CN111770758A

CN111770758A - 用于治疗Angelman综合征的方法和组合物

Info

Publication number: CN111770758A
Application number: CN201980015559.2A
Authority: CN
Inventors: M·J·泽尔卡; J·M·沃尔特; G·弗拉戈拉; J·M·西蒙; H·毛
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2020-10-13
Also published as: US20210054370A1; EP3758714A1; CA3091912A1; WO2019168950A1; JP2021513866A; EP3758714A4

Abstract

本发明涉及用于治疗Angelman综合征的方法和组合物，其包括向受试者施用有效量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关的核酸内切酶以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A‑ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。

Description

用于治疗Angelman综合征的方法和组合物

优先权声明

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年2月27日提交的美国临时申请序列号62/635,815的利益，所述美国临时申请的全部内容引入本文作为参考。

政府支持的声明

本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号ES024088的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及用于治疗Angelman综合征的方法和组合物。

关于电子提交序列表的声明

替代纸质副本提供了以ASCII文本格式的序列表，其根据37C.F.R.§1.821提交，名称为5470-839WO_ST25.txt，大小为577,227字节，于2019年2月27日生成并经由EFS-Web提交。该序列表就其公开内容在此引入本说明书作为参考。

发明背景

Angelman综合征(AS)是由UBE3A的母系等位基因的缺失或突变引起的严重神经发育障碍。UBE3A在身体的几乎所有细胞中双等位基因表达，除了成熟神经元之外，其中父系等位基因由称为UBE3A-ATS的超长非编码RNA沉默。按照这种生物学，治疗与AS相关的神经和行为功能障碍的最直接方法是使完整的父系UBE3A等位基因不沉默。CRISPR/Cas9技术可以用于永久修饰哺乳动物基因组的特定区域，例如当使用活性Cas9时。CRISPR/Cas9技术也可以用于阻遏在哺乳动物基因组的特定区域处的转录，例如当无效的Cas9单独使用或与阻遏物结构域融合时。

本发明通过提供用于治疗神经发育障碍例如Angelman综合征的方法和组合物，克服了本领域中的先前缺点。

发明概述

在一个方面，本发明提供了使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向受试者施用有效量的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶(其是催化活性或无活性的/无效的)以及一种或多于一种引导RNA(gRNA)分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。

在一个进一步方面，本发明提供了治疗有此需要的受试者中的Angelman综合征(AS)的方法，其包括向受试者施用有效量的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶(其是催化活性或无活性的/无效的)以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。

附图简述

图1.使完整的父系UBE3A等位基因不沉默的分子途径。

图2A-B.(2A)Ube3a-ATS经由转录干扰/碰撞机制阻断了神经元中的父系Ube3a。(2B)边界元件截断了非神经元细胞中的Ube3a-ATS。X＝甲基化/印迹区域。

图3A-D.(3A)在gRNA文库中gRNA相对于基因和调控元件的位置。(3B)基因注释。(3C)来自皮层神经元的Ribozero RNA-seq。(3D)调控元件标记。

图4.SpCas9和jw33gRNA上调父系Ube3a，同时它还下调Snord115和Ube3a-ATS，而不影响附近的其它基因。(小图A)来自野生型小鼠神经元的总RNA的RT-qPCR，所述小鼠神经元用携带SpCas9和靶向小鼠Snord115或人SNORD115(阴性对照，对虚线标准化)的gRNA的慢病毒进行转导。(小图B)用与小图A中相同的病毒转导的Ube3a^WT/YFP神经元。RT-qPCR使用选择性地查询母系等位基因(WTUbe3a)或父系等位基因(Ube3a:YFP)的表达的引物。父系(黑色)和母系(灰色)等位基因。

图5.活性SpCas9、无效的(d)SpCas9、与KRAB阻遏物结构域融合的dSpCas9、活性SaCas9和dSaCas9都可以使培养的小鼠神经元中的父系Ube3a不沉默。Cas9质粒和gRNA连同tdTomato一起转染到Ube3a^m+/patYFP神经元培养物内。Scr.＝乱序gRNA；jw33gRNA；Sajw33gRNA。YFP和tdTomato之间的共定位百分比使用高内涵成像进行定量。N＝4。*P<0.0005。

图6.UBE3A-ATS中的单核苷酸多态性(SNP)在人神经元中显示强等位基因偏倚。父系(黑色)和母系(灰色)等位基因。

图7.UBE3A中的SNP在人神经元中显示强等位基因偏倚。在8周神经元分化后，在原代人神经祖细胞(phNPC)和phNPC衍生的神经元中，使用链特异性RNA-seq鉴定了UBE3A的读码框中的单核苷酸多态性。父系(黑色)和母系(灰色)等位基因。

图8.(小图A)数据显示了SpCas9和hsajw33的慢病毒递送使由phNPC分化的人神经元中的父系UBE3A不沉默。乱序gRNA阴性对照并未使父系UBE3A不沉默。对UBE3A(Chr15:25,371,697；rs530054948)的外显子5中的A/TSNP特异性的TaqMan基因分型探针，用于定量每个等位基因之间的表达差异。Cas9-：未用Cas9转导的神经元。Cas9+：用Cas9转导的神经元。(小图B)在phNPC衍生的神经元中，在SpCas9和hsajw33的慢病毒递送后，在引导RNA靶位点附近的基因表达。虚线标记了相对于乱序gRNA(阴性)对照的表达值。

图9.SaCas9和Sajw33gRNA的子宫内电穿孔使小鼠脑中的父系Ube3a不沉默。E15.5patUbe3a:YFP胚胎用AAV-hSyn1::SaCas9-Sajw33和pCAGG-mCherry质粒进行子宫内电穿孔。在P30时，小鼠脑对于mCherry(小图A)和父系UBE3A-YFP(小图B)进行共标记。

图10.含有SaCas9和Sajw33gRNA的AAV2基因治疗载体使小鼠脑中的父系Ube3a不沉默。(小图A)E16.5patUbe3a:YFP胚胎用AAV2-hSyn1-SaCas9-Sajw33进行脑室内注射。在P30时，解剖小鼠脑并用针对YFP的抗体染色。(小图B-C)放大显示了神经元中patUBE3A:YFP的增加表达。注意到一致的最大表达水平和占优势的核定位，指示来自父系Ube3a启动子的正确表达和正确的同种型使用。

图11.当在胚胎日15.5进行脑室内注射时，含有SaCas9和Sajw33gRNA的AAV9基因治疗载体使小鼠脑中的父系Ube3a不沉默。(小图A)E15.5patUbe3a:YFP胚胎用AAV9-hSyn1-SaCas9-Sajw33进行子宫内注射。在P30时，解剖小鼠脑并用针对YFP的抗体染色。(小图B)放大显示了海马神经元中patUBE3A:YFP的增加表达。(小图C-D)放大显示了大脑皮层神经元中patUBE3A:YFP的增加表达。注意到一致的最大表达水平和占优势的核定位，其指示来自父系Ube3a启动子的正确表达和正确的同种型使用。这种载体实现了跨越脑范围的UBE3A不沉默。

图12.当在出生后第1天进行脑室内注射时，含有SaCas9和Sajw33gRNA的AAV9基因治疗载体使小鼠脑中的父系Ube3a不沉默。(小图A)出生后第1天(P1)patUbe3a:YFP小鼠用AAV9-hSyn1-SaCas9-Sajw33进行注射。在P30时，解剖小鼠脑并用针对YFP的抗体染色。(小图B)放大显示了海马神经元中patUBE3A:YFP的增加表达。(小图C-D)放大显示了大脑皮层神经元中patUBE3A:YFP的增加表达。

图13.当在出生后第1天进行脑室内注射时，含有SaCas9和Sajw33gRNA的AAV9基因治疗载体使Angelman综合征模型小鼠(Ube3a^m-/p+)中的父系Ube3a不沉默。(小图A)出生后第1天(P1)Ube3a^m-/p+小鼠通过脑室内注射用AAV9-hSyn1-SaCas9-Sajw33gRNA进行治疗。在P30时，对治疗的小鼠进行灌注，并且解剖脑并对于UBE3A蛋白进行染色。(小图B)放大显示了海马神经元中patUBE3A的增加表达。(小图C-D)放大显示了大脑皮层神经元中patUBE3A的增加表达。

图14.含有SaCas9和Sajw33gRNA的AAV9基因治疗载体拯救Angelman综合征模型小鼠(Ube3a^m-/p+)中的后肢扣紧表型。(小图A)后肢扣紧表型在0(无表型)、1(轻度)、2(重度)的量表上进行评分。(小图B)WT和Ube3a^m-/p+Angelman综合征模型小鼠在P1时用AAV9:SaCas9+Sajw33(或乱序gRNA)进行注射，在P30时进行后肢扣紧评分。N＝6-10/组。n.s.＝不显著。*P<0.05。

发明详述

本发明现在将在下文参考其中显示了本发明的优选实施方案的附图和说明书更全面地进行描述。然而，本发明可以以不同的形式体现，并且不应解释为限于本文阐述的实施方案。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。本文在本发明的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不预期是本发明的限制。

本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献就与其中提供参考的句子和/或段落有关的教导整体引入作为参考。

本发明基于以下出乎意料的发现：可以使用采用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的方案使父系UBE3A基因不沉默。因此，在一个方面，本发明提供了使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向受试者施用有效量的CRISPR相关的核酸内切酶以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。

在一个另外的方面，本发明提供了治疗有此需要的受试者中的Angelman综合征(AS)的方法，其包括向受试者施用有效量的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。

在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码针对可移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的RNA引导的适应性免疫系统。CRISPR簇含有间隔区，其为与在前的移动元件互补的序列。CRISPR簇被转录并加工为成熟的CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)RNA(crRNA)。CRISPR相关的核酸内切酶，例如Cas9，属于II型CRISPR/Cas系统，并且具有强核酸内切酶活性，以切割靶DNA。Cas9由成熟的crRNA引导，所述成熟的crRNA含有约20个碱基对(bp)的独特靶序列(称为间隔区)和反式激活的小RNA(tracrRNA)，其充当核糖核酸酶III辅助的前crRNA加工的指导。crRNA:tracrRNA双链体经由crRNA上的间隔区与靶DNA上的互补序列(称为前间隔序列)之间的互补碱基配对，将Cas9导向靶DNA。从化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)中分离的Cas9(SpCas9)识别三核苷酸(NGG)前间隔序列邻近基序(PAM)，以指定切割位点(距离PAM的第3个核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以分开表达，或可以经由合成茎环(AGAAAU)改造成人工融合的小引导RNA(sgRNA，也称为“gRNA”)，以模仿天然crRNA/tracrRNA双链体。此类sgRNA如shRNA可以合成，或在体外转录用于直接RNA转染，或者由U6或H1启动子表达，尽管人工sgRNA的切割效率低于具有分开表达的crRNA和tracrRNA的系统的切割效率。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了组合物，其包含CRISPR相关的核酸内切酶以及一种或多种引导RNA分子，所述引导RNA分子与UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶作为编码CRISPR相关的核酸酶的核酸分子存在于组合物中。在一些实施方案中，编码CRISPR相关的核酸内切酶和一种或多于一种引导RNA分子的核酸分子存在于单个核酸构建体中。在一些实施方案中，编码CRISPR相关的核酸内切酶的核酸分子和编码一种或多于一种引导RNA分子的核酸分子存在于两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)分开的核酸构建体上。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas核酸酶是催化活性的。在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶是Cas9或其变体，人优化的Cas9，包括SpCas9、SaCas9、St1Cas9、BlatCas9、NmCas9、FnCas9、CjCas9、xCas9、Cas9碱基编辑器，C2C2RNA引导的和/或RNA靶向核酸酶(例如，靶向UBE3A-ATS)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas核酸酶是Cpf1核酸酶和/或其变体。示例性的Cpf1变体包括但不限于AsCpf1和/或LbCpf1。示例性的CRISPR-Cas核酸酶和Cpf1核酸酶包括但不限于如Nakade等人，Bioengineered8(3):265-273(2017)中所述的CRISPR-Cas核酸酶。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas核酸酶是CasX核酸酶和/或其变体。示例性的CasX变体包括但不限于DpbCasX和/或PlmCasX(Lui等人Nature566(7743):218-223(2019))。在一些实施方案中，CRISPR-Cas核酸酶是Cas12核酸酶和/或其变体。示例性的Cas12变体包括但不限于Cas12b、Cas12c、Cas12g(Yan等人Science363(6422):88-91(2019))。

在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶是催化无活性和/或无效的。催化无活性和/或无效的示例性的CRISPR相关的核酸内切酶包括但不限于无效的SaCas9、无效的SpCas9和无效的CasX。

在一些实施方案中，将CRISPR相关的核酸内切酶融合至阻遏物结构域。在一些实施方案中，阻遏物基因是KRAB阻遏物。(Urrutia.“KRAB-containing zinc-fingerrepressor proteins”Genome Biology4(10):231(2003))。此类CRISPR相关的核酸内切酶的实例包括但不限于无效的SpCas9-KRAB和/或无效的SaCas9-KRAB(例如，与靶向UBE3A-ATS中的核苷酸序列(例如Snord115)的引导RNA(gRNA)组合)。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向受试者施用有效量的无效的CRISPR相关的核酸内切酶(例如，无效的SpCas9和/或无效的SaCas9)以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列(例如Snord115)具有互补性。在一些实施方案中，将无效的CRISPR相关的核酸内切酶融合至阻遏物结构域(例如，无效的SpCas9-KRAB和/或无效的SaCas9-KRAB)。

在一个另外的方面，本发明提供了治疗有此需要的受试者中的Angelman综合征(AS)的方法，其包括向受试者施用有效量的无效的CRISPR相关的核酸内切酶(例如，无效的SpCas9和/或无效的SaCas9)和/或与阻遏物结构域融合的无效的CRISPR相关的核酸内切酶(例如，无效的SpCas9-KRAB和/或无效的SaCas9-KRAB)以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列(例如Snord115)具有互补性。

在一些实施方案中，本发明提供了编码CRISPR相关的核酸内切酶的核酸分子，其中所述CRISPR相关的核酸内切酶是CRISPR-Cas核酸酶。在一些实施方案中，本发明提供了编码CRISPR相关的核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas核酸酶)的核酸分子、以及编码一种或多于一种引导RNA的核酸分子，所述引导RNA与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶序列互补。

本发明提供了一种或多于一种引导RNA(gRNA)分子，其包含与UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列互补的序列。gRNA分子可以与编码序列和/或非编码序列互补。在一些实施方案中，gRNA分子可以包含约1至约30个核苷酸、约5至约25个核苷酸、或约10至约20个核苷酸(包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。在一些实施方案中，gRNA分子或其一部分可以与UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列碱基配对。例如，在一些实施方案中，与靶核苷酸序列碱基配对的核苷酸的数目可以是约1至约10、或约1至约20个核苷酸(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了包含核酸酶的组合物，所述核酸酶已改造为结合如本文所述的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列。在一些实施方案中，在不存在一种或多种引导RNA分子的情况下，此类核酸酶与本发明的靶核苷酸序列直接结合。此类核酸酶的实例包括但不限于TAL核酸酶(Hockemeyer等人Nat.Biotechnol.29(8):731-734(2012)；Wood等人Science333(6040):1-8)(2011))、锌指核酸酶以及目前已知或以后鉴定的任何其它核酸酶。在一些实施方案中，UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列是由本发明的一种或多种引导RNA分子靶向的相同靶序列。TAL和锌指核酸酶可以使用本领域已知的方法，通过将对于靶序列具有序列特异性的一系列TAL或锌指DNA识别结构域融合在一起而进行改造。

在本发明的一些实施方案中，提供了使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向受试者施用有效量的转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指DNA结合结构域、和/或与受试者的细胞中UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列结合的锌指核酸酶。

在一个进一步方面，本发明提供了治疗有此需要的受试者中的Angelman综合征(AS)的方法，其包括向受试者施用有效量的转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指DNA结合结构域、和/或与受试者的细胞中UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列结合的锌指核酸酶。

在一些实施方案中，UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列包括但不限于能够减少UBE3A-ATS的表达和/或转录水平的任何核苷酸序列。在一些实施方案中，UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列包括但不限于如本文鉴定或以后鉴定的能够治疗Angelman综合征的任何核苷酸序列。此类靶核苷酸序列跨越物种可以是保守的或可以是不保守的。在其中靶核苷酸序列跨越物种不是保守的本发明的实施方案中，此类靶序列的相应转录物跨越物种是保守的(例如，参见表1-4)。在一些实施方案中，UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列在一个或多个Snord115(在人中又名HBII-52，在小鼠中又名MBII-52)、Snord115HG、SNHG14、SNRPN、Snord64、IPW、Snord116和/或Snord116HG基因中。在一些实施方案中，UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列是一个或多个Snord115基因。在一些实施方案中，UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个Snord115基因。可以通过添加数字后缀(例如Snord115-1、Snord155-2等)来区分Snord115基因。在一些实施方案中，UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列是一个或多个Snord116(在人中又名HBII-85，在小鼠中又名MBII-85)基因。

在一些实施方案中，靶核苷酸序列是人UBE3A-ATS的完整核苷酸序列(SEQ ID NO：1)、或SEQ ID NO：1的核苷酸序列的至少约十个核苷酸(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个等，包括任何数目的核苷酸直到本文未明确阐述的SEQ ID NO：1中的核苷酸总数目)的任何邻接区域。这种人序列(SEQ ID NO：1)涵盖IPW转录物的3'末端，通过所有snord115重复序列，并且紧在UBE3A的注释3'UTR之前终止。

本发明的gRNA分子可以包含与UBE3A-ATS中的任何靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述靶核苷酸序列可以是SNORD116、SNORD115和/或IPW或其任何部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是小鼠Ube3a-ATS的完整核苷酸序列(SEQ ID NO：2)、或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的至少约十个核苷酸(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个等，包括任何数目的核苷酸直到本文未明确阐述的SEQ ID NO：2中的核苷酸总数目)的任何邻接区域。这种小鼠序列(SEQ ID NO：2)涵盖IPW转录物的3'末端，通过所有snord115重复序列，并且紧在ube3a的注释3'UTR之前终止。

本发明的gRNA分子可以包含与Ube3a-ATS中的任何靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述靶核苷酸序列可以是Snord116、Snord115和/或IPW或其任何部分。

在一些实施方案中，靶核苷酸序列和/或基因的位置以Hg转录物注释(表8)的形式提供。在一些实施方案中，gRNA分子可以选自表1-5中的gRNA序列。例如，在一些实施方案中，本发明的gRNA分子可以包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90中任一个的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以存在于载体中，所述载体可以是非病毒载体或病毒载体。本发明的病毒载体的非限制性实例包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体、牛痘病毒载体、疱疹病毒载体等，如本领域中已知或以后鉴定的。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以存在于腺相关病毒(AAV)载体中，其可以是AAV2载体和/或AAV9载体或任何其它AAV血清型的病毒载体。在一些实施方案中，核酸分子可以是包含编码选自SpCas9、SaCas9、NmCas9和CjCas9的Cas9核酸内切酶的核苷酸序列的AVV9载体，并且可以进一步编码一种或多于一种gRNA分子。

在一些实施方案中，本发明的载体可以是非病毒载体(例如，质粒、脂质体或者目前已知或以后鉴定的任何其它核酸递送媒介物)。

在一些实施方案中，本发明的核酸构建体是载体，其可以包含例如位于编码Cas9的核苷酸序列上游的启动子和内含子、以及位于编码gRNA的核苷酸序列上游的单独的U6启动子。在一些实施方案中，编码Cas9的核苷酸序列上游的启动子可以是细胞类型特异性启动子，例如但不限于突触素(即，以驱动在神经元中的表达)和/或普遍存在的启动子(例如，巨细胞病毒(CMV)和/或鸡β肌动蛋白(CBA)杂合(CBh)启动子)。

在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶和一种或多于一种引导RNA可以附着或连接至包含Cas9核糖核蛋白复合物的纳米颗粒或微米颗粒。

此外，本发明的载体可以包含相对于野生型载体基因组已优化的载体基因组，例如以增强对于复制、包装和/或递送等所需的病毒顺式元件的活性，如本领域众所周知的。此类优化的载体可以包含优化的转录盒、优化的末端重复序列等，如本领域众所周知的。

在一些实施方案中，一种或多于一种引导RNA(gRNA)分子与UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列的互补性可以不同，但通常为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，可以耐受单个碱基对的错配，尽管靶向效率可能降低。

在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶可以具有与野生型序列等同的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，CRISPR-Cas核酸酶(例如，Cas9)的核苷酸序列可以具有与野生型化脓性链球菌序列(Deltcheva等人Nature471(7340):602-607(2011)；Mali等人Science339(6121):823-826(2013))；Cong等人Science339(6121):819-823(2013))等同的核苷酸序列。在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶可以是来自其它物种的核苷酸序列，所述其它物种包括例如其它物种，例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)或其它测序的细菌基因组和古细菌，或其它原核微生物。实例包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)(Ran等人Nature520(7456):186-191(2015)；Friedland等人Genome Biology16:257(2105))；脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)(NmCas9)(Hou等人PNAS110(39):15644-15649(2103))；空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)(CjCas9)(Kim等人Nature Comm8:1-12(2017))；进化的SpCas9(xCas9)(Hu等人Nature556(7699):57-63(2108))；氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)(AsCpf1)(Kleinstiver等人Nat.Biotechnol.34(8):869-874(2016))；毛螺菌科(Lachnospiracea)细菌(LbCpf1)(Kleinstiver等人Nat.Biotechnol.34(8):869-874(2106))；Cas12(Yan等人Science363(6422):88-91(2019))；δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)(DpbCasX)；以及浮霉菌门(Planctomycetes)(PlmCasX)(Lui等人Nature566(743):218-223(2019))。

在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶可以包括CRISPRi(例如，无效的SpCas9、无效的SpCas9-KRAB(Lui等人Science355(6320):1-19(2107)，Mandegar等人CellStem18(4):541-553(2106))；Cas9碱基编辑器(Korner等人Nature533(7603):420-424(2106))；和/或C2C2RNA引导的RNA靶向(例如靶向UBE3A-ATS(Abudayyeh等人Science353(6299):1-23(2016)，Gilbert等人Cell159(3):647-661(2014))。

可替代地，在一些实施方案中，可以修饰野生型CRISPR相关的核酸内切酶。例如，在一些实施方案中，可以修饰野生型Cas9序列(例如，化脓性链球菌Cas9序列)。核酸序列可以对于在哺乳动物细胞中的有效表达进行密码子优化，即“人源化的”。人源化的Cas9核酸酶序列可以是例如由在以下GenBank登录号下鉴定的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列：KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；KM099233.1GI:669193765；和/或LP885305.1。

在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶序列可以在商购可得的载体中提供。例如，在一些实施方案中，Cas9核酸酶序列可以包含在商购可得的载体内，例如但不限于来自Addgene(Cambridge，Mass.)的PX330、PX260、PX600或PX601。在一些实施方案中，Cas9核酸内切酶可以具有其为GenBank登录号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765的任何Cas9核酸内切酶序列的变体或片段的氨基酸序列，或者PX330、PX260、PX600或PX601(Addgene，Cambridge，Mass.)的Cas9氨基酸序列。在一些实施方案中，可以修饰CRISPR相关的核酸内切酶的核苷酸序列，以编码生物活性的变体，并且这些变体可以具有或可以包括例如通过包含一个或多个突变(例如，添加、插入、缺失和/或取代、或此类突变的任何组合)而不同于野生型的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，可以修饰Cas9核酸酶序列(例如，Cas9)，以编码Cas(例如，Cas9)的生物活性变体，并且此类变体可以具有或可以包括由于一个或多个突变(例如，添加、缺失、插入或取代或此类突变的组合)的存在而不同于野生型Cas(例如，Cas9)的氨基酸序列。一个或多个突变可以是以任何组合的保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。例如，CRISPR相关多肽如Cas多肽(例如，Cas9)的生物活性变体可以具有氨基酸序列，其与野生型CRISPR相关多肽如Cas(例如，Cas9)多肽具有至少约50％的序列同一性(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性)。保守氨基酸取代通常包括在下述组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的那些，以及非标准氨基酸(例如，具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的多肽可以包括其为标准残基的修饰形式的氨基酸残基(例如，吡咯赖氨酸可以代替赖氨酸使用，而硒代半胱氨酸可以代替半胱氨酸使用)。

在一些实施方案中，CRISPR相关的多肽(例如，Cas9)氨基酸序列中的氨基酸残基可以包括非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基是这样的，其在自然界中未发现，但符合氨基酸的基本公式并且可以掺入氨基酸序列内。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。

在一些实施方案中，Cas(例如，Cas9)核酸酶可以在保守的HNH和RuvC结构域中突变，所述结构域涉及链特异性切割。例如，RuvC催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)切口而不是切割DNA以产生单链断裂，并且通过HDR的后续优先修复可以潜在地降低来自脱靶双链断裂的不需要的插入缺失突变的频率。

在一些实施方案中，可以通过负责核酸酶活性的RuvC和HNH结构域两者的保守结构域中的突变，致使Cas(例如，Cas9)核酸酶催化无活性。例如，RuvC和HNH结构域中的D10A和H840A突变分别导致催化无活性，即无效的Cas(例如，无效的Cas9)。在一些实施方案中，将阻遏物结构域融合到无效的Cas(例如无效的Cas9)允许通过诱导异染色质化甚至进一步阻遏转录。例如，Krüppel相关盒(KRAB)结构域可以与无效的Cas(例如，无效的Cas9)融合，以阻遏靶基因的转录。

本发明的多肽的氨基酸残基之间的键可以是常规的肽键或另一种共价键(例如酯键或醚键)，并且可以通过酰胺化、磷酸化和/或糖基化来修饰多肽。修饰可以影响多肽主链和/或一个或多个侧链。化学修饰可以是在编码多肽的mRNA翻译后在体内进行的天然存在的修饰(例如细菌宿主中的糖基化)，或在体外进行的合成修饰。CRISPR相关的核酸内切酶的生物活性变体可以包括一种或多种结构修饰，其由天然存在的(即，在体内天然进行的)和/或合成的修饰(即，在体外进行的天然存在或非天然存在的修饰)的任何组合产生。修饰的实例包括但不限于酰胺化(例如，用氨基替换在C末端处的游离羧基)；生物素化(例如，赖氨酸或其它反应性氨基酸残基用生物素分子的酰化)；糖基化(例如，糖基添加至天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基，以生成糖蛋白或糖肽)；乙酰化(例如，通常在多肽的N末端处的乙酰基添加)；烷基化(例如，烷基的添加)；异戊二烯化(例如，类异戊二烯基的添加)；硫辛酸化(例如，硫辛酸酯部分的附着)；以及磷酸化(例如，磷酸酯基对丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸的添加)。

CRISPR相关的核酸内切酶多肽的生物活性变体将保留足够的生物活性，以用于本方法中。生物活性变体将保留足够的活性，以在靶向DNA切割中起作用。生物活性可以以本领域普通技术人员已知的方式进行评价，并且包括但不限于体外切割测定或功能测定。

本发明还提供了在本领域已知的药学上可接受的载剂和/或合适的稀释剂中本发明的CRISPR相关的核酸内切酶、核酸酶(例如TALE DNA结合结构域、TALEN、锌指DNA结合结构域和/或锌指核酸酶)、引导RNA分子、载体、核酸构建体、核酸分子、纳米颗粒或微米颗粒等的组合物(例如药物组合物)。此类组合物可以包含单独或以任何组合的缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、无菌盐水等等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA和/或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)和/或防腐剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在药学上可接受的载剂中的CRISPR-Cas核酸内切酶以及一种或多种gRNA分子，所述gRNA分子包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90中任一个的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在药学上可接受的载剂中的编码CRISPR-Cas核酸内切酶的核酸分子、以及编码一种或多种gRNA分子的核酸分子，所述gRNA分子包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90中任一个的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在药学上可接受的载剂中的编码TALEDNA结合结构域的核酸分子，所述TALEDNA结合结构域识别SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90中任一个的一个或多个核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在药学上可接受的载剂中的编码锌指DNA结合结构域的核酸分子，所述锌指DNA结合结构域识别SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90中任一个的一个或多个核苷酸序列。

本发明的组合物对本发明的受试者的施用可以通过几种不同途径中的任一种来完成。在具体实施方案中，组合物可以静脉内、鞘内、肌内、皮下、腹膜内、皮内、鼻内、颅内、舌下、阴道内、直肠内和/或经口施用。在一些实施方案中，本发明的组合物可以经由脑室内(即，室内)注射或递送来施用。在一些实施方案中，组合物和/或药物组合物可以作为单剂量或以多于一个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)剂量施用。待施用于受试者的本发明的组合物的剂量取决于施用模式、待递送的特定核酸等等，并且可以由本领域技术人员以常规方式确定。用于达到疗效的示例性剂量是至少约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵病毒基因组(vg)/kg，任选地约10⁸至约10¹⁴vg/kg的滴度。

本发明的核酸分子的递送或施用的非限制性实例包括以任何组合的转导、转染、电穿孔、脂质体和/或本领域已知或以后鉴定的任何其它方法。在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以作为裸核酸分子施用或递送。

在一些实施方案中，本发明的载体可以经由几种不同的途径引入受试者内，所述途径包括但不限于静脉内、鞘内和/或脑室内施用。

在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶和一种或多种引导RNA可以作为核酸分子引入受试者内，所述核酸分子可以例如在核酸构建体中，作为裸DNA，作为质粒和/或作为病毒载体存在。在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以在腺相关病毒(AAV)载体中，所述载体包含编码本发明的核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，AAV载体可以包含一种或多种改造的衣壳蛋白。示例性的衣壳蛋白包括但不限于在自然界中通常未发现的嵌合衣壳蛋白，并且进行改造以增强组织和细胞递送和/或增强转导等，如本领域已知的。在特定实施方案中，核酸分子在AAV9载体(其任选地包含改造的衣壳蛋白)中，所述AAV9载体包含编码Cas9核酸酶的核苷酸序列和/或编码一种或多种gRNA的核苷酸序列，所述Cas9核酸酶可以是例如SpCas9、SaCas9、NmCas9或CjCas9。

在一些实施方案中，本发明提供了使人受试者(例如，有此需要的受试者)中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向受试者施用有效量的与Snord115和/或Snord116关联的核酸酶、以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。在一些实施方案中，人受试者可以是胎儿、婴儿、青少年或成人。在一些实施方案中，与Snord115和/或Snord116关联的核酸酶、以及与受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性的一种或多于一种引导RNA分子，可以在出生前(即，妊娠早期、妊娠中期和/或妊娠晚期)和/或出生后(即，出生后约0至约30天)施用于婴儿。

在一些实施方案中，本发明提供了使人受试者中的父系UBE3A不沉默至少3、6、9、12或15个月，或者至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或至少15年的方法。

在一些实施方案中，本发明的方法可以使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默至少约50％、60％、70％、80％、90％或100％。

定义

如本文使用的，“a”、“an”或“the”可以意指一个或多于一个。例如，“a”细胞可以意指单个细胞或多个细胞。

另外如本文使用的，“和/或”指并且涵盖一个或多个相关的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时缺少组合。

如本文使用的，术语“约”当指可测量的值，例如剂量的量(例如，非病毒载体的量)等等时，意欲涵盖指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。

如本文使用的，过渡性短语“基本上由……组成”意指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤，“以及不会实质性影响本发明的基本和新型特征的那些材料或步骤”。参见In re Herz，537 F.2d 549，551-52，190 USPQ 461，463(CCPA1976)(原文中的重点)；还参见MPEP§2111.03。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由……组成”并不预期被解释为等价于“包含”。

如本文使用的，术语“引导RNA”或“gRNA”指包含引导序列、tracer序列和tracer配偶序列的多核苷酸序列。术语“引导序列”指引导RNA内指定靶位点的约20bp序列，并且可以与术语“引导”或“间隔区”互换使用。术语“tracer配偶序列”也可以与术语“直接重复序列”互换使用。

术语“非天然存在的”或“改造的”可互换使用，并且指示人为的牵涉。当提及核酸分子或多肽时，该术语意指该核酸分子或多肽至少基本上不含它与之在自然界中天然关联且如自然界中发现的至少一种其它组分。

“互补性”指核酸通过传统的沃森-克里克碱基配对或其它非传统类型与另一个核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比指示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补性)。“完全互补性”意指核酸序列的所有邻接残基与第二核酸序列中相同数目的邻接残基氢键合。如本文使用的，“基本上互补性”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性程度，或者指在严格条件下杂交的两个核酸。

如本文使用的，“表达”指多核苷酸通过其从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其它RNA转录物)的过程，和/或转录的mRNA随后通过其翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中的mRNA剪接。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，以指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，例如与标记组分缀合。如本文使用的，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体两者，以及氨基酸类似物和拟肽。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，以指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠科动物、猿猴、人、农场动物、运动动物和宠物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是新生儿，其中所述新生儿是不多于约28天的婴儿。

还涵盖的是在体内获得的或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。

如本文使用的，术语“核酸”指从5'至3'端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。“核酸”还可以任选地含有非天然存在的或改变的核苷酸碱基，其允许通过聚合酶的正确通读，并且不减少由该核酸编码的多肽的表达。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指作为单独的单链或以双链体形式的核酸的有义和反义链两者。术语“核糖核酸”(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、tRNA(转移RNA，无论是负荷还是卸载相应的酰化氨基酸)和cRNA(互补RNA)在内，并且术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂交体在内。

术语“核酸区段”、“核苷酸序列”或更一般地“区段”由本领域技术人员理解为功能性术语，其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、小调控RNA、操纵子序列和表达或可以适于表达蛋白质、多肽或肽的较小的改造核苷酸序列。本公开内容的核酸也可以通过本领域已知的方法完全或部分地合成。因此，可以使用由所选宿主优选的密码子来合成本密码子的全部或部分核酸。物种优选的密码子可以例如根据在特定宿主物种中表达的蛋白质中最频繁使用的密码子来确定。核苷酸序列的其它修饰可以导致具有轻微改变活性的突变体。

“载体”指用作将外来遗传材料携带到另一个细胞内的媒介物的核酸分子，在所述细胞中它可以被复制和/或表达。含有外来核酸的克隆载体被称为重组载体。载体的实例是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。重组载体通常含有复制起点、多克隆位点和可选择标记物。核酸序列通常由插入物(重组核酸或转基因)和充当载体“主链”的较大序列组成。将遗传信息转移到另一个细胞的载体的目的通常是在靶细胞中分离，增加或表达插入物。表达载体(表达构建体)用于在靶细胞中表达转基因，并且一般具有驱动转基因表达的启动子序列。载体插入靶细胞内指用于细菌和真核细胞的转化或转染，尽管病毒载体的插入经常被称为转导。

术语“调控元件”指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件。例如，启动子是促进可操作连接的编码区的转录起始的调控元件。其它调控元件是剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止信号等。

真核生物中的转录控制信号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，所述DNA序列与涉及转录的细胞蛋白质特异性相互作用。启动子和增强子元件已从各种真核来源中分离，所述真核来源包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞中的基因。启动子和增强子元件还已从病毒中分离，并且类似的控制元件例如启动子也在原核生物中发现。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达目的蛋白的细胞类型。如本领域众所周知的，某些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其它真核启动子和增强子在细胞类型的有限子集中起作用。

如本文使用的，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”指位于DNA聚合物的蛋白质编码区的5'端(即，在其之前)的DNA序列。自然界中已知的大多数启动子的位置在转录的区域之前。启动子充当开关，激活基因的表达。如果该基因被激活，则认为它被转录或参与转录。转录涉及从基因合成mRNA。因此，启动子充当转录调控元件，并且还提供了用于起始基因转录成mRNA的位点。如应用于启动子的术语“细胞类型特异性的”指，在相同组织内的不同类型细胞中相同的目的核苷酸序列的表达的相对缺乏下，能够在特异性类型的细胞中指导目的核苷酸序列的选择性表达的启动子。启动子可以是组成型或调节型的。

当提及启动子时，术语“组成型”意指该启动子能够在不存在刺激(例如热激、化学品、光等)的情况下，指导可操作连接的核酸序列的转录。通常，组成型启动子能够指导转基因在基本上任何细胞和任何组织中的表达。相比之下，“调节型”或“诱导型”启动子是能够在刺激(例如热激、化学品、光等)的存在下，指导可操作连接的核酸序列的转录水平的启动子，所述转录水平不同于在不存在刺激的情况下可操作连接的核酸序列的转录水平。

“序列同一性”指两种或更多种核酸或蛋白质之间的相关性的量度，并且通常作为关于总比较长度的百分比给出。同一性计算考虑了在其各自较大的序列中等同且在相同的相对位置中的那些核苷酸或氨基酸残基。

同一性的计算可以通过计算机程序中包含的算法使用缺省参数来执行，所述计算机程序例如"GAP"(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)和"ALIGN"(DNAStar，Madison，Wis.)。在某些实施方案中，序列“同一性”指在两个比对序列之间的序列比对中确切匹配的残基数目(表示为百分比)。在某些实施方案中，可以使用等同位置的数目除以最短序列或排除突出端的等价位置数目中的较大者来计算比对的同一性百分比，其中内部缺口被视为等价位置。例如，多肽GGGGGG和GGGGT具有5个中的4个或80％的序列同一性。例如，多肽GGGPPP和GGGAPPP具有7个中的6个或85％的序列同一性。在某些实施方案中，对于任何考虑的序列同一性百分比，还考虑该序列可以具有相同百分比的序列相似性。

“相似性”百分比用于定量两个比对序列之间的氨基酸的相似性程度，例如疏水性、氢键合电势、静电电荷。这种方法类似于确定同一性，不同之处在于某些氨基酸不必相同以具有匹配。在某些实施方案中，可以用众所周知的计算机程序使用缺省参数来计算序列相似性。通常，如果氨基酸在具有相似特性的组中，例如根据下述氨基酸组，则它们被分类为匹配：芳香族-F Y W。

如本文使用的，“有效量”指本发明的群体或组合物或制剂的量，其足以产生所需效应，所述效应可以是疗效。有效量将随着年龄、受试者的一般状况、待治疗病况的严重性、所施用的特定试剂、治疗的持续时间、任何同时治疗的性质、所使用的药学上可接受的载剂、以及在本领域技术人员的知识和技能内的类似因素而变。适当时，任何个别情况下的“有效量”可以由本领域普通技术人员，通过参考相关的科教书和文献和/或通过使用常规实验来确定。(参见例如，Remington，The Science And Practice of Pharmacy(2000年第20版))。

“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指任何类型的动作，其对患有病症、疾病或病的受试者赋予调节效应，所述调节效应例如可以是有益效应，包括受试者的病况(例如，一种或多种症状)的改善，病况进展的延迟或减少，病症、疾病或病的发作延迟，和/或病症、疾病或病的任何临床参数的改变等，如本领域众所周知的。

“药学上可接受的”意指并非生物学上或在其它方面不期望的材料，即，该材料可以连同所选择的颗粒和/或其群体一起施用于受试者，而不引起基本的有害生物效应、或以有害方式与包含它的组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载剂适合于施用或递送至人和本发明的其它受试者。如本领域技术人员众所周知的，载剂自然地选择为使活性成分的任何降解降到最低，并且使受试者中的任何不良副作用降到最低(参见例如，Remington's Pharmaceutical Science；最新版本)。药物制剂，例如本发明的疫苗或其它免疫原性组合物，可以包含与药学上可接受的载剂组合的免疫原性量的本发明的甲病毒颗粒。示例性的药学上可接受的载剂包括但不限于灭菌无热原水和灭菌无热原生理盐水溶液。

现在将在下文参考所附实施例更全面地描述本主题，在所述实施例中显示了了本文公开的主题的代表性实施方案。然而，本文公开的主题可以以不同的形式体现，并且不应被解释为限制于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容将是彻底和完整的，并且向本领域技术人员充分传达本文公开的主题的范围。

实施例

下述实施例提供了说明性实施方案。下述实施例的某些方面按照由本发明人发现或考虑的在实施方案的实践中良好工作的技术和程序公开。鉴于本公开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员将了解，下述实施例预期仅是示例性的，并且可以采用众多改变、修改和变更，而不脱离本文请求保护的主题的范围。

实施例1：用于Angelman综合征的基于CRISPR/Cas9的基因疗法

Angelman综合征(AS)是严重神经发育障碍，对于其目前不存在有效的治疗或治愈。AS的特征在于发育迟缓、严重的智力残疾、缺乏言语、令人衰弱的癫痫发作、以及运动和平衡问题。由于表型重叠，AS分类为自闭症谱系障碍。由于1:15000的患病率以及跨越整个生命周期的不断照护的需要，家庭负担和医疗保健费用是巨大的。存在显著的生物医学需求，以开发治疗与这种小儿发作性遗传病症有关的一些或全部症状的疗法。

在大多数情况下，AS由母系遗传的UBE3A等位基因的缺失或突变引起。UBE3A在除了成熟神经元之外的身体的几乎所有细胞中双等位基因表达(图2A-2B)。在神经元中，UBE3A仅由母系遗传的等位基因表达。这种生物学解释了为何母系等位基因的丧失引起AS并损害脑功能。父系等位基因由UBE3A-ATS(超长的反义转录物)沉默，所述UBE3A-ATS顺式干扰父系UBE3A转录物。按照这种生物学，治疗与AS相关的神经和行为功能障碍的最直接方法是使完整的父系UBE3A等位基因不沉默(图1)。本发明基于以下科学前提：破坏或截短UBE3A-ATS使得它不干扰父系UBE3A，将使父系UBE3A不沉默并且治疗与AS相关的行为表型。

以前，发明人之一执行了>2,300种药物的筛选，并且发现拓扑异构酶抑制剂，包括拓扑替康，通过减少Ube3a-ATS表达有效地使小鼠和人神经元中的父系Ube3a等位基因不沉默。拓扑替康使培养的神经元、脑(脑室内或i.c.v.途径)和脊髓中的父系UBE3A增加至接近正常水平。然而，拓扑异构酶抑制剂在人中具有副作用，并且如发明人所发现的，下调其它长基因，包括与自闭症联系的突触基因。

在随后的研究中，通过敲入转录终止盒将Ube3a-ATS截短。这种种系修饰使神经元中的父系Ube3a不沉默，并且拯救了AS模型小鼠中的行为缺陷。反义寡核苷酸(ASO)导向Ube3a-ATS非沉默父系Ube3a的相似区域，虽然这些ASO不像拓扑替康一样有效。当i.c.v.递送至成年AS小鼠(2-4月龄)时，这些ASO适度拯救了一种行为表型(在情境恐惧测定中的％凝滞)，并且使体重部分正常化。然而，其它行为表型并未得到拯救，与在较年轻的动物中恢复Ube3a用于更完全的表型拯救的需要相一致(表6)。此外，ASO的效应是短暂的(16周)，需要在整个生命中反复的侵入性注射，这尤其在儿童中是不切实际或不期望的。

在本文所述的研究中，发明人使用AAV9将Cas9和gRNA递送至AS模型中的脑。检查了中靶和脱靶效应。这些实验提供了概念验证：靶向Ube3a-ATS的Cas9和gRNA的递送可以使Ube3a不沉默延长的时间段(例如，至少六个月)，并且拯救了AS模型中的表型。在一些实施方案中，对于本发明的gRNA，也可以使用递送Cas9蛋白或RNA的非病毒方法。

AS嵌合体指示，即使UBE3A在少至所有神经元的10％中得到恢复，也可以实现一些行为恢复。印记缺陷虽然很罕见，但可以使母系UBE3A失活并引起AS。印记缺陷通常是嵌合体的，其意味着一些神经元表达“正常”母系UBE3A，而其它神经元缺乏母系UBE3A表达。当少至所有细胞的10％含有正常水平的UBE3A时，AS症状分类为“异常轻度的”。轻度表型包括接近正常的言语、接近正常的运动表现和癫痫发作的不存在。发明人可以通过用AAV9将Cas9和gRNA递送至脑，使所有皮层神经元的>50％中的父系Ube3a不沉默，因此它们已经超过了将在其它方面严重的表型转变为异常轻度所需的10％阈值。这种幅度的改善显著改善了AS个体及其照顾者的生活。

在本发明中，已鉴定了Ube3a-ATS中的区域，其可以通过Cas9靶向，以使神经元中的父系Ube3a不沉默。在这些研究中，设计了288种SpCas9相容性gRNA，其靶向Ube3a-ATS和附近的基因(图3A-3B；使用MIT CRISPR Design Tool来鉴定具有脱靶效应的低概率的gRNA)。还设计了靶向潜在的调节区的gRNA。假设Ube3a-ATS中对拓扑替康治疗敏感的区域也可能对通过Cas9的破坏敏感。为了鉴定此类区域，发明人用媒介物或拓扑替康处理皮层神经元培养物，然后使用Ribo-zero RNA-seq，以极深的覆盖率(>2.8亿个映射的读数/条件；3个重复/条件)查询了新生(非多聚A选择的)转录物(图3C)。发明人还靶向假定的调控元件(图3D)，包括CTCF结合位点、DNA酶超敏位点、染色质表观遗传标记、多聚腺苷酸化位点、RNA二级结构的预测位点和转录因子ChIP-seq结合位点(从ENCODE和其它可公开获得的数据集鉴定)。将所有gRNA克隆到pLenti CRISPR v2质粒内，所述质粒可以用于瞬时转染或慢病毒递送。发明人使用基于PCR的方法来验证每个质粒含有正确的gRNA。

发明人使用高内涵384孔格式测定，培养了来自Ube3a-黄色荧光蛋白(YFP)敲入报告小鼠的神经元。发明人用CamKIIα-tdTomato(以鉴定转染的神经元；CamKIIα启动子是神经元选择性的)、SpCas9和来自其文库的每种gRNA瞬时共转染Ube3a^m+/patYFP原代皮层神经元。用高内涵成像仪(GE IN Cell Analyzer2200，每孔9帧)对孔进行整体成像。使用Cellprofiler来定量其为YFP+(未沉默的UBE3A-YFP)的CamKIIα-tdTomato+转染的神经元的百分比。相对于拓扑替康(基准阳性对照)以及相对于其它阳性对照和阴性对照，发明人对所有gRNA进行排序。鉴定了与拓扑替康一样有效地使父系Ube3a不沉默的几种gRNA。几个“命中”位于Snord115和Snord116基因(也分别称为H/MBII-52和H/MBII-85)中或附近，所述Snord115和Snord116基因是从Ube3a-ATS的内含子加工的C/D盒snoRNA的两个簇。

实施例2：用于AS的第一候选治疗性gRNA的鉴定

SNORD116基因的缺失引起普拉德-威利综合征(PWS)。PWS关键区域重叠并且局限于SNORD116基因(Bieth等人Eur J Hum Genet23:252-255(2015)；deSmith等人Hum MolGenet18:3257-3265(2009))。因此，缺失所有SNORD116基因或下调整个Ube3a-ATS转录物的gRNA(其将消除所有SNORD116基因)不太可能具有治疗效用。相比之下，靶向PWS关键区域外(3')的区域的gRNA很可能有效治疗AS，伴随很少的副作用至无副作用(这个区域中的gRNA定义为“候选治疗性gRNA”)。通过靶向这些区域，发明人可以同时克服与其它治疗方法相关的主要局限性，同时还实现了下述：

1.用单一治疗使父系Ube3a持久不沉默。AAV驱动在灵长类动物脑中的表达和行为恢复至少15年。AAV介导的无效Cas9和Snord115gRNA的递送阻断转录极长时间，覆盖脑发育的大部分(如果不是全部的话)关键时期，尤其是如果施用于新生儿。AAV在单次注射后驱动持久的基因表达，并且与ASO、小分子和基于蛋白质的阻遏物的瞬时效应形成对比。

2.内部冗余以将父系Ube3a表达的变化局限于神经元。可以通过使用神经元特异性启动子hSyn1来限制Cas9表达。在Cas9在非神经元细胞中表达的情况下，潜在的生物学提供另外一层限制：在非神经元细胞中，在PWS关键区域内存在截断Ube3a-ATS的边界元件(图2A-2B)。在神经元中，Ube3a-ATS延伸超过这个边界元件，并且经由转录碰撞机制使父系Ube3a沉默(图2A-2B)。通过集中于靶向这个边界元件下游的Ube3a-ATS的gRNA，可以将父系Ube3a表达的变化局限于神经元。

3.通过利用SNORD115基因的极端冗余来限制副作用。尽管SNORD115基因调节脑中的几个基因的可变剪接，但它们也是高度冗余的。在人中存在48个SNORD115基因，而在小鼠中存在110个Snord115基因。Snord115基因的序列和基因组组构在物种之间是保守的。Snord115基因位于PWS关键区域的3'，因此其缺失不引起PWS。具有涵盖Snord115和其它附近基因的大缺失的小鼠是有活力的，其指示可以缺失所有Snord115基因而不影响生存力。

作为关键创新，最有效的Snord115gRNA(jw33；用活性SpCas9转染，表1-5)具有中靶效应，如通过Snord115和3’Ube3a-ATS区域的下调所证明的(图4)。jw33并不改变上游基因(Snrpn，Snord116；图4)的水平。这种方法具有使父系Ube3a不沉默而不损害其它Snord115功能的独特潜力，并且高度不可能损害Snrpn和Snord116功能。这些研究证实了使用CRISPR/Cas9靶向Snord115基因的这个高度冗余簇用于治疗AS的治疗潜力。

其它有效的gRNA靶向Snord116基因(表1-5)，用靶向Snord116的ASO再现结果。尽管Snord116基因是高度冗余的，但它们的完全缺失与PWS的发病机制联系，使得其成为用于AS治疗的危险靶。

4.将Ube3a恢复到正常水平。UBE3A水平对于正常的脑发育必须紧密维持在窄范围内，如通过母系UBE3A的丧失引起AS，而UBE3A的重复增加自闭症风险的事实所证明的。因此，传统的基因替代疗法并不理想，因为它们经常以异常高的水平驱动单个Ube3a同种型的基因表达，由于载体拷贝数而具有细胞之间的变化性。相比之下，在本发明中，父系Ube3a的表达由内源启动子(其与母系启动子等同)驱动。结果，蛋白质水平和同种型分布等价于母系拷贝，对于所有AS个体中缺少母系Ube3a的绝大多数提供了最佳治疗。

实施例3：评价人神经元中的UBE3A和UBE3A-ATS的等位基因特异性表达的初步研究

Snord115基因在小鼠和人之间是保守的，使得能够将本发明中所述的研究平移到人神经元。人UBE3A的等位基因特异性表达可以使用单核苷酸多态性(SNP)或母系和父系染色体之间不同(即，杂合的)的重复长度多态性来定量。评估了来自假定的神经典型胎儿人脑的107个原代人神经元祖细胞(phNPC)系。这些系可以分化成具有比胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(IPSC)更高保真度的神经元。使用单核苷酸多态性(SNP)芯片，对所有phNPC系进行基因分型，并且在分化成神经元之前和之后，从大多数phNPC系收集了链式RNA-seq数据。

通过分析这些RNA-seq数据，在UBE3A-ATS中重叠UBE3A内含子的区域中鉴定了SNP(图6)，并且在UBE3A的外显子中鉴定了7个SNP(图7，表7)，其在一些供体细胞系中是杂合的。这些SNP可以用于检测祖细胞中UBE3A的双等位基因表达，以及成熟神经元中UBE3A的单等位基因(推测为母系的)表达(图7)。我们还可以定量成熟神经元中UBE3A-ATS的单等位基因(推测为父系的)表达(这个区域在祖细胞中不表达，如预期的，图7)。我们接下来用含有活性SpCas9和类似于jw33的人gRNA(“hsajw33”，例如Snord115-6)的慢病毒处理phNPC衍生的神经元。重要的是，这种处理使人神经元中的父系UBE3A不沉默(图8)。

作为另外的方法，人UBE3A的内含子9中的重复长度多态性可以用于区分IPSC中的母系表达与父系表达(使用等位基因特异性RT-PCR伴随有义和反义前mRNA转录物)。在初步研究中，确认了几个供体系在人UBE3A的内含子9中是多态性的，允许在内含子9和前mRNART-PCR中使用重复长度多态性，以定量UBE3A的等位基因表达。

实施例4：定量分化的人神经元中的等位基因特异性表达

原代人神经祖细胞(phNPC)进行扩增，并且以4x10⁵个细胞/孔的密度在6孔板中铺平板。在铺平板后48小时，用含有人重组NT3和BDNF的分化培养基替换增殖培养基。细胞每2-3天经历50％的培养基更换，持续8周。在第4周时，细胞用含有pLC2-SpCas9:mCherry-Snord115gRNA(或阴性对照)和标记神经元的pLentiCamkIIa:eGFP的慢病毒混合物进行感染。在分化后8周时，收集细胞并且就mCherry+/eGFP+/DAPI+事件进行分选。使用Trizol提取RNA并且进行DNA酶I处理。使用随机六聚体和多聚dT引物的组合来合成cDNA。通过TaqMan基因分型探针，使用由RNAseq鉴定的SNP，来测定等位基因特异性表达(表7)。在特异性供体系中分化后预期的等位基因表达模式显示于图7中。响应用gRNA靶向SNORD115的SNP表达的相对变化显示于图8中。

为了定量UBE3A mRNA中的每种SNP的两个等位基因之间的表达差异，我们使用等位基因特异性TaqMan探针应用了ΔΔCt方法qPCR实验。具体地，我们比较了用以下处理的phNPC分化的神经元之间的假定父系/母系等位基因的表达水平：a)SpCas9乱序gRNA、以及b)SpCas9各种SNORD115靶向gRNA。使用这种方法的初步实验证实了人SNORD115靶向gRNA使UBE3A的假定父系等位基因不沉默的可行性和功效(表5)。

实施例5：活性和无效Cas9在使父系Ube3a不沉默方面是有效的

活性Cas9、无效Cas9(未与任何东西融合)、以及与KRAB阻遏物结构域融合的无效Cas9，在使父系Ube3a不沉默方面是同样有效的(图5)。这些数据指示，Cas9可以通过与Snord115基因结合并阻断转录来使父系Ube3a不沉默。这个发现使得能够使用无效Cas9来治疗AS并且使副作用降到最低。无效Cas9不包含染色质修饰结构域，它也不切割基因组，因此存在诱变、癌症或p53激活/双链断裂的很少风险至无风险。发明人发现，无效Cas9可以用于绕过CRISPR作为治疗剂的主要弱点。此外，如果可逆性是期望的，则无效Cas9可以与抗CRISPR或其它技术组合以使dCas9灭活。

实施例6：AAV2-hsyn1-SaCas9-Sajw33或AAV9-hsyn1-SaCas9-Sajw33的出生前脑室内注射

将以2.4x10¹³个病毒分子/ml的病毒原液与在无菌PBS中制备的10％坚固绿混合，用于显现注射部位。使用C57BL/6雄性与Ube3a^mat+/pat-雌性小鼠或Ube3a^m+/patUbe3a雄性与C57BL/6雌性小鼠建立定时交配。在E15.5时，妊娠雌性在整个程序中用2％异氟烷进行麻醉。子宫中的胚胎以1μl/半球用病毒溶液在脑室中进行注射。将大约2.2x10¹⁰个病毒分子注射到脑的每一侧。将注射的胚胎重新定位到腹腔内。每天用5mg/Kg氯胺酮处理手术的雌性，持续三天。允许幼鼠自然分娩，并且保持与养母一起直至断奶。在P30时，用4％PFA/PBS灌注Ube3a^mat+/patYFP或Ube3a^mat-/pat+幼鼠。解剖小鼠脑，并且经由在4℃下的过夜温育在4％PFA中后固定。使用LeicaVibratome将脑切片成100μm的切片。脑切片然后用兔抗GFP抗体(Ube3a^mat+/patYFP)或小鼠抗UBE3A抗体(Ube3a^mat-/pat+)进行染色，并且通过Zeiss780共聚焦显微镜以10X放大率进行成像(图10、11)。

实施例7：AAV9-hsyn1-SaCas9-Sajw33的出生后脑室内注射

将以2.4x10¹³个病毒分子/ml的病毒原液与在无菌PBS中制备的10％坚固绿混合，用于显现注射部位。经由冷冻麻醉将P1新生儿Ube3a^mat+/patYFP或Ube3a^mat-/pat+幼鼠固定3.5分钟。用附着至25μl注射器的32GHamilton针，将病毒注射到脑室的两侧内。将1μl病毒溶液，大约2.2x10¹⁰个病毒分子注射到脑的每一侧。允许注射的幼鼠在37℃的加热垫上恢复，然后返回居住笼。在P30时，用4％PFA/PBS灌注病毒注射的Ube3a^mat+/patYFP或Ube3a^mat-/pat+幼鼠，解剖脑，并且经由在4℃下的过夜温育在4％PFA中后固定。使用Leica Vibratome将脑切片成100μm的切片。脑切片然后用兔抗GFP抗体(Ube3a^mat+/patYFP)或小鼠抗UBE3A抗体(Ube3a^mat ^-/pat+)进行染色，并且通过Zeiss780共聚焦显微镜以10X放大率进行成像(图12、13)。

前文是本发明的说明，并且不应解释为其限制。虽然本发明的一些示例性实施方案已得到描述，但本领域技术人员将容易了解，许多修改在示例性实施方案中是可能的，而在实质上不脱离本发明的新型教导和优点。相应地，所有此类修改预期包括在如权利要求中限定的本发明的范围内。本发明由随附权利要求限定，其中包括权利要求的等价物。

表1：当与活性SpCas9一起转染到神经元内时，使父系UBE3A-YFP不沉默的SpCas9gRNA

表2：当与无效CasCas9一起转染到神经元内时，使父系UBE3A-YFP不沉默的SpCas9gRNA

表3：当与活性SaCas9一起转染到神经元内时，使父系UBE3A-YFP不沉默的SaCas9gRNA

表4：当与无效SaCas9一起转染到神经元内时，使父系UBE3A-YFP不沉默的SaCas9gRNA

表5：当与活性SpCas9一起转染到神经元内时，使父系UBE3A-YFP不沉默的人SpCas9gRNA

表6：当父系Ube3a在不同发育时间段不沉默时，预期显示完全拯救(FR)、部分拯救或无拯救(NR)的表型

表7：

表8.Hg转录物注释

Claims

1.一种使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向所述受试者施用有效量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关的核酸内切酶以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与所述受试者的细胞中的UBE3A-ATS（SEQ ID NO：1）中的靶核苷酸序列具有互补性。

2.一种治疗有此需要的受试者中的Angelman综合征的方法，其包括向所述受试者施用有效量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关的核酸内切酶以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与所述受试者的细胞中的UBE3A-ATS（SEQ ID NO：1）中的靶核苷酸序列具有互补性的。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述CRISPR相关的核酸内切酶是Cas9、CasX、Cas12或其变体。

4.权利要求3的方法，其中所述CRISPR相关的核酸内切酶是人优化的Cas9、CasX、Cas12或其变体。

5.权利要求4的方法，其中所述Cas9、CasX、Cas12或其变体是无效的和/或催化无活性的。

6.权利要求5的方法，其中所述无效的Cas9、CasX、Cas12或其变体与转录阻遏物结构域融合。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列在一个或多个SNORD115（在人中的HBII-52、在小鼠中的MBII-52）和/或SNORD115HG基因中。

8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列在一个或多个SNHG14基因中。

9.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列在一个或多个SNORD109B基因中。

10.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列在一个或多个SNORD116和/或SNORD116HG基因中。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述引导RNA包含SEQ ID NO：3-90中任一个的核苷酸序列。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述CRISPR相关的核酸内切酶和所述一种或多种引导RNA作为一种或多种核酸分子引入所述受试者内。

13.权利要求12的方法，其中所述核酸分子存在于载体中。

14.权利要求13的方法，其中所述载体是病毒载体。

15.权利要求14的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒（AAV）载体。

16.一种使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向所述受试者施用有效量的无效SpCas9-KRAB融合物和/或无效SaCas9-KRAB融合物以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与所述受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的Snord115中的靶核苷酸序列具有互补性。

17.一种使有此需要的人受试者中的父系UBE3A不沉默的方法，其包括向所述受试者施用有效量的无效SpCas9和/或无效SaCas9以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与所述受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的Snord115中的靶核苷酸序列具有互补性。

18.一种治疗有此需要的受试者中的Angelman综合征（AS）的方法，其包括向所述受试者施用有效量的无效SpCas9-KRAB融合物和/或无效SaCas9-KRAB融合物以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与所述受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的Snord115中的靶核苷酸序列具有互补性。

19.一种治疗有此需要的受试者中的Angelman综合征（AS）的方法，其包括向所述受试者施用有效量的无效SpCas9和/或无效SaCas9以及一种或多于一种引导RNA分子，所述引导RNA分子与所述受试者的细胞中的UBE3A-ATS中的Snord115中的靶核苷酸序列具有互补性。

20.一种组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的CRISPR相关的核酸内切酶以及一种或多种引导RNA分子，所述引导RNA分子与UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。

21.一种组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的编码CRISPR相关的核酸内切酶的核酸分子以及编码一种或多于一种引导RNA的核酸分子，所述引导RNA与UBE3A-ATS中的靶核苷酸序列具有互补性。

22.权利要求21的组合物，其中编码CRISPR相关的核酸内切酶的所述核酸分子以及编码一种或多于一种引导RNA分子的所述核酸分子存在于单个核酸构建体上。

23.权利要求21的组合物，其中编码CRISPR相关的核酸内切酶的所述核酸分子以及编码一种或多于一种引导RNA分子的所述核酸分子存在于两个或更多个单独的核酸构建体上。

24.权利要求22的组合物，其中所述核酸构建体在病毒载体中。

25.权利要求23的组合物，其中所述核酸构建体各自存在于病毒载体中。

26.权利要求24或25中任一项的病毒载体，其中所述病毒载体是AAV载体。

27.权利要求26的病毒载体，其中所述AAV载体来自血清型AAV9。