CN111718404A - 一种分离血清中高密度脂蛋白的装置、其制备方法及分离血清中高密度脂蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离血清中高密度脂蛋白的装置，其包括具有管道且所述的管道的两端与外界连通的管体、设置在所述的管体的管道内的过滤组件，所述的过滤组件包括低密度脂蛋白阻隔滤膜，所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜通过将滤膜浸泡在处理液中，然后经干燥制得；所述的处理液包括浓度为20～30mg/mL的低密度脂蛋白阻隔试剂、0.2～0.3M的MgCl2、质量浓度为0.016％～0.024％的防腐剂以及水。本发明的设备成本低、普及率高、易于制备获得，且反应快速，操作方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离血清中高密度脂蛋白的装置、其制备方法及分离血清中高密度脂蛋白的方法。
背景技术
高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein,HDL)是大多数哺乳类动物血浆中最多的脂蛋白,但人血浆中HDL水平较低密度脂蛋白(LDL)低,按密度差别可再分成HDL1、HDL2、HDL3等几个亚类。血浆HDL中的载脂蛋白主要为apoAI和apoAⅡ，apoAI与HDL的结合较松,apoAⅡ结合则较紧。HDL呈球形,是血浆中密度最大、颗粒最小、且极不均一的一类脂蛋白。HDL的主要功能是参与机体胆固醇逆向转运(RCT),可将周围组织细胞的胆固醇移出并转运至肝脏转化清除,因而具有对抗动脉粥样硬化(AS)发生及发展的潜在作用。临床上主要用于治疗高血脂症、冠心病、动脉粥样硬化等疾病。为了生物及医药方面研究的需要,研究者常需制备脂蛋白纯品,采用的方法有超速离心法、化学沉淀法(如硫酸右旋糖苷沉淀法)、凝胶过滤和高压液相层析法等。
迄今为止,采用密度梯度超速离心分离纯化各种脂蛋白仍是纯度较高、简便实用的好方法。超速离心法可分为制备型和分析型两种,制备型密度梯度离心法可以分为等密度离心法和速率-区带密度梯度离心法,可以选用的转头有角头、甩平头、垂直头和区带头。具体方法如下所述：
1、梯度液配制：
A液：使用天平称取0.1g EDTA-Na2和11.40g NaCl,将称好的试剂放入1L烧杯中,用量筒量取500ml纯水加入烧杯，再加入1mL浓度为1M的NaOH,搅拌至全部溶解。加纯水至1000mL。最后再加3mL纯水。最终溶液中NaCl浓度为0.195mol，溶液终密度1.006g/cm3,pH10.37。
B液:使用天平称取24.98g NaBr，加入到100mL A液中。最终溶液中NaCl浓度为0.195mol，NaBr浓度为2.44mol，溶液终密度1.182g/cm3，pH 9.72。
C液:使用天平称取78.32g NaBr，加入到100mL A液中。最终溶液中NaCl浓度为0.195mol，NaBr浓度为7.65mol，溶液终密度1.478g/cm3，pH 8.86。
2、离心机、转头、离心管：
1)离心机：Hitachi CP-MX系列超速离心机或其他类似机组，如Hitachi CS-150GXL微量超速离心机。
2)转头和离心管：S140 AT：140,000rpm，1,050,000×g,10×2mL，K＝5，1PC厚壁管。S80 AT3：80,000rpm,415,000×g，8×8mL，K＝23，6PC厚壁管。S70 AT：70,000rpm,505,000×g，8×40mL,K＝44，40PA管。
3、离心操作
1)血浆-血球分离：全血,角转头或甩平转头3000rpm×20min，沉淀为血细胞,上清为血浆，待用。
2)乳糜微粒(CM)分离：任意转头均可使用，10℃条件下将离心机设置为4×106(g×min)。离心管内底部3/4容积为血浆，上部1/4为0.15M NaCl+0.3M EDTA，pH7.4。离心后CM将上浮到上层。此时将离心管倾斜，使用移液枪将CM缓慢吸出。
3)极低密度脂蛋白(VLDL)分离：使用S140AT(或同类型)转头，在离心管下部加入30mL血浆，上部加入15mL A液，以140,000rpm的转速，16℃条件下离心50min(加速5，减速7)。完成后可见离心管中明显分层，上部1/3为VLDL。此时将离心管倾斜，使用移液枪将极低密度脂蛋白缓慢吸出。
4)低密度脂蛋白(LDL)(含中间密度脂蛋白IDL)分离：使用S140AT(或同类型)转头，将离心管中剩下的30mL血样的表面加入15mL的B液，以140,000rpm的转速，16℃条件下离心80min(加速9，减速7)。完成后可见离心管中明显分层，上部1/3为LDL+IDL。此时将离心管倾斜，使用移液枪将LDL+IDL缓慢吸出。
5)高密度脂蛋白(HDL)分离：使用S140AT(或同类型)转头，将离心管中取出LDL+IDL后，剩下的30mL血样移入另一离心管中，表面加入15mL的C液，以140,000rpm的转速，16℃条件下离心140min(加速9，减速7)。完成后可见离心管中明显分层，上部为HDL，下部为血清白蛋白及球蛋白。此时将离心管倾斜，使用移液枪将HDL缓慢吸出。
至此，完成了对血浆中乳糜微粒、LDL和HDL的分离。
目前普遍采用的超速离心法分离LDL与HDL的方案，需要使用价格昂贵的超高速离心机作为主要的分离设备，而且实验步骤多，操作十分复杂，需要配制多种试剂，最重要的是十分耗时，整个分离时间往往超过6小时。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低廉，且在30分钟内即可高效地将血浆中的LDL除去，得到较高纯度的HDL的装置。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种所述装置的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种采用上述装置高效地将血浆中的LDL除去，得到较高纯度的HDL的方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种分离血清中高密度脂蛋白的装置，其包括具有管道且所述的管道的两端与外界连通的管体、设置在所述的管体的管道内的过滤组件，所述的过滤组件包括低密度脂蛋白阻隔滤膜，所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜通过将滤膜浸泡在处理液中，然后经干燥制得；所述的处理液包括浓度为20～30mg/mL的低密度脂蛋白阻隔试剂、0.2～0.3M的MgCl2、质量浓度为0.016％～0.024％的防腐剂以及水。
优选地，所述的处理液包括浓度为22～28mg/mL的低密度脂蛋白阻隔试剂、0.22～0.28M的MgCl2、质量浓度为0.018％～0.022％的防腐剂以及水。
进一步优选地，所述的处理液包括浓度为24～26mg/mL的低密度脂蛋白阻隔试剂、0.24～0.26M的MgCl2、质量浓度为0.019％～0.021％的防腐剂以及水。
优选地，所述的低密度脂蛋白阻断试剂为硫酸葡聚糖及其盐、磷钨酸镁、聚乙二醇20000中的一种或多种。
进一步优选地，所述的低密度脂蛋白阻断试剂为硫酸葡聚糖及其盐。
更为优选地，所述的低密度脂蛋白阻断试剂为硫酸葡聚糖钠盐。
优选地，所述的防腐剂为Procline300。
优选地，所述的滤膜为玻璃纤维滤膜、滤纸或纱布。
进一步优选地，所述的滤膜为玻璃纤维膜，所述的玻璃纤维滤膜包括但不限于millipore AQFA型、whatman GFB膜、科百特PES膜。
更为优选地，所述的玻璃纤维滤膜为whatman GFB膜。
所述的滤膜的厚度为650～700微米，过滤速度为400～450微米/秒。
进一步优选地，所述的玻璃纤维滤膜的厚度为670～680微米，过滤速度为430～440微米/秒。
优选地，3～5张所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜压紧塞实在所述的管体的管道内形成所述的过滤组件。
优选地，所述的管体为移液枪头。
本发明中采用的移液枪头可以为多种规格，例如，5mL、10mL等规格的移液枪头。
本发明的另一个目的是提供一种所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将所述的滤膜切割成圆片；
步骤(2)、将所述的低密度脂蛋白阻隔试剂、所述的MgCl2、所述的的防腐剂溶于水中配制成所述的处理液；
步骤(3)、将经步骤(1)切割后的滤膜在步骤(2)配置的所述的处理液中浸泡50～70min，然后在35～40℃下干燥50～70min，制得所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜；
步骤(4)、将步骤(3)制得的所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜塞入所述的管体的管道中制成所述的排除血清中低密度脂蛋白的装置。
本发明的第三个目的是提供一种分离血清中高密度脂蛋白的方法，采用多个所述的装置对血清进行多轮过滤以排除血清中的低密度脂蛋白，滤液即为高密度脂蛋白，其中，每轮过滤的具体方法为：将血清从所述的管体的一端加入所述的管体中，然后使用移液枪对所述的管体中的血清进行加压以促使血清滤过所述的过滤组件，收集滤液。
优选地，进行2～5轮所述的过滤。
本发明中所述的进行多轮过滤是指采用1个所述的装置对血清进行过滤后收集滤液，为1轮过滤，将收集到的滤液再采用另一个所述的装置进行过滤后收集滤液，为2轮过滤。
本发明的原理是基于LDL(低密度脂蛋白)、VLDL(极低密度脂蛋白)和乳糜微粒(CM)表面都以主要带阴离子的载脂蛋白B(ApoB)为主，而硫酸葡聚糖等低密度脂蛋白阻隔试剂和Mg2+能使这些脂蛋白成份聚集形成沉淀，从而达到分离HDL和LDL的目的。在本方案中，我们使用玻璃纤维过滤膜作为载体，将其浸泡在硫酸葡聚糖和Mg2+的试剂中，使相关试剂饱和吸附在滤膜上，将滤膜塞入移液枪头中制备成简易过滤器，用于过滤血清。血清通过滤膜时，其中的LDL等相关成份会被滤膜中的硫酸葡聚糖和Mg2+聚集成沉淀留在滤膜中，而HDL成分则可以穿过滤膜，从而实现两种成份的分离。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供了一种简单易行的分离血清中高密度脂蛋白(HDL)的装置及方法，制备该装置所需试剂简单、材料廉价易得，在30分钟内即可将血清中90％的LDL排除，而保留50％以上的高密度脂蛋白(HDL)。可高效地将血浆中的LDL除去，得到较高纯度的HDL。
本发明的设备成本低、普及率高、易于制备获得，且反应快速，操作方便。
附图说明
附图1为装置的示意图；
附图2为装置的使用状态示意图；
附图3为实施例1的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用试剂均可市购获得，具体型号如下：
| 试剂名称 | 型号(分子量) | 用途 | 来源 |
| 硫酸葡聚糖钠盐 | 6,500～10,000 | 低密度脂蛋白阻隔试剂 | 市购 |
| 硫酸葡聚糖钠盐 | 50,000 | 低密度脂蛋白阻隔试剂 | 市购 |
| 磷钨酸钠水合物 | - | 低密度脂蛋白阻隔试剂 | 市购 |
| Proclin 300 | - | 防腐剂 | 市购 |
| MgCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O | - | 辅酶 | 市购 |
实施例1：包括具有管道且所述的管道的两端与外界连通的管体、设置在所述的管体的管道内的过滤组件，所述的过滤组件包括低密度脂蛋白阻隔滤膜：
(1)将GFB玻璃纤维滤膜切割为直径13mm的圆片，备用；
(2)配制15mL处理液，其中：硫酸葡聚糖(DS)钠盐(6,500-10,000)：25mg/ml、MgCl2:0.25M、Procline300:质量百分比0.02％；
(3)将第一步中制作的圆形滤膜在处理液中浸泡1小时，37摄氏度条件下在鼓风烘箱中烘干1小时，制得低密度脂蛋白阻隔滤膜1，备用；
(4)将制备好的4张圆形低密度脂蛋白阻隔滤膜1塞入5mL移液枪头2中，用玻璃棒将移液枪头2中的低密度脂蛋白阻隔滤膜1压紧、塞实，即制备成一个简易的LDL过滤头，即为本发明的装置；
(5)用移液枪3将血清5从LDL过滤头开口较大的一头加入LDL过滤头中，在开口较大的一头使用移液枪对过滤头中的血清进行加压，促进其滤过低密度脂蛋白阻隔滤膜1。在LDL过滤头的尖端用EP管或小烧杯4收集过滤后的血清；
(6)使用3个LDL过滤头对1份血清进行3轮过滤，将每次过滤前后的血清使用日立7180全自动生化分析仪进行HDL-c和LDL-c的检测，结果如图3所示。可见经3轮过滤后，血清中仍然保留原HDL的近60％(HDL浓度由1.377mmol/L下降到0.819mmol/L)，而LDL浓度由4.333mmol/L下降至0.423mmol/L，下降幅度达90％。
实施例2：包括具有管道且所述的管道的两端与外界连通的管体、设置在所述的管体的管道内的过滤组件，所述的过滤组件包括低密度脂蛋白阻隔滤膜：
(1)将Millipore玻璃纤维滤膜切割为直径13mm的圆片，备用；
(2)配制15mL处理液，其中：磷钨酸钠盐：10mg/ml、MgCl2:0.25M、Procline300:质量百分比0.02％；
(3)将第一步中制作的圆形滤膜在处理液中浸泡1小时，37摄氏度条件下在鼓风烘箱中烘干1小时，制得低密度脂蛋白阻隔滤膜1，备用；
(4)将制备好的4张圆形低密度脂蛋白阻隔滤膜1塞入5mL移液枪头2中，用玻璃棒将移液枪头2中的低密度脂蛋白阻隔滤膜1压紧、塞实，即制备成一个简易的LDL过滤头，即为本发明的装置；
(5)用移液枪3将血清5从LDL过滤头开口较大的一头加入LDL过滤头中，在开口较大的一头使用移液枪对过滤头中的血清进行加压，促进其滤过低密度脂蛋白阻隔滤膜1。在LDL过滤头的尖端用EP管或小烧杯4收集过滤后的血清；
(6)使用3个LDL过滤头对1份血清进行3轮过滤，将每次过滤前后的血清使用日立7180全自动生化分析仪进行HDL-c和LDL-c的检测，结果如图3所示。可见经3轮过滤后，血清中仍然保留原HDL的近50％(HDL浓度由1.377mmol/L下降到0.652mmol/L)，而LDL浓度由4.333mmol/L下降至0.816mmol/L，下降幅度达80％。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (14)
1.一种分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：其包括具有管道且所述的管道的两端与外界连通的管体、设置在所述的管体的管道内的过滤组件，所述的过滤组件包括低密度脂蛋白阻隔滤膜，所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜通过将滤膜浸泡在处理液中，然后经干燥制得；所述的处理液包括浓度为20～30mg/mL的低密度脂蛋白阻隔试剂、0.2～0.3M的MgCl2、质量浓度为0.016％～0.024％的防腐剂以及水。
2.根据权利要求1所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的处理液包括浓度为22～28mg/mL的低密度脂蛋白阻断试剂、0.22～0.28M的MgCl2、质量浓度为0.018％～0.022％的防腐剂以及水。
3.根据权利要求2所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的处理液包括浓度为24～26mg/mL的低密度脂蛋白阻断试剂、0.24～0.26M的MgCl2、质量浓度为0.019％～0.021％的防腐剂以及水。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的低密度脂蛋白阻断试剂为硫酸葡聚糖及其盐、磷钨酸镁、聚乙二醇20000中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的低密度脂蛋白阻断试剂为硫酸葡聚糖及其盐。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的防腐剂为Procline300。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的滤膜为玻璃纤维滤膜、滤纸或纱布，所述的滤膜的厚度为650～700微米，过滤速度为400～450微米/秒。
8.根据权利要求7所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的滤膜为玻璃纤维膜，所述的玻璃纤维滤膜为millipore AQFA型、whatman GFB膜、科百特PES膜。
9.根据权利要求8所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的玻璃纤维滤膜为whatman GFB膜。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：3～5张所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜压紧塞实在所述的管体的管道内形成所述的过滤组件。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置，其特征在于：所述的管体为移液枪头。
12.一种如权利要求1至11中任一项所述的分离血清中高密度脂蛋白的装置的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(1)、将所述的滤膜切割成圆片；
步骤(2)、将所述的低密度脂蛋白阻隔试剂、所述的MgCl2、所述的的防腐剂溶于水中配置成所述的处理液；
步骤(3)、将经步骤(1)切割后的滤膜在步骤(2)配制的所述的处理液中浸泡50～70min，然后在35～40℃下干燥50～70min，制得所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜；
步骤(4)、将步骤(3)制得的所述的低密度脂蛋白阻隔滤膜塞入所述的管体的管道中制成所述的排除血清中低密度脂蛋白的装置。
13.一种分离血清中高密度脂蛋白的方法，其特征在于：采用多个如权利要求1至11中任一项所述的装置对血清进行多轮过滤以排除血清中的低密度脂蛋白，滤液即为高密度脂蛋白，其中，每轮过滤的具体方法为：将血清从所述的管体的一端加入所述的管体中，然后使用移液枪对所述的管体中的血清进行加压以促使血清滤过所述的过滤组件，收集滤液。
14.根据权利要求13所述的分离血清中高密度脂蛋白的方法，其特征在于：进行2～5轮所述的过滤。
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