CN111733104A - 一种红茶菌蛋白的制备新方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红茶菌蛋白的制备新方法及其应用，属于红茶菌蛋白技术领域。该方法包括：将水煮沸后加入红茶茶叶,在煮沸条件下煎煮5min～1h，过滤除去茶叶渣后在茶汤中加入蔗糖和无机盐搅拌溶解完全，然后将茶汤冷却，在冷却后的茶汤中加入红茶菌菌种，搅拌均匀后在弱紫外灯下照射，然后在电热恒温箱中恒温发酵得红茶菌发酵液；将得到的红茶菌发酵液过滤、离心，收集上清液，并加入有机试剂‑盐形成的双水相液，搅拌混匀，静置沉降后离心，收集上清液，重复数次，将上清液减压浓缩得浓缩液，浓缩液干燥后即得红茶菌蛋白。本发明可以显著提高从红茶菌发酵液中所提取出的红茶菌蛋白的产出含量。

Description

一种红茶菌蛋白的制备新方法及其应用

技术领域

本发明涉及到一种红茶菌蛋白的制备新方法及其应用，属于红茶菌蛋白技术领域。

背景技术

红茶菌又名海宝、胃宝，康普茶，是一种历史悠久的民间传统酸性保健饮料，因其具有酸甜清爽的口感，目前仍然非常受大众欢迎。红茶菌是以蔗糖和茶叶水为发酵基质，经由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多种菌种共发酵而成，研究表明，红菌茶是一种对人体有多种保健作用的健康饮品，如清理肠胃助消化、保肝护肾排结石、促进代谢增强食欲、抗衰老、增强免疫、清肺安神、预防和治疗动脉粥样硬化等。

虽然已有研究表明红茶菌发酵液具有抗菌作用，其抗菌活性主要源于三个方面：一是茶叶本身含有的茶多酚；二是红茶菌共生体系在代谢过程中形成的乙酸、乙醇、葡萄糖酸二酸等代谢产物对微生物的抑制；三是红茶菌共生体中微生物的共同作用，产生一些具有抗菌的蛋白和多糖。但目前关于红茶菌的研究多集中在发酵条件分析和菌群的分析以及红茶菌在其他食品保健饮料上的探索和应用，关于红茶菌发酵液成分中的红茶菌抑菌蛋白的研究较少，关于红茶菌抑菌蛋白在化妆品祛痘上的应用研究更少。文献(谢俊杰,佘世望,钟青萍,晏学明,李华光.红茶菌抗菌蛋白抗菌活性研究[J].生物技术,1999(06):22-25.)从培养后的红茶菌发酵液中提取了抗菌蛋白并对其抗菌活性进行了研究，但是采用该文献方法从红茶菌发酵液中所提取出的抗菌蛋白的产出含量较低，每1L红茶菌发酵液所提取出的红茶菌蛋白的质量仅为1.227g。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种红茶菌蛋白的制备新方法及其应用，本发明方法通过改善发酵和分离过程，可以显著提高从红茶菌发酵液中所提取出的红茶菌蛋白的产出含量。

为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：

一种红茶菌蛋白的制备新方法，包括如下步骤：

(1)将水煮沸后加入红茶茶叶,在煮沸条件下煎煮5min～1h，过滤除去茶叶渣后在茶汤中加入蔗糖和无机盐搅拌溶解完全，然后将茶汤冷却，在冷却后的茶汤中加入红茶菌菌种，搅拌均匀后在弱紫外灯下照射，然后在电热恒温箱中恒温发酵得红茶菌发酵液；

(2)将步骤(1)得到的红茶菌发酵液过滤、离心，收集上清液，并加入有机试剂-盐形成的双水相液，搅拌混匀，静置沉降后离心，收集上清液，重复数次，将上清液减压浓缩得浓缩液，浓缩液干燥后即得红茶菌蛋白。

优选地，步骤(1)中水、红茶茶叶、蔗糖、无机盐、红茶菌菌种的质量比为：100：(0.1～10)：(1～20)：(0.1～1.1)：(1～2)。

优选地，步骤(1)中所述的无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐中的一种或几种混合。

优选地，步骤(1)中所述的弱紫外灯为4～6W的紫外灯，照射时间为1s～1min。

优选地，步骤(1)中所述的发酵的温度为30℃，发酵时间为5～20天。

优选地，步骤(2)中所述的双水相液是首先将有机试剂溶于水中配成质量分数为1～50％的有机溶液，将盐溶于水中配成质量分数为5～50％的盐溶液，然后将有机溶液与盐溶液混合均匀后形成的。

进一步优选地，所述的有机试剂为乙醇、异丙醇、丙酮、甲醇中的任意一种，盐为硫酸盐、氯化钠、氯化钾中的一种或几种混合。

采用上述方法制备的红茶菌蛋白在化妆品上的应用。

优选地，所述红茶菌蛋白用于制备祛痘凝胶，按质量百分数计，所述祛痘凝胶由以下成分组成：

水95.57％

甘油3％

卡波姆U20 0.2％

透明质酸钠0.02％

三乙醇胺0.2％

红茶菌蛋白0.01％。

进一步优选地，所述祛痘凝胶的制备方法为：

按配方量称取各原料，在70～80℃将水、甘油、卡波姆U20混合并搅拌均匀，加入透明质酸钠，继续搅拌均匀成均一相，然后降温至40～50℃，加入三乙醇胺，搅拌均匀；最后加入红茶菌蛋白，搅拌混合至完全溶解，得祛痘凝胶。

从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：

(1)本发明首先通过弱紫外灯照射红茶菌液，然后自然条件下发酵，再采用双水相技术对红茶菌发酵液进行分离制备出红茶菌蛋白，本发明方法操作简便，条件温和，不仅可以提高红茶菌发酵液中所产生的红茶菌蛋白的含量，而且可以提高红茶菌蛋白被从红茶菌发酵液中提取出来的提取率，从而明显改善从红茶菌发酵液中所提取出的抗菌蛋白的产出含量，每1L红茶菌发酵液所提取出的红茶菌蛋白的质量可达1.410g，相比传统提取方法，提高率达14.9％；

(2)本发明所制备出的红茶菌蛋白具有良好的抑菌效果，对痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌具有良好的抑制作用；

(3)本发明所制备出的红茶菌蛋白可以用在化妆品中，如凝胶、水、膏霜等，可作为祛痘和修复使用。

具体实施方式

下面结合实施例及测试例，对本发明进行具体描述，但不对本发明的权利要求做任何限定。

实施例1：

一种红茶菌蛋白的制备新方法，包括如下步骤：

(1)将100g水煮沸后加入红茶茶叶0.5g,在煮沸条件下煎煮15min，过滤除去茶叶渣后在茶汤中加入10g蔗糖和0.1gMgCl₂、1gK₂HPO₄搅拌溶解完全，然后将茶汤冷却，在冷却后的茶汤中加入1.5g红茶菌菌种(红茶菌新胜三号菌种，购买于新胜红茶菌菌种公司)，搅拌均匀后在5W紫外灯下照射10s，然后在电热恒温箱中于30℃恒温发酵10天得红茶菌发酵液(体积为V1)；

(2)将异丙醇溶于水中配成质量分数为26％的有机溶液，将硫酸铵溶于水中配成质量分数为12％的盐溶液，然后将有机溶液与盐溶液混合均匀后形成异丙醇-硫酸铵双水相液；

(3)将步骤(1)得到的红茶菌发酵液过滤、过滤液于4℃下以4000r/min的转速离心，收集上清液，并加入步骤(2)得到的异丙醇-硫酸铵双水相液，搅拌混匀，静置沉降后于4℃下以8000r/min的转速离心，收集上清液，重复1次，将上清液减压浓缩得浓缩液，浓缩液干燥后即得红茶菌蛋白A。

对比例1：

采用文献(谢俊杰,佘世望,钟青萍,晏学明,李华光.红茶菌抗菌蛋白抗菌活性研究[J].生物技术,1999(06):22-25.)中所述的实验方法制备红茶菌蛋白B。

红茶菌蛋白的产出含量测试：

将实施例1和对比例1所制备出的红茶菌蛋白全部溶解于蒸馏水中得到红茶菌蛋白液，实施例和对比例所使用的蒸馏水的体积与相应红茶菌蛋白制备过程中所得红茶菌发酵液的体积相同，采用考马斯亮蓝法测试各红茶菌蛋白液的浓度即可得从红茶菌发酵液中所提取出的红茶菌蛋白的产出含量，结果如表1所示；

表1

红茶菌蛋白	含量(mg/mL)
		A	1.410
B	1.227

红茶菌蛋白的抑菌效果测试：

(1)供试菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、痤疮丙酸杆菌；

(2)培养基：营养琼脂培养基和LB液体培养基用于培养细菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)，马铃薯葡萄糖琼脂和沙保弱液体培养基用于白色念珠菌，改良GAM琼脂基础和改良GAM肉汤用于培养痤疮丙酸杆菌，均购于北京陆桥有限公司；

(3)样品溶解制备：用无菌水将红茶菌蛋白溶解成0.5mg/mL 100mL溶液，按倍数稀释法将液体稀释不同的梯度，用无菌滤膜分别将溶液过滤除菌，滤液待用；

(4)菌悬液：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌37℃条件下活化后的菌株用无菌生理盐水制成10⁷cfu/mL的菌悬液备用；白色念珠菌28℃条件下活化后的菌株用无菌生理盐水制成10⁷cfu/mL的菌悬液备用；痤疮丙酸杆菌37℃厌氧条件下活化后的菌株用无菌生理盐水制成10⁵cfu/mL的菌悬液备用；

(5)最低抑菌浓度MIC测定：

a)分别吸取上述菌悬液100uL至96孔微量板上的小孔内，加入100uL培养液，加入不同稀释梯度的红茶菌蛋白液体10uL，细菌在37℃培养20h，白念在28℃培养，痤疮丙酸杆菌厌氧37℃培养48h，测试样品的MIC值，每个测试3次平行实验，结果如表2。

b)判断标准：以在小孔内完全抑制微生物生长的最低药物浓度为MIC，当阳性对照(不加红茶菌蛋白液体)孔内微生物明显生长实验有意义。

表2

菌种	MIC(ug/mL)
		大肠杆菌	7.5
铜绿假单胞菌	7.5
		金黄色葡萄球菌	5
表皮葡萄球菌	15
		白色念珠菌	5
痤疮丙酸杆菌	2.5

红茶菌蛋白在化妆品上的应用：

(1)祛痘凝胶的制备：按表3所示配方称取各原料，在70～80℃将水、甘油、卡波姆U20混合并搅拌均匀，加入透明质酸钠，继续搅拌均匀成均一相，然后降温至40～50℃，加入三乙醇胺，搅拌均匀；最后加入红茶菌蛋白，搅拌混合至完全溶解，得祛痘凝胶。

表3

(2)祛痘测试

选择40人(男性16人和女性24人)，首先根据患者的皮肤损伤和长痘情况分为四级：

第一级为有明显红色炎性粉刺和痤疮、皮损严重(+++)

第二级为有少量粉刺、一般皮损(++)

第三级为轻微皮损(+)

第四级为基本无皮损(-)

将患者分为4组，分别使用实验组凝胶、对照组1凝胶、对照组2凝胶、对照组3凝胶，每日使用3次，使用28天，实验结果如表4所示：

由表4可以看出，相比未添加红茶菌蛋白的祛痘凝胶(对照组)，本发明祛痘凝胶对祛痘和皮损有良好的改善和修复效果，且由实验组1和实验组2～3的对比可以看出，祛痘凝胶中各成分用量发生微小变化就会对祛痘凝胶的祛痘和修复效果产生影响，本发明通过大量研究选择出最佳的搭配比例所制备的祛痘凝胶(实验组1)的祛痘和修复效果最佳。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种红茶菌蛋白的制备新方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将水煮沸后加入红茶茶叶,在煮沸条件下煎煮5min～1h，过滤除去茶叶渣后在茶汤中加入蔗糖和无机盐搅拌溶解完全，然后将茶汤冷却，在冷却后的茶汤中加入红茶菌菌种，搅拌均匀后在弱紫外灯下照射，然后在电热恒温箱中恒温发酵得红茶菌发酵液；

(2)将步骤(1)得到的红茶菌发酵液过滤、离心，收集上清液，并加入有机试剂-盐形成的双水相液，搅拌混匀，静置沉降后离心，收集上清液，重复数次，将上清液减压浓缩得浓缩液，浓缩液干燥后即得红茶菌蛋白。

2.如权利要求1所述的制备新方法，其特征在于，步骤(1)中水、红茶茶叶、蔗糖、无机盐、红茶菌菌种的质量比为：100：(0.1～10)：(1～20)：(0.1～1.1)：(1～2)。

3.如权利要求1所述的制备新方法，其特征在于，步骤(1)中所述的无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐中的一种或几种混合。

4.如权利要求1所述的制备新方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弱紫外灯为4～6W的紫外灯，照射时间为1s～1min。

5.如权利要求1所述的制备新方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发酵的温度为30℃，发酵时间为5～20天。

6.如权利要求1所述的制备新方法，其特征在于，步骤(2)中所述的双水相液是首先将有机试剂溶于水中配成质量分数为1～50％的有机溶液，将盐溶于水中配成质量分数为5～50％的盐溶液，然后将有机溶液与盐溶液混合均匀后形成的。

7.如权利要求6所述的制备新方法，其特征在于，所述的有机试剂为乙醇、异丙醇、丙酮、甲醇中的任意一种，盐为硫酸盐、氯化钠、氯化钾中的一种或几种混合。

8.采用权利要求1～7任一所述的制备新方法制备的红茶菌蛋白在化妆品上的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述红茶菌蛋白用于制备祛痘凝胶，按质量百分数计，所述祛痘凝胶由以下成分组成：

水95.57％

甘油3％

卡波姆U20 0.2％

透明质酸钠0.02％

三乙醇胺0.2％

红茶菌蛋白0.01％。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述祛痘凝胶的制备方法为：

按配方量称取各原料，在70～80℃将水、甘油、卡波姆U20混合并搅拌均匀，加入透明质酸钠，继续搅拌均匀成均一相，然后降温至40～50℃，加入三乙醇胺，搅拌均匀；最后加入红茶菌蛋白，搅拌混合至完全溶解，得祛痘凝胶。