CN111721872B

CN111721872B - 一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法及应用

Info

Publication number: CN111721872B
Application number: CN202010589084.2A
Authority: CN
Inventors: 王凤山; 刘冬科
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN111721872A

Abstract

本发明提供一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法及应用，属于医药检测技术领域。本发明通过研究发现，0S，NS，6S，2S，2SNS，6SNS，2S6S，TriS八种二糖成分在肝素类药物中含量丰富，作为混合标准品能够很好的用于鉴别肝素及硫酸乙酰肝素。因此，针对上述八种成分建立一套基于亲水相互作用色谱‑质谱的定量检测方法，该方法具有操作简便、耗时短、选择性高、灵敏度高、专属性好、重复性好等优点。可用于简便、准确地鉴别肝素与硫酸乙酰肝素，也为构建糖胺聚糖类药物更加完整的质量控制标准体系提供方法和数据参考，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法及应用

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肝素与硫酸乙酰肝素是一种内源性、结构复杂、多分散性的线性硫酸化糖胺聚糖，由葡萄糖醛酸或艾杜糖酸酸与葡糖胺通过1→4糖苷键连接形成的双糖单元重复组成，各单元存在可变的硫酸化、异构化，糖链长短不一，使其成为分子量不均一、结构复杂的多组分混合物，常以蛋白聚糖的糖链形式广泛存在于胞外基质和细胞表面。肝素是一种高度硫酸化的硫酸乙酰肝素的特殊形式，电荷密度即SO₄ ^2-的数量对它们的生物学功能影响最大，肝素硫酸化程度较高，主要用于预防、治疗动静脉血栓。硫酸乙酰肝素硫酸化程度较低，在细胞增殖分化、肿瘤转移、病毒感染、炎症等生物学过程中起着重要作用。

目前，由于新型糖胺聚糖类创新药物质量标准要求确定的组成和结构，因此，需要对其组成成分做严格定量分析，而发明人发现，目前专一定量鉴别肝素与硫酸乙酰肝素这两种相似的糖胺聚糖类药物的研究鲜有报道。

发明内容

针对目前现有技术的不足，本发明提供一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法及应用，本发明通过研究发现，0S，ΔUA(1→4)GlcNAc；NS，ΔUA(1→4)GlcNS；6S，ΔUA(1→4)GlcNAc6S；2S，ΔUA2S(1→4)GlcNAc；2SNS，ΔUA2S(1→4)GlcNS；6SNS，ΔUA(1→4)GlcNS6S；2S6S，ΔUA2S(1→4)GlcNAc6S；和TriS，ΔUA2S(1→4)GlcNS6S八种二糖成分在肝素类药物中含量丰富，作为混合标准品能够很好的用于鉴别肝素及硫酸乙酰肝素。因此，针对上述八种成分建立一套基于亲水相互作用色谱-质谱的定量检测方法，该方法具有操作简便、耗时短、选择性高、灵敏度高、专属性好、重复性好等优点。

为了实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供二糖成分在鉴别肝素和硫酸乙酰肝素中的应用。

所述二糖成分包括0S，ΔUA(1→4)GlcNAc；NS，ΔUA(1→4)GlcNS；6S，ΔUA(1→4)GlcNAc6S；2S，ΔUA2S(1→4)GlcNAc；2SNS，ΔUA2S(1→4)GlcNS；6SNS，ΔUA(1→4)GlcNS6S；2S6S，ΔUA2S(1→4)GlcNAc6S和TriS，ΔUA2S(1→4)GlcNS6S中的任意一种或多种。

所述应用具体为在糖胺聚糖类药物中进行。

本发明的第二个方面，提供一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法，所述鉴别方法包括对二糖成分进行定量测定。

所述定量测定方法包括采用HPLC-ESI-MS/MS进行分析。

具体的，所述鉴别方法包括：

取待测样品加入肝素酶酶解后，进行HPLC-ESI-MS/MS分析；

其中，所述肝素酶包括肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III。

色谱条件包括：色谱柱为PC HILIC(4.6×250mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相为：A相(10mM NH₄Ac-水)-B相(10mM NH₄Ac-90％乙腈)；流动相流速为0.6-1.2mL/min(优选为0.9mL/min)，柱温度为25-45℃(优选为40℃)；进样量10μL；采用梯度洗脱方式进行。本发明通过优化试验参数，最终获得上述条件参数，从而使得各成分色谱分离效果更佳，基线平稳，峰形对称，各色谱峰保留时间适宜，分离度好。

梯度洗脱程序如下：0-1min，流动相A 40％→40％；1-1.1min，流动相A 40％→60％；1.1-3.5min，流动相A 60％→60％；3.5-3.6min，流动相A 60％→40％；3.6-8min，流动相A 40％→40％。

质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：负离子；离子源电压：4500V；离子源温度：600℃；气帘气：10psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。通过对质谱条件进行优化，从而保证每一对离子对高响应的出峰，更加便于进行定量分析。

所述鉴别方法还包括采用外标法对二糖成分进行定量。

所述鉴别方法还包括分析待测样品中二糖成分含量，从而定量鉴别肝素和硫酸乙酰肝素。

本发明的第三个方面，提供上述鉴别方法在如下任意一种的应用：

1)药物质量控制；

2)药物品质评价；

3)药物鉴定。

其中，所述药物为糖胺聚糖类药物，进一步包括但不限于肝素和硫酸乙酰肝素。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案提供一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法，通过HPLC-ESI-MS/MS分析方法，同时测定肝素类药物中8个二糖成分的含量，上述方法简单、快捷，灵敏度高、专属性强、重复性好，可为肝素与硫酸乙酰肝素的定量鉴别提供参考依据。

上述技术方案液质联用定量测定方法具有准确可靠、灵敏度高、专属性强，检测限和定量限更低等优点，对药物成分含量分析更具有效，为构建糖胺聚糖类药物更加完整的质量控制标准体系提供方法和数据参考，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中八种有效成分的对照品液质图谱；其中，2SNS/6SNS，2S/6S为两对同分异构体，色谱与质谱均不能将其分离，本发明中将其一起定量。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，由于新型糖胺聚糖类创新药物质量标准要求确定的组成和结构，因此，需要对其组成成分做严格定量分析，而目前专一定量鉴别肝素与硫酸乙酰肝素这两种相似的糖胺聚糖类药物的研究鲜有报道。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供二糖成分在鉴别肝素和硫酸乙酰肝素中的应用。

所述应用具体为在糖胺聚糖类药物中进行。

上述八种成分在肝素类药物中含量丰富，作为待测成分能够很好的鉴别肝素与硫酸乙酰肝素。

所述定量测定方法，其步骤如下：

(1)对照品溶液制备：精密量取混合标准品溶液适量，加酶反应缓冲液混匀，加入混合后的肝素酶I、II、III(分别为10μL、40μL、5μL)，置37℃控温箱反应24h。反应结束后14000rpm离心10min，取上清即得对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：取供试品粉末10.0mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制得浓度为1.00mg/mL的样品储备液。精密量取样品储备液100μL，加酶反应缓冲液900μL混匀，取50μL加入混合后的肝素酶I、II、III(分别为10μL、40μL、5μL)，置37℃控温箱反应24h。反应结束后14000rpm离心10min，取上清即得供试品溶液。

(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪分离，采用梯度洗脱，流动相A相：10mM NH₄Ac-水，流动相B相：10mM NH₄Ac-90％乙腈。

本发明对色谱条件的选择及优化：考察了流动相中不同盐溶液(乙酸铵和甲酸铵)以及乙酸铵和甲酸铵缓冲液配比(5mM和10mM)、乙酸和甲酸缓冲液配比(0.1％、0.2％和0.3％)对色谱分离效果的影响。试验结果表明：流动相A中加10mM NH₄Ac盐溶液时色谱分离效果较好，基线平稳，峰形对称，分离度较好，有效避免了拖尾现象，因此流动相确定为：A相(10mM NH₄Ac-水)-B相(10mM NH₄Ac-90％乙腈)。

本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(3)中色谱柱为PC HILIC(4.6×250mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.9ml/min；柱温为40℃；进样量10μL。

本发明试验了三个流速(0.6、0.9、1.2mL/min)对检测结果的影响。结果表明：流速为0.9mL/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.9mL/min。

同时，本发明试验了四个不同柱温(如25℃，35℃，40℃，45℃)对质谱色谱检测结果的影响。结果显示柱温为40℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为40℃。

本发明同时对质谱条件进行优化，采用API4000型三重四级杆质谱仪的多反应离子检测模式(MRM)优化0S，NS，6S，2S，2SNS，6SNS，2S6S，TriS的质谱条件，保证每一对离子对高响应的出峰，检测结果如表1所示，各有效成分均找到特异性的母离子、子离子用于定量分析。

各成分色谱及质谱参数见表1。

表1 8种二糖的色谱与质谱参数

在分析时间的选择上，本发明在选择色谱图谱的洗脱时间时记录了30min的色谱图。结果表明8min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择8min作为分析时间。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(3)中梯度洗脱方式为：0-1min，流动相A40％→40％；1-1.1min，流动相A 40％→60％；1.1-3.5min，流动相A 60％→60％；3.5-3.6min，流动相A 60％→40％；3.6-8min，流动相A 40％→40％。

本发明的又一具体实施方式中，上述中质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：负离子；离子源电压：4500V；离子源温度：450℃；气帘气：10psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。

本发明采用HPLC-ESI-MS/MS液质联用分析方法，实验过程中尝试选择离子检测(SIM)模式测定，结果各成分响应较低且基线高，基质影响较大，而多反应检测(MRM)法对母离子和特征碎片的子离子进行扫描时，发现离子峰的响应强度明显高于选择离子检测(SIM)模式，且基线低可实现定量分析。因此实验选用多反应检测(MRM)扫描模式用于定量0S，NS，6S，2S，2SNS，6SNS，2S6S，TriS，用常规液相方法分离8个成分耗时长，分离较难，检测限高。不利于试验的进行。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述鉴别方法在如下任意一种的应用：

1)药物质量控制；

2)药物品质评价；

3)药物鉴定。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种肝素类药物二糖混合标准品液质定量测定方法，包括如下步骤：

第一步：

精密量取混合标准品溶液适量，加酶反应缓冲液混匀，加入混合后的肝素酶I、II、III(分别为10μL、40μL、5μL)，置37℃控温箱反应24h。反应结束后14000rpm离心10min，取上清即得对照品溶液。

第二步：

取供试品粉末10.0mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制得浓度为1.00mg/mL的样品储备液。精密量取样品储备液100μL，加酶反应缓冲液900μL混匀，取50μL加入混合后的肝素酶I、II、III(分别为10μL、40μL、5μL)，置37℃控温箱反应24h。反应结束后14000rpm离心10min，取上清即得供试品溶液。

第三步：

分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪分离，采用梯度洗脱，流动相A相：10mM NH4Ac-水，流动相B相：10mM NH4Ac-90％乙腈，色谱柱为PCHILIC(4.6×250mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.9ml/min；柱温为40℃；进样量10μL。梯度洗脱方式为：0-1min，流动相A 40％→40％；1-1.1min，流动相A 40％→60％；1.1-3.5min，流动相A 60％→60％；3.5-3.6min，流动相A 60％→40％；3.6-8min，流动相A40％→40％。

质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：负离子；离子源电压：4500V；离子源温度：450℃；气帘气：10psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。

第四步：

对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对线性关系、定量限、精密度、重复性、稳定性以及加样回收率，其中

线性关系及定量限：精密吸取适量混合对照品溶液，用酶反应缓冲液作稀释液，配制9个系列梯度浓度的混标溶液(0.02、0.04、0.10、0.30、0.60、1.00、1.50、3.00nM/mL)，按照上述方法处理并进样分析。以各待测成分摩尔浓度X(nM/mL)为横坐标，以检测成分峰面积(Y)为纵坐标，得回归方程，及相关系数，结果表明8种成分在相应的范围内线性关系良好。按待测成分信噪比S/N＝10及S/N＝3分别计算最低定量限和检测限，结果见表2；

表2线性方程、线性范围、相关系数、LOD和LOQ

精密度：取混合对照品溶液(浓度为1.00nM/mL)50μL，按对照品溶液制备方法处理，连续进样6次，测得0S，NS，6S，2S，2SNS，6SNS，2S6S，TriS的峰面积RSD均＜9.0％，结果表明精密度良好；

重复性：按照供试品制备方法制备同一批依诺肝素钠样品6份(批号：E0180000)，进样分析测得各成分峰面积，结果0S，NS，2SNS/6SNS，TriS，2S6S峰面积RSD分别为5.6％、7.1％、3.3％、5.3％，3.5％。结果表明重复性良好。

稳定性：取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样检测，结果0S，2S6S，NS，2SNS/6SNS，TriS，2S/6S峰面积RSD分别为7.0％、9.5％、4.6％、9.9％、6.3％、5.9％，结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好；

加样回收率：精密吸取适量混标溶液，用酶反应缓冲液作稀释液，配制高、中、低(2.00、0.50、0.06nM/mL)三个质控溶液，取50μL稀释10倍的依诺肝素钠样品储备液(批号：E0180000)，分别精密加入20μL高、中、低质控溶液(n＝6)。按上述方法处理并进样检测，计算含量、回收率及RSD。结果0S，NS，2S/6S，2SNS/6SNS，2S6S，TriS的平均加样回收率分别为88.32％，87.70％，90.34％，87.90％，89.62％，82.33％，RSD分别为6.7％，5.8％，7.4％，5.0％，4.9％，6.2％。

实施例2

一种肝素与硫酸乙酰肝素的鉴别方法，如下：

分别取8批硫酸乙酰肝素样品和6批肝素样品，按照供试品溶液制备方法得到溶液，进样检测，通过回归方程计算含量，定量方法选用外标法定量，肝素及硫酸乙酰肝素样品中8中二糖的含量测定结果见表3。以8种二糖总含量计，硫酸乙酰肝素样品中0S占比较大，平均约50％。肝素样品中2S6SNS占比较大，平均约70％，以此可作为定量鉴别肝素及硫酸乙酰肝素的依据。

表3肝素及硫酸乙酰肝素样品中8中二糖的含量测定结果(％)

综上，本发明开发了灵敏度高、特异性强、质谱兼容性好的亲水相互作用色谱-质谱法同时测定肝素与硫酸乙酰肝素中含量较丰富的8种双糖含量，可用于简便、准确地鉴别肝素与硫酸乙酰肝素，也为构建糖胺聚糖类药物更加完整的质量控制标准体系提供方法和数据参考。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种肝素和硫酸乙酰肝素中二糖成分的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括对二糖成分采用外标法进行定量测定；

所述定量测定方法包括：

取待测样品加入肝素酶酶解后，采用HPLC-ESI-MS/MS进行分析；所述肝素酶包括肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III；

其中，色谱条件包括：色谱柱为PC HILIC；流动相为：A相为10 mM NH₄Ac-水，B相为10 mMNH₄Ac-90%乙腈；流动相流速为0.9 mL/min，柱温度为40 ℃；进样量10 μL；采用梯度洗脱方式进行；

所述梯度洗脱程序如下：0-1 min，流动相A 40%→40%；1-1.1 min，流动相A 40%→60%；1.1-3.5 min，流动相A 60%→60%；3.5-3.6 min，流动相A 60%→40%；3.6-8 min，流动相A40%→40%；

质谱条件为：离子源：电喷雾（ESI）；扫描方式：多反应监测（MRM）；离子化方式：负离子；离子源电压：4500 V；离子源温度：600 ℃；气帘气：10 psi；雾化气：45 psi；辅助气：55psi；

所述二糖成分包括0S，∆UA(1→4)GlcNAc；NS，∆UA(1→4)GlcNS；6S，∆UA(1→4)GlcNAc6S；2S，∆UA2S(1→4)GlcNAc；2SNS，∆UA2S(1→4)GlcNS；6SNS，∆UA(1→4)GlcNS6S；2S6S，∆UA2S(1→4)GlcNAc6S和TriS，∆UA2S(1→4)GlcNS6S。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括分析待测样品中二糖成分含量，从而定量鉴别肝素和硫酸乙酰肝素。

3.权利要求1-2任一项所述检测方法在如下任意一种的应用：

1）药物质量控制；

2）药物品质评价；

3）药物鉴定。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述药物为糖胺聚糖类药物，包括肝素和硫酸乙酰肝素。