CN111718863B - 一种发酵生产闰年霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种生产闰年霉素的发酵培养基。所述发酵培养基通过优化有机碳源、有机氮源、无机盐以及维生素B1的加入量，使闰年霉素发酵单位达到2000µg/ml以上。利用本发明的发酵培养基不仅提高了闰年霉素的发酵单位，而且发酵液中闰年霉素的HPLC纯度达到了75%以上，可大幅度提高产品质量，降低生产成本，适用于闰年霉素的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产闰年霉素的方法。
背景技术
闰年霉素是通过指孢囊菌发酵产生的一种18元环结构的新型大环内酯类抗生素，属于窄谱型抗菌化合物，对革兰氏阳性需氧及厌氧菌具有优良的抗菌作用。
闰年霉素与非达霉素具有相同的抗菌谱，体外对艰难梭菌菌株有很好的抗菌活性，为较有潜力的用于治疗艰难梭菌感染引起腹泻的化合物。
目前，对闰年霉素的研究主要集中在其抗菌活性、应用、组合物等方面，发明专利CN 107898801 A公开了含有利福霉素和闰年霉素组合物及其应用，闰年霉素与利福霉素连用，可以产生协同杀菌效应，在更低的使用剂量下有效，毒性更低，且不易产生耐药性，很好解决了治疗细菌感染单独用药存在的肝毒性和易产生耐药性问题，为闰年霉素的深入研究注入了新的活力。关于闰年霉素发酵生产的培养基和发酵工艺的专利文献不多，发明专利CN104497079 A公开了一种高纯度闰年霉素的制备方法，其中闰年霉素的发酵单位在500 µg/ml左右，且发酵方法产物收率低。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵生产闰年霉素发酵水平低的问题，通过提供一种发酵培养基，有效提高闰年霉素的发酵单位。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种生产闰年霉素的发酵培养基，其组分包含有机碳源、有机氮源、无机盐及维生素B1，其中：有机碳源为麦芽糊精5-25g/L，葡萄糖30-65g/L；有机氮源为黄豆饼粉10-30g/L，酵母粉5-20g/L，玉米浆1-3g/L；无机盐为硫酸铵2-5g/L，七水硫酸镁1-3g/L，碳酸钙3-5g/L；维生素B1为0.01-0.1g/L。
所述的有机碳源中麦芽糊精用量优选10-20g/L，葡萄糖用量优选50-65g/L。
所述的有机氮源中黄豆饼粉优选低温黄豆饼粉，用量优选20-30g/L，酵母粉用量优选15-20g/L，玉米浆用量优选1-2g/L。
所述的无机盐为硫酸铵、七水硫酸镁和碳酸钙，硫酸铵用量优选4-5g/L，七水硫酸镁用量优选2-3g/L，碳酸钙用量优选4-5g/L。
所述的维生素B1用量优选0.05-0.07g/L。
本发明所用菌株为游动放线菌菌株（Actinoplanes sp.）N12W0304，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年12月26日，保藏编号为CGMCC No.7043。
将游动放线菌株接种于种子培养基，装量为40ml/250ml，在28℃、220rpm的旋转式摇床上培养48h获得种子液；种子液以10%的接种量接种于装量为40ml/250ml的发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度28℃，发酵周期7天。发酵结束后在含有产物闰年霉素的发酵液中加入等体积的乙醇，振摇30min后离心取上清，HPLC测定闰年霉素的发酵单位。
所述种子培养基的组成为：葡萄糖50g/L、低温黄豆饼粉10g/L、牛肉膏4g/L、酵母粉1.0g/L、蛋白胨4.0g/L、氯化钠2.5g/L、碳酸钙5.0g/L，培养基pH7.0-7.2，121℃灭菌30min。
本发明的有益效果在于：
本发明解决了闰年霉素发酵水平低的不足，提供了一种有利于游动放线菌高效发酵生产闰年霉素的发酵培养基，通过优选发酵培养基的有机碳源、有机氮源及配比、无机盐及适量加入维生素B1，从而大幅度提高了闰年霉素的发酵单位，适用于其的发酵生产。
采用该培养基，所得的发酵产物组分较为单一，发酵液中闰年霉素的HPLC纯度达到了75%以上，便于后序分离纯化。
附图说明
图1 是闰年霉素发酵液的液相图。
图2 是闰年霉素粗品的液相图。
图3 是闰年霉素纯品的液相图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所用的培养基各组分如无特殊说明均为工业级原料。
本发明中所使用的游动放线菌菌株（Actinoplanes sp.）N12W0304保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年12月26日，保藏编号为CGMCC No.7043。
高效液相色谱仪器包括996型检测器、515泵（Waters公司生产）；INVOA 500型核磁共振波谱仪购自Varian公司；Acquity uplc system，PDA检测器，Xevo TQ MS/MS检测器均购自Waters公司。
实施例1
将游动放线菌株接种于种子培养基，装量为40ml/250ml，在28℃、220rpm的旋转式摇床上培养48h获得种子液；种子液以10%的接种量接种于装量为40ml/250ml的发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度28℃，发酵周期7天。发酵结束后在含有产物闰年霉素的发酵液中加入等体积的乙醇，振摇30min后离心取上清，HPLC测定闰年霉素的发酵单位。
所述种子培养基的组成为：葡萄糖50g/L、低温黄豆饼粉10g/L、牛肉膏4g/L、酵母粉1.0g/L、蛋白胨4.0g/L、氯化钠2.5g/L、碳酸钙5.0g/L，培养基pH7.0-7.2，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精10g/L，葡萄糖57g/L，低温黄豆饼粉18g/L，酵母粉5g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵2g/L，七水硫酸镁1g/L，碳酸钙3g/L，维生素B1 0.03g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。闰年霉素的发酵单位为2130µg/ml，HPLC纯度为75.6%。HPLC图谱见图1。
实施例2
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精25g/L，葡萄糖30g/L，低温黄豆饼粉25g/L，酵母粉10g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵3.5g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙5g/L，维生素B1 0.1g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2231µg/ml，HPLC纯度为76.1%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例3
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精15g/L，葡萄糖56g/L，低温黄豆饼粉30g/L，酵母粉16g/L，玉米浆2g/L，硫酸铵4 g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.06g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2612µg/ml，HPLC纯度为75.7%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例4
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精10g/L，葡萄糖65g/L，低温黄豆饼粉25g/L，酵母粉15g/L，玉米浆2g/L，硫酸铵5g/L，七水硫酸镁3g/L，碳酸钙5g/L，维生素B1 0.05g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2465µg/ml，HPLC纯度为77.2%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例5
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精14g/L，葡萄糖40g/L，低温黄豆饼粉30g/L，酵母粉13g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵2.8 g/L，七水硫酸镁3g/L，碳酸钙3g/L，维生素B1 0.01g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2084µg/ml， HPLC纯度为76.4%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例6
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精20g/L，葡萄糖50g/L，低温黄豆饼粉20g/L，酵母粉20g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵4.3g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.07g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2507µg/ml， HPLC纯度为78.1%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例7
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精22g/L，葡萄糖54g/L，低温黄豆饼粉20g/L，酵母粉8g/L，玉米浆3g/L，硫酸铵5g/L，七水硫酸镁1g/L，碳酸钙5g/L，维生素B1 0.1g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2269µg/ml，HPLC纯度为76.3%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例8
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精5g/L，葡萄糖49g/L，低温黄豆饼粉15g/L，酵母粉11g/L，玉米浆3g/L，硫酸铵2g/L，七水硫酸镁3g/L，碳酸钙3g/L，维生素B1 0.08g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2176µg/ml，HPLC纯度为76.4%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例9
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精13g/L，葡萄糖33g/L，低温黄豆饼粉12g/L，酵母粉20g/L，玉米浆3g/L，硫酸铵3g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.02g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2362µg/ml，HPLC纯度为79.3%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例10
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精17g/L，葡萄糖50g/L，低温黄豆饼粉10g/L，酵母粉19g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵3.5g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.01g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2405µg/ml，HPLC纯度为78.7%。HPLC图谱与图1基本一致。
综上可知，将本发明发酵培养基用于生产闰年霉素发酵培养基时，具有较高的发酵单位，能大幅度提高闰年霉素的产率。
表1 不同发酵培养基的闰年霉素发酵情况统计
实施例11
a、取实施例1发酵液20L，过滤，得到4.0kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为95%的乙醇12.0L，搅拌浸提3h后过滤，得到闰年霉素浸提液。
b、浸提液在40℃，真空度大于0.08Mpa下减压浓缩至乙醇浓度小于10%，得到1400ml浓缩液，加入2800ml乙酸乙酯萃取3h后，浓缩、干燥得到闰年霉素粗品42g，含量为83.5%（HPLC图谱见图2），粗提收率为80.3%。
c、取闰年霉素粗品10g，加入50ml乙醇溶解，0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有1000ml C18的中压层析柱中，加入乙醇：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为1：10000（v/v），HPLC在线检测，收集含量≥98.5%的洗脱液，40℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素湿粉。将湿粉置于40℃、真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥9h，得到闰年霉素纯品6.1g，含量为99.5%（HPLC图谱见图3），纯化收率为72.7%。
实施例12
a、取实施例2发酵液15L，过滤，得到3.2kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为90%的乙醇水溶液6.4L，搅拌浸提4h后过滤，得到闰年霉素浸提液。
b、浸提液在 50℃，真空度大于0.08Mpa下减压浓缩至乙醇浓度小于10%，得到1120ml浓缩液，加入1120ml乙酸乙酯萃取4h后，浓缩、干燥得到闰年霉素粗品33g，含量为82.7%，粗提收率为81.6%。
c、取闰年霉素粗品10g，加入30ml乙腈溶解，0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有1000ml C18的中压层析柱中，加入乙腈：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为5：10000（v/v），HPLC在线检测，收集含量≥98.5%的洗脱液，50℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素湿粉。将湿粉置于50℃、真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥4h，得到闰年霉素纯品6.0g，含量为99.2%，纯化收率为72.0%。
Claims (5)
1.一种发酵培养基在游动放线菌发酵生产闰年霉素中的应用，其特征在于，所述培养基由有机碳源、有机氮源、无机盐及维生素B1组成，其中，有机碳源为麦芽糊精5-25g/L，葡萄糖30-65g/L；有机氮源为低温黄豆饼粉10-30g/L，酵母粉5-20g/L，玉米浆1-3g/L；无机盐为硫酸铵2-5g/L，七水硫酸镁1-3g/L，碳酸钙3-5g/L；维生素B1为0.01-0.1g/L；所述闰年霉素发酵培养基的菌种为游动放线菌Actinoplanes sp.N12W0304，保藏编号为CGMCCNo.7043。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的有机碳源中麦芽糊精用量为10-20g/L，葡萄糖用量为50-65g/L。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的有机氮源中低温黄豆饼粉用量为20-30g/L，酵母粉用量为15-20g/L，玉米浆用量为1-2g/L。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的无机盐中硫酸铵用量为4-5g/L，七水硫酸镁用量为2-3g/L，碳酸钙用量为4-5g/L。
5.根据权利要求1所述的应用，所述的维生素B1用量为0.05-0.07g/L。
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