CN111787929A - 细胞重编程疗法 - Google Patents
细胞重编程疗法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111787929A CN111787929A CN201980016156.XA CN201980016156A CN111787929A CN 111787929 A CN111787929 A CN 111787929A CN 201980016156 A CN201980016156 A CN 201980016156A CN 111787929 A CN111787929 A CN 111787929A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- stimulating
- population
- cell population
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 title description 11
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims abstract description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 372
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 29
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 16
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 12
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 6
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 claims 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 abstract description 49
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 131
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 102
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 34
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 34
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 34
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 31
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 30
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 30
- 101001047681 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lck Proteins 0.000 description 28
- 101001022864 Mus musculus Proto-oncogene tyrosine-protein kinase LCK Proteins 0.000 description 28
- 230000004044 response Effects 0.000 description 24
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 22
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 20
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 16
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 10
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 8
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 8
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 8
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 7
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 5
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000032672 Histiocytosis haematophagic Diseases 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 4
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 4
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 description 3
- 101001105486 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-7 Proteins 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 102100033461 Interleukin-17A Human genes 0.000 description 3
- 102100021201 Proteasome subunit alpha type-7 Human genes 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 platinum siloxane Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 208000036066 Hemophagocytic Lymphohistiocytosis Diseases 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 208000004987 Macrophage activation syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 2
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000014752 hemophagocytic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 description 1
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001436672 Bhatia Species 0.000 description 1
- 208000018240 Bone Marrow Failure disease Diseases 0.000 description 1
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001663880 Gammaretrovirus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 229920002145 PharMed Polymers 0.000 description 1
- 208000016012 Phenotypic abnormality Diseases 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 208000012827 T-B+ severe combined immunodeficiency due to gamma chain deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 201000007146 X-linked severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000879 anti-atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000003040 circulating cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009668 clonal growth Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 1
- VWTINHYPRWEBQY-UHFFFAOYSA-N denatonium Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1C[N+](CC)(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C VWTINHYPRWEBQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004901 spalling Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/02—Membranes; Filters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/10—Hollow fibers or tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/10—Hollow fibers or tubes
- C12M25/12—Hollow fibers or tubes the culture medium flowing outside the fiber or tube
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/14—Scaffolds; Matrices
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/10—Perfusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/14—Pressurized fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
- C12N2502/1114—T cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
- C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1394—Bone marrow stromal cells; whole marrow
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2521/00—Culture process characterised by the use of hydrostatic pressure, flow or shear forces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/76—Agarose, agar-agar
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
提供了用于动态共培养两个细胞群的系统和方法。所述系统包括被设置为将置于容器内的刺激细胞群与应答细胞群物理分隔开的屏障。所述屏障可使至少一种细胞群的分泌因子透过。因此所述应答细胞群可通过暴露于分泌因子而被改变以产生重编程细胞群，所述重编程细胞群包含来自刺激细胞群的生物分子(核酸)和/或表现出一种或多种不同于所述重编程细胞的亲本细胞群的额外的或修饰的功能活性。
Description
相关申请
本申请要求2018年1月12日提交的美国临时申请No.62/616,930的权益。上述申请的所有教导通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院授权的R01EB012521和T32EB016652-01A1号政府资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
造血细胞因其在人体中重建血细胞的能力而常用于细胞疗法(Lorenz等人,1951)。骨髓、外周血动员的造血干细胞(HSC)、脐带HSC、血红细胞、血小板及白细胞是可用的细胞来源，其采自患者并制备以用于静脉施用以修复其造血功能。随着造血细胞疗法的持续发展，需要改进的生物加工系统，以用于体外维持和工程化造血细胞以适应临床应用。
发明概述
本申请提供了动态共培养刺激细胞和应答细胞，如成纤维细胞刺激细胞和HSC应答细胞，以支持如体外扩增和生物加工治疗细胞的系统和方法。
在一些实施方案中，共培养系统包括被置于容器内的应答细胞群和刺激细胞群。屏障被设置为将应答细胞群与刺激细胞群物理隔开，所述屏障对所述刺激细胞群的分泌因子是可渗透的。所述系统还包括被设置为引导液体悬浮液流经所述容器的射流驱动器，所述液体悬浮液包含所述应答和刺激细胞群中的至少一种。
在其他实施方案中，提供了重编程细胞的方法。所述方法包括将应答细胞群暴露于刺激细胞群的分泌因子中。所述应答细胞群和刺激细胞群被置于容器内，且所述分泌因子散布于在容器中分隔所述应答细胞群和刺激细胞群的屏障中，使得所述应答细胞群在暴露于分泌因子后被修饰。所述方法还包括在所述容器中引导细胞培养基流，所述细胞培养基流包含所述应答和刺激细胞群中的至少一种。
在其他实施方案中，提供了组合物，其包含重编程细胞群。所述重编程细胞包括源自不同细胞群的核酸。与亲本重编程细胞群相比，所述重编程细胞还表现出一种或多种额外的或修饰的功能活性。所述组合物可被施用于有需要的患者。
在其他实施方案中，提供了向需要其的患者(如具有自身免疫疾病、炎症疾病或移植物的患者)施用重编程细胞组合物的方法。所述组合物可经静脉施用或局部施用递送，并可包括约500万-约10亿个重编程细胞的剂量。
附图说明
前述内容根据如下示例实施方案的更具体描述理解，如附图所示，其中不同图中相似的标记指代相同的部分。该附图不必按比例绘制，而重在说明实施方案。
图1是动态共培养系统的示意图。
图2A-2C显示了3T3支持的2D短时长共培养以富集LSK的结果。以基质细胞:BMC为1:10的比例对全骨髓细胞(BMC)进行分析。细胞以非接触依赖方式培养72小时。图2A为72小时培养期结束时细胞产量的图。图2B为谱系阴性Sca阳性cKit阳性(LSK)比例的图。图2C为谱系阴性群中LSK细胞代表性门的图。该数据代表3个生物学重复。所有的值都是平均值+标准差。*表示仅与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图3A-3D显示了在微反应器中缓流培养人造血细胞。装置接种1小时后对BMC进行。图3A为缓流培养系统的示意图，其中含有全BMC的气体交换袋与中空纤维微反应器的毛细管内空间连接，该中空纤维微反应器又经由铂硅氧烷耐压管与
泵(Cole-Parmer公司)连接。图3B为图3A的缓流培养系统的微反应器的示意图。基质细胞经由毛细管外入口接种入毛细管外空间。全BMC经由毛细管内入口而流经毛细管内空间。图3C为在图3B的微反应器中的骨髓细胞(BMC)流的示意图。基质细胞与全BMC之间无直接接触。沿中空纤维表面的0.2μM孔允许分泌因子双向交换而不允许细胞通过。图3D为作为液流的函数的细胞计数的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图4A-4B显示了高剂量及低剂量3T3支持培养的结果。在装置接种后不同时间点对全BMC进行分析。将细胞计数标准化为1小时细胞计数。图4A为相比于单独BMC，高剂量3T3支持的BMC的细胞计数随时间变化的图。图4B为相比于单独BMC，低剂量3T3支持的BMC的细胞计数随时间变化的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图5A-5D显示了3T3介导的富集培养结果。装置接种后在不同时间点对全BMC进行分析。图5A为LSK库占全部活BMC的比例随时间变化的图。在1小时后的所有时间点，所述细胞用3T3支持富集。图5B为LSK数量随时间变化的图。图5C为谱系阳性群随时间变化的图。图5D为谱系阴性群随时间变化的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示仅与BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图6A-6D显示了3T3介导的增强的细胞循环培养结果。对用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)脉冲的全BMC进行分析。在各个时间点取样细胞以测定细胞循环特性。图6A为CFSElo群中的LSK的代表性门策略的图。图6B为CFSElo群中的LSK的比例随时间变化的图。图6C是为CFSE+的谱系阳性细胞比例随时间变化的图。图6D是为CFSE+的谱系阴性细胞比例随时间变化的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。
图7为在高基质剂量和低基质剂量的2-D
(Corning公司)共培养中分散的LSK比例的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图8A为3T3接种的微反应器中高基质剂量培养的原始细胞计数和活性的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图8B为3T3接种的微反应器中低基质剂量培养的原始细胞计数和活性的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图9A为低基质剂量模型中LSK比例的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.0001。
图9B为低基质剂量模型中LSK细胞数量的图。所有的值都是平均值+标准差。数据代表3个生物学重复。*表示与单独BM比较的p值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。
图10是通过与间质基质细胞(MSC)共培养以剂量依赖性方式调节的外周血单核细胞(PBMC)增殖的图。
图11为用MSC孵育的PBMC增殖随时间变化的图。
图12为用不同类型细胞孵育的PBMC增殖的图。
图13为使用布雷菲德菌素A(BrefA)处理的PBMC增殖的图。X轴显示了以下培养条件：Stim(P+)＝刺激的PBMC w/布雷菲德菌素A；Stim(P-)＝刺激的PBMCw/o布雷菲德菌素A；Ctrl(P+)＝未刺激的PBMCw/布雷菲德菌素A；Ctrl(P-)＝未刺激的PBMCw/o布雷菲德菌素A；M+P+＝刺激的PBMC与MSCw/布雷菲德菌素A共培养；M+P-＝刺激的PBMC与MSC w/o布雷菲德菌素A共培养。
图14为用BrefA处理的PBMC增殖的图。X轴显示了以下培养条件：Stim＝刺激的PBMCw/o布雷菲德菌素A；No Stim＝未刺激的PBMCw/o布雷菲德菌素A+BA＝刺激的PBMC与MSCw/布雷菲德菌素A共培养；-BA＝刺激的PBMC与MSCw/o布雷菲德菌素A共培养。
图15为用BrefA处理的PBMC增殖随时间变化的图。
图16为动态流条件下的PBMC增殖的图。
图17为PBMC增殖vsMSC预刺激影响免疫抑制能力的图。分别使用IFNy、IL-1b、TNFa、TLR3激动剂(Poly I:C)、TLR4激动剂(LPS)预刺激MSC 1小时或24小时。然后，洗脱这些试剂，并与刺激的PBMC共培养。X轴显示了培养条件，Y轴显示了PBMC增殖。
图18A-18I显示了MSC:PBMC共培养的增殖跟踪模型。图18A为显示基于CFSE的增殖跟踪的实例的图。倍数变化显示了目标免疫群(PBMC等)相对于最大增殖能力的增殖倍数变化。图18B为药代动力学模型图。图18C为显示药代动力学模型的控制方程的图表。图18D为倍数变化vs MSC:PBMC比的图。图18E为倍数变化vs MSC/孔的图。图18E为倍数变化vs MSC/mL的图。图18G为MSC:PBMC比的预测性增殖vs经验性增殖的图。图18H为MSC/孔的预测性增殖vs经验性增殖的图。图18I为MSC/mL的预测性增殖vs经验性增殖的图。在图18D-I中，青色代表1.5M PBMS，并且粉色代表3M PBMS。
图19A-19F显示了MSC:PBMC共培养实验的流式细胞仪数据。顶行显示了整个增殖群的表达。底行显示了各单个增殖代的表达。Y轴为标准化的增殖。图19A为各种MSC:PBMC比例的CD3增殖的图。图19B为各种MSC:PBMC比例的CD3代的图。图19C为CD4增殖的图。图19C为CD4代的图。图19E为CD8增殖的图。图19F为CD8代的图。在图19A-F中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。
图20A-20H显示了MSC:PBMC共培养实验的流式细胞仪数据。顶行(包括图20A、20C、20E及20G)显示了整个增殖群的表达。底行(包括图20B、20D、20E及20F)显示了各单个增殖群的表达。X轴为标准化的增殖，并且Y轴为表面标志物表达水平。图20A为不同MSC:PBMC比例的CD4增殖和CD38表达的图。图20B为显示高线性/相关性CD4增殖和CD38表达的图。图20C为各种MSC:PBMC比例的CD4增殖和CD25表达的图。图20D为显示高线性/相关性CD4增殖和CD25表达的图。图20E为各种MSC:PBMC比例的CD8增殖和CD38表达的图。图20F为显示高线性/相关性CD8增殖和CD38表达的图。图20G为各种MSC:PBMC比例的CD8增殖和CD25表达的图。图20H为显示高线性/相关性CD8增殖和CD25表达的图。在图20A-20F20H中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。
图21A-21K显示了分泌的细胞因子的多剂量应答。图21A显示了各种MSC:PBMC比例的IFNa的应答。图21B显示了INFg的应答。图21C显示了IL1b的应答。图21D显示了IL1ra的应答。图21E显示了IL4的应答。图21F显示了IL10的应答。图21G显示了IL12p40的应答。图21H显示了IL17的应答。图21I显示了IP10的应答。图21J显示了PGE2的应答。图21K显示了TNFa的应答。在图21A-21K中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。
图22为PBMC的标准化增殖vs暴露于MSC的时间的图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。共培养1、2和3天后将MSC
插入物移除。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
图23A-23K为标准化细胞因子分泌vs暴露于MSC的时间的柱状图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。共培养1、2和3天后将MSC Transwell插入物移除。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。图23A显示了IFNa随MSC暴露延长而增加。图23B显示了INFy随MSC暴露延长而降低。图23C显示了IL1b随MSC暴露延长的显著变化。图23D显示了IL1ra随MSC暴露延长的略微增加。图23E显示了IL4随MSC暴露延长而降低。图23F显示了IL10随MSC暴露延长而降低。图23G显示了IL12p40随MSC暴露延长而无显著变化。图23H显示了IL17随MSC暴露延长而降低。图23I显示了IP10随MSC暴露延长而无显著变化。图23J显示了PGE2随MSC暴露延长而增加。图23K显示了TNFa随MSC暴露延长而降低。
图24为标准化增殖vs培养体积条件的图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
图25A-25K为标准化细胞因子分泌vs培养体积条件的柱状图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
图26为标准化增殖vs布雷菲德菌素A(BrefA)条件的图。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC 24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
图27A-27K为标准化细胞因子分泌vs BrefA条件的柱状图。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC 24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
图28为标准化增殖vs BrefA条件的图。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
图29A-29K为标准化细胞因子分泌vs BrefA条件的柱状图。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC 24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
图30A-30D显示了各种生物反应器培养条件下分泌的胞外囊泡粒径分布。图30A显示了刺激的PBMC细胞颗粒计数vs培养直径(diameterculture)。图30B显示了刺激的PBMC细胞颗粒计数vs培养直径。图30C显示了来自刺激的PBMC:MSC培养物与MSC的细胞颗粒计数vs直径。图30D显示了来自刺激的PBMC:MSC培养物与MSC的细胞颗粒计数vs直径。NoMSC＝刺激的PBMC；B-M＝刺激的PBMC；PlusMSC＝刺激的PBMC+MSC；B+M＝刺激的PBMC+MSC。
图31为PBMC(线标为停与续_3)和纯化的T细胞(线标为续_1与续_3)的扩增结果的图。
图32A-B为停流培养期间细胞的显微照片。图32A显示流前的细胞聚集物。图32B显示流后的细胞聚集物。
图33为使用磁力泵(线标为“磁力泵”)和蠕动泵(线标为“蠕动泵”)停流培养期间PBMC的扩增结果的图。
图34A-34D为显示了共培养的屏障结构的示意图。图34A显示了在腔内-外隔室中的细胞悬液。图34B显示了在腔外空间中包封的细胞群。图34C显示了在腔内空间中包封的细胞群。图34D显示了在腔外空间中接种的细胞-生物材料凝胶。
图35为细胞培养流程示意图。
图36为显示了使用HEK293T细胞的慢病毒工程化的整合的小规模生产/转导过程和量化的示意图。
图37A为迁移皿系统中转导策略的示意图。
图37B为转染和转导过程与图37A的迁移皿系统重合的时间线。
图37C为实验的板布局示意图，其中目标细胞转导组n＝3。进行重复实验。
图37D显示了迁移皿插入物内部的表达GFP的HEK293T细胞，证实瞬时转染并产生慢病毒颗粒。
图37E显示了包含Jurkat T细胞并显示荧光面积的底孔，证实从游离漂浮的慢病毒颗粒转导目标细胞。
图38A显示了当插入物中HEK293T细胞的接种密度改变时，通过流式细胞仪测定的转导效率。
图38B显示了当插入物中Jurkat T细胞的接种密度改变时，通过流式细胞仪测定的转导效率。
图38C显示了由于过于密集而从迁移皿渗透进底孔的HEK293T细胞。
图38C显示了45％HEK细胞插入物的底孔中的转导的Jurkat细胞。
图39A1显示了1μm插入物孔的200μm尺寸的蔡司荧光图像。
图39A2显示了1μm插入物孔的50μm尺寸的蔡司荧光图像。
图39B1显示了8μm插入物孔的200μm尺寸的蔡司荧光图像。
图39B2显示了8μm插入物孔的50μm尺寸的蔡司荧光图像。
图39C显示了当各插入物的孔径改变时，通过流式细胞仪测定的Jurkat T细胞的转导效率。
图40为显示PBMC增殖研究的时间线示意图。
图41显示了MSC:PBMC的剂量应答。柱状图代表3个样本的平均值±标准差。
图41显示了MSC/NHDF:PBMC(1:5)的剂量应答。柱状图代表3个样本的平均值±标准差。
图42显示了共培养对T细胞增殖的影响。柱状图代表3个样本的平均值±标准差。
图43显示了EC表型对T细胞增殖的影响。柱状图代表3个样本的平均值±标准差。
图44显示了通过剪切应力激活的工程化EC的影响及其对PBMC共培养的增殖应答。柱状图代表3个样本的平均值±标准差。
图45显示了与NHDF(皮肤成纤维细胞)、HepG2(肝)和EA.hy296(内皮细胞)共培养的PBMC的标准化增殖应答。柱状图代表3个样本的平均值±标准差。
发明详述
使用生物反应器体外维持和/或工程化造血干细胞(HSC)及其他治疗细胞类型已以多种形式应用；但是，这些生物反应器形式已显示出可能妨碍大规模应用、技术标准化和/或可重复性结果的问题，因而阻碍此类生物反应器有效用于临床中心的能力。例如，持续流动小室允许高效递送营养但代价是增加的、昂贵的介质消耗需求(Koller等人,1993a；Koller等人,1993b；Palsson等人,1993；
Sandstrom等人,1996)；搅拌槽支持更大的容积并允许监测克隆生长和分化，但不能维持HSC的表型和干细胞潜能(De Leon等人,
1998；Levee等人,1994；Sardonini与Wu,1993；Zandstra等人,1994)；
填充床式反应器允许提供更大的表面积/体积比，使培养的HSC与生长配体接触，但难以纯化HSC而且回收率较低(Liu等人,2014；
Meissner等人,1999；Wang等人,1995)。中空纤维生物反应器已应用于连续循环液流培养HSC，尽管这种生物反应器无法成功支持HSC数量(Sardonini与Wu,1993；Schmelzer等人,2015)。尽管这些系统已显示益处，仍然需要能够维持HSC数量和表型并且下游易于纯化的整合系统。
体外生物加工HSC的一个主要挑战是在培养基中随时间而出现干细胞活性和/或表型丧失。传统的培养方法严重依赖培养基配方来在维持合适的HSC表型的同时驱动生长。目前，培养基补充物包括干细胞因子(SCF)、干扰素(IL)-3、-6、Fms样酪氨酸激酶
-3配体(Flt3-L)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、成纤维细胞生长因子-1、-2、Delta-1和促血小板生成素的各种组合，其价格高昂，而且显示出能在体外广泛扩增脐带血HSC(Bhatia等人,1997；Conneally等人,1997；Delaney等人,2005；Himburg等人,2010；Lui等人,2014；Zhang等人,2006)。为增强这些体外系统，细胞HSC生态位可通过直接或间接与成纤维基质细胞(Pan等人,2017；Perucca等人,2017)或内皮细胞(Gori等人,2017)共培养来部分概括。相比2-D培养，更大程度地模拟基质细胞和造血干细胞和前体细胞(HSPC)的空间组织的高级3-D培养系统显现出扩增细胞的增强的长期移植(Futrega等人,2017)。因此，需要改进的生物反应器系统，其可用于体外维持和/或工程化HSC以及其他治疗细胞类型。
以下为示例性实施方案的说明。
提供了间接的动态共培养两个或更多个细胞群的系统。在一个实施方案中，所述系统包括被屏障分隔的第一和第二细胞群。所述屏障将所述细胞群彼此物理分隔开，并且对至少一个所述细胞群的分泌因子是可渗透的。在另一个实施方案中，包括三个或更多个细胞群。各细胞群可通过屏障与系统中的其他细胞群分隔开。在又进一步的实施方案中，系统包括单个细胞群，所述单个细胞群通过屏障与配置为包含第二细胞群的腔室分隔开。所述第一和第二细胞群可为不同细胞类型或相同细胞类型。
共培养系统的示例如图1所示。在一个具体实施方案中，所述屏障为半透膜，例如中空纤维膜120。所述细胞群之一130被置于中空纤维膜的腔内空间内，而其他细胞群140可被置于腔外空间中。所述中空纤维膜置于容器100内，以提供封闭的共培养系统。也可参见图34A。或者，所述屏障可以是凝胶，例如水凝胶或其他生物材料，其中第一和第二细胞群中的至少一种被置于凝胶内。参见图34D。在又另一个实施方案中，所述屏障可以是胶囊，其中第一和第二细胞群中至少一种被置于胶囊内。参见图34B和34C。包封的细胞群和/或生物材料也可以被置于容器内以提供封闭的共培养系统，并且任选地，也可通过渗透膜被分隔开。
所述系统还可以包括射流驱动器，所述射流驱动器被设置为引导所述第一和第二细胞群中的至少一种的液体悬浮液流入或流经所述容器。例如，系统可以包括泵，其使细胞悬浮液流经中空纤维膜的腔内空间。或者，所述射流驱动器可以是被配置成引导设置在罐中的细胞悬浮液流的搅拌器，该悬浮液包括例如接种的胶囊。
所述两种细胞群可以为刺激细胞和应答细胞。尽管其被物理分隔开，所述系统促进这两种细胞群之间通过分泌因子的动态且非直接的相互作用。所述系统因此可提供通过与所述刺激细胞的交流以修饰所述应答细胞例如原始造血细胞群。所述修饰的应答细胞可被修饰为提供可以递送给患者的治疗性医疗产品。所述转导的造血细胞产品与初始的或亲本细胞群的功能不同，例如具有缓解疾病或其症状的能力。所述重编程细胞群的特征可基于：纯度/同源性分析、功能性生物活性、分泌表型、基因与DNA表达谱、表面生物标志物的表达，以及其他标准化的表征技术。
所述刺激与应答细胞的物理分隔有利地提供终产品的简化下游处理。由于所述两个细胞群的分隔，简化了应答细胞的纯化，避免额外和非必要的产物处理步骤。本发明的系统可以放置在临床机构的现场，或在现场之外的经许可的加工和处理设施。
本发明的系统(如生物反应器系统)内，有效浓度的刺激细胞类型能通过半透膜与患者的免疫细胞体外交互一段时间。以此方式，刺激细胞能不必注射进患者机体内而可以连续地并动态地调节免疫细胞疗法。例如，生物反应器系统可以放置在医院，并具有整合的刺激细胞群，例如以盒的方式提供。然后，一袋获自患者的造血细胞能通过反应器循环一段特定量的时间来重编程该造血细胞。然后，所述造血细胞能被配制并再施用回患者以解决病程。
动态共培养系统的成分的实例如下表所示。
表1.动态共培养系统的成分
所述系统既可以是针对细胞群之间的交互的动态，又可以是所述细胞群中至少一个的物理运动/搅拌的动态。关于细胞群之间的交互，可以增强特定细胞类型的功能。例如，已知由T细胞分泌的炎症细胞因子(IL-1、TNF、IFNy)可以增强间充质基质细胞的免疫调节功能。用药理学(如化学和/或蛋白质)试剂概括分泌因子的复杂环境是非常昂贵的。通过组织培养，细胞的自我更新性能结合暴露于刺激细胞的分泌因子，提供经济的细胞重编程。
至于共培养系统的物理运动/搅拌，动态培养比静态培养更优选，因为物理运动增加了气体和可溶因子在整个培养基中的扩散，从而提供改进的整体细胞健康状况，并增加剪切力以阻断细胞聚集。而且，动态系统能解决显著更高的细胞量，促进解决满足临床和商业规模需求的能力。非动态系统受表面积限制，并如果细胞是非粘附性的，会导致细胞最终沉降；这些系统达到最终汇合(confluency)比动态系统快得多。分离细胞可通过渗透膜(如PES)或渗透基质(如水凝胶包封)。动态系统的形式可包括下组的任一或任何组合：中空纤维膜、搅拌瓶/罐、微载体、摇动(激波反应器)袋或烧瓶、转瓶、填充珠/床和组织工程化的构建体。
在一些实施方案中，共培养系统在静态条件下维持一段时间，并且包含应答与刺激细胞群中的至少一种的细胞培养基流是非连续的。例如，通过在接种应答与刺激细胞群中的至少一种，可以最初维持静态的或基本静态的条件，以在系统内建立细胞群，和/或为分泌因子散布在屏障中并被应答细胞吸收提供时间。然后，静态共培养一段时间，其间其间穿插使细胞培养基流经系统的时期。例如通过射流驱动器，将所述流导入以阻断细胞聚集，其可以协助系统内的细胞生长和细胞分化。所述导入流可为脉冲的，例如将所述流导入一段限定的时间和/或以限定的时间间隔导入。例如，脉冲流可持续至少约10秒，例如约10秒左右-约30分钟、约10秒-约5分钟或约10秒-约1分钟。细胞培养基流的时间长度足以引导剪切以阻断细胞聚集。以设定的频率施加脉冲。例如，以约2小时-约40小时、约2小时-约6小时左右、约6小时-约12小时、约12小时-约24小时的频率施加脉冲。例如，T细胞可以在克隆聚集体中生长。被设置为在限定时间或以限定的时间段阻断聚集的非连续流能允许一旦停止流动就可以形成新的簇。由于连续的剪切力，连续流条件下的聚集物可能不好形成，因而其细胞数显著低于非连续流条件下生长的聚集物。
提供接种有刺激细胞群的盒，例如中空纤维膜胶囊(图3B)。所述盒可被插入动态共培养系统中，使得可以在临床场所用特定的刺激细胞群再调节患者血液。
动态共培养系统的屏障的截留分子量(MWCO)可以为约30kDA-约100,000kDA，或约5,000kDA。或者，所述屏障的孔径尺寸可以为约0.00001μm-约0.65，或约0.5μm。
细胞调节或细胞重编程持续至少约1小时、至少约2小时或至少约3小时。在一些实施方案中，细胞调节持续时间长达约21天。在一个具体实施方式中，细胞调节持续时间为约60小时-约120小时、或约96小时、或约24小时以上。延长应答细胞暴露于刺激细胞能有利地为应答细胞提供足够的时间来重编程。调节方案结束后，可立即向患者施用重编程细胞。或者，可产生大批细胞，其中将其他细胞“剂量”低温保存以备后用。
细胞调节方法、或重编程细胞方法的实例如35图所示。在第一方案、或操作阶段，生物反应器(如存放通过屏障分隔的应答细胞群和刺激细胞群的容器)接种有刺激细胞。通过将细胞液体悬浮液通过超滤流体入口流入生物反应器中，可将刺激细胞群引入生物反应器中。然后，将细胞孵育一段时间，例如约6-24小时。生物反应器中，以至少1个细胞/cm2，例如约1-约1,100,000个细胞/cm2的密度接种刺激细胞群。刺激细胞还可补充一种或多种生长因子、血清、血小板裂解液和/或抗生素。
接种刺激细胞后，第二方案中将应答细胞导入系统中。具体地，应答细胞可通过循环流体入口导入，并保存在生物反应器的流体密封室内。流体密封室可作为气体交换工具，尤其是在还使用细胞培养袋时。接种和或共培养期间，包括刺激细胞和应答细胞的细胞可保存在约0.1％-约21％的氧分压中。
在第三方案中，允许所述共培养系统运行一段足以进行细胞重编程的时间，例如约24小时或更久。在第三方案期间，可能发生停流过程，其中含有刺激细胞或应答细胞或两者的细胞培养基流导入一段时间，然后基本静止一段时间。可将数个感应单元整合入流动回路中，以实时监测该系统并能调节系统参数(如添加新鲜培养基)。传感器和模块可以包括：氧气、二氧化碳、葡萄糖、pH、细胞密度工具、通风孔和排气室。
然后，共培养期间结束时，应答细胞群以及任选的刺激细胞群可在第四方案中从系统获得。
系统可包含一个或更多的泵以将任何应答细胞群、刺激细胞群、新鲜培养基和/或试剂的流导入或导出生物反应器。例如，泵可为蠕动泵或磁力泵(如
泵)。如实施例3所示，显示停流条件相比连续的共培养条件增加了应答细胞的增殖。如实施例4所示，相比由蠕动泵引导的流，由磁力泵引导的流也显示增加应答细胞的增殖。
所述生物反应器或延伸至/自生物反应器的管道还可包括排气室和/或通风孔以用于从封闭系统中排出气体。排气室和/或通风孔也可用于去除或捕获系统内对细胞有害的气泡。
动态共培养系统中包括的刺激细胞可为基质细胞、病毒包装细胞、抗原暴露细胞、年轻血细胞、微生物细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、癌细胞和/或神经元。所述刺激细胞可置于组织内。
应答细胞可为免疫细胞、骨髓细胞和/或红细胞。在一个具体实施方案中，所述应答细胞为造血干细胞或造血祖细胞。在另一个具体实施方案中，所述应答细胞为白细胞。
在另一个实施方案中，所述刺激细胞为间充质干细胞，且所述应答细胞为T细胞。
所述应答细胞暴露的分泌因子可为核酸分子，例如mRNA、微小RNA、环状RNA和DNA。或者，所述分泌因子可为生长因子、趋化因子和/或细胞因子。所述分泌因子可包括在刺激细胞的外泌体中，所述外泌体之后可被所述应答细胞内吞。
刺激细胞与应答细胞对的实例如表2所示。白细胞可被认为是一种免疫细胞且包括在表2中反映的免疫细胞类别内。年轻细胞包括取自胚胎、新生儿或青春期早期阶段期间的受试者，例如直至18岁的人类受试者的细胞。脂肪细胞包括白色、棕色和米色脂肪细胞。
表2.刺激细胞与应答细胞对
在另一实施方案中，提供了具有重编程细胞群的组合物。所述重编程细胞包含源自不同细胞群(如刺激细胞)的生物分子(如核酸分子、蛋白)。与其亲本群相比，所述重编程细胞可表现出一种或多种额外的或修饰的功能活性。如本文所用，“亲本群”为尚未暴露于所述不同细胞群的分泌因子的细胞群。术语“重编程细胞”是指已暴露于所述不同细胞群的分泌因子的亲本细胞群。所述重编程细胞还可表达不由其亲本群表达的细胞表面标志物。与其亲本群相比，所述重编程细胞可具有额外的或修饰的功能活性，例如修饰的T细胞体外增殖活性。
所述组合物可配制于可接受的载体中以施用给患有免疫疾病的受试者。方法可包括将所述组合物施用给需要其的患者。例如，可根据治疗方案提供所述组合物以增加或减少一种或多种抗炎细胞的产量或治疗炎症相关的疾病、失调或病症。所述疾病、失调或病症包括，例如类风湿性关节炎、I型和II型糖尿病、强直性脊柱炎、肌萎缩侧索硬化症、硬皮病、白塞氏病、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)和巨噬细胞活化综合征(MAS)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻、多发性硬化症、心肌梗塞、肿瘤、慢性感染性疾病、系统性红斑狼疮、骨髓衰竭、急性肾损伤、败血症、多器官功能障碍综合征、急性肝衰竭、慢性肝功能衰竭、慢性肾衰竭、胰腺炎和格雷夫氏病。
生物反应器系统的实例如本文实施例1和2中所述。特别地，造血干细胞和祖细胞(HSPC)通过间接的成纤维饲养共培养固定并富集(实施例1)。此外，数据还表明使用间充质干细胞(MSC)获得了免疫细胞的重编程(实施例2)。
免疫细胞重编程的理论机制是MSC分泌的外泌体。外泌体含有来自其宿主细胞(在实施例2中为MSC)的遗传物质，如RNA。随后，外泌体能被受体细胞(在实施例2中为T细胞)内吞。所述T细胞可通过吸收并整合MSC衍生的物质经历构象变化。相比于对照，在培养的MSC:PBMC中观察到测量的外泌体的明显变化。也可参见实施例5。该原始数据证明MSC确实在生物反应器中释放了可检测的外泌体。
具体实施方式
实施例1.中空纤维生物反应器系统
建立一个可扩展的中空纤维生物反应系统，其中已知能提供造血支持的小鼠胚胎成纤维细胞系(Roberts等人,1987)与小鼠HSC在连续、浓缩和循环流中间接共培养为饲养层，以稳定并富集用于短期生物加工的HSC细胞。由于饲养细胞通过本系统的中空纤维膜与HSC分离并且经历循环流，HSC的分离被简化。进行概念-验证研究以筛选合适的纯化的基质饲养细胞，在微反应器系统中开发共培养方法，并评估小鼠骨髓HSC的间接稳定和富集效果。
动物与骨髓细胞悬液
通过使用28号针和3ml注射器冲洗中央骨髓，已从6-8周龄的雌性C57 BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离小鼠原代全BM细胞。冲洗的骨髓使用22号针和和3ml注射器研磨成单细胞悬液，然后通过70μM尼龙网筛过滤以从细胞制品中除去组织碎片。用培养基洗涤细胞，然后进行胺-氯化物-钾(ACK)裂解缓冲液(Biolegend,CA,USA)处理以移除血红细胞。然后，使用细胞活性染色、台盼蓝(ThermoFisher Scientific,USA)和血细胞计数器对BM细胞进行实验计数。用添加有10％FBS，1％青霉素/链霉素，10mM HEPES(ThermoFisher Scientific,USA)和1mM丙酮酸钠(ThermoFisher Scientific,USA)的RPMI(Roswell Park MemorialInstitute Medium；Gibco,USA)制成培养基。
2-D迁移皿共培养
在2-D迁移皿共培养中进行初始优化实验，以实现更高程度的通量和参数评价，以确定优化的培养标准：基质细胞类型和剂量。将含有0.4μM孔的Corning 24孔迁移皿(Grenier Biosciences,Austria)用于这些培养物。在加入全骨髓细胞(BMC)24小时前，用2E5(低基质剂量:1:10)或4E5(高基质剂量:1:2)接种基质细胞。将BMC分别接种于2E6或8E5细胞中，然后将共培养物在37℃孵育72小时。通过流式细胞仪计数并分析细胞的HSPC群。如前所述，使用标准RPMI细胞培养基培养细胞。
3-D微反应器建立
所述中空纤维微反应器购自Spectrum实验室(CA,USA)。用无菌过滤的0.5M氢氧化钠(NaOH)填充所述微反应器中空纤维的内和外毛细管空间，并在37℃放置1-2小时以进行反应器灭菌。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)(Sigma,USA)多次冲洗以去除NaOH。所有流体连接器和管(Masterflex
BPT管和铂金硫化硅胶管,IL,USA)类似地用0.5M NaOH浸泡并冲洗至少1个小时，然后用无菌过滤的PBS洗涤。图3A显示了用于共培养的装置的建立。
3-D微反应器接种和取样
在开始共培养前24小时，用7E6(高基质剂量:1:2)或3-4E6(低基质剂量:1:10)3T3基质细胞接种微反应器。在24小时，用培养基轻轻地洗涤接种的微反应器，然后将其吸附到分别含有14E6(高基质剂量:1:2)或30-40E6(低基质剂量:1:10)全BMC的细胞培养袋(Origen)上。使用Masterflex(IL,USA)蠕动泵以4mL/min的速度导入流体。在1、24、48小时的时间点，采集250-500μL样品等分试样进行细胞定量和流式细胞仪分析。施加流体后72小时收获共培养物，然后类似地进行分析。
基质细胞培养
小鼠间充质干细胞购自Gibco。将细胞在由添加有10％热灭活胎牛血清(FBS；Atlanta Biologicals,GA)、1％青霉素/链霉素(Gibco,MA)、1％抗细菌-抗真菌素(Gibco,MA)的无菌α-MEM(Gibco,MA)组成的培养基中培养，然后在从供应商得到原始细胞的1-3代之内进行实验。3T3细胞购自ATCC(American Type Culture Collection)，然后按照其推荐的指示进行扩增；在DMEM中添加10％FBS(Atlanta Biologicals,GA)和1％青霉素/链霉素(Gibco,MA)。
流式细胞仪分析
在4℃下、黑暗中，使用直接标记的偶联至生物素的针对CD11b-、CD11c-、Gr1-、CD3-、CD4-、CD8a-、CD19-、B220-、NK1.1和TER119的人单克隆抗体、cKit(CD117)-APC、Sca1-PECy7和链霉亲和素APC Cy7(BD Biosciences和eBiosciences,USA)对细胞染色20-30分钟。用添加2％FBS和2mM乙二胺四乙酸(EDTA；Gibco,USA)的PBS洗涤并重悬细胞。使用FACSLSRII(BD Biosciences,USA)和FlowJo软件(USA)进行流式细胞仪分析。
在共培养开始时，使用羧基荧光素(CFSE)掺入评估细胞周期。使用流经无基质支持的微反应器的BMC对照样品测定F0峰。
统计分析
用GraphPad Prism进行所有的统计检验。通过Student’s t检验来检验组间差异，其中p值≤0.05被认为是统计学显著差异。相对于单独BM微反应器共培养物进行所有比较。所有实验进行至少三次生物学重复。
结果：在2-D无接触依赖性共培养中鼠胚胎成纤维细胞系支持LSK富集。
之前已表明基质细胞增强了全BMC体外造血支持。本研究中，应用选择优化的基质细胞类型的两个标准：1)易于细胞分离、维持和扩增以“现成”使用，以及2)HSPC的造血支持潜力。为确定使用哪种基质细胞类型用于体外支持全BMC，比较骨髓间充质细胞(MSC)和3T3小鼠胚胎皮肤成纤维细胞系的支持HSPC的能力。包括无基质细胞组作为对照。为筛选优化的共培养条件，调整了2-D无接触依赖性迁移皿设置以模拟具有更高通量实验优势的间接共培养。
有或没有基质支持的共培养72小时后，枚举全BMC的隔室。3天内，基质支持使全BMC的总数量(图2A)维持在其初始接种数量2x106个输入细胞。然后，分析BMC各亚群中与治疗更相关的LSK群，其表型上定义为谱系阴性Sca阳性cKit阳性(LSK)(图2B)。有趣的是，3T3成纤维细胞系表现了出色的能力以从谱系阴性及全BMC库内富集LSK群(图2B-C及图7)。3T3基质细胞支持的BMC的LSK谱中不存在表型异常(图2C)。在3T3细胞与全BMC的比例为1:2和1:10的范围内观察到了这些LSK富集的发现(图7)，提示了规模扩大的动态工作范围。该结果揭示了之前未发现的3T3成纤维细胞支持从全BM富集小鼠HSPC的能力。在我们的中空纤维微反应器中的所有后续实验中，“现成的”特性和优异的造血支持潜力导致3T3的规模扩大。
结果：在中空纤维生物反应器中的全骨髓接种和稳定
图3A-C图示了所述中空纤维生物反应器。生物反应器通常用于单细胞类型的规模扩大。中空纤维系统用于流线化交换和补给新鲜的培养基以支持大规模细胞扩增。该系统改为共培养工具，其中外腔空间中接种基质细胞而BMC流经纤维内腔，以研究连续悬液培养期间工程化的组织层支持LSK的潜力(图3A-C)。
微反应器装置由通过专用管从气体交换袋通过Masterflex泵向下流动的细胞组成，所述泵驱动细胞经由其毛细管内入口穿过中空纤维(图3A-B)。基质细胞通过标记的入口接种毛细管外表面(图3B)。中空纤维膜由亲水的聚醚砜(PES)构成，且各纤维的截留分子量为0.2μM孔，其允许仅非细胞的流体可双向交换(图3C)。因其在高温下和恒定的流体暴露下具有高度耐用性而选择PES。Masterflex
BPT管用于使BMC循环通过(loopthrough)Masterflex泵头从袋中流向微反应器(图3A)。该PharMed BPT管由铂金硅胶制成，因其具有散裂水平低、对酸碱耐受度高、且能耐具有最小的细胞剪切的高压而被使用。测试14x 106个细胞的密度的造血细胞以不同流速(5mL/min、10mL/min和5mL/min)在毛细管内隔室中循环时的活力。由于单核细胞的吸附，全BMC经过1小时内流动后细胞总计数下降，然后72小时培养期间保持相对不变。72小时后，更低的流速下观察到更高的细胞计数，因此选择Masterflex泵的最低流速为4mL/min(图3D)。
结果：基质细胞支持挽救中空纤维生物反应器中的细胞丢失
静态共培养显示，3T3成纤维细胞表现出比MSC和非支持的BMC更优异的造血支持(见图2)。为在微反应系统中证实这种结果，将新冻融的3T3接种到中空纤维的外腔表面24小时，然后再向设备中加载主要BMC，以使3T3有时间附着并具有稳定的功能。相比非基质细胞支持的骨髓，含有3T3的共培养物比BMC具有统计学上显着的保护优势(图4A)。一直持续观察到72小时时间点。为维持LSK细胞数量需要高剂量的基质细胞支持，即1个3T3细胞对2个BMC细胞(图4A-B)。随着时间的推移，检测到的死细胞数量没有可观察到的差异，说明循环的细胞很可能附着于系统组件，而不占悬液中细胞计数(图8A-B)。
与相对1小时样品标准化计数所观察到的相似，在1、24、48和72小时的时间点时的原始计数也表明，1个基质细胞对2个BMC的3T3成纤维细胞的剂量能够阻止在非支持BMC的情况下观察到的细胞数量下降趋势(图9A-B)。基于这些结果，所有从微反应器中分离出BMC的造血隔室的后续实验均使用1:2高基质剂量模式进行。
结果：3T3成纤维细胞富集LSK
接种3T3的微反应器在48小时内稳定细胞计数的能力为其探索扩增源自BM的细胞奠定了坚实的基础；但是，该细胞库内的主要治疗性关注点是造血干细胞及祖细胞隔室。为评估HSPC群，通过流式细胞仪分析取样时间点的LSK表型(图5A-B)。结果表明，来自接种3T3的微反应器的全BMC细胞群内LSK细胞富集的趋势非常强烈(图5A)。相比非基质细胞支持的骨髓，用3T3支持的LSK细胞数量以类似方式扩增(图5B)。还用低基质剂量装置进行了类似的分析(图9A-B)。这种LSK富集潜力仅见于用更高剂量的1个3T3细胞对2个BMC细胞(图9A-B及图5A-B)。
然后，评估了全BMC细胞库中的基质群谱系阳性和谱系阴性细胞。有趣的是，全BMC群内谱系阳性和谱系阴性造血支持细胞的数量没有可检测的变化(图5C-D)。
结果：3T3支持的LSK表现出增强的固有细胞循环。
由于流经接种3T3的微反应器的全BMC的基质隔室内未检测出差异，推测观察到的LSK细胞群的富集是固有变化的结果。因此，微反应器上样前，将全BMC用CFSE脉冲，以研究与3T3支持相关的固有细胞循环模式。图6A显示了分析的LSK的CFSlo库。正如预期，在0-1小时的时间点，几乎没有LSK循环(图6B)。随后在48和72小时的时间点(仅48小时的时间点具有统计学显著差异)，当3T3支持BMC时，作为CFSElo的LSK库明显更大(图6B)。
为评估这是否只是接种3T3的微反应器中的所有BM细胞扩增的结果，进一步分析了基质细胞谱系阳性和谱系阴性的循环特性(图6C-D)。虽然这两种细胞类型中CFSE的掺入量随着微反应器中时间的增加而逐渐增加，但有或没有基质细胞支持的BMC之间没有差异(图6C-D)。
实施例2.使用间充质基质细胞重编程免疫细胞的实例
进行一组实验以表明间充质基质细胞(MSC)能通过间接共培养灭活T细胞，从而形成一种新型抗炎细胞组合物。减少MSC的剂量、共培养的时间、共培养的体积、以及T细胞发生的表型变化，以在体外系统中实践。所述体外系统包括结合有迁移皿插入物的标准的组织培养多孔板。将T细胞置于孔底，而将MSC置于迁移皿插入物中。所述迁移皿插入物允许在两种细胞群之间运输分泌因子，但消除细胞直接接触和相互作用的可能性。
已知与MSC共培养时(直接的、或通过迁移皿插入物而间接的)，MSC抑制激活的T细胞(分裂素，CD3/CD28)的CD3+T细胞增殖。这可在代差异中进一步观察到，因此在MSC存在下培养的T细胞可检测到增殖代数的明显减少。证实这种功能具有剂量依赖功能。T细胞激活标志物还显示出与增殖水平的良好相关性。共培养条件下，MSC能以剂量依赖方式抑制CD38和CD25(中期和后期标志物)。与T细胞激活和增殖相关，MSC在刺激下还改变T细胞分泌组。间接共培养期间，观察到促炎因子(TNFa、IL1b、IL17)剂量依赖性减少。
剂量应答与体积
图10显示了MSC:PMBC相互作用的剂量应答和体积。可以剂量依赖方式直接调节MSC/PMBC相互作用。表明培养物体积的变化明显影响增殖产出量。图10A中的组如下：组A:1.5M PBMCs,0.8mL；组B:1.5M PBMCs,1.6mL；组C:3.0M PBMCs,0.8mL；组D:3.0M PBMCs,1.6mL；组E:0.75M PBMCS,0.8mL。
MSC:PMBC时机
表明MSC存在持续时间明显影响PBMC增殖，如图11所示。
另外，免疫增殖作用增强，但不特异于MSC。通过与其他细胞类型一起孵育，同样存在增强的增殖，如图12所示。
24小时BrefA PBMC
表明布雷菲德菌素A处理PBMC降低MSC效率，其揭示了交互机制。在PBMC上进行24小时BrefA处理，其结果如图13所示。另外，表明布雷菲德菌素A处理MSC降低MSC效率，支持分泌因子的治疗性。在MSC上进行24小时BrefA处理，其结果如图14所示。
相比对照，布雷菲德菌素A处理的MSC证实了增强的功能。在共培养前3小时以及在第1、2、3天处理MSC，其结果如图15所示。
MSC:PMBC生物反应器
动态培养中，观察到PBMC动态流下免疫抑制效果增强。PBMC刺激24小时后进行共培养，说明MSC挽救炎症损伤的能力。结果如图16所示。
MSC:PMBC预刺激
表明具有炎症信号的MSC许可不显著增强功能。结果如图17所示。
IFN-γ似乎是唯一在1:10时具有良好效果的细胞因子。在1:50时，表明主要影响因素是不能通过许可克服的细胞数量。
增殖追踪
使用标准CFSE染色进行增殖追踪。共培养开始前，使用该染料给PBMC群染色。细胞分裂时，该染料在亲本群和子代群之间分配，因此导致整体信号减少。可从随着代增加信号强度左移容易地看出这一点(图18A)。通过标准流式细胞仪分析可以容易地检测并允许检测各代。
药动力学模型的实例如图18A-18I所示。图18A显示了基于CFSE的增殖追踪的实例。药代动力学模型和控制方程如图18B-18C所示。建模结果如图18D-F所示，阴影区以任意单位(a.u.)计。模型的预测能力如图18G-I所示。
图19A-19F显示了来自MSC:PBMC共培养实验的流式细胞仪数据。顶行显示了整个增殖群的表达。底行显示了各单个增殖群的表达。Y轴为标准化的增殖。图19A为各种MSC:PBMC比例的CD3增殖的图。图19B为各种MSC:PBMC比例的CD3代的图。图19C为CD4增殖的图。图19D为CD4代的图。图19E为CD8增殖的图。图19F为CD8代的图。在图19A-19F中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。
图20A-20H显示了MSC:PBMC共培养实验的流式细胞仪数据。顶行(包括图20A、20C、20E及20G)显示了整个增殖群的表达。底行(包括图20B、20D、20E及20F)显示了各单个增殖细胞群的表达。X轴为标准化的增殖，并且Y轴为表面标志物表达水平。图20A为不同MSC:PBMC比例的CD4增殖和CD38表达的图。图20B为显示高线性/相关性的CD4增殖和CD38表达的图。图20C为各种MSC:PBMC比例的CD4增殖和CD25表达的图。图20D为显示高线性/相关性CD4增殖和CD25表达的图。图20E为各种MSC:PBMC比例的CD8增殖和CD38表达的图。图20F为显示高线性/相关性CD8增殖和CD38表达的图。图20G为各种MSC:PBMC比例的CD8增殖和CD25表达的图。图20H为显示高线性/相关性CD8增殖和CD38表达的图。在图20A-20F20H中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。
图21A-21K显示了分泌的细胞因子的多剂量应答。图21A显示了各种MSC:PBMC比例的IFNa的应答。图21B显示了INFg的应答。图21C显示了IL1b的应答。图21D显示了IL1ra的应答。图21E显示了IL4的应答。图21F显示了IL10的应答。图21G显示了IL12p40的应答。图21H显示了IL17的应答。图21I显示了IP10的应答。图21J显示了PGE2的应答。图21K显示了TNFa的应答。在图21A-21K中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。
在图19A-21K,St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。
图22为PBMC的标准化增殖vs暴露于MSC的时间的图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。共培养1、2和3天后将MSC
插入物移除。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。需要大量的治疗性MSC持续时间以引起完全反应。发现有效MSC剂量下4天中3天是必要的。在第1天和第2天存在明显的免疫抑制，但水平明显降低。
图23A-23K为标准化细胞因子分泌vs暴露于MSC的时间的柱状图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。共培养1、2和3天后将MSC Transwell插入物移除。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。如在之前章节中所述，调查细胞因子谱，观察到一致的关联。较长暴露于MSC导致更大程度地抑制炎症细胞因子，对于短期暴露，反之亦然。图23A显示了IFNa随MSC暴露延长而增加。图23B显示了INFy随MSC暴露延长而降低。图23C显示了IL1b随MSC暴露延长而无显著变化。图23D显示了IL1ra随MSC暴露延长的略微增加。图23E显示了IL4随MSC暴露延长而降低。图23F显示了IL10随MSC暴露延长而降低。图23G显示了IL12p40随MSC暴露延长而无显著变化。图23H显示了IL17随MSC暴露延长而降低。图23I显示了IP10随MSC暴露延长而无显著变化。图23J显示了PGE2随MSC暴露延长而增加。图23K显示了TNFa随MSC暴露延长而降低。
图24为标准化增殖vs培养体积条件的图。如图24所示，体积是驱动MSC效性的潜在微环境因素。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。发现加倍共培养体积显著降低MSC效性。
图25A-25K为标准化细胞因子分泌vs培养体积条件的柱状图。如图25A-25所示，体积是驱动MSC效性的潜在微环境因素。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。明显地，该作用通过内因子的稀释通过药代动力学驱动。有趣的是，未观察到对MSC主导因子的影响，说明由于两个体积的分泌水平相似，缺乏这些特定因子的功效以及潜在的自分泌调节。主导的PBMC因子提高到2倍，说明缺乏MSC作用。这也反映出缺乏足够的初始细胞因子水平以许可MSC。
在图24-25K中,S1＝stim 1x vol,S2＝stim 2x vol,C1＝ctrl 1x vol,C2＝ctrl2x vol,M1＝共培养1x vol,M2＝共培养2x vol
图26显示了关键性的MSC:PBMC交互作用，如使用蛋白转运抑制剂所示。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。正如预期，发现使用BA处理MSC消除了治疗功能。
图27A-K显示了关键性的MSC:PBMC交互作用，如使用蛋白转运抑制剂所示。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。正如预期，结果显示MSC分泌的因子极大减少。也观察到促炎因子显著增多，其与MSC免疫抑制功能直接相关。
图28显示了布雷菲德菌素A处理MSC:PBMC共培养物的结果。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。还观察到，BrefA处理PBMC导致MSC功能极大降低，这支持需要MSC许可。
图29A-K显示了布雷菲德菌素A处理MSC:PBMC共培养物的结果。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。标准化细胞因子分泌vs BrefA条件的柱状图。发现了PBMC主导因子的显著抑制，其可能导致MSC许可不足，导致免疫抑制缺乏。
图30A-30D显示了不同生物反应器培养条件下分泌的粒径分布。图30A显示了刺激的PBMC培养物的颗粒计数。图30B显示了刺激的PBMC培养物的颗粒计数。图30C显示了刺激的PBMC:MSC培养物的颗粒计数。图30D显示了刺激的PBMC:MSC培养物的颗粒计数。NoMSC＝刺激的PBMC；B-M＝刺激的PBMC；PlusMSC＝刺激的PBMC+MSC；B+M＝刺激的PBMC+MSC。
实施例3.停流培养
在气体透过性细胞培养袋中用50ng/mL CD3、50ng/mL CD28和50ng/mL IL-2刺激PBMC(停与续_3，图31)和纯化的T细胞(续_1与续_3，图31)长达336小时(14天)。培养条件为使用RPMI 1640和10％FBS在37℃和5％CO2的标准培养孵育器中。连续流培养的整个时期中，循环连续流保持在50-100mL/min。除了在台盼蓝排除细胞计数(蓝色线/点)当天以50-100mL/min持续5分钟，停流培养保持静态培养。
如图32A-B所示，静态培养能够聚集，而添加短暂的流体脉冲导致剪切诱导的细胞分散体。这被证明是有利的，因其1)减弱了大的聚集体，其可造成营养物质扩散受限，因而导致非理想的细胞培养条件；及2)允许细胞枚举，这对于完整的大细胞聚集体而言是不可能的。
实施例4.停流培养的磁力泵
在气体透过性细胞培养袋中，用50ng/mL CD3、50ng/mL CD28和50ng/mL IL-2刺激PBMC(磁力泵，图33)，并用5μg/mL PHA-L和100ng/mL IL-2刺激PBMC(蠕动泵，图33)，长达240小时(10天)。引入磁力流并与蠕动泵流比较。在不同时间点从细胞培养袋中获取细胞计数。使用连续的磁力流10天后，发现产量更多。蠕动流中观察到明显的细胞碎片，说明由于蠕动机制相关的机械破坏而导致细胞死亡。
实施例5.暴露于MSC外泌体和纯化的MSC外泌体的PBMC中表达的miRNA
在中空纤维生物反应器中，在4天的培养期内将PBMC暴露于MSC外泌体。将MSC接种到腔外表面，而允许PBMC以50-100mL/min的流速在腔内空间内流动。刺激培养物诱导炎症环境。
培养期间MSC外泌体中和暴露于MSC外泌体的PBMC中表达的miRNA结果如表3所示。两栏中所示的数字代表来自测定的MFI(平均荧光密度)并指示样品中存在的miRNA量。上清液：
体系中仅有MSC的生物反应器实验的浓缩样品。沉淀：体系中有MSC和PBMC两者的生物反应器中PBMC沉淀样品。
表3.重编程的PBMC中表达的miRNA
实施例6.在迁移皿工程化体系中通过生产细胞转导慢病毒颗粒
慢病毒衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)，这使其成为有效的递送体系。但是，使用其将遗传物质递送入目标细胞之前，生产这些病毒的常规操作涉及冗长的收集和量化过程。已证明，迁移皿体系中生产细胞HEK293T具有同时产生慢病毒颗粒和转导(感染)靶细胞的能力，这消除了对单独的病毒收集和定量过程的需求。对于各实验，评估HEK293T的变体以及靶细胞类型密度以及迁移皿插入物孔径，以鉴定吸附和悬液细胞类型的颗粒生产速率与感染动力学之间的重要关系。本实验成功表明在本系统的调控下，使用RFP构建体能够在六天内工程化人PBMC。这些研究表明能够结合并使转染/转导过程更接近自动化，以促进人靶细胞类型的及时和成本效益的转导。这样的研究可以为向病毒生产和随后的细胞疗法工程的改进的制造系统提供过渡。
基因工程化和治疗领域已应用三种初级病毒载体体系(腺相关病毒(AAV)、γ-逆转录病毒和慢病毒)，其中使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞在X连锁性严重混合免疫缺陷症(SCID-X1)、B型血友病以及血液系统恶性肿瘤的多种疾病中取得日益增加的成功(Rogers等人,2015；Hacein-Bey-Abina等人,2014；Porter等人,2011)。特别地，慢病毒载体已用于治疗罕见疾病，包括原生性免疫缺陷症和神经退行性贮积疾病(Mukherjee等人,2013；Aiuti等人,2013；Cartier等人,2009；Biffi等人,2013)。过去的几十年内，慢病毒已被使用和优化并且由于其能够转导分裂期和非分裂期细胞、其整合谱更安全且能以高滴度的载体产生，可作为优选的病毒载体体系(Merten等人,2016)。慢病毒载体的强大的感染性归因于基于HIV-1骨架，以及通过使用VSV-G包膜蛋白进行假分型，其允许通过病毒载体与大多数哺乳动物细胞类型的靶细胞表面之间的直接接触改进遗传物质的向性和转移(Durand等人,2011；Farley等人,2007)。
小规模生产慢病毒载体颗粒的常规方法涉及将3到4个质粒加入汇合度>90％的HEK293T细胞的2D培养系统中，然后是细胞培养上清液的收集过程，其进一步纯化、定量并储存在-80℃，(Ausubel等人,2012)。如图36所示，从HEK293T细胞的初始接种到其可用于后续转导靶细胞类型的时间，取决于优选使用的定量方法需要大约7到10天(Ausubel等人,2012；Geraerts等人,2006)。随着越来越多的使用慢病毒载体的临床试验收到临床批准，需要过渡到常规的用于细胞治疗的大规模制备方法，其限制需要过长的生产时间、减少试剂消耗和昂贵手工操作(Merten等人,2016；Geraerts等人,2006；Sheu等人,2015；Gandara等人,2018；Merten等人,2010)。使用目前所用的体系，病毒颗粒在转染期间不处于其滴度峰值，因为转染和转导过程作为两个不同的事件处理，意味着病毒并没有立即用于递送目标基因。相反，允许产生颗粒并立即转导靶细胞的单一低操作体系可将对单独的病毒收集和处理步骤的需求最小化。目前产生慢病毒并基因递送给细胞的方法需要优化，以将产生的病毒的滴度和数量最大化，同时保持制备过程中的终产物(靶细胞)的无菌性。该体系的重要性在于限制污染的可能性，同时允许更精简地过渡为大规模、封闭体系细胞工程化制造平台。
本研究显示了通过结合基于迁移皿的装置，一步法慢病毒颗粒生产和靶细胞转导体系的潜力。基于迁移皿的体系的操作能提供对靶细胞治疗产品参数的进一步了解，其中通过改变体系参数(例如插入物孔径和细胞密度)可确定颗粒输出以及后续的感染倍数(MOI)的控制。本文收集的数据表明，可以确定基于迁移皿的装置中的附着和悬液细胞类型的颗粒输出和后续感染的优化范围，以匹配细胞治疗产品的需求。另外，转染和转导两个重要过程的结合可以解决目前许多与更及时且更具成本效益的使用慢病毒载体的细胞制备方法相关的问题(Milone等人,2018)。
分泌慢病毒颗粒的HEK293T细胞可感染迁移皿体系中的靶细胞
在添加慢病毒颗粒包装质粒前24小时，产生慢病毒颗粒的细胞系HEK293T细胞以45％汇合度接种到0.4μm插入物中，以在转染开始时达到90％的最优密度。初始实验使用附着的胰腺癌细胞(病人1319)以及悬液Jurkat T细胞以评估基于迁移皿的体系的可行性。在添加质粒前24小时，将靶细胞以1.8x105个细胞/mL接种到6孔中，以当HEK293T细胞开始产生慢病毒颗粒时(如图37A-E中所示，第24-48天)达到预期的25-30％的转导汇合度。在添加质粒后的第0天，将板放回37℃、5％CO2的孵育器中。24小时后，将迁移皿插入物中的培养基变更为收集培养基(仅DMEM/F12)，然后在HEK293T细胞开始产生子代慢病毒颗粒时(如图37A-E中所示，24-72小时)进行标准转染方案。在48小时，向所有板中加入8ug/mL聚凝胺转导剂，在25℃以600rpm震摇90分钟，以模拟悬浮液Jurkat T细胞的标准自旋接种(spinoculation)方案，然后移入孵育器中8-12小时。然后，将各孔中培养基变更为针对靶细胞类型的完全生长培养基并允许再生长48小时。然后，通过ZEISS显微镜评估各孔中转导的GFP表达，如分别对应于1319和Jurkat T细胞的图27C-D所示。
改变HEK293T和Jurkat T靶细胞的密度
一旦确定了迁移皿中靶细胞的转导，评估靶细胞和HEK293T细胞的接种密度的变化。在添加质粒一天前接种HEK293T细胞，以使转染当天达到目标汇合度的90％、75％、60％、45％和30％。在转导开始时，在6孔的每孔中接种Jurkat T细胞以达到30％的最优密度。使用流式细胞仪分析(FACS)测定各插入物中HEK293T细胞密度对Jurkat T靶细胞转导效率的影响。
孔中Jurkat T靶细胞密度在10％、20％、30％、40％、50％之间变化以评估对转导效率的影响，同时HEK293T细胞以最优的90％汇合度维持在插入物中。图38A比较了HEK293T细胞密度的变化，以及图38B比较了Jurkat T细胞密度的变化。
在转染时以90％汇合度接种于插入物中的HEK293T细胞显示出颗粒产生以及后续转导底孔中的Jurkat T靶细胞的最高水平。如图38C所示，尽管观察到最多GFP阳性细胞，但在迁移皿底孔中还存在HEK细胞，这是不期望的副作用。因此，对于下游应用，插入物中的较低密度(例如45％)的HEK293T可能更合适，例如在图38D中。在转导前以10％汇合度初始接种的Jurkat T细胞显示产生最多的GFP阳性细胞。
迁移皿插入物孔径变化
选择待操作的另一个变量是迁移皿插入物的孔径。使用理想的转导汇合度的HEK293T细胞和Jurkat T细胞，用不同孔径的插入物评估其对迁移皿体系的转导效率的影响。选择孔径在0.4、1、3和8μm之间变化的插入物。使用流式细胞仪分析来测定各组的转导效率。结果如图39A1-C所示。
对于更小的孔径，例如0.4和1μm，同时产生的病毒颗粒可能会堵塞孔，这限制其渗透和转导孔中靶细胞的能力。对于8μm孔径，尽管观察到更高的转导效率，更大的孔径使HEK293T细胞穿过膜，这是不理想的。
转导人PBMC
为了评估迁移皿体系的效率以转导目标人细胞类型，将来自供体PM的人外周血单核细胞(PBMC)在接种前按照材料与方法部分所述的CellTraceTM CFSE细胞增殖染色法进行染色。转染开始前1天和转导开始前3天用PHA和IL-2刺激细胞。用流式细胞仪来测定利用基于迁移皿体系PMBC的转导效率和增殖潜力。使用RFP构建体，以区别转导与增殖的荧光。
讨论
本工作中，我们研究了基于迁移皿的细胞工程化体系是否允许以一个体系方式以最少的操作和试剂应用，使HEK293T同时产生慢病毒颗粒并转导目标的粘附的1319胰腺癌细胞和悬浮Jurkat T细胞和PBMC。
目前的许多纯化方案涉及使用超离心以浓缩病毒，但这些方法存在规模限制性，耗时且经常杂质和病毒一起被浓缩，之后所述杂质和病毒会引起免疫反应或干扰转导。常常采用一系列微滤步骤，基于一系列减小孔径的过滤器以最小化与过滤相关的颗粒衰减。切向流过滤(TFF)提供选择并可用于成功浓缩并部分纯化慢病毒，该方法比之前讨论的方法更可扩展且高效。本报道中，这几种策略在一步法体系中解决。为了完全除去由于目前实施的很多操作条件导致的与颗粒滴度损失和损伤相关的作用，使用HEK293T细胞连续产生高滴度的慢病毒颗粒，其立即与靶细胞接触。通过使用有孔的迁移皿膜，颗粒渗透穿过的程度是可控的，且已鉴定哪些孔会造成顶层的HEK293T细胞也透过(这种透过是不期望的)并可以固定。
目前，可以在将质粒加入HEK293T细胞后的两个不同的时间点收集病毒以用于进一步下游加工，这发生在转染后48和72小时。在收集过程中，许多HEK293T细胞受到干扰并将上清液留在板上，也因为一旦FBS从培养基中去除然后转移到收集液(仅含有DMEM/F12的培养基)中，HEK293T细胞也容易去除，因此第二轮收集可包括少于理想数量的产生病毒颗粒的HEK293T细胞。建议3天后不再进行进一步收集，因为上清液可含有少量质量差的病毒颗粒。根据本研究，建立了一种连续产生高质量的慢病毒的方法，所述慢病毒可立即与靶细胞接触用于转染。
在本研究中，显示了在基于迁移皿的体系中成功转导人Jurkat T细胞。另外，使用PBMC评估基于迁移皿的体系工程化可用于下游临床装置的人靶细胞的能力。
材料与方法
产生载体
使用表达SV40大T抗原突变版本(ATCC:CRL-3216)的人293T肾成纤维细胞系(HEK293T)基于各实验以各种密度接种于细胞插入物和孔中，以产生慢病毒载体。慢病毒转移载体pLVEC-EFNB1-Fc-IRB来自于Rick Cohen的馈赠，其包含GFP或RFP报告基因。在存在DMEM/F12(Gibco)+10％FBS(Gibco)+1％青霉素/链霉素(Gibco)的存在下，使用包装质粒psPAX2和表达VSV-G的包膜质粒pMD2.G来进行转染。在37℃在相应的培养基(详见下文)中，在8ug/mL聚凝胺(Millipore Sigma)存在下，将转导进行指定的时长。
细胞培养
在添加有10％FBS(Gibco)和1％Pen/Strep(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)中生长HEK293T和1319细胞。在含10％FBS(Gibco)和1％Pen/Strep(Gibco)的RPMI-1640培养基(Gibco)中培养Jurkat细胞和PBMC。将PBMC用CFSE染色以用于增殖，并用PHA和IL-2刺激。
PBMC染色
通过将每2mL密度为2-4x106个细胞/mL的全部细胞与总共1μL CFSE结合，用CellTraceTM CFSE进行PBMC染色以用于增殖。在15mL圆锥管中将细胞以1700rpm离心5分钟，然后重悬于5mL的PBS中。加入3μL的CFSE并混合，并将管用箔覆盖并室温孵育5分钟。在管中的细胞悬浮液顶部加入2mL培养基来重构，并将管再次离心5分钟。一旦从细胞沉淀除去上清液后，用5mL的PBS短暂冲洗细胞一次，细胞第三次离心5分钟。用培养基替换上清液，进行细胞计数并将3mL的3.3x106个细胞铺在6孔中。
PBMC刺激
用植物凝集素(PHA)和IL-2刺激PBMC以增殖。简言之，在往各插入物中接种HEK293T细胞的同一天，往各孔中添加3μL PHA(1000ng/mL)和6uL IL-2(100ng/mL)并轻轻混合。
迁移皿体系
迁移皿插入物获自于Grenier Bio-One，孔径尺寸在8、3、1和0.4μm范围内。膜由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制成，且根据尺寸为半透明的或透明的。插入物的培养表面积平均为456.05mm2。
流式细胞仪
使用BDFacsCanto II(BD Biosciences)和Flow Jo软件通过GFP表达分析靶细胞的慢病毒转导。各实验收集10000个事件/样品。无活性细胞排除在分析之外。
荧光显微镜
使用ZEISS显微镜定性分析样品的绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)标记物的表达。
实施例7.PBMC增殖
通过用ConA和IL2刺激4天时间获得PBMC增殖。显示研究的时间线的流程图如图40所示。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。
与剂量应答相关的结果如图41和42所示。MSC:PBMC比值显示出剂量应答样曲线。NHDF显示出免疫抑制能力，但不如MSC。
与共培养对T细胞增殖的影响相关的结果如图43所示。以150k/孔且与PBMC比例为1:10条件下，培养EC或MSC。术语EGM-2代表EGM-2细胞培养基。缩写50/50代表EGM-2+PBMC培养基(50/50混合)。缩写EC代表内皮细胞。缩写M代表即充质干细胞。缩写EC_M代表150k个ECS和150k个MCS。单独的ES显示适度的免疫调节效果。MSC显示明显的免疫抑制。EC+MSC仅显示比单独的MSC略微的改进。
与T细胞增殖中EC表型相关结果如图44所示。以150k/孔且与PBMC比例为1:10条件下，培养EC。动脉粥样硬化易发性和抗动脉粥样硬化性EC表型之间不存在可观察到的差异。两者均证明免疫抑制表型。
表明与NFDF(皮肤成纤维细胞)、HepG2(肝)和EA.hy296(内皮细胞)共培养的PBMC的标准化增殖应答的结果如图45所示。相比MSC，非MSC细胞显示出抑制PBMC增殖的能力显著下降。有趣的是，HepG2和EA.hy296细胞显示出增强的增殖。
参考文献
Aiuti,A,Biasco,L,Scaramuzza,S,Ferrua,F,Cicalese,MP,Baricordi,C et al.(2013).Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients withWiskott–Aldrich syndrome.Science,341:1233151.
Ausubel,L.,Hall,C.,Sharma,A.,et al.(2012).Production of CGMP-GradeLentiviral Vectors.Bioprocess Int,10(2):32-43.
Bhatia,M.,Bonnet,D.,Kapp,U.,Wang,J.C.Y.,Murdoch,B.,and Dick,J.E.(1997).Quantitative Analysis Reveals Expansion of Hμman HematopoieticRepopulating Cells After Short-term Ex Vivo Culture.The Journal ofExperimental Medicine 186,619-624.
Biffi,A,Montini,E,Lorioli,L,Cesani,M,Fμmagalli,F,Plati,T et al.(2013).Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromaticleukodystrophy.Science,341:1233158.
Cartier,N,Hacein-Bey-Abina,S,Bartholomae,CC,Veres,G,Schmidt,M,Kutschera,I et al.(2009).Hematopoietic stem cell gene therapy with alentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.Science,326:818–823.
Conneally,E.,Cashman,J.,Petzer,A.,and Eaves,C.(1997).Expansion invitro of transplantable hμman cord blood stem cells demonstrated using aquantitative assay of their lympho-myeloid repopulating activity in nonobesediabetic–scid/scid mice.Proceedings of the National Academy of Sciences 94,9836-9841.
Coughlin,T.R.,and Niebur,G.L.(2012).Fluid shear stress in trabecularbone marrow due to low-magnitude high-frequency vibration.Journal ofBiomechanics 45,2222-2229.
Davis,T.A.,Wiesmann,W.,Kidwell,W.,Cannon,T.,Kerns,L.,Serke,C.,Delaplaine,T.,Pranger,A.,and Lee,K.P.(1996).Effect of spaceflight on hμmanstem cell hematopoiesis:suppression of erythropoiesis andmyelopoiesis.Journal of Leukocyte Biology 60,69-76.
De Leon,A.,Mayani,H.,and Ramirez,O.T.(1998).Design,characterizationand application of a minibioreactor for the culture of hμman hematopoieticcells under controlled conditions.Cytotechnology 28,127-138.
Delaney,C.,Heimfeld,S.,Brashem-Stein,C.,Voorhies,H.,Manger,R.L.,andBernstein,I.D.(2010).Notch-mediated expansion of hμman cord blood progenitorcells capable of rapid myeloid reconstitution.Nature medicine 16,232-236.
Delaney,C.,Varnμm-Finney,B.,Aoyama,K.,Brashem-Stein,C.,and Bernstein,I.D.(2005).Dose-dependent effects of the Notch ligand Delta1 on ex vivodifferentiation and in vivo marrow repopulating ability of cord bloodcells.Blood 106,2693-2699.
Dormady,S.P.,Zhang,X.-M.,and Basch,R.S.(2000).Hematopoieticprogenitor cells grow on 3T3 fibroblast monolayers that overexpress growtharrest-specific gene-6(GAS6).Proceedings of the National Academy of Sciences97,12260-12265.
Durand,S.and Cimarelli,A.(2011).The Inside Out of LentiviralVectors.Viruses.3(2):132-159.
Farley,DC.,Iqball,S.,Smith,JC.,Miskin,JE.,Kingsman,SM.,Mitrophanous,KA.(2007).Factors that influence VSV-G pseudotyping and transductionefficiency of lentiviral vectors-in vitro and in vivo implications.J GeneMed,9(5):345-56.
Futrega,K.,Atkinson,K.,Lott,W.B.,and Doran,M.R.(2017).SpheroidCoculture of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells and Monolayer ExpandedMesenchymal Stem/Stromal Cells in Polydimethylsiloxane Microwells ModestlyImproves In Vitro Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Expansion.Tissueengineering Part C,Methods 23,200-218.
Gandara,C.,Affleck,V.,Stoll,EA.(2018).Manufacture of Third-GenerationLentivirus for Preclinical Use,with Process Development Considerations forTranslation to Good Manufacturing Practice.Hμman Gene Therapy Methods,29(1):1-15.
Geraerts,M.,Willems,S.,Baekelandt,V.,Debyser,Z.,Gijsbers,R.(2006).Comparision of lentiviral vector titration methods.BMC Biotechnol,6:34.
Gori,J.L.,Butler,J.M.,Kunar,B.,Poulos,M.G.,Ginsberg,M.,Nolan,D.J.,Norgaard,Z.K.,Adair,J.E.,Rafii,S.,and Kiem,H.-P.(2017).Endothelial CellsPromote Expansion of Long-Term Engrafting Marrow Hematopoietic Stem andProgenitor Cells in Primates.STEM CELLS Translational Medicine 6,864-876.
Hacein-Bey-Abina,S.,Pai,S.Y.,Gaspar,H.B.,Armant,M.,Berry,C.C.,Blanche,S.,Bleesing,J.,Blondeau,J.,de Boer,H.,Buckland,K.F.et al.(2014).Amodified gamma-retrovirus vector for X-linked severe combinedimmunodeficiency.N.Engl.J.Med.,371,1407–1417.
Himburg,H.A.,Muramoto,G.G.,Daher,P.,Meadows,S.K.,Russell,J.L.,Doan,P.,Chi,J.T.,Salter,A.B.,Lento,W.E.,Reya,T.,et al.(2010).Pleiotrophinregulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.Naturemedicine 16,475-482.
Irani,A.A.,Craig,S.S.,Nilsson,G.,Ishizaka,T.,and Schwartz,L.B.(1992).Characterization of hμman mast cells developed in vitro from fetal livercells cocultured with murine 3T3 fibroblasts.Immunology 77,136-143.
Koller,M.R.,Bender,J.G.,Miller,W.M.,and Papoutsakis,E.T.(1993a).Expansion of primitive hμman hematopoietic progenitors in a perfusionbioreactor system with IL-3,IL-6,and stem cell factor.Bio/technology(NaturePublishing Company)11,358-363.
Koller,M.R.,Emerson,S.G.,and Palsson,B.O.(1993b).Large-scaleexpansion of hμman stem and progenitor cells from bone marrow mononuclearcells in continuous perfusion cultures.Blood 82,378-384.
Kμmar,S.,and Geiger,H.(2017).HSC Niche Biology and HSC Expansion ExVivo.Trends in Molecular Medicine 23,799-819.
Levee,M.G.,Lee,G.M.,Paek,S.H.,and Palsson,B.O.(1994).Microencapsulated hμman bone marrow cultures:a potential culture system forthe clonal outgrowth of hematopoietic progenitor cells.Biotechnology andbioengineering 43,734-739.
Levi-Schaffer,F.,Austen,K.F.,Caulfield,J.P.,Hein,A.,Gravallese,P.M.,and Stevens,R.L.(1987).Co-culture of hμman lung-derived mast cells with mouse3T3 fibroblasts:morphology and IgE-mediated release of histamine,prostaglandin D2,and leukotrienes.Journal of immunology(Baltimore,Md:1950)139,494-500.
Liu,N.,Zang,R.,Yang,S.-T.,and Li,Y.(2014).Stem cell engineering inbioreactors for large-scale bioprocessing.Engineering in Life Sciences 14,4-15.
Lorenz,E.,Uphoff,D.,Reid,T.R.,and Shelton,E.(1951).Modification ofirradiation injury in mice and guinea pigs by bone marrow injections.Journalof the National Cancer Institute 12,197-201.
Lui,W.C.,Chan,Y.F.,Chan,L.C.,and Ng,R.K.(2014).Cytokine combinationson the potential for ex vivo expansion of murine hematopoietic stemcells.Cytokine 68,127-132.
Meissner,P.,Schroder,B.,Herfurth,C.,and Biselli,M.(1999).Developmentof a fixed bed bioreactor for the expansion of hμman hematopoietic progenitorcells.Cytotechnology 30,227-234.
Merten,O.,Charrier,S.,Laroudie,N.,et al.(2010).Large-ScaleManufacture and Characterization of a Lentiviral Vector Produced for ClinicalExx Vivo Gene Therapy Application.Hμman Gene Therapy,22(3),343-356.
Merten,O.,Hebben,M.,&Bovolenta,C.(2016).Production of lentiviralvectors.Molecular Therapy-Methods&Clinical Development,3,16017.
Milone,M.and O’Doherty,U.(2018).Clincal use of lentiviralvectors.Leukemia,32,1529-1541.
Mukherjee,S and Thrasher,AJ(2013).Gene therapy for PIDs:progress,pitfalls and prospects.Gene,525:174–181.
Obi,S.,Yamamoto,K.,and Ando,J.(2014).Effects of Shear Stress onEndothelial Progenitor Cells.Journal of Biomedical Nanotechnology 10,2586-2597.
Palsson,B.O.,Paek,S.H.,Schwartz,R.M.,Palsson,M.,Lee,G.M.,Silver,S.,and Emerson,S.G.(1993).Expansion of hμman bone marrow progenitor cells in ahigh cell density continuous perfusion system.Bio/technology(NaturePublishing Company)11,368-372.
Pan,X.,Sun,Q.,Zhang,Y.,Cai,H.,Gao,Y.,Shen,Y.,and Zhang,W.(2017).Biomimetic Macroporous PCL Scaffolds for Ex Vivo Expansion of Cord Blood-Derived CD34+Cells with Feeder Cells Support.Macromolecular Bioscience 17,1700054-n/a.
Peris,P.,Roforth,M.M.,Nicks,K.M.,Fraser,D.,Fujita,K.,Jilka,R.L.,Khosla,S.,and McGregor,U.(2015).Ability of Circulating Hμman HematopoieticLineage Negative Cells to Support Hematopoiesis.Journal of cellularbiochemistry 116,58-66.
Perucca,S.,Di Palma,A.,Piccaluga,P.P.,Gemelli,C.,Zoratti,E.,Bassi,G.,Giacopuzzi,E.,Lojacono,A.,Borsani,G.,Tagliafico,E.,et al.(2017).Mesenchymalstromal cells(MSCs)induce ex vivo proliferation and erythroid commitment ofcord blood haematopoietic stem cells(CB-CD34+cells).PLOS ONE 12,e0172430.
Porter,D.L.,Levine,B.L.,Kalos,M.,Bagg,A.and June,C.H.(2011).Chimericantigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.N.Engl.J.Med.,365,725–733.
Roberts,R.A.,Spooncer,E.,Parkinson,E.K.,Lord,B.I.,Allen,T.D.,andDexter,T.M.(1987).Metabolically inactive 3T3 cells can substitute for marrowstromal cells to promote the proliferation and development of multipotenthaemopoietic stem cells.Journal of cellular physiology 132,203-214.
Rogers,G.L.and Herzog,R.W.(2015).Gene therapy forhemophilia.Front.Biosci.(Landmark Ed).,20,556–603.
Sandstrom,C.E.,Bender,J.G.,Miller,W.M.,and Papoutsakis,E.T.(1996).Development of novel perfusion chamber to retain nonadherent cells and itsuse for comparison of hμman"mobilized"peripheral blood mononuclear cellcultures with and without irradiated bone marrow stroma.Biotechnology andbioengineering 50,493-504.
Sardonini,C.A.,and Wu,Y.-J.(1993).Expansion and Differentiation of Hμman Hematopoietic Cells from Static Cultures through Small-ScaleBioreactors.Biotechnology Progress 9,131-137.
Schmelzer,E.,Finoli,A.,Nettleship,I.,and Gerlach,J.C.(2015).Long-termthree-dimensional perfusion culture of hμman adult bone marrow mononuclearcells in bioreactors.Biotechnology and bioengineering 112,801-810.
Sheu,J.,Beltzer,J.,Fury,B.,Wilczek,K.,Tobin,S.,Falconer,D.,Nolta,J.,Bauer,G.(2015).Large-scale production of lentiviral vector in a closed systemhollow fiber bioreactor.Molecular Therapy-Methods and Clinical Development,2,15020.
Shpall,E.J.,Quinones,R.,Giller,R.,Zeng,C.,Baron,A.E.,Jones,R.B.,Bearman,S.I.,Nieto,Y.,Freed,B.,Madinger,N.,et al.Transplantation of ex vivoexpanded cord blood.Biology of Blood and Marrow Transplantation 8,368-376.
Wagner,John E.,Brunstein,Claudio G.,Boitano,Anthony E.,DeFor,Todd E.,McKenna,D.,Sμmstad,D.,Blazar,Bruce R.,Tolar,J.,Le,C.,Jones,J.,et al.(2016).Phase I/II Trial of StemRegenin-1ExpandedΜmbilical Cord Blood HematopoieticStem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.Cell Stem Cell 18,144-155.
Wang,T.Y.,Brennan,J.K.,and Wu,J.H.(1995).Multilineal hematopoiesis ina three-dimensional murine long-term bone marrow culture.Exp Hematol 23,26-32.
Xue,C.,Kwek,K.Y.C.,Chan,J.K.Y.,Chen,Q.,and Lim,M.(2014).The hollowfiber bioreactor as a stroma-supported,serμm-free ex vivo expansion platformfor hμmanμmbilical cord blood cells.Biotechnology Journal 9,980-989.
Zandstra,P.W.,Eaves,C.J.,and Piret,J.M.(1994).Expansion ofhematopoietic progenitor cell populations in stirred suspension bioreactorsof normal hμman bone marrow cells.Bio/technology(Nature Publishing Company)12,909-914.
Zhang,C.C.,Kaba,M.,Ge,G.,Xie,K.,Tong,W.,Hug,C.,and Lodish,H.F.(2006).Angiopoietin-like proteins stimulate ex vivo expansion of hematopoietic stemcells.Nature medicine 12,240-245.
本文引用的所有专利、公开申请和参考文献的教导通过引用全部并入。
尽管已经具体示出和描述了示例实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的实施方案的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
Claims (60)
1.共培养系统，其包含：
a)应答细胞群；
b)刺激细胞群，所述应答细胞群和刺激细胞群被置于容器内；
c)屏障，其被设置为将所述应答细胞群与所述刺激细胞群物理分隔开，所述屏障对所述刺激细胞群的分泌因子是可渗透的；和
d)射流驱动器，其被设置为引导液体悬浮液流经所述容器，所述液体悬浮液包含所述应答和刺激细胞群中的至少一种。
2.权利要求1所述的系统，其中所述屏障为半透膜。
3.权利要求1所述的系统，其中所述屏障为凝胶。
4.权利要求3所述的系统，其中所述应答和刺激细胞群中的至少一种被置于凝胶中。
5.权利要求3所述的系统，其中所述凝胶为水凝胶。
6.权利要求1所述的系统，其中所述屏障为胶囊，且所述应答和刺激细胞群之一被置于所述胶囊内。
7.权利要求1所述的系统，其中所述屏障包含中空纤维膜。
8.权利要求7所述的系统，其中所述应答和刺激细胞群之一被置于所述中空纤维膜的腔内空间内。
9.权利要求7所述的系统，其中所述刺激细胞群以约1个-约1,000,000个的细胞/cm2的密度置于所述中空纤维膜的腔外空间内。
10.权利要求1-9中任一项所述的系统，其中所述射流驱动器被设置为引导所述液体悬浮液的非连续流。
11.权利要求1-10中任一项所述的系统，其中所述射流驱动器被设置为引导所述液体悬浮液的脉冲流。
12.权利要求11所述的系统，其中所述脉冲流的持续时间为至少约10秒。
13.权利要求11所述的系统，其中所述脉冲流的持续时间为约10秒到约5分钟。
14.权利要求11-13中任一项所述的系统，其中所述脉冲流以至少约2小时的频率施加。
15.权利要求11-13中任一项所述的系统，其中所述脉冲流以约2小时-约24小时的频率施加。
16.权利要求1-15中任一项所述的系统，其中所述应答细胞在约0.1％-约21％的氧分压中保存。
17.权利要求1-16中任一项所述的系统，其中所述屏障的截留分子量(MWCO)为约30kDA-约100,000kDA。
18.权利要求17所述的系统，其中所述屏障的截留分子量(MWCO)为约5000kDA。
19.权利要求1-18中任一项所述的系统，其中所述屏障的孔径为约0.00001μm-约0.65μm。
20.权利要求19所述的系统，其中所述屏障的孔径为约0.5μm。
21.权利要求1-20中任一项所述的系统，其中所述刺激细胞选自下组：基质细胞、病毒包装细胞、抗原暴露细胞、年轻血细胞、微生物细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、癌细胞和神经元。
22.权利要求1-21中任一项所述的系统，其中所述刺激细胞被置于组织内。
23.权利要求1-22中任一项所述的系统，其中所述应答细胞选自下组：外周血细胞、单核细胞、免疫细胞、骨髓细胞、血小板和红细胞。
24.权利要求23所述的系统，其中所述应答细胞为白细胞。
25.权利要求23所述的系统，其中所述应答细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
26.权利要求1-25中任一项所述的系统，其中所述分泌因子为核酸分子。
27.权利要求26所述的系统，其中所述核酸分子选自下组：mRNA、微小RNA、环状RNA和DNA。
28.权利要求1-25中任一项所述的系统，其中所述分泌因子选自下组：生长因子、趋化因子和细胞因子。
29.权利要求1-23中任一项所述的系统，其中所述刺激细胞为间充质干细胞且所述应答细胞为T细胞。
30.权利要求1-29中任一项所述的系统，其中所述分泌因子包括在外泌体中。
31.权利要求30所述的系统，其中所述外泌体被所述应答细胞内吞。
32.权利要求1-31中任一项所述的系统，其中所述应答细胞群被暴露于所述刺激细胞群的分泌因子中至少1小时。
33.权利要求1-31中任一项所述的系统，其中所述应答细胞群被暴露于所述刺激细胞群的分泌因子中约1小时-约21天。
34.修饰细胞的方法，其包括：
将应答细胞群暴露于刺激细胞群的分泌因子，所述应答和刺激细胞群被置于容器内，且所述分泌因子散布在分隔所述应答和刺激细胞群的屏障中；及
在所述容器中引导细胞培养基流，所述细胞培养基包含所述应答和刺激细胞群中的至少一种，其中所述应答细胞群在暴露于所述分泌因子后被修饰，从而产生修饰的细胞。
35.权利要求34所述的方法，其中所述暴露发生至少1小时。
36.权利要求34所述的方法，其中所述暴露发生约1小时-约21天。
37.权利要求34所述的方法，其中所述暴露发生约40小时-约100小时。
38.权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述引导细胞培养基流非连续地发生。
39.权利要求38所述的方法，其中所述细胞培养基流是脉冲的。
40.权利要求39所述的方法，其中所述脉冲的持续时间为至少约10秒。
41.权利要求39所述的方法，其中所述脉冲的持续时间为约10秒-约5分钟。
42.权利要求39所述的方法，其还包括将所述应答和刺激细胞群在基本上静置的条件下保存至少约2小时后施加脉冲。
43.权利要求39所述的方法，其还包括将所述应答和刺激细胞群在基本上静置的条件下保存约2小时-约24小时后施加脉冲。
44.权利要求34-43中任一项所述的方法，其还包括将所述应答和刺激细胞群中的至少一种置于中空纤维膜的腔内空间中。
45.权利要求34-44中任一项所述的方法，其还包括以约1个-约1,000,000个的细胞/cm2的密度将所述刺激细胞群置于中空纤维膜的腔外空间中。
46.权利要求34-45中任一项所述的方法，其还包括将所述应答细胞群保存在约0.1％-约21％的氧分压中。
47.组合物，其包含：
重编程细胞群，所述重编程细胞：
a)包括源自不同细胞群的生物分子，
b)与所述重编程细胞的亲本细胞群相比，表现出一种或多种额外的或修饰的功能活性，或
c)其组合。
48.权利要求47所述的组合物，其中所述重编程细胞表达不由所述亲本细胞群表达的细胞表面标志物。
49.权利要求47或48所述的组合物，其中所述重编程细胞包含含有基质细胞核酸的免疫细胞。
50.权利要求47或48所述的组合物，其中所述重编程细胞包含含有基质细胞核酸的造血干细胞。
51.权利要求47或48所述的组合物，其中所述重编程细胞包含白细胞。
52.权利要求47或48所述的组合物，其中所述重编程细胞具有修饰的T细胞体外增殖活性。
53.一种方法，其包括向需要其的患者施用权利要求47-52中任一项所述的组合物。
54.权利要求53所述的方法，其中所述患者具有表2列出的适应症。
55.权利要求53所述的方法，其中所述患者具有自身免疫疾病。
56.权利要求53所述的方法，其中所述患者接受过移植。
57.权利要求53所述的方法，其中所述患者具有炎症疾病。
58.权利要求53-57中任一项所述的方法，其中所述组合物经静脉施用递送。
59.权利要求53-57中任一项所述的方法，其中所述组合物经局部施用递送。
60.权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述组合物包含约500万-约10亿个重编程细胞的剂量。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862616930P | 2018-01-12 | 2018-01-12 | |
| US62/616,930 | 2018-01-12 | ||
| PCT/US2019/013367 WO2019140315A2 (en) | 2018-01-12 | 2019-01-11 | Cell reprogramming therapy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111787929A true CN111787929A (zh) | 2020-10-16 |
Family
ID=67218775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980016156.XA Pending CN111787929A (zh) | 2018-01-12 | 2019-01-11 | 细胞重编程疗法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210163872A1 (zh) |
| EP (1) | EP3737392A4 (zh) |
| JP (1) | JP2021510510A (zh) |
| KR (1) | KR20200108316A (zh) |
| CN (1) | CN111787929A (zh) |
| AU (1) | AU2019206643A1 (zh) |
| WO (1) | WO2019140315A2 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111979186B (zh) * | 2020-08-21 | 2022-04-08 | 遵义医科大学附属医院 | 一种快速高效体外扩增人间充质干细胞的方法及应用 |
| CN116515995B (zh) * | 2023-06-29 | 2023-09-19 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种检测噬血细胞性淋巴组织细胞增生症的血清microRNA标志物及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030211603A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-11-13 | Earp David J. | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells |
| US20080217245A1 (en) * | 2001-11-16 | 2008-09-11 | National Quality Care, Inc. | Enhanced clearance in an artificial kidney incorporating a pulsatile pump |
| US20110190680A1 (en) * | 2008-09-29 | 2011-08-04 | Yoram Vodovotz | Self-Regulating Device for Modulating Inflammation |
| US20120003736A1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-01-05 | Regenerative Research Foundation | Methods for culturing undifferentiated cells using sustained release compositions |
| WO2017003546A2 (en) * | 2015-04-24 | 2017-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Devices for simulating a function of a tissue and methods of use and manufacturing thereof |
| CN106659742A (zh) * | 2014-08-18 | 2017-05-10 | 埃普塞斯有限责任两合公司 | 表达免疫应答刺激细胞因子以吸引和/或激活免疫细胞的基因修饰间充质干细胞 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9575055B2 (en) * | 2009-06-18 | 2017-02-21 | Kiyatec Inc. | Co-culture bioreactor system |
| KR102351944B1 (ko) * | 2011-02-28 | 2022-01-18 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 세포 배양 시스템 |
| KR101955053B1 (ko) * | 2011-06-06 | 2019-03-06 | 리제네시스 비브이비에이 | 중공 섬유 생물 반응기에서의 줄기 세포의 확장 |
| WO2014145753A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Kiyatec Inc. | Bioreactor system |
| EP3083940A4 (en) * | 2013-12-20 | 2017-08-23 | President and Fellows of Harvard College | Low shear microfluidic devices and methods of use and manufacturing thereof |
| CA3225255A1 (en) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | EMULATE, Inc. | Methods of determining tumor marker expression in human tumor cells |
-
2019
- 2019-01-11 WO PCT/US2019/013367 patent/WO2019140315A2/en unknown
- 2019-01-11 AU AU2019206643A patent/AU2019206643A1/en not_active Abandoned
- 2019-01-11 CN CN201980016156.XA patent/CN111787929A/zh active Pending
- 2019-01-11 US US16/961,098 patent/US20210163872A1/en not_active Abandoned
- 2019-01-11 JP JP2020538562A patent/JP2021510510A/ja active Pending
- 2019-01-11 EP EP19738887.9A patent/EP3737392A4/en not_active Withdrawn
- 2019-01-11 KR KR1020207022885A patent/KR20200108316A/ko unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030211603A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-11-13 | Earp David J. | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells |
| US20080217245A1 (en) * | 2001-11-16 | 2008-09-11 | National Quality Care, Inc. | Enhanced clearance in an artificial kidney incorporating a pulsatile pump |
| US20110190680A1 (en) * | 2008-09-29 | 2011-08-04 | Yoram Vodovotz | Self-Regulating Device for Modulating Inflammation |
| US20120003736A1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-01-05 | Regenerative Research Foundation | Methods for culturing undifferentiated cells using sustained release compositions |
| CN106659742A (zh) * | 2014-08-18 | 2017-05-10 | 埃普塞斯有限责任两合公司 | 表达免疫应答刺激细胞因子以吸引和/或激活免疫细胞的基因修饰间充质干细胞 |
| WO2017003546A2 (en) * | 2015-04-24 | 2017-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Devices for simulating a function of a tissue and methods of use and manufacturing thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019140315A3 (en) | 2019-09-26 |
| JP2021510510A (ja) | 2021-04-30 |
| AU2019206643A1 (en) | 2020-07-23 |
| EP3737392A4 (en) | 2021-11-10 |
| WO2019140315A2 (en) | 2019-07-18 |
| US20210163872A1 (en) | 2021-06-03 |
| EP3737392A2 (en) | 2020-11-18 |
| KR20200108316A (ko) | 2020-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Hematopoietic stem cell repopulating ability can be maintained in vitro by some primary endothelial cells | |
| JP6661544B2 (ja) | 遺伝子改変したｔ細胞の自動生成法 | |
| KR100271284B1 (ko) | 사람의 스템 세포 및/또는 조혈세포를 유지하고 증식시키는 방법, 조성 및 장치 | |
| KR101881520B1 (ko) | Ｎｋ 세포의 증식 | |
| JP6182135B2 (ja) | 中空繊維バイオリアクター中での幹細胞の増幅 | |
| KR100225307B1 (ko) | 사람 간세포-함유 조성물의 배양방법 및 형질전환 방법 | |
| US8278101B2 (en) | Stem cell bioprocessing and cell expansion | |
| EP1625212B1 (en) | Artificial immune organ | |
| CA2646185A1 (en) | Method and bioreactor for generating ex vivo tissue matrix | |
| JP2006525013A (ja) | 血液幹細胞の数の増幅のための装置および方法 | |
| US20230293582A1 (en) | Methods and systems for t cell expansion | |
| Baudequin et al. | Objectives, benefits and challenges of bioreactor systems for the clinical-scale expansion of T lymphocyte cells | |
| Scibona et al. | Expansion processes for cell-based therapies | |
| US7179643B2 (en) | Device and a process for expansion of haemopoeitic stem cells for therapeutic use | |
| CN111787929A (zh) | 细胞重编程疗法 | |
| US20240200009A1 (en) | System and methods for immune cells expansion and activation in large scale | |
| CA2066645A1 (en) | Method for the production of in vitro expanded lymphoid cells for use in adoptive immunotherapy | |
| CN106267425A (zh) | Aids免疫吸附治疗仪 | |
| CN106178163B (zh) | 艾滋病生物细胞免疫治疗仪 | |
| WO2023072813A1 (en) | Methods for expanding natural killer cells (nk cells) | |
| Khong et al. | Stromalized microreactor supports murine hematopoietic progenitor enrichment | |
| CN106267415B (zh) | 艾滋病净化治疗仪 | |
| US20230193201A1 (en) | Methods for producing immune cell cultures | |
| EP1499707A2 (en) | Enhancement of hematopoietic stem cell survival | |
| Mackowski | Fetal liver hematopoiesis: characterization of the hematopoietic stromal compartment that sustains stem cell expansion |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20201016 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |