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CN111686111B - Malt1蛋白酶抑制剂在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用 - Google Patents

Malt1蛋白酶抑制剂在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用 Download PDF

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CN111686111B CN202010516594.7A CN202010516594A CN111686111B CN 111686111 B CN111686111 B CN 111686111B CN 202010516594 A CN202010516594 A CN 202010516594A CN 111686111 B CN111686111 B CN 111686111B
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Abstract

本发明公开了MALT1蛋白酶抑制剂MI‑2在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。本发明中的MALT1抑制剂MI‑2能有效抑制NSCLC细胞系的细胞增殖和迁移能力。在体内试验中，对小鼠原位肺癌模型显示出了极佳的治疗效果，有效的抑制了肿瘤的生长，可作为治疗NSCLC的有效手段进一步研究与发展。

Description

MALT1蛋白酶抑制剂在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及MALT1蛋白酶抑制剂的应用领域，具体涉及MALT1蛋白酶抑制剂MI-2在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。
背景技术
肺癌是人群中发病率和死亡率最高的一种癌症，其发病率和死亡率呈现不断增长的趋势。每年全世界约有160万人死于肺癌，其中85％是非小细胞肺癌(NSCLC)。在我国，肺癌发病率也呈现逐年上升趋势，预期至2025年新发病例将超过100万人次，每年大约将有61万人死于肺癌，位居我国癌症死亡的首位。NSCLC患者的早期临床症状不明显，发现或确诊的比例低于15％，因此超过80％的患者因发现时已经处于临床晚期或身体机能较差，不适合进行手术切除。虽然放疗、化疗等治疗方式不断进步，但对于局部晚期的NSCLC的患者，现有的联合放化疗方案对于预后的改善并不明显。
酪氨酸抑制剂(TKIs)是针对EGFR突变的NSCLC的药物，目前临床上应用较多。临床试验数据显示，其客观缓解率(ORR)为51％，疾病控制率(DCR)为84％，无进展生存期(PFS)为8.2月。细胞学实验证明，肿瘤中其他基因的突变会影响TKIs类药物抑制肿瘤细胞增殖的效果，也有动物实验的研究表明，此类药物单独使用并不能有效抑制肿瘤的生长，至少需要同时使用两种药物才有效。同时，该类药物的使用缺陷十分明显，服用该药后，不仅不良反应的发生率较高，还会出现不可避免的耐药性。另一种应用较多的药物为PD-1/PD-L1抗体，与传统化疗相比，其PFS可延长4个月。然而，PD-1/PD-L1抗体药物所导致的免疫反应不良事件发生几率较高。除上述两类药物外，常用于治疗NSCLC的药物也存在一些问题，如ALK抑制剂存在耐药性问题。因此，开发更为有效且安全性的NSCLC治疗药物是目前亟待解决的重要临床问题。
MALT1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocationprotein 1)最初是在MALT淋巴瘤中的t(11；18)(q21；q21)中发现的。在淋巴瘤中，MALT1通常与BCL10和CARMA1组成CBM复合体，通过激活NF-κB通路从而促进淋巴瘤的发生和发展。已有的研究证实，NF-κB通路不仅参与B细胞的激活和发育过程，并且在人类遗传性疾病、炎症反应以及多种恶性肿瘤的发生发展中都起到着重要的作用。因此，针对NF-κB通路的抑制剂也作为靶向药物被广泛的应用于临床。有实验表明，在ABC-DLBCL淋巴瘤中，阻断NF-κB通路是一种有效的治疗手段。此外，NF-κB抑制药物可广泛抵抗自身免疫性和淋巴增生性疾病。虽然，此前有报道验证了MALT1在黑色素瘤中可以通过激活NF-κB通路发挥促癌作用。但MALT1在NSCLC中的作用还尚不清楚，是否也可以通过影响NF-κB通路从而影响NSCLC的发生和发展也需要更多的研究证据支持。
发明内容
本发明的目的在于提供MALT1蛋白酶抑制剂在制备非小细胞肺癌治疗药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
MALT1蛋白酶抑制剂在制备肺癌治疗药物中的应用。
进一步地，上述肺癌为非小细胞肺癌。
进一步地，上述MALT1蛋白酶抑制剂为MI-2。
本发明的第二个方面，提供：
MALT1蛋白酶抑制剂在制备细胞增殖和迁移的药剂中的应用。
进一步地，上述细胞为非小细胞肺癌细胞。
进一步地，上述非小细胞肺癌细胞包括肺腺癌细胞、大细胞肺癌细胞。当然，可以根据实际需求，合理的替换为其他非小细胞肺癌(NSCLC)系细胞。
更进一步地，上述肺腺癌细胞株型为A549，上述大细胞肺癌细胞株型为H460。当然，可以根据实际需求，合理的替换为其他肺腺癌细胞株型和大细胞肺癌细胞株型。
进一步地，上述MALT1蛋白酶抑制剂为MI-2。
本发明的第三个方面，提供：
MALT1蛋白酶抑制剂在制备NF-κB通路抑制剂中的应用。
进一步地，上述MALT1蛋白酶抑制剂为MI-2。
本发明的有益效果是：在体外实验中，以肺腺癌细胞株A549和大细胞肺癌细胞株H460作为研究对象，本发明的MALT1抑制剂可抑制NSCLC细胞系的细胞增殖和迁移能力；在体内实验中，以小鼠原位肺癌模型为实验对象，本发明的MALT1抑制剂可抑制肿瘤生长，最终作为治疗NSCLC的有效手段。
附图说明
图1是MI-2对A549(A)和H460(B)细胞增殖的影响；
图2是MI-2对A549(A)和H460(B)细胞克隆形成能力的影响(右图为统计图)；
图3是MI-2对A549(A)和H460(B)细胞迁移的影响(右图为统计图)；
图4是MI-2对小鼠原位肺癌的影响：(A)给药结束时小鼠肺部荧光信号强度；(B)是每周小鼠肺部荧光信号强度的统计图；(C)处死小鼠后组织切片的镜下图；
图5是MI-2抑制NF-κB通路的激活：(A)A549细胞；(B)H460细胞。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验操作说明
1.细胞培养
选取A549和H460细胞作为实验对象，在37℃、5％CO2培养条件下，使用含10％新生牛血清和100U/ml青霉素-链霉素的DMEM进行传代培养。当细胞汇合度长至70％-80％时，进行细胞传代并用于后续实验。
2.细胞增殖实验
在96孔板中接种细胞，24h后换为含有不同浓度的MI-2的新鲜培养基。在24h后每孔加入10μl CCK-8，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育2h后，用酶标仪在450nm处读取OD值。
3.克隆形成实验
在6孔板中接种500个细胞，24h后换为含有不同浓度的MI-2的新鲜培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育10-14天。克隆形成后使用3.7％甲醛固定，并用0.1％结晶紫染色。含有超过50个细胞的集落数目进行计数，并进行统计学分析。
4.细胞迁移实验
当细胞长至对数生长期时，消化细胞后进行计数，取4x104个细胞重悬于200μlDMEM中。将transwell小室置于24孔板中，在下室中加入750μl新鲜培养基，上室中加入200μl细胞悬液，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育16h后，使用3.7％甲醛固定，并用0.1％结晶紫染色。于高倍镜下选取5个不同的视野拍摄照片，并使用Image J软件进行计数。计数结果进行统计学分析。
5.小鼠原位肺癌模型
购买4-6周的BALB/c雌性裸鼠，在裸鼠适应环境一周后进行实验。使用异氟烷进行麻醉，将小鼠取右侧卧位置于实验台上，4x106个的A549-Luc细胞用29G胰岛素针沿腋后线以45°角直接注射入小鼠左肺，进针深度约3-5mm。在细胞接种一周后，按照体重将小鼠随机分为两组，即对照组和MI-2组，其中，对照组3只，MI-2组4只。从细胞接种一周后开始给药，MI-2组按照每天25mg/kg的剂量腹腔注射MI-2(使用含5％DMSO的PBS溶液溶解)，对照组给等体积的含5％DMSO的PBS，共给药3周。使用多模式小动物活体成像系统(In-vivo Fx Pro，Bruker)观察小鼠体内瘤体生长情况，每周一次，成像前按150mg/kg的剂量注射D-荧光素钠盐，根据荧光强度和面积计算分析肿瘤生长情况。
6.统计学分析
统计学分析使用SPSS 20.0软件进行分析。使用独立样本单因素方差分析，所有数据均采用双侧检验及方差齐性分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001具有统计学意义。
实验结果
1.MI-2抑制NSCLC细胞增殖和迁移
在A549和H460细胞中，使用不同浓度的MI-2进行处理24h，分别通过CCK-8、克隆形成实验以及transwell迁移实验来检测NSCLC细胞的增殖和迁移能力。如图1所示，CCK-8实验结果发现，细胞增殖能力随着MI-2剂量的增加不断下降，且差异具有统计学意义。如图2所示，经过14天的克隆形成实验，结果表明，MI-2剂量越大，克隆数越少，且在大剂量的情况下细胞无法形成克隆，差异具有统计学意义。如图3所示，Transwell迁移实验结果发现，随着MI-2剂量的增加，细胞穿过小室的能力明显下降，差异具有统计学意义。上述结果说明，MI-2可有效抑制NSCLC细胞的增殖和迁移，从而可达到抑制NSCLC的发展的目的。
2.MI-2在体内抑制肿瘤生长
通过小鼠肺癌原位模型的建立，检测MI-2在体内对肿瘤生长的影响。结果显示，持续给药3周后，给药组的小鼠肺部荧光信号强度自给药一周后开始下降并保持稳定(如图4A-4B)，而对照组小鼠的肺部荧光信号强度持续增强，且处死小鼠后的肺部组织切片显示MI-2组小鼠肺部实变部分少于对照组，肺泡多呈正常形态(如图4C)，说明MI-2可以抑制小鼠肺部肿瘤的发展。
3.MI-2抑制NF-κB通路的激活
在A549和H460细胞中，使用不同浓度的MI-2进行处理24h，通过western blot实验检测NF-κB通路关键蛋白p-p65的表达情况。如图5所示，随着MI-2剂量的增加，p-p65的表达随之下降。上述结果表明MI-2可能通过抑制NF-κB通路的激活从而调控NSCLC的增殖和迁移能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.MI-2作为唯一活性物质在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，所述MI-2能够抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移，以及抑制NF-κB通路。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌细胞包括肺腺癌细胞、大细胞肺癌细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肺腺癌细胞株型为A549，所述大细胞肺癌细胞株型为H460。
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