核苷酸，其中所述接头包含至少三个核苷酸。
实施方案18是实施方案16或17的寡核苷酸，其中所述接头包含六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
实施方案19是实施方案16至18中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
实施方案20是前述实施方案1-19中任一项的寡核苷酸，其中所述至少一个CpG基序是多个CpG基序。
实施方案21是实施方案20的寡核苷酸，其中所述多个CpG基序包含两个、三个、四个或五个CpG基序。
实施方案22是实施方案20或21的寡核苷酸，其中每个CpG基序通过至少一个核苷酸或核苷酸类似物与其他CpG基序分隔。
实施方案23是实施方案22的寡核苷酸，其中所述至少一个核苷酸是一至四个胸腺嘧啶核苷酸。
实施方案24是实施方案22或23的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:217、218、219或220。
实施方案25是实施方案20的寡核苷酸，其中所述CpG基序各自通过间隔基与其他CpG基序分隔。
实施方案26是实施方案25的寡核苷酸，其中所述间隔基是脱氧核糖磷酸酯桥。
实施方案27是实施方案26的寡核苷酸，其中所述脱氧核糖磷酸酯桥是无碱基的。
实施方案28是实施方案27的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:221。
实施方案29是实施方案25的寡核苷酸，其中所述间隔基包含碳链。
实施方案30是实施方案29的寡核苷酸，其中所述碳链包含两个碳原子。
实施方案31是实施方案30的寡核苷酸，其中所述碳链衍生自乙二醇。
实施方案32是实施方案31的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2是乙二醇。
实施方案33是实施方案29的寡核苷酸，其中所述碳链包含三个碳原子。
实施方案34是实施方案33的寡核苷酸，其中所述碳链衍生自1,3-丙二醇。
实施方案35是实施方案33或34的寡核苷酸，其中所述核苷酸包含CG-Gw2X2、Gw2X2-2或ODN-X3、CG-Gw2X2-1、CG-Gw2X2-3、CG-Gw2X2-4、CG-Gw2X2-5、CG-G4T16X2-1、CG-G4T16X2-2、CG-G4T16X2-3、CG-G4T16X2-4或CG-G4T16X2-5，其中X2是三碳链；2006-PDE5dG4-X2，其中X2是衍生自丙二醇的三碳链；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4是衍生自丙二醇的三碳链。
实施方案36是实施方案29的寡核苷酸核苷酸，其中所述碳链包含四个碳原子。
实施方案37是实施方案36的寡核苷酸，其中所述碳链衍生自1,4-丁二醇。
实施方案38是实施方案36或37的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4是衍生自1,4-丁二醇的四碳链。
实施方案39是实施方案25的寡核苷酸，其中所述间隔基包含重复的化学单元。
实施方案40是实施方案39的寡核苷酸，其中所述重复的化学单元是乙二醇。
实施方案41是实施方案39或40的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，其中X1是衍生自六乙二醇的间隔基。
实施方案42是前述实施方案1-41中任一项的寡核苷酸，其进一步包含至少一个核苷酸类似物。
实施方案43是前述实施方案1-42中任一项的寡核苷酸，其进一步包含磷酸二酯主链。
实施方案44是前述实施方案1-43中任一项的寡核苷酸，其进一步包含硫代磷酸酯主链。
实施方案45是前述实施方案1-44中任一项的寡核苷酸，其进一步包含脂质部分。
实施方案46是实施方案45的寡核苷酸，其中所述脂质部分是胆固醇。
实施方案47是实施方案45或46的寡核苷酸，其中所述脂质部分在所述寡核苷酸的5’末端处或附近。
实施方案48是前述实施方案1-47中任一项的寡核苷酸，其中所述CpG基序包含具有至少四个核苷酸的CpG序列元件。
实施方案49是实施方案48的寡核苷酸，其包含至少两个CpG序列元件。
实施方案50是实施方案48或49的寡核苷酸，其包含至少三个CpG序列元件。
实施方案51是实施方案48至50中任一项的寡核苷酸，其中所述CpG序列元件是GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其任何组合。
实施方案52是前述实施方案1-51中任一项的寡核苷酸，其进一步包含三胸腺嘧啶核苷酸3'末端。
实施方案53是实施方案55的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
实施方案54是用于预防或治疗感染性疾病的疫苗，其包含前述实施方案1-53中任一项的寡核苷酸。
实施方案55是载体，其包含前述实施方案1-54中任一项的寡核苷酸。
实施方案56是免疫刺激性组合物，其包含前述实施方案1-55中任一项的寡核苷酸。
实施方案57是实施方案56的免疫刺激性组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案58是实施方案57的免疫刺激性组合物，其中所述寡核苷酸和所述载体是连接的。
实施方案59是实施方案56的免疫刺激性组合物，其进一步包含半抗原。
实施方案60是实施方案57的免疫刺激性组合物，其中所述寡核苷酸和所述半抗原是连接的。
实施方案61是刺激toll-样受体21 (TLR21)的方法，其包括：
向有此需要的受试者施用免疫刺激性寡核苷酸，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列，所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含第一多个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案62是实施方案61的方法，其中所述寡核苷酸的浓度小于20nM。
实施方案63是实施方案61或62的方法，其中所述寡核苷酸进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案64是实施方案61至63中任一项的方法，其中所述免疫刺激性组合物进一步包含半抗原。
实施方案65是实施方案61至64中任一项的方法，其中所述寡核苷酸的半最大浓度(EC50)小于100 pM。
实施方案66是实施方案61至65中任一项的方法，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的核苷酸序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)。
实施方案67是实施方案61至66中任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ IDNO:110、111、112、113、114、115、116、117118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
实施方案68是实施方案61至67中任一项的方法，其中所述寡核苷酸进一步包含G-线序列。
实施方案69是实施方案68的方法，其中所述G-线序列包含SEQ ID NO:257或258。
实施方案70是实施方案68的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-G线3。
实施方案71是实施方案61至70中任一项的方法，其包含第二多个鸟嘌呤核苷酸，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述第二多个鸟嘌呤核苷酸被至少一个核苷酸分隔。
实施方案72是实施方案61至71中任一项的方法，其中所述寡核苷酸进一步包含在所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述至少一个CpG基序之间的接头。
实施方案73是实施方案72的方法，其中所述接头包含至少三个核苷酸。
实施方案74是实施方案72的方法，其中所述接头包含六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
实施方案75是实施方案72至74的方法，其中所述寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
实施方案76是实施方案72至75的方法，其中所述至少一个CpG基序是多个CpG基序。
实施方案77是实施方案76的方法，其中所述多个CpG基序包含两个、三个、四个或五个CpG基序。
实施方案78是实施方案76或77的方法，其中每个CpG基序通过至少一个核苷酸或核苷酸类似物与其他CpG基序分隔。
实施方案79是实施方案78的方法，其中所述至少一个核苷酸是一至四个胸腺嘧啶核苷酸。
实施方案80是实施方案78或79的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:217、218、219或220。
实施方案81是实施方案76或77的方法，其中所述CpG基序各自通过间隔基与其他CpG基序分隔。
实施方案82是实施方案81的方法，其中所述间隔基是脱氧核糖磷酸酯桥。
实施方案83是实施方案82的方法，其中所述脱氧核糖磷酸酯桥是无碱基的。
实施方案84是实施方案82或83的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:221。
实施方案85是实施方案81的方法，其中所述间隔基包含碳链。
实施方案86是实施方案85的方法，其中所述碳链包含两个碳原子。
实施方案87是实施方案86的方法，其中所述碳链衍生自乙二醇。
实施方案88是实施方案86或87的方法，其中所述寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2是乙二醇。
实施方案89是实施方案85的方法，其中所述碳链包含三个碳原子。
实施方案90是实施方案89的方法，其中所述碳链衍生自1,3-丙二醇。
实施方案91是实施方案89或90的方法，其中所述核苷酸包含CG-Gw2X2, Gw2X2-2或ODN-X3, CG-Gw2X2-1, CG-Gw2X2-3, CG-Gw2X2-4, CG-Gw2X2-5, CG-G4T16X2-1, CG-G4T16X2-2, CG-G4T16X2-3, CG-G4T16X2-4或CG-G4T16X2-5，其中X2是三碳链；2006-PDE5dG4-X2，其中X2是衍生自丙二醇的三碳链；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4是衍生自丙二醇的三碳链。
实施方案92是实施方案85的方法，其中所述碳链包含四个碳原子。
实施方案93是实施方案92的方法，其中所述碳链衍生自1,4-丁二醇。
实施方案94是实施方案92或93的方法，其中所述寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4是衍生自1,4-丁二醇的四碳链。
实施方案95是实施方案81的方法，其中所述间隔基包含重复的化学单元。
实施方案96是实施方案95的方法，其中所述重复的化学单元是乙二醇。
实施方案97是实施方案95或96的方法，其中所述寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，其中X1是衍生自六乙二醇的间隔基。
实施方案98是前述实施方案61-97中任一项的方法，其进一步包含至少一个核苷酸类似物。
实施方案99是前述实施方案61-98中任一项的方法，其进一步包含脂质部分。
实施方案100是实施方案99的方法，其中所述脂质部分是胆固醇。
实施方案101是实施方案99或100的方法，其中所述脂质部分在所述寡核苷酸的5’末端处或附近。
实施方案102是实施方案61至101中任一项的方法，其中所述CpG基序包含具有至少四个核苷酸的CpG序列元件。
实施方案103是实施方案102的方法，其中所述寡核苷酸包含至少两个CpG序列元件。
实施方案104是实施方案102或103的方法，其中所述寡核苷酸包含至少三个CpG序列元件。
实施方案105是实施方案101至104中任一项的方法，其中所述CpG序列元件是GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其任何组合。
实施方案106是实施方案61的方法，其进一步包含三胸腺嘧啶核苷酸3'末端。
实施方案107是实施方案106的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
实施方案108是实施方案61至107中任一项的方法，其中所述免疫刺激性组合物包含用于预防或治疗感染性疾病的疫苗。
实施方案109是实施方案61至107中任一项的方法，其中所述免疫刺激性组合物包含载体。
实施方案110是实施方案61至109中任一项的方法，其中所述免疫刺激性组合物进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案111是实施方案110的方法，其中所述寡核苷酸和所述载体是连接的。
实施方案112是实施方案61至111中任一项的方法，其中所述免疫刺激性组合物进一步包含半抗原。
实施方案113是实施方案112中任一项的方法，其中所述寡核苷酸和所述半抗原是连接的。
实施方案114是实施方案61至113中任一项的方法，其中所述施用静脉内、肌肉内、乳房内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通过气溶胶、卵内、粘膜、经皮、通过浸入、口服、眼内、气管内或鼻内进行。
实施方案115是实施方案61至114中任一项的方法，其中所述受试者是动物。
实施方案116是实施方案61至115中任一项的方法，其中所述受试者是禽类物种的成员。
实施方案117是用于增加具有至少一个CpG基序的寡核苷酸的TLR21-刺激活性的方法，其包括将所述寡核苷酸的5'末端融合至鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
实施方案118是实施方案117的方法，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列是G-四联体序列。
实施方案119是实施方案118的方法，其中所述G-四联体序列包含第一多个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案120是实施方案119的方法，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含三至八个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案121是实施方案119或120的方法，其中所述G-四联体序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)。
实施方案122是实施方案117至121中任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含第二多个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案123是实施方案117至122中任一项的方法，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含G-线序列。
实施方案124是实施方案123的方法，其中所述G-线序列包含SEQ ID NO:257或258。
实施方案125是实施方案119至124中任一项的方法，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述第二多个鸟嘌呤核苷酸被至少一个核苷酸分隔。
实施方案126是实施方案117的方法，其进一步包括在所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述至少一个CpG基序之间插入接头。
实施方案127是实施方案126的方法，其中所述接头包含至少三个核苷酸。
实施方案128是实施方案126或127的方法，其中所述接头包含六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
实施方案129是实施方案126至128中任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
实施方案130是实施方案117的方法，其中所述至少一个CpG基序是多个CpG基序。
实施方案131是实施方案130的方法，其中所述多个CpG基序包含两个、三个、四个或五个CpG基序。
实施方案132是实施方案130或131的方法，其进一步包括在所述CpG基序之间插入至少一个核苷酸或核苷酸类似物。
实施方案133是权利要求132的方法，其中所述至少一个核苷酸是一至四个胸腺嘧啶核苷酸。
实施方案134是实施方案117的方法，其进一步包括在所述CpG基序各自之间插入间隔基。
实施方案135是实施方案134的方法，其中所述间隔基是脱氧核糖磷酸酯桥。
实施方案136是实施方案135的方法，其中所述脱氧核糖磷酸酯桥是无碱基的。
实施方案137是实施方案134的方法，其中所述间隔基包含碳链。
实施方案138是实施方案137的方法，其中所述碳链包含两个碳原子。
实施方案139是实施方案137或138的方法，其中所述碳链衍生自乙二醇。
实施方案140是实施方案137的方法，其中所述碳链包含三个碳原子。
实施方案141是实施方案137或140的方法，其中所述碳链衍生自1,3-丙二醇。
实施方案142是实施方案137的方法，其中所述碳链包含四个碳原子。
实施方案143是实施方案137或142的方法，其中所述碳链衍生自1,4-丁二醇。
实施方案144是实施方案137的方法，其中所述间隔基包含重复的化学单元。
实施方案145是实施方案137或144的方法，其中所述重复的化学单元是乙二醇。
实施方案146是实施方案137、144或145中任一项的方法，其中所述间隔基衍生自六乙二醇。
实施方案147是实施方案117至146中任一项的方法，其进一步包括插入至少一个核苷酸类似物。
实施方案148是实施方案117至147中任一项的方法，其进一步包括插入脂质部分。
实施方案149是实施方案148的方法，其中所述脂质部分是胆固醇。
实施方案150是实施方案148或149的方法，其中所述脂质部分在所述寡核苷酸的5’末端处或附近。
实施方案151是实施方案117至150中任一项的方法，其进一步包括修饰与所述CpG基序相邻的核苷酸。
实施方案152是引发受试者中的免疫应答的方法，其包括：
向有此需要的受试者施用包含寡核苷酸的免疫刺激性组合物，所述寡核苷酸具有至少一个CpG二核苷酸基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
实施方案153是实施方案152的方法，其中所述寡核苷酸的浓度小于20nM。
实施方案154是实施方案152或153的方法，其中所述免疫刺激性组合物进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案155是实施方案152至154中任一项的方法，其中所述免疫刺激性组合物进一步包含半抗原。
实施方案156是实施方案152至155中任一项的方法，其中所述免疫刺激性组合物的半最大浓度(EC50)小于100 pM。
实施方案157是实施方案152的方法，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含G-四联体序列。
实施方案158是实施方案152至156中任一项的方法，其中所述G-四联体序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG (SEQ IDNO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC、TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)或TGGGGT (SEQ ID NO:265)。
实施方案159是实施方案152至157中任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQID NO:110、111、112、113、114、115、116、117118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
实施方案160是实施方案152的方法，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含G-线序列。
实施方案161是实施方案160的方法，其中所述G-线序列包含SEQ ID NO:257或258。
实施方案162是实施方案160的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-G线3。
实施方案163是实施方案152的方法，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含被至少一个核苷酸分隔的第一和第二多个鸟嘌呤核苷酸。
实施方案164是实施方案152的方法，其中所述寡核苷酸进一步包含所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列和所述至少一个CpG基序之间的接头。
实施方案165是实施方案164的方法，其中所述接头包含至少三个核苷酸。
实施方案166是实施方案164的方法，其中所述接头包含六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
实施方案167是实施方案164至166的方法，其中所述寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
实施方案168是实施方案152的方法，其中所述至少一个CpG基序是多个CpG基序。
实施方案169是实施方案168的方法，其中所述多个CpG基序包含两个、三个、四个或五个CpG基序。
实施方案170是实施方案168或169的方法，其中每个CpG基序通过至少一个核苷酸或核苷酸类似物与其他CpG基序分隔。
实施方案171是实施方案170的方法，其中所述至少一个核苷酸类似物是一至四个胸腺嘧啶核苷酸。
实施方案172是实施方案170或171的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:217、218、219或220。
实施方案173是实施方案168或169的方法，其中所述CpG基序各自通过间隔基与其他CpG基序分隔。
实施方案174是实施方案173的方法，其中所述间隔基是脱氧核糖磷酸酯桥。
实施方案175是实施方案174的方法，其中所述脱氧核糖磷酸酯桥是无碱基的。
实施方案176是实施方案174或175的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:221。
实施方案177是实施方案173的方法，其中所述间隔基包含碳链。
实施方案178是实施方案177的方法，其中所述碳链包含两个碳原子。
实施方案179是实施方案177或178的方法，其中所述碳链衍生自乙二醇。
实施方案180是实施方案177至179中任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2是乙二醇。
实施方案181是实施方案177的方法，其中所述碳链包含三个碳原子。
实施方案182是实施方案177或181的方法，其中所述碳链衍生自1,3-丙二醇。
实施方案183是实施方案177、181或182中任一项的方法，其中所述核苷酸包含CG-Gw2X2, Gw2X2-2或ODN-X3, CG-Gw2X2-1, CG-Gw2X2-3, CG-Gw2X2-4, CG-Gw2X2-5, CG-G4T16X2-1, CG-G4T16X2-2, CG-G4T16X2-3, CG-G4T16X2-4或CG-G4T16X2-5，其中X2是三碳链；2006-PDE5dG4-X2，其中X2是衍生自丙二醇的三碳链；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4是衍生自丙二醇的三碳链。
实施方案184是实施方案177的方法，其中所述碳链包含四个碳原子。
实施方案185是实施方案177或184的方法，其中所述碳链衍生自1,4-丁二醇。
实施方案186是实施方案177、184或185中任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4是衍生自1,4-丁二醇的四碳链。
实施方案187是实施方案173的方法，其中所述间隔基包含重复的化学单元。
实施方案188是实施方案187的方法，其中所述重复的化学单元是乙二醇。
实施方案189是实施方案187或188的方法，其中所述寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，且其中X1是衍生自六乙二醇的间隔基。
实施方案190是实施方案152至189中任一项的方法，其进一步包含至少一个核苷酸类似物。
实施方案191是实施方案152至190的方法，其进一步包括将脂质部分连接至所述寡核苷酸中。
实施方案192是实施方案191的方法，其中所述脂质部分是胆固醇。
实施方案193是实施方案191或192的方法，其中所述脂质部分在所述寡核苷酸的5’末端处或附近。
实施方案194是实施方案152的方法，其中所述CpG基序包含具有至少四个核苷酸的CpG序列元件。
实施方案195是实施方案194的方法，其包含至少两个CpG序列元件。
实施方案196是实施方案194或195的方法，其包含至少三个CpG序列元件。
实施方案197是实施方案194至196中任一项的方法，其中所述CpG序列元件是GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其任何组合。
实施方案198是实施方案152的方法，其进一步包括将三胸腺嘧啶核苷酸延伸插入所述寡核苷酸的3'末端上。
实施方案199是实施方案198的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
实施方案200是包含SEQ ID NO:252的免疫刺激性寡核苷酸。
实施方案201是实施方案200的寡核苷酸，其进一步包含5'胆固醇基修饰。
实施方案202是实施方案201的寡核苷酸，其中所述5'胆固醇基修饰包含三乙二醇接头。
当引入本公开的要素或其优选实施方案时，冠词“一(a)”、“一(an)”、“该(the)”和“所述(said)”意指存在该要素中的一者或多者。术语“包含”、“包括”和“具有”意欲是包括性的，并且意味着除了所列要素之外可以存在额外要素。
鉴于上述内容，可见实现了本公开的几个目的并且获得了其他有利的结果。
由于可以在不背离本公开的范围的情况下在上述产品和方法中进行各种改变，所以意欲应当将上述说明书中含有的所有内容解释为说明性的而不是在限制性意义上解释。
Claims (20)
1.免疫刺激性寡核苷酸，其包含至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含第一多个鸟嘌呤核苷酸。
3.权利要求2的寡核苷酸，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸包含三至八个鸟嘌呤核苷酸。
4.权利要求3的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、92、93、96、97、100、102、104、106、108、143或252。
5.权利要求1至3中任一项的寡核苷酸，其中所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG (SEQ IDNO:262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263)、TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO:268)、GGAGG、TGGAGGC、TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264)或TGGGGT (SEQ ID NO:265)。
6.权利要求1至3中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
7.前述权利要求中任一项的寡核苷酸，其进一步包含在所述第一多个鸟嘌呤核苷酸和所述至少一个CpG基序之间的第二多个鸟嘌呤核苷酸。
8.权利要求2至7中任一项的寡核苷酸，其中所述第一多个鸟嘌呤核苷酸、所述第二多个鸟嘌呤核苷酸或两者包含G-四联体序列。
9.权利要求7的寡核苷酸，其中所述第一和第二多个鸟嘌呤核苷酸包含G-线序列。
10.用于预防或治疗感染性疾病的疫苗，其包含前述权利要求中任一项的寡核苷酸。
11.载体，其包含前述权利要求中任一项的寡核苷酸。
12.免疫刺激性组合物，其包含前述权利要求中任一项的寡核苷酸。
13.权利要求12的免疫刺激性组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
14.权利要求13的免疫刺激性组合物，其中所述寡核苷酸和所述载体是连接的。
15.刺激toll-样受体21 (TLR21)的方法，其包括：
a. 向有此需要的受试者施用免疫刺激性寡核苷酸，所述免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个CpG基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列，所述鸟嘌呤核苷酸富集的序列包含第一多个鸟嘌呤核苷酸。
16.权利要求15的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:110、111、112、113、114、115、116、117118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
17.权利要求16的方法，其中所述寡核苷酸进一步包含G-线序列。
18.权利要求17的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-G线3。
19.用于增加具有至少一个CpG基序的寡核苷酸的TLR21-刺激活性的方法，其包括将所述寡核苷酸的5'末端融合至鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
20.引发受试者中的免疫应答的方法，其包括：
a. 向有此需要的受试者施用包含寡核苷酸的免疫刺激性组合物，所述寡核苷酸具有至少一个CpG二核苷酸基序和起始于所述寡核苷酸的5'末端的四个核苷酸处或之内的鸟嘌呤核苷酸富集的序列。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17207750 | 2017-12-15 | ||
| EP17207740 | 2017-12-15 | ||
| EP17207746 | 2017-12-15 | ||
| EP17207746.3 | 2017-12-15 | ||
| EP17207740.6 | 2017-12-15 | ||
| EP17207750.5 | 2017-12-15 | ||
| PCT/EP2018/083958 WO2019115386A1 (en) | 2017-12-15 | 2018-12-07 | Immunostimulatory oligonucleotides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111801419A true CN111801419A (zh) | 2020-10-20 |
Family
ID=66818991
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880080814.7A Pending CN111447949A (zh) | 2017-12-15 | 2018-12-07 | 免疫刺激寡核苷酸 |
| CN201880089469.3A Pending CN111801419A (zh) | 2017-12-15 | 2018-12-07 | 免疫刺激性寡核苷酸 |
| CN201880089491.8A Pending CN111801116A (zh) | 2017-12-15 | 2018-12-07 | 免疫刺激性组合物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880080814.7A Pending CN111447949A (zh) | 2017-12-15 | 2018-12-07 | 免疫刺激寡核苷酸 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880089491.8A Pending CN111801116A (zh) | 2017-12-15 | 2018-12-07 | 免疫刺激性组合物 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US20210062192A1 (zh) |
| EP (3) | EP3694549A1 (zh) |
| JP (5) | JP7273040B2 (zh) |
| KR (3) | KR20200099556A (zh) |
| CN (3) | CN111447949A (zh) |
| AU (3) | AU2018385257A1 (zh) |
| BR (3) | BR112020011815A2 (zh) |
| CA (3) | CA3085575A1 (zh) |
| CL (3) | CL2020001562A1 (zh) |
| CO (3) | CO2020007102A2 (zh) |
| CR (1) | CR20200260A (zh) |
| DO (3) | DOP2020000106A (zh) |
| IL (3) | IL274975A (zh) |
| MX (3) | MX2020006243A (zh) |
| PE (2) | PE20210635A1 (zh) |
| PH (3) | PH12020550903A1 (zh) |
| SG (3) | SG11202004471RA (zh) |
| TW (3) | TWI821224B (zh) |
| UY (3) | UY38016A (zh) |
| WO (3) | WO2019115402A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA202004317B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2020310853A1 (en) | 2019-07-05 | 2022-01-27 | Tambo, Inc. | Trans-cyclooctene bioorthogonal agents and uses in cancer and immunotherapy |
| CN113493790A (zh) * | 2020-04-01 | 2021-10-12 | 南京华普生物技术股份有限公司 | 具有免疫调节功能的CpG ODN及其应用 |
| EP3892260A1 (en) * | 2020-04-10 | 2021-10-13 | Bayer Animal Health GmbH | Immunostimulatory compositions based on liposomes with zwiterionic and cationic lipids |
| EP4192506A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-06-14 | Tambo, Inc. | Trans-cyclooctene bioorthogonal agents and uses in cancer and immunotherapy |
| CN112159814B (zh) * | 2020-10-29 | 2023-05-16 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种CpG寡聚脱氧核苷酸及制备与其用途 |
| CN113797329A (zh) * | 2021-10-19 | 2021-12-17 | 启锰生物科技(江苏)有限公司 | 一种二价锰佐剂和CpG佐剂的疫苗佐剂组合物及其制作方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001022990A2 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
| KR20010063153A (ko) * | 1999-12-21 | 2001-07-09 | 서유석 | 면역조절능력 및 안전성이 증가되고 ｄＧ 연속서열이결합된 포스포다이에스터 ＣｐＧ올리고데옥시뉴클레오티드 변형체 |
| WO2005049647A2 (en) * | 2003-11-05 | 2005-06-02 | Pevion Biotech Ltd. | Compositions comprising melittin-derved peptides and methods for the potentiation of immune responses against target antigens |
| CN1989439A (zh) * | 2004-05-06 | 2007-06-27 | 美国政府健康及人类服务部 | 治疗葡萄膜炎的方法以及组合物 |
| CN101543507A (zh) * | 1999-09-25 | 2009-09-30 | 衣阿华大学研究基金会 | 免疫刺激性核酸 |
| CN101979542A (zh) * | 2010-10-28 | 2011-02-23 | 国家兽用生物制品工程技术研究中心 | 含CpG基序的核酸序列的制备方法及应用 |
| CN103270159A (zh) * | 2010-12-30 | 2013-08-28 | 英特维特国际股份有限公司 | 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 |
| CN103547675A (zh) * | 2011-05-26 | 2014-01-29 | 英特维特国际股份有限公司 | 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 |
| CN103547674A (zh) * | 2011-05-26 | 2014-01-29 | 英特维特国际股份有限公司 | 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 |
| CN104718221A (zh) * | 2012-06-28 | 2015-06-17 | 英特维特国际股份有限公司 | Toll-样受体及免疫刺激性寡核苷酸 |
| US20150301058A1 (en) * | 2012-11-26 | 2015-10-22 | Caris Science, Inc. | Biomarker compositions and methods |
| CN105452468A (zh) * | 2013-07-26 | 2016-03-30 | 英特维特国际股份有限公司 | 在禽类中加速载体病毒诱导的免疫应答 |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5719028A (en) * | 1992-12-07 | 1998-02-17 | Third Wave Technologies Inc. | Cleavase fragment length polymorphism |
| CA2194761C (en) * | 1994-07-15 | 2006-12-19 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
| US6693086B1 (en) | 1998-06-25 | 2004-02-17 | National Jewish Medical And Research Center | Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes |
| AR040996A1 (es) * | 2002-08-19 | 2005-04-27 | Coley Pharm Group Inc | Acidos nucleicos inmunoestimuladores |
| EP1631576A4 (en) * | 2003-06-11 | 2010-08-25 | Idera Pharmaceuticals Inc | STABILIZED IMMUNOMODULATION OLIGONUCLEOTIDES |
| CA2536139A1 (en) | 2003-09-25 | 2005-04-07 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid-lipophilic conjugates |
| EP1728863A3 (en) * | 2003-10-30 | 2006-12-20 | Coley Pharmaceutical GmbH | C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency |
| KR100558851B1 (ko) * | 2004-01-08 | 2006-03-10 | 학교법인연세대학교 | 면역조절능력이 증가된 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드변형체 |
| CA2598992A1 (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory oligonucleotides |
| EP1764108A1 (en) * | 2005-09-14 | 2007-03-21 | Gunther Hartmann | Compositions comprising immunostimulatory RNA oligonucleotides and methods for producing said RNA oligonucleotides |
| DK2405002T3 (en) * | 2006-02-15 | 2015-01-05 | Adiutide Pharmaceuticals Gmbh | Compositions and methods for oligonukleotidformuleringer |
| CN100418583C (zh) | 2006-02-21 | 2008-09-17 | 朱鸿飞 | 预防和治疗乳腺炎的药物组合物 |
| US20080124366A1 (en) * | 2006-08-06 | 2008-05-29 | Ohlfest John R | Methods and Compositions for Treating Tumors |
| CN102851295B (zh) * | 2006-08-28 | 2015-01-07 | 长春华普生物技术有限公司 | Toll 样受体调节性寡核苷酸及其用途 |
| PT2078080E (pt) | 2006-09-27 | 2015-09-18 | Coley Pharm Gmbh | Análogos dos oligonucleotídeos cpg que contêm análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulante potenciada |
| AU2008288241B2 (en) * | 2007-08-13 | 2011-12-01 | Zoetis Belgium S.A. | RNA sequence motifs in the context of defined internucleotide linkages inducing specific immune modulatory profiles |
| EP2427472B1 (en) | 2009-05-05 | 2016-06-22 | Miragen Therapeutics | Lipophilic polynucleotide conjugates |
| CN102427827B (zh) * | 2009-05-14 | 2015-07-22 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 鸟类中增强的免疫应答 |
| PT2575878T (pt) * | 2010-05-28 | 2018-10-03 | Zoetis Belgium S A | Vacinas compreendendo colesterol e cpg como moléculas únicas adjuvante-portador |
| CN103501810A (zh) * | 2010-12-22 | 2014-01-08 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 牛物种中增强的免疫应答 |
| US9107904B2 (en) * | 2012-04-05 | 2015-08-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunostimulatory compositions and methods of use thereof |
| CN105164261B (zh) * | 2013-05-01 | 2022-03-18 | 莱古路斯治疗法股份有限公司 | 用于增强的细胞摄取的化合物和方法 |
| CN105530957B (zh) * | 2013-07-19 | 2022-03-29 | 台湾卫生研究院 | CpG寡脱氧核苷酸、包含其的免疫组合物及组合物用于制备治疗以刺激免疫反应的药物的应用 |
| GB2517700A (en) * | 2013-08-27 | 2015-03-04 | Lgc Ltd | Oligonucleotides comprising a secondary structure and uses thereof |
| RU2740492C2 (ru) * | 2014-02-28 | 2021-01-14 | Байер Энимэл Хельс ГмбХ | Иммуностимулирующие плазмиды |
| US10888603B2 (en) * | 2016-02-12 | 2021-01-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of treating cancer cells expressing tumor-associated integrins |
-
2018
- 2018-12-07 CN CN201880080814.7A patent/CN111447949A/zh active Pending
- 2018-12-07 CN CN201880089469.3A patent/CN111801419A/zh active Pending
- 2018-12-07 CA CA3085575A patent/CA3085575A1/en active Pending
- 2018-12-07 WO PCT/EP2018/084019 patent/WO2019115402A1/en active Application Filing
- 2018-12-07 CN CN201880089491.8A patent/CN111801116A/zh active Pending
- 2018-12-07 JP JP2020531972A patent/JP7273040B2/ja active Active
- 2018-12-07 CA CA3085657A patent/CA3085657A1/en active Pending
- 2018-12-07 SG SG11202004471RA patent/SG11202004471RA/en unknown
- 2018-12-07 SG SG11202004773SA patent/SG11202004773SA/en unknown
- 2018-12-07 EP EP18829227.0A patent/EP3694549A1/en active Pending
- 2018-12-07 BR BR112020011815-0A patent/BR112020011815A2/pt unknown
- 2018-12-07 MX MX2020006243A patent/MX2020006243A/es unknown
- 2018-12-07 EP EP18829225.4A patent/EP3700564A1/en active Pending
- 2018-12-07 WO PCT/EP2018/083956 patent/WO2019115385A1/en active Application Filing
- 2018-12-07 MX MX2020006246A patent/MX2020006246A/es unknown
- 2018-12-07 PE PE2020000765A patent/PE20210635A1/es unknown
- 2018-12-07 JP JP2020531988A patent/JP7458977B2/ja active Active
- 2018-12-07 CR CR20200260A patent/CR20200260A/es unknown
- 2018-12-07 AU AU2018385257A patent/AU2018385257A1/en active Pending
- 2018-12-07 SG SG11202004952UA patent/SG11202004952UA/en unknown
- 2018-12-07 US US16/771,789 patent/US20210062192A1/en not_active Abandoned
- 2018-12-07 JP JP2020531982A patent/JP2021506246A/ja active Pending
- 2018-12-07 BR BR112020011838-9A patent/BR112020011838A2/pt unknown
- 2018-12-07 KR KR1020207020350A patent/KR20200099556A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-12-07 KR KR1020207020351A patent/KR20200098638A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-12-07 AU AU2018385256A patent/AU2018385256A1/en active Pending
- 2018-12-07 WO PCT/EP2018/083958 patent/WO2019115386A1/en active Application Filing
- 2018-12-07 AU AU2018382419A patent/AU2018382419A1/en active Pending
- 2018-12-07 EP EP18811581.0A patent/EP3701032A1/en active Pending
- 2018-12-07 KR KR1020207020349A patent/KR20200098637A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-12-07 US US16/772,541 patent/US11932857B2/en active Active
- 2018-12-07 US US16/772,046 patent/US11542507B2/en active Active
- 2018-12-07 MX MX2020006244A patent/MX2020006244A/es unknown
- 2018-12-07 PE PE2020000766A patent/PE20210636A1/es unknown
- 2018-12-07 CA CA3085661A patent/CA3085661A1/en active Pending
- 2018-12-07 BR BR112020011845-1A patent/BR112020011845A2/pt unknown
- 2018-12-13 TW TW107144947A patent/TWI821224B/zh active
- 2018-12-13 TW TW107144948A patent/TW201936924A/zh unknown
- 2018-12-13 TW TW107144946A patent/TW201940192A/zh unknown
- 2018-12-14 UY UY0001038016A patent/UY38016A/es not_active Application Discontinuation
- 2018-12-14 UY UY0001038015A patent/UY38015A/es not_active Application Discontinuation
- 2018-12-14 UY UY0001038014A patent/UY38014A/es not_active Application Discontinuation
-
2020
- 2020-05-27 IL IL274975A patent/IL274975A/en unknown
- 2020-06-03 IL IL275086A patent/IL275086A/en unknown
- 2020-06-08 IL IL275217A patent/IL275217A/en unknown
- 2020-06-10 DO DO2020000106A patent/DOP2020000106A/es unknown
- 2020-06-10 DO DO2020000113A patent/DOP2020000113A/es unknown
- 2020-06-10 DO DO2020000107A patent/DOP2020000107A/es unknown
- 2020-06-11 CO CONC2020/0007102A patent/CO2020007102A2/es unknown
- 2020-06-11 CL CL2020001562A patent/CL2020001562A1/es unknown
- 2020-06-11 CL CL2020001560A patent/CL2020001560A1/es unknown
- 2020-06-11 CL CL2020001561A patent/CL2020001561A1/es unknown
- 2020-06-11 CO CONC2020/0007120A patent/CO2020007120A2/es unknown
- 2020-06-11 CO CONC2020/0007100A patent/CO2020007100A2/es unknown
- 2020-06-15 PH PH12020550903A patent/PH12020550903A1/en unknown
- 2020-06-15 PH PH12020550906A patent/PH12020550906A1/en unknown
- 2020-06-15 PH PH12020550904A patent/PH12020550904A1/en unknown
- 2020-07-14 ZA ZA2020/04317A patent/ZA202004317B/en unknown
-
2022
- 2022-08-08 US US17/883,031 patent/US20230174990A1/en active Pending
- 2022-11-18 US US18/057,053 patent/US20230332162A1/en active Pending
-
2023
- 2023-08-07 JP JP2023128316A patent/JP2023153970A/ja active Pending
- 2023-08-07 US US18/366,306 patent/US20240076681A1/en active Pending
- 2023-08-21 JP JP2023134080A patent/JP2023156485A/ja active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101543507A (zh) * | 1999-09-25 | 2009-09-30 | 衣阿华大学研究基金会 | 免疫刺激性核酸 |
| WO2001022990A2 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
| KR20010063153A (ko) * | 1999-12-21 | 2001-07-09 | 서유석 | 면역조절능력 및 안전성이 증가되고 ｄＧ 연속서열이결합된 포스포다이에스터 ＣｐＧ올리고데옥시뉴클레오티드 변형체 |
| WO2005049647A2 (en) * | 2003-11-05 | 2005-06-02 | Pevion Biotech Ltd. | Compositions comprising melittin-derved peptides and methods for the potentiation of immune responses against target antigens |
| CN1989439A (zh) * | 2004-05-06 | 2007-06-27 | 美国政府健康及人类服务部 | 治疗葡萄膜炎的方法以及组合物 |
| CN101979542A (zh) * | 2010-10-28 | 2011-02-23 | 国家兽用生物制品工程技术研究中心 | 含CpG基序的核酸序列的制备方法及应用 |
| CN103270159A (zh) * | 2010-12-30 | 2013-08-28 | 英特维特国际股份有限公司 | 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 |
| US20140205633A1 (en) * | 2010-12-30 | 2014-07-24 | Carla Christina Schrier | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides |
| CN103547675A (zh) * | 2011-05-26 | 2014-01-29 | 英特维特国际股份有限公司 | 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 |
| CN103547674A (zh) * | 2011-05-26 | 2014-01-29 | 英特维特国际股份有限公司 | 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 |
| CN104718221A (zh) * | 2012-06-28 | 2015-06-17 | 英特维特国际股份有限公司 | Toll-样受体及免疫刺激性寡核苷酸 |
| US20150301058A1 (en) * | 2012-11-26 | 2015-10-22 | Caris Science, Inc. | Biomarker compositions and methods |
| CN105452468A (zh) * | 2013-07-26 | 2016-03-30 | 英特维特国际股份有限公司 | 在禽类中加速载体病毒诱导的免疫应答 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROBERT BROWNLIE等: "Chicken TLR21 acts as a functional homologue to mammalian TLR9 in the recognition of CpG oligodeoxynucleotides", MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 46, no. 15, pages 3163 - 3170, XP026494546, DOI: 10.1016/j.molimm.2009.06.002 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111801419A (zh) | 免疫刺激性寡核苷酸 | |
| US20230110516A1 (en) | Coronavirus vaccines comprising a tlr9 agonist | |
| EP2658974B1 (en) | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides | |
| JP7506708B2 (ja) | 口蹄疫ワクチン | |
| KR20130069668A (ko) | 콜레스테롤 및 ｃｐｇ를 단독 아주반트－담체 분자로서 포함하는 백신 | |
| AU2001251407A1 (en) | Synergistic improvements to polynucleotide vaccines | |
| JP2003502345A (ja) | ペットまたはスポ−ツ用動物のためのｄｎａワクチン | |
| JP2003502345A5 (zh) | ||
| JP6427487B2 (ja) | Ｔｏｌｌ様受容体 | |
| AU2014315353A1 (en) | Hendra and Nipah virus G glycoprotein immunogenic compositions | |
| RU2795701C2 (ru) | Иммуностимулирующие олигонуклеотиды | |
| KR20230011916A (ko) | 파상풍, 디프테리아 및 백일해에 대한 능동 부스터 면역화 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40039984 Country of ref document: HK |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: Germany Address after: Germany's Rhine River Monheim Applicant after: Lilan animal health care Co.,Ltd. Address before: Leverkusen, Germany Applicant before: BAYER ANIMAL HEALTH GmbH Country or region before: Germany |