CN111748503A - 一种深海独岛枝芽胞杆菌培养基和剂型 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一种深海独岛枝芽胞杆菌培养基和剂型。本发明提供了一种原料易得的培养基，该培养基发酵上清液经5倍稀释在离体处理南方根结线虫（Meloidogyne incognita）48 h后，其效果要远好于利用2216e海水培养基培养获得的发酵液上清5倍稀释液。在发酵液或发酵上清液中添加0.25‑1%的苯甲酸钠或0.1‑0.3%的山梨酸钾，可获得可稳定贮藏的液体剂型，使得其货架期保持至少3个月。本发明提供的培养基非常适合工业化的大型推广。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一种深海独岛枝芽胞杆菌培养基和剂型。
背景技术
植物寄生线虫能够寄生于植物各个组织，造成植物出现病症的一类病原动物。主要分为根结线虫、松材线虫、大豆孢囊线虫和茎线虫等，以根结线虫危害最为严重，在世界范围内广泛分布。蔬菜根结线虫(Meloidogyne spp.)严重危害我国蔬菜的安全生产，一般使蔬菜减产20％-30％，严重的达到75％。目前，国内尚无大量推广应用的抗根结线虫病的作物和蔬菜品种，对根结线虫病有效的生物防治措施缺乏。因此，开发对根结线虫病有效的生物防治制剂势在必行。
农业微生物杀菌剂主要包括活菌杀菌剂和农用抗生素两种类型。(1)活菌杀菌剂：包括细菌杀菌剂和真菌杀菌剂，细菌杀菌剂以芽胞杆菌(B.subtilis)为主，真菌杀菌剂主要是木霉属(Trichoderma)的一些种。(2)农用抗生素：农用抗生素是微生物发酵过程中产生的一类次级代谢产物，在较低浓度时就可以对植物的病原起抑制或杀灭作用，此外还能调节植物的生长发育。
农业微生物杀菌剂防效的影响因素包括生防菌活菌数，生产条件和贮存条件。(1)生防菌活菌数：活菌数是农业微生物杀菌剂的一项重要的质量指标，保证一定数量的活菌数是微生物杀菌剂发挥作用的基础。(2)生产条件：农业微生物杀菌剂生产条件包括微生物培养条件以及菌剂加工条件，如培养基的营养控制情况和微生物培养温度、pH值等。(3)贮存条件：对于液体菌剂的贮存，通过向微生物杀菌剂中添加适量的防腐剂也能有效抑制杂菌的生长，防止菌剂腐坏变质，从而延长货架期。
本发明中的独岛枝芽胞杆菌1A00493对根结线虫具有很好的杀线虫活性，但1A00493菌株原始培养基为2216e海水培养基，海水培养基成分复杂、成本较高、产芽胞周期长。
发明内容
本发明的目的是提供了一种独岛枝芽胞杆菌培养基，与原本2216e培养基相比，降低了成本，减少的培养基的复杂成分，提高了触杀南方根结线虫活性以及保留了较短的产芽胞天数，所述的独岛枝芽胞杆菌来源于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：MCCC NO.1A00493。
本发明的另一个目的在于提供了独岛枝芽胞杆菌的发酵方法。
本发明最后一个目的在于提供了一种稳定的线虫杀虫剂。
为了达到以上目的，本发明采用以下技术措施：
一种独岛枝芽胞杆菌(Virgibacillus dokdonensis)发酵培养基，包括：鱼粉2-4％，葡萄糖0.5-1.5％，氯化钠2-3％，氯化镁0.07-0.08％，氯化钙.0.05-0.15％，柠檬酸铁0.01-0.02％，pH为7.5-9.5，其余为水；所述的独岛枝芽胞杆菌为：MCCC NO.1A00493。
以上所述的培养基，优选的，包括：鱼粉3％，葡萄糖1％，氯化钠1.5％，氯化镁0.075％，氯化钙0.1％，柠檬酸铁0.01％，以上均为质量百分比，pH为8.5，其余为水。
一种独岛枝芽胞杆菌(Virgibacillus dokdonensis)的发酵方法：培养温度为25-31℃，培养基包括：鱼粉2-4％，葡萄糖0.5-1.5％，氯化钠2-3％％，氯化镁0.07-0.08％％，氯化钙0.05-0.15％，柠檬酸铁0.01-0.02％，pH为7.5-9.5，其余为水；所述的独岛枝芽胞杆菌为：MCCC NO.1A00493。
本发明的保护范围还包括：利用上述方法制备得到的发酵液，或发酵上清液，以及利用该发酵液或上清液制备成的线虫杀虫剂。
以上所述的发酵液或发酵上清液，优选的，添加了0.25-1％的苯甲酸钠或0.1-0.3％的山梨酸钾。
本发明的保护范围还包括利用本发明提供的发酵培养基制备的发酵液或发酵上清液在制备线虫杀虫剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
第一：与原本2216e培养基相比，降低了成本，减少的培养基的复杂成分，提高了发酵液触杀南方根结线虫活性以及保留了较短的产芽胞天数；
第二：利用本发明提供的培养基制备的发酵液及其上清稳定性好，制作完成的液体菌剂在90d后依然具有良好的触杀南方根结线虫活性以及合格的活菌数；
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。所述试剂或材料，如无特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例将独岛枝芽胞杆菌(Virgibacillus dokdonensis，MCCC NO.1A00493)写为独岛枝芽胞杆菌1A00493。
实施例1：
独岛枝芽胞杆菌1A00493 2216e培养基发酵上清液杀虫活性实验：
1A00493发酵上清液的制备：
1)在2216E培养基平板上将1A00493菌株划线分离活化得到单菌落；
2)挑单菌落接到装有2216E培养基的PA瓶中活化；
3)PA瓶中的种子液接到装有2216E培养基的250mL三角瓶中液体摇瓶培养28℃
摇瓶培养48h，至OD600＝1.85；
4)摇瓶后的发酵液8000rpm离心15min得到1A00493发酵上清液。
1A00493发酵上清液对线虫的离体防治实验：
1)用96孔板进行毒力测定，每孔吸取试验用二龄线虫30头；
2)加入200μl待测试剂；
3)20℃温育24h统计死亡率；12h观察一次；
4)根据目测观察以及染色观察确定死虫数量，统计校正死亡率，结果见表1。对照组为未接种菌株的2216E发酵液200μl。
表1 独岛枝芽胞杆菌1A00493 2216e发酵上清液触杀线虫实验结果
表1表示使用2216e培养基培养1A00493菌株的不同浓度发酵上清液处理南方根结线虫的死亡率，随着稀释浓度上升，死亡率下降严重，且2216e培养基存在成分复杂，成本高等问题，因此需要优化培养基来培养1A00493菌株。
针对上述问题，本发明提供了独岛枝芽胞杆菌1A00493的发酵培养基，包括：鱼粉3％，葡萄糖1％，氯化钠1.5％，氯化镁0.075％，氯化钙0.1％(均为质量体积比)，柠檬酸铁0.01％，其余为水。
实施例2：
本发明提供的发酵培养基的效果实验：
本实施例使用的独岛枝芽胞杆菌1A00493的发酵培养基，包括：鱼粉3％，葡萄糖1％，氯化钠1.5％，氯化镁0.075％，氯化钙0.1％，柠檬酸铁0.01％，其余为水。
1)培养基的不同pH值对独岛枝芽胞杆菌1A00493的发酵上清液的杀虫效率的影响：
按照上述配方配制不同ph浓度的独岛枝芽胞杆菌1A00493发酵培养基，pH分别为5.5，6.5，7.5，8.5，9.5；以pH＝8.5的2216e培养基作为对照；
按照实施例1中1A00493发酵上清液的制备方法，制备1A00493发酵上清液，并进行南方根结线虫的离体防治实验：
1)用96孔板进行毒力测定，每孔吸取试验用二龄南方根结线虫30头；
2)发酵液2倍稀释液：加入60μl发酵上清液，用无菌水补充至约120μl，发酵液5倍稀释液：加入24μl发酵上清液，用无菌水补充至约120μl，
3)20℃温育24h统计死亡率；12h观察一次；
4)根据目测观察以及染色观察确定死虫数量，统计矫正死亡率，结果见表2。对照组发酵液以同样的方式进行2倍和5倍稀释加入。
pH＝8.5的2216e培养基产芽胞天数为4d。
本发明提供的发酵培养基，pH5.5和pH6.5的组菌株在4d后死亡，所以也无法测杀虫活性。pH7.5第5d产生芽胞，pH8.5第4d产生芽胞，pH9.5第5d产生芽胞。所以，从产芽胞天数分析，pH8.5组效果最佳。
独岛枝芽胞杆菌1A00493在pH7.5，pH8.5和pH9.5的培养条件下，其发酵上清液对南方根结线虫的抑制情况，由于2216e培养基和本发明提供的培养基在不稀释发酵上清液进行的杀线虫检测实验中，其死亡率均接近100％且不具备显著性差异，因此，在发酵液抑虫效果试验时，均以原始发酵上清液的2倍和5倍的稀释液进行检测，具体结果如表2所示。
表2 不同初始pH培养基发酵上清液处理南方根结线虫48h死亡率
注：死亡率以平均值±标准偏差表示。通过spss 17.0Duncan法差异显著性分析,不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
如表2所示，通过对原始数据进行统计分析，根据不同培养基发酵上清液2倍稀释下根结线虫死亡率，pH＝7.5组和pH＝9.5组与pH＝8.5组具有显著性差异，pH＝7.5组和pH＝9.5组的死亡率均大于pH＝8.5组，但pH过高不利于工业生产发酵过程，所以在杀虫活性相差不大的情况下，尽量选择pH＝7.5和pH＝8.5组。根据不同培养基发酵上清液5倍稀释下根结线虫死亡率，pH＝8.5组和pH＝9.5组与pH＝7.5组具有显著性差异。结合产芽胞天数，以及发酵罐生产的应用，选择pH＝8.5组。
2)独岛枝芽胞杆菌1A00493在本发明提供的培养基不同温度的培养条件下，其发酵上清液对南方根结线虫的抑制情况，设置6个温度梯度，分别为22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，综合产芽胞天数和杀虫活性分析，以2216e培养基为对照(其原始温度为28℃)，结果如表3和表4所示；
1A00493培养基发酵液上清制备和1A00493发酵上清液对南方根结线虫的离体防治实验同本实施例步骤1)，结果如下：
表3 不同培养温度下独岛枝芽胞杆菌1A00493的产芽胞天数
表4 不同温度培养基发酵上清液处理南方根结线虫48h死亡率
注：死亡率以平均值±标准偏差表示。通过spss 17.0Duncan法差异显著性分析,不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
根据表2-表4的结果，独岛枝芽胞杆菌1A00493最佳培养条件：鱼粉3％，葡萄糖1％，氯化钠1.5％，氯化镁0.075％，氯化钙0.1％，柠檬酸铁0.01％，初始pH8.5，培养温度为28℃。
实施例3：
1A00493 50L发酵罐培养实验及1A00493发酵液液体菌剂制备：
按照已完成的1A00493菌株的培养基配方及培养条件，扩大到50L发酵罐培养。
种子液的制备：挑取独岛枝芽胞杆菌1A00493的单菌落于装有250mL的2216E培养基的6个500mL的锥形瓶中，在28℃，180r/min的摇床培养约24h，至菌液浑浊即可。
上罐发酵：对罐内清洗后，将发酵培养基30L装入发酵罐内，进行实消，灭菌完成后，以5％的接种量即1500mL独岛枝芽胞杆菌1A00493种子液接种，设置温度28℃，转速为337r/min，消泡剂20mL,通气量为0.6～0.8m3/h，设置pH维持在8.5，每日取样，观察芽胞形成状况。在发酵完成后进行菌液上清杀虫活性的检测。
所述的发酵培养基为：鱼粉3％，葡萄糖1％，氯化钠1.5％，氯化镁0.075％，氯化钙0.1％，柠檬酸铁0.01％，pH8.5，其余为水，均为质量体积比。
将发酵罐发酵108h得到的1A00493发酵液进行下罐，取800mL的发酵液于2L干净的广口塑料瓶中，分别加入0.1％，0.2％和0.3％的山梨酸钾溶液(0.25％，0.5％和1％的苯甲酸钠，均为质量体积比，为发酵液稀释之前的加入的量，稀释使用无菌水稀释)，充分混匀，对照组为最初发酵完成的发酵上清液，每个浓度设置3个重复，旋紧瓶盖，常温条件(20℃-25℃)下放置90d后进行触杀南方根结线虫活性和菌含量的测定。
1A00493发酵上清液对南方根结线虫的离体防治实验同实施例2
表5 液剂90d处理后发酵上清液处理南方根结线虫48h死亡率及发酵液菌数
注：1A00493发酵液上清为5倍稀释浓度；死亡率以平均值±标准偏差表示。通过spss 17.0Duncan法差异显著性分析,不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
如表5所示，通过添加山梨酸钾等防腐剂制备的液体菌剂，经过5倍稀释，在离体处理南方根结线虫48h，添加苯甲酸钠组中0.25％苯甲酸钠的发酵上清液5倍稀释死亡率最高达83.49％，比储藏前死亡率还高；菌数可达2.76×108CFU/mL，添加山梨酸钾组中0.2％山梨酸钾的发酵上清液5倍稀释死亡率可达82.94％，也比储藏前的死亡率高，菌数可达2.89×108CFU/mL，也比储藏前稍有降低。说明添加0.25％苯甲酸钠和添加0.2％山梨酸钾的1A00493发酵液制备的菌剂货架期可以保持3个月以上。
Claims (6)
1.一种独岛枝芽胞杆菌（Virgibacillus dokdonensis）发酵培养基，包括：鱼粉2-4%，葡萄糖0.5-1.5%，氯化钠2-3%，氯化镁0.07-0.08%，氯化钙.0.05-0.15%，柠檬酸铁0.01-0.02%，pH为7.5-9.5，其余为水；所述的独岛枝芽胞杆菌为：MCCC NO. 1A00493。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，起特征在于：鱼粉3%，葡萄糖1%，氯化钠1.5%，氯化镁0.075%，氯化钙0.1%，柠檬酸铁0.01%，以上均为质量百分比，pH为8.5，其余为水。
3.利用权利要求1所述的发酵培养基发酵培养独岛枝芽胞杆菌的方法，包括：培养温度为25-31℃，所述的独岛枝芽胞杆菌为：MCCC NO. 1A00493。
4.利用权利要求1所述的发酵培养基发酵培养独岛枝芽胞杆菌获得的发酵液或发酵上清液，所述的独岛枝芽胞杆菌为：MCCC NO. 1A00493。
5.权利要求4所述的发酵液或发酵上清液在制备线虫杀虫剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的杀虫剂中添加了0.25-1%的苯甲酸钠或0.1-0.3%的山梨酸钾。
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