CN111684285A - 利用光散射确定溶液中脂蛋白浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用单颗粒光散射，优选干涉散射显微技术(本文也称为iSCAT)来测量溶液中颗粒的浓度。此外，本发明涉及使用光散射来检测样品中的脂蛋白颗粒，并且涉及相关的诊断和治疗方法。
Description
技术领域
本发明涉及使用单颗粒光散射，优选干涉散射显微技术(本文也称为iSCAT)，来测量溶液中颗粒的浓度。颗粒可存在于简单或复杂的溶液中，例如生物或环境样品。本发明可用于确定溶液中颗粒的绝对浓度，并且这种能力提供了研究溶液中不同颗粒之间化学计量关系的手段。正如发明人已证明的那样，iSCAT还提供了对小至单个分子的颗粒进行可靠且精确的检测、质量量化、成像和表征的手段，并且因此使用相同技术进行浓度测量的能力是非常有好处的。
此外，本发明涉及使用光散射，优选干涉散射显微技术(本文也称为iSCAT)来检测样品中的脂蛋白颗粒，并且涉及相关的诊断和治疗方法。本方法测量溶液中各种脂蛋白浓度的能力是特别令人感兴趣的。
背景技术
iSCAT已经成为一种强大的方法，既能以独特的时空分辨率进行单颗粒跟踪，又具有低至单分子水平的无标记灵敏度。
干涉散射显微技术提供溶液中关于不同质量颗粒相对分布的信息，而无需加入标记物。加入绝对或相对浓度的颗粒提供了关于被分析样品的有价值的附加信息，特别是当该溶液是生物或环境样品时。
在本申请人的早期工作之前，对定制显微镜、非常规相机和复杂样品照明的要求限制了iSCAT的广泛应用，从而限制了iSCAT对小至单个分子的颗粒进行可靠且精确的检测、成像和表征的能力。然而，随着仪器的改进的发展，使得该技术已经发展成为观察单一目标物(objects)的强大手段。iSCAT仪器的示例性设计记载于Cole et al ACSPhotonics,2017,4(2),pp 211–216和Arroyo et al.Nat Protocols 2016,617-633中，这两篇文件均通过引用并入本文。关于该仪器的进一步细节还提供在本申请人的早期申请WO2018/011591中，该文件通过引用并入本文。
之前已经记载了iSCAT用于对纯化的单一蛋白质进行检测(Cole et al(ACSPhotonics,2017,4(2),pp 211-216)，但是由于认为检测复杂溶液中的颗粒是不可行的，故此之前并没有对脂蛋白的检测和定量进行探索。
心血管疾病的诊断分析可包括检测脂蛋白(也称为脂蛋白颗粒)。在Circulation.2009May 5；119(17):2396–2404；Curr Opin Lipidol.2017Jun；28(3):261-266中综述了检测脂蛋白检测的多种方法。这些方法存在耗时、昂贵、关于脂蛋白颗粒的信息提供不完整和/或在临床环境中应用受限的缺点。
发明内容
本发明人惊讶地发现，可使用单颗粒光散射，优选单颗粒干涉散射显微技术来确定溶液中颗粒的浓度。此外，本发明人出乎意料地证明了，可通过直接来自生物样品(例如血液或血浆)的单颗粒光散射(例如通过使用iSCAT)来确定颗粒的浓度，而无需将这些颗粒从其它组分中纯化出来，尽管这些其它组分会带来背景信号。这已被证明是对例如生物样品中的脂蛋白特别有用的技术。
本发明提供了一种测量溶液中颗粒的浓度的方法，包括使该溶液与表面接触，并使用光散射检测所述颗粒与该表面的结合。
用于检测颗粒结合的光散射方法优选为iSCAT。该方法可以优选使用合适的显微镜来进行。上述浓度优选为绝对浓度。可使用单颗粒光散射来检测或可视化(visualised)所述颗粒与所述表面的结合。
本发明提供了一种确定溶液中颗粒的浓度的方法，包括使所述溶液与测量溶液和表面接触，并使用光散射来检测颗粒与所述表面的结合。
本发明的该特征在溶液被认为是浓缩的情况下是特别有用的。在检测颗粒与表面的结合之前，可将一定体积的含该颗粒的溶液与一定体积的测量溶液一起容纳在样品保持器中。这方面的优点在于确保所测量的浓度代表了原始的更浓的溶液中颗粒的状态。
本发明提供了一种确定溶液中颗粒的浓度的方法，包括：在校准物的存在下，使该溶液与表面接触；并使用光散射来检测该颗粒与该表面的结合。
因此，本发明能够通过检测所述颗粒与表面的结合速率来测量溶液中颗粒的浓度。
此外，本发明能够通过分析光散射检测到的颗粒与表面的结合速率随时间的变化或衰减来测量溶液中颗粒的绝对浓度。
溶液中的绝对浓度可通过测量样品中颗粒与表面之间的结合事件来确定，并相对于已知颗粒浓度的样品所观察到的结合事件来校准。该表面可以是样品保持器的一部分。在具有高表面积-体积比的样品保持器中，颗粒与表面的结合依据溶液中剩余的颗粒数和结合的可用位点而随着时间降低。由结合数据可外推出一系列浓度的初始结合速率，并且该一系列浓度的初始结合速率金可用于生成标准曲线，从而使得能够将所测得的样品中的初始结合速率转换为溶液中颗粒的相应绝对浓度。
可使用光散射，优选iSCAT来检测或可视化颗粒与表面的结合。
可替代地，溶液中的浓度可以通过使用钝化或活化的表面来确定，从而可以通过控制表面与颗粒之间的结合活性来控制颗粒的结合速率。在这种情况下，表面活化或钝化可以增加结合亲和力并由此将测量范围扩大到更低的浓度或者可以降低结合亲和力并因此能够在更高的浓度下进行测量。
优选地，该表面形成用于所述溶液的样品保持器的一部分。所述样品保持器可以是光散射显微镜的元件。样品保持器可以是高表面积-体积比的腔室。
为了计算浓度，可能需要对扩散速率进行校正。根据颗粒的已知性质，如质量和形状可以容易地计算出扩散速率。
因此，本发明提供了一种测量溶液中颗粒的浓度的方法，该方法包括：
i)使该溶液与表面接触；
ii)检测通过光散射可视化的与所述表面结合的颗粒；
iii)重复检测步骤，并计算颗粒与表面的结合速率和初始结合速率随时间的变化；
iv)基于来自已知颗粒浓度的溶液的数据，提供初始结合速率相对于浓度的校准曲线；
v)使用步骤(iv)中的校准曲线将步骤(iii)中记录的样品的初始结合速率转换为溶液中颗粒的浓度。
优选地，上述浓度是绝对浓度。
在一些变型中，在与表面接触之前或同时，可对溶液进行预处理，例如用测量溶液或校准物进行预处理。
可使溶液中的颗粒与测量溶液和表面接触。
这方面的优点在于确保所测量的浓度代表了原始的更浓的溶液中颗粒的状态。
测量溶液可以是缓冲溶液。通常，测量溶液的体积是已知的，以便能够计算稀释效应。
可能需要多种技术来制备用于确定浓度的溶液。例如，可将一定体积的溶液置于优选具有已知几何形状的样品保持器中。这使得能够引入一定体积的测量溶液(或者将颗粒溶液引入测量溶液)，并且利用稀释作用，使得检测到的颗粒与表面的结合速率能够转换成颗粒的浓度。
可在引入测量溶液后的一个或多个不同的时间间隔下进行对颗粒与表面的结合的检测。如果在引入测量溶液后的不同时间间隔重复检测步骤，则这将使得能够校正稀释效应，如解离。如果在加入(并由此稀释)后的不同时间点进行测量，则可以可视化出当颗粒在较低浓度下发生解离或聚集时例如物质分布的变化。因此，这种方法使得能够更详细地观察颗粒，并能够验证浓度测量结果。
可替代地或附加地，上述溶液(颗粒溶液或测量溶液)之一或两者的体积可以变动，和/或样品保持器的几何形状可以变动。这两种情况都能够修正稀释效应。如果检测步骤以一个或多个不同溶液体积和/或在不同几何形状的一个或多个样品保持器中重复进行，也可以修正稀释效应，例如解离。
因此，本发明提供了一种确定溶液中颗粒的浓度的方法，该方法包括：
i)在具有一定几何形状的样品保持器中，使溶液与表面和一定体积的测量溶液接触；
ii)检测通过光散射可视化的与表面结合的颗粒；
iii)重复检测步骤，并计算颗粒与表面的结合速率和初始结合速率随时间的变化；
iv)基于来自已知颗粒浓度的溶液的数据，提供初始结合速率相对于浓度的校准曲线；
v)使用步骤(iv)中的校准曲线，将步骤(iii)中记录的样品的初始结合速率转换为溶液中颗粒的绝对浓度。
该方法可进一步涉及使用具有不同几何形状的一个或多个样品保持器或使用不同体积的测量溶液来重复步骤(i)至步骤(ii)，以便验证所确定的浓度。
可替代地，可在校准物的存在下，使溶液中的颗粒与表面接触。
溶液中的校准物具有预定的浓度和质量。一旦将其引入到颗粒溶液中，独立但同时地检测校准物和颗粒与所述表面的结合速率。重复测量颗粒和校准物与表面的结合，从而能够确定颗粒的初始结合速率和校准物的初始结合速率。已知浓度的校准物的初始结合速率允许将颗粒的初始结合速率转换为所述颗粒的浓度。
在一个实施方式中，对校准物进行选择，使其在与表面结合的特征方面与颗粒相似。例如，可取的是，选择具有相似表面性质(例如电荷、疏水性、亲水性)的校准物。这种选择使得能够对各种颗粒进行更精确的测量。有效地，校准物和颗粒对表面应该具有相同的亲和力，因此已知浓度的校准物的结合速率的确定允许将颗粒的结合速率转换成浓度。
因此，本发明提供了一种测量溶液中颗粒的浓度的方法，该方法包括：
i)在校准物的存在下，使该溶液与表面接触；
ii)检测通过光散射可视化的与表面结合的颗粒；
iii)同时检测通过光散射可视化的与表面结合的校准物；
iv)重复检测步骤(ii)和(iii)，并计算颗粒和校准物与表面的结合速率和初始结合速率随时间的变化；
v)使用步骤(iv)中计算的校准物的初始结合速率，将步骤(iv)中计算的颗粒的初始结合速率转换为溶液中颗粒的浓度。
优选地，校准物具有已知的浓度，并且尤其在与表面的结合方面具有与颗粒相似的特性。
此外，本发明人惊奇地发现，通过光散射，特别是使用干涉散射显微技术，可以检测代表包括各种非蛋白质组分的不同生物分子的不均匀混合物的脂蛋白颗粒。单个脂蛋白颗粒能够通过光学方式可视化。这使得能够直接在样品中确定脂蛋白颗粒(和不同种类的脂蛋白颗粒)的数量和尺寸。样品中不同脂蛋白颗粒的相对比例也可以在单次测量中确定。因此，本发明的检测方法提供了一种快速且简单的检测脂蛋白颗粒的方法，并提供了关于样品中脂蛋白颗粒的性质和分布的大量信息。所进行的光学检测也相对便宜，并且有利地适合于临床环境，并且避免了与先前的脂蛋白检测方法相关的复杂处理方案。
此外，本发明人出乎意料地证明了，可通过直接对生物样品(例如血液或血浆)进行光散射(例如通过使用iSCAT)来检测脂蛋白颗粒，而无需将这些颗粒从其它组分中纯化出来，尽管这些其它组分会产生背景信号。
本发明的检测方法有利地在临床情形中用于检测来自患者样品的脂蛋白颗粒，以帮助诊断和治疗与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病和病症。
因此，本发明提供了一种检测样品中脂蛋白颗粒的方法，包括通过光散射，优选通过干涉散射显微技术来检测所述颗粒。本发明进一步提供了一种用于诊断与个体中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法，或者用于确定个体患上所述疾病或病症的风险的方法，包括通过干涉散射显微技术检测来自所述个体的样品中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量。
此外，本发明提供了一种用于选择向其施用物质或组合物或者向其开具治疗方案的个体的方法，其中，所述物质、组合物或治疗方案适用于治疗或预防与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症，包括通过本发明的检测方法检测来自所述个体的样品中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量，以及当所检测的脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量表明存在所述疾病或病症或其风险时，则选出所述患者进行所述施用或所述治疗方案。
本发明还提供了一种治疗或预防个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法，该方法包括：诊断或确定所述个体中所述疾病或病症的风险，或者通过本发明的方法选择所述个体；以及向所述个体施用物质或组合物或者对所述个体进行治疗方案，从而有效治疗或预防所述个体中所述疾病或病症。
本发明进一步提供了在治疗或预防个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法使用的物质或组合物，其中，所述个体通过本发明的方法被诊断或确定为具有风险或者被选出。
本发明还提供了物质或组合物在制备用于治疗或预防与个体中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的药物中的用途，其中，所述个体通过本发明的方法被诊断或确定为具有风险或者被选出。
附图说明
图1提供了描述人血液中存在的不同类型的脂蛋白颗粒及其各自的直径(nm)和密度(g/ml)的图表。表格中还提供了关于各类型颗粒中蛋白质、胆固醇、磷脂和甘油三酯的相对比例的信息。
图2示出了通过iSCAT检测血液样品中脂蛋白颗粒的示例性方案。
图3是并入有空间滤波器的iSCAT显微镜的示意图。
图4示出了从经纯化的脂蛋白样品中捕获的HDL和LDL脂蛋白颗粒的图像，其中比例尺代表被定义为(Is-Ip)/Is的iSCAT信号，其中，Is是不存在颗粒时玻璃表面的反射强度，并且Ip是存在颗粒时的相同测量。一并示出了HDL和LDL脂蛋白颗粒的图像以及通过iSCAT信号相对所检测的各颗粒作图而由全部HDL和LDL图像获得的单颗粒直方图。
图5提供了通过iSCAT从血清样品中检测到的HDL和LDL脂蛋白的图像和单颗粒直方图，与图4所示的那些相对应。
图6提供了通过iSCAT检测全血样品中HDL、LDL和VLDL脂蛋白颗粒的单颗粒直方图。图6A和图6B分别提供了非空腹样品和空腹样品的直方图。
图7示出了使用已知质量/浓度的脂蛋白对iSCAT测量值的校准。左图绘制了颗粒结合事件与孵育时间(秒)的结合事件。右图绘制了由结合数据确定的相对于浓度的初始结合速率，以提供校准曲线，使得能够将所测量的初始结合速率转换为样品中颗粒的浓度。
图8a示出了通过实施例4中描述的稀释法，在1kHz的帧率和25Hz的有效帧率下记录的垫片(gesket)中300nM肌动蛋白的降落视频的示例帧。
图8b用于与图8a进行比较，图8b示出了在相似条件下，在1kHz的帧率和25Hz的有效帧率下记录的流动室中300nm肌动蛋白的降落视频的示例帧。
图9示出了实施例4中描述的实验4次重复所累积得到的质量直方图。
具体实施方式
本发明通过使用光散射检测样品中的颗粒与表面的结合来实现溶液中颗粒的浓度测量。优选地，使用光散射显微镜。
本发明人尤其证实了通过光散射直接检测单个脂蛋白颗粒的能力，特别是通过使用干涉散射显微技术。本发明可用于检测任何形式的脂蛋白颗粒，包括样品中不同形式的脂蛋白颗粒。
颗粒
根据本发明的方法可检测的颗粒可以是溶液中的任意颗粒，涵盖单个分子且经由生物大分子到寡聚体组合体(oligomeric assembly)。合适颗粒的示例是单分子、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、单糖、碳水化合物、寡糖、多糖、糖肽、糖蛋白、脂类、脂肪酸、蜡、甾醇、脂溶性维生素、单甘酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、甘油糖脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮、糖脂质、脂蛋白、核酸、核苷酸、多核酸、成簇的分子、组合体、聚集体、蛋白质/蛋白质相互作用体、蛋白质/小分子相互作用体、蛋白质-核酸相互作用体和/或寡聚体组合体。
为了确定溶液中颗粒的浓度，无需在检测前对颗粒进行标记。由于光散射显微技术能够确定颗粒的质量，所以可以通过质量来简单地确认。
脂蛋白颗粒
根据本发明可检测的脂蛋白颗粒可以是存在于样品中的任意脂蛋白颗粒。脂蛋白颗粒可以是任意尺寸或以任意数量存在。脂蛋白颗粒通常选自存在于人或动物血液中的脂蛋白颗粒。脂蛋白颗粒通常包括甘油三酯、胆固醇、磷脂以及一种或多种蛋白质，例如一种或多种载脂蛋白。脂蛋白颗粒可以具有不同比例和/或密度的脂类和蛋白质。载脂蛋白可以是外周载脂蛋白或整合载脂蛋白。载脂蛋白可以选自任何类或亚类的载脂蛋白。载脂蛋白可以具有任何遗传多样性。载脂蛋白可以选自A类、B类、C类、D类、E类和/或H类。A类的载脂蛋白可以选自apo A-I、apo A-II、apo A-IV和apo A-V；B类的载脂蛋白可选自apo B48和apo B100；C类的载脂蛋白可选自apo C-I、apo C-II、apo C-III和apo C-IV。B类的载脂蛋白存在于LDL脂蛋白颗粒中，而其他类的载脂蛋白通常与HDL脂蛋白颗粒有关。
脂蛋白颗粒通常具有至少1nm的直径，并且可以具有高达1000nm或更大的直径。根据本发明可检测的具体类型的脂蛋白颗粒包括乳糜微粒(也称为超低密度脂蛋白，ULDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、中低密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。图1提供了上述脂蛋白颗粒的示意性颗粒直径、密度以及脂质:蛋白质的比例。根据本发明所检测的脂蛋白颗粒可以具有图1所示的任意颗粒直径、密度或脂质:蛋白质的比例。因此，例如，HDL脂蛋白颗粒可具有约5nm至约15nm的颗粒直径。LDL脂蛋白颗粒可具有约18nm至约28nm的颗粒直径。IDL脂蛋白颗粒可具有约25nm至约50nm的颗粒直径。VLDL脂蛋白颗粒可具有约30nm至约80nm的颗粒直径。乳糜微粒可具有约100nm至约1000nm的颗粒直径。HDL脂蛋白颗粒可具有约200kDa至约500kDa的分子量。LDL脂蛋白可具有约为3MDA的分子量。
优选地，本发明的方法检测HDL和/或LDL脂蛋白颗粒。本发明的方法可包括检测VLDL脂蛋白颗粒。本发明的方法可包括检测HDL和LDL；HDL和VLDL；HDL和IDL；HDL和UDL；LDL和VLDL；LDL和IDL；或LDL和UDL脂蛋白颗粒。本发明的方法可包括检测HDL、LDL和VLDL；HDL、LDL和IDL；或HDL、LDL和UDL脂蛋白颗粒。本发明的方法可包括检测HDL、LDL、IDL、VLDL和ULDL脂蛋白颗粒。对与其他类型脂蛋白颗粒具有重叠颗粒直径的IDL和VLDL颗粒的检测可包括使用额外的步骤(例如荧光标记的抗体)来检测这些颗粒中存在的特定蛋白质。
溶液中的颗粒
溶液可以是颗粒在液体溶剂中的任意溶液。溶液可以是简单的溶液，例如颗粒分散在水中(颗粒的水性溶液)，或者可以是复杂的溶液，例如包括该颗粒以及一种或多种其他溶质。溶液可以是样品。样品可取自于从商业制备的溶液以用于测试浓度。体液是复杂溶液的示例，其中存在着多种溶质，包括电解质、糖和尿素。样品可以取自任何来源，包括生物或环境样品。如果样品是生物样品，它可以取自或获自人体或动物体或个体，例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、汗液、羊水、脑脊髓液、母乳、眼泪、分泌物、滑液、精液、胆汁或粘液。如果样品是环境样品，它可以取自任何来源，例如水(例如井、溪流、河流、湖泊、雨水、海水等)、食物和饮品(例如饮料)、农业样品或来自工厂和制造过程的液体样品。
在与表面接触之前不必准备溶液或样品，但是如果认为溶液是浓缩的，则可以使该溶液与本文所述的测量溶液接触。
表面
用于结合颗粒以确定颗粒浓度的表面优选为检测器表面，并且可以形成光散射显微镜的样品保持器的一部分。
该表面优选为玻璃、蓝宝石或由透明聚合物制成。使样品与表面接触，以确定浓度。可以将样品置于包括表面的样品保持器中。如前所述，显微镜包括用于将样品保持在样品位置的样品保持器。样品可以是包含待成像颗粒的液体样品，下文将对其进行更详细的描述。样品保持器可以采取适合于保持样品的任何形式。通常，样品保持器将样品保持在表面上，其形成样品保持器与样品之间的界面。例如，样品保持器可以是盖玻片和/或可以由玻璃制成。样品可以简单的方式提供在样品保持器上，例如使用微量移液器或自动分配系统。
样品保持器可以采用任何合适的形式。在一些形式中，样品保持器将允许高表面积与体积比，使得对表面的接近不会限制溶液中颗粒的结合。在其他形式中，表面积和体积之间的比可以减小，使得其具有较低的表面积与体积比，这会限制颗粒接近表面。对于本领域技术人员将清楚的是，样品保持器的表面积相对体积的选择将改变测量浓度的方式。例如，如果样品保持器具有低的表面积与体积比，则颗粒的结合速率不会随时间而降低。在这种情况下，使用光散射检测的任何时刻的结合速率都可以用来计算浓度。
本发明中使用的表面可以是任何合适的表面。例如，该表面可以是钝化的表面。钝化是对表面进行处理或涂覆的过程，以提高或降低化学反应性，从而增加或减少结合事件的数量。
可替代地，该表面可以是活化的、涂覆的、衍生化的(derivatised)或处理过的表面。表面可以通过将实体(entity)，例如硅烷固定在表面上而衍生化。在实施例4中，表面涂覆有APTES，这使得能够进行硅烷化，即用烷氧基硅烷分子对表面进行官能化。由于该操作会使表面带正电。从而对于某些颗粒是有利的。用APTES进行的涂覆过程使表面和硅烷之间形成共价键。质子化的胺基在自由空间中对其，并形成用于任何带负电荷基团(如唾液酸、羧基和硫酸酯基团)颗粒的正对接位点。
表面可以涂覆有用于颗粒的特定结合实体或配对物。这种表面使得能够从浓缩或复杂的混合物中选择颗粒。在这种情况下，浓度的计算需要知道颗粒的结合常数和特定的结合实体。
重要的是，如果对表面进行了修饰，则这些修饰不会导致通过光散射检测颗粒结合的能力发生任何改变。
使样品与表面接触
使溶液与表面接触，以确定所述溶液中颗粒的浓度。颗粒与表面结合，并且这种与表面的结合可使用光散射，优选使用iSCAT并优选通过显微镜来可视化(visualised)或检测。
如上所述，取决于所用表面的性质，颗粒与表面的结合可以是非特异性的，或者可替代地，结合可以是特异性的。如果表面是玻璃的(即玻璃盖玻片)，则该结合将是非特异性的。如果表面经过处理，则该结合可能是特异性的。与表面结合的比例可以通过重复一次或多次检测步骤来计算，或者可以得自于单次测量。
使用光散射可检测结合至表面的颗粒的结合和/或数量。然后，可以重复一次或多次，以确定颗粒与表面的结合速率和/或初始结合速率的变化。可绘制每个时间点的结合以建立结合速率。
在溶液的表面积与体积之比较低的情况下，可能一次测量便足以确定浓度，因为任何给定时间的结合速率代表颗粒的数量。结合速率是恒定的。
在某些情况下，可能需要重复检测结合的颗粒，以确定结合速率是否恒定或者结合速率是否随时间变化。当结合速率(恒定比率)没有变化时，任何点记录的结合速率代表绝对浓度。当结合速率发生变化时，可以绘制这些变化，并将数据外推至零时间点，以计算浓度。
根据恒定的结合速率或在结合速率从初始结合速率发生变化的情况下，可以计算颗粒与表面结合速率的降低或下降。结合速率的下降可与溶液中的颗粒浓度有关。例如，颗粒与表面的结合(如iSCAT所可视化的)随着时间依据溶液中剩余的颗粒数量和可接近的结合位点而减少。
随着时间可重复进行检测颗粒与表面的结合，并且测量之间的间隔取决于需要进行测量的颗粒和溶液的性质，并且随着溶液的不同而不同。
示例性地，可以在样品与表面接触之后，例如在接触的那一秒或其几分之一秒内立即有效地额外进行测量，然后，在此之后每隔几秒钟进行测量，例如测量间隔为接触后1-60、1-30、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、45-50、55-60秒。为了测定初始结合速率，可视需要重复测量。
应当理解，测量之间的间隔可以与所研究的颗粒有关，因此可能更长，即测量之间的时间可以是数分钟至数小时。因此，测量可在初始测量后每隔几分钟来进行，例如以接触后1-60、1-30、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、45-50、55-60分钟的间隔来进行测量。可替代地或附加地，测量可在初始测量后每隔几小时来进行，例如以接触后1-24、1-12、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2小时或1小时的间隔来进行测量。
可考虑更长的时间间隔以提供进一步的证据，即，证明在实际测量的几分钟内没有发生解离，因为有可能表明其需要更长的时间。
此外，在一次实验中，时间间隔可以变化。例如，最初几次测量可以每隔数秒进行，并且进一步的测量可以以数分钟的更长时间间隔来进行。只要记录了检测时间，间隔就可以变化。
优选在初始检测之后至少检测一次结合。优选地，对颗粒与表面的结合检测两次或更多次，甚至更优选三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或更多次。颗粒与表面结合的每个独立检测事件由时间间隔分开，如前所述，该时间间隔在各检测事件之间可以是相同或不同的。
为了检测结合速率，有用的是，记录/视频记录与表面的结合，如实施例4所示。
浓度的确定
为了确定溶液中颗粒的浓度，可以将恒定或初始结合速率与已经溶液中颗粒浓度的恒定或初始结合速率进行比较。这允许对该方法进行校准，因为先前已经针对已知浓度的颗粒实施过该方法。
一系列已知浓度的初始结合速率可以从结合数据外推得出，并用于生成标准曲线，从而能够测量的样品中的初始结合速率转换为相应的颗粒的绝对浓度。在实施方式中，可以通过使用质量/浓度已知的颗粒来校准使用光散射显微镜进行的浓度测量。图7示出了其中颗粒为脂蛋白的实施例。左图绘制了颗粒结合事件相对于孵育时间(秒)的关系。右图绘制了根据结合数据确定的初始结合速率相对于浓度的关系，以提供校准曲线，从而能够将所测量的初始结合速率转换为样品中颗粒的浓度。在这种情况下，结合速率是颗粒与表面的结合的比率。对于该实施方式，表面存在于样品保持器中，而在该样品保持器中保持有所述溶液。
对所检测颗粒与表面的结合速率随时间衰减或下降的分析可以为实现浓度的测量提供基础。为了对该方法进行校准，可能需要使用已知颗粒浓度的结合速率。
为了计算浓度，可能需要包括对扩散率的校正。根据颗粒的已知性质，如质量和形状可容易地计算扩散率。
可替代地，该实验可使用内部校准物来校准。校准物在表面结合的能力(例如电荷、疏水性、亲水性)方面具有与颗粒相似的特性，并因此，根据溶液中颗粒的性质来选择校准物。校准物具有已知的质量和浓度。基本上同时(即，在同一时间)将校准物引入至溶液中的颗粒和表面。使用光散射检测结合至表面的校准物能够确定校准物的初始结合速率。同时，通过光散射来确定颗粒与表面的初始结合速率。可将颗粒的初始结合速率与已知浓度的校准物的初始结合速率进行比较，从而能够计算颗粒的浓度。
如先前出版物中所讨论的，单颗粒光散射可用于确定颗粒的质量，因此可以利用质量来确定感兴趣的颗粒，从而确定一种特定颗粒类型的结合速率。可使用与质量相关的对比来选择感兴趣的颗粒或校准物。因此，可以仅检测颗粒或校准物与表面的结合，而忽略其他溶质与表面的结合。
浓缩的溶液
如果怀疑溶液是浓缩的，这可能会使浓度的测量更加复杂。为了确保使用本发明的方法确定的测量是正确的，发明人开发了一种使用测量溶液的方法。该测量溶液基本上同时被引入到颗粒溶液和表面。
测量溶液可以是缓冲溶液。通常，测量溶液的体积是已知的，以便能够计算稀释效应。
可将一定体积的颗粒溶液置于样品保持器中，优选置于具有已知的几何形状的样品保持器中。这使得能够引入一定体积的测量溶液(或者将颗粒溶液引入测量溶液)，并且利用稀释作用，能够将检测到的颗粒与表面的结合速率转换成颗粒的浓度。
如上所述，颗粒与表面的结合的检测可以在引入测量溶液后的一个或多个不同的时间间隔进行。如果在引入测量溶液后的不同时间间隔重复检测步骤，将使得能够校正稀释效应，如解离。如果在加入(并由此稀释)后的不同时间点进行测量，则可以显现出例如在颗粒在较低浓度下发生解离或簇化时，物质种类分布的变化。因此，这种方法使得能够更详细地观察颗粒，并能够验证浓度测量结果。
可替代地或附加地，可以变化一种或两种溶液(颗粒溶液或测量溶液)的体积，和/或可以变化样品保持器的几何形状。两者都使得能够校正稀释效应。如果利用一个或多个不同体积的溶液和/或一个或多个不同几何形状的样品保持器重复检测步骤，也可以校正稀释效应，例如解离。
方法步骤
如本文所述，本发明提供了一种测量溶液中颗粒的浓度的方法，该方法包括：
i)使溶液与表面接触；
ii)检测通过光散射可视化的与该表面结合的颗粒；
iii)重复检测步骤，并计算颗粒与表面的结合速率和/或初始结合速率随时间的变化；
iv)基于来自已知颗粒浓度的溶液的数据，提供初始结合速率相对于浓度的校准曲线；
v)使用步骤(iv)中的校准曲线将步骤(iii)中记录的样品的初始结合速率转换为溶液中颗粒的浓度。
该方法可进一步涉及使用一个或多个不同几何形状的样品保持器或使用不同体积的测量溶液来重复步骤(i)至(ii)，以便验证所确定的浓度。
可替代地，本发明的方法提供了一种测量溶液中颗粒的浓度的方法，该方法包括：
i)使溶液与表面接触；
ii)通过光散射的可视化，检测与表面结合的颗粒；
iii)重复检测步骤，并计算颗粒与表面的结合速率和/或恒定结合速率随时间的变化；
iv)基于来自已知颗粒浓度的溶液的数据，提供恒定结合速率相对于浓度的校准曲线；
v)使用步骤(iv)中的校准曲线将步骤(iii)中记录的样品的恒定结合速率转换为溶液中颗粒的浓度。
该方法可进一步涉及使用一个或多个不同几何形状的样品保持器或使用不同体积的测量溶液来重复步骤(i)至(ii)，以便验证所测定的浓度。
如果本发明的方法中使用内部校准物，则本发明提供了一种测量溶液中颗粒的浓度的方法，该方法包括：
i)在校准物存在下，使溶液与表面接触；
ii)检测通过光散射可视化的与表面结合的颗粒；
iii)同时检测通过光散射的可视化的与表面结合的校准物；
iv)重复检测步骤(ii)和(iii)，并计算颗粒和校准物与表面的结合速率和/或初始结合速率随时间的变化；
v)使用步骤(iv)中计算的校准物的结合速率，将步骤(iv)中计算的颗粒的初始结合速率转换为溶液中颗粒的浓度。
在所有的变型中，通过检测颗粒与表面的结合，能够测定溶液中该颗粒的浓度。颗粒与表面的结合速率可以是恒定的，在这种情况下，恒定的结合速率可与已知浓度的相同颗粒的恒定结合速率进行比较。结合速率可变化，因此可以计算初始结合速率，以便与已知浓度的相同颗粒的初始结合速率进行比较。如前所述，样品保持器在表面积与体积之比方面的性质会改变浓度计算。
脂蛋白测量
如上所述，本发明的方法允许直接测量样品中一种或多种脂蛋白颗粒的尺寸和数量，以及一种或多种不同脂蛋白颗粒的比例。该方法可包括同时或并行确定两种或更多种不同类型的脂蛋白颗粒的数量、尺寸或比例。该方法可包括确定样品中特定种类的脂蛋白颗粒的总数量，例如HDL和/或LDL脂蛋白颗粒的总数量。该方法可包括确定样品中特定尺寸的脂蛋白颗粒的数量。该方法可包括测定样品中特定类型的脂蛋白颗粒的尺寸分布。该方法优选包括确定样品中HDL与LDL脂蛋白颗粒的比例。还可以确定样品中HDL和/或LDL脂蛋白与一种或多种其他脂蛋白颗粒(诸如VLDL脂蛋白颗粒)的比例。因此可确定所检测的各种脂蛋白类型的颗粒或各部分的颗粒的相对数量。
本发明的方法可包括获得样品中一种或多种脂蛋白颗粒的单颗粒直方图，包括所检测的给定类型的脂蛋白颗粒的各不同尺寸的颗粒数量。因此，样品中的每种颗粒都是单独检测的，这不同于先前表征整体总脂蛋白含量的检测方法。因此，与先前依赖算法的检测方法相比，可以直接检测群体中脂蛋白的分布。该方法优选包括获得HDL和/或LDL脂蛋白颗粒的单颗粒直方图。
该方法可包括确定样品中脂蛋白的质量。该方法可包括确定样品中一种或多种类型的脂蛋白的绝对浓度。脂蛋白的质量和/或浓度可以通过针对于合适的标准品进行校准来确定。因此，一系列的已知质量的脂蛋白(例如脂质纳米盘)可通过光散射，诸如通过iSCAT来检测。如实施例中所述，合适的经纯化的脂蛋白制剂可例如得自于LeeBiosolutions。
因此可以生成脂蛋白质量与iSCAT信号之间关系的校准曲线。然后，可以将感兴趣的样品中所检测的颗粒获得的iSCAT信号与校准曲线相关联，以确定它们的质量。
溶液中的绝对浓度可通过测量样品中脂蛋白颗粒与表面之间的结合事件来确定，并且相对于已知浓度的脂蛋白样品所观察到的结合事件来进行校准。例如，颗粒与表面的结合(如iSCAT所可视化的)随时间依据溶液中剩余的颗粒数量和可接近的结合位点而减少。可由结合数据来外推一系列浓度的初始结合速率，并将其用于生成标准曲线，从而能够将所测量的样品中的初始结合速率转换为溶液中脂蛋白的相应绝对浓度。可替代地，给定浓度下的恒定结合速率可通过在流动室中恒定地供应样品来确定或者通过使用钝化表面使得仅可能发生颗粒的瞬时结合来确定。
实施例中描述了用于确定样品中HDL和LDL脂蛋白的质量和浓度的示例性校准。应当理解，本发明的方法也可以不包括用已知的标准品进行的任何校准。相反，可将颗粒尺寸和分布与感兴趣的脂蛋白部分的代表性颗粒尺寸/分布进行比较。
该方法还可包括确定样品中脂蛋白颗粒的一个或多个其他参数。该方法可包括检测样品中的胆固醇、甘油三酯和/或载脂蛋白的水平。这些脂蛋白组分的水平可以通过本领域已知的方法来确定，如下文所述，或者可替代地，从感兴趣的脂蛋白颗粒中给定类型的分子的已知的平均数量来确定。因此，通过光散射(例如通过iSCAT)检测的给定类型的脂蛋白颗粒的数量乘以这种脂蛋白颗粒中感兴趣的脂蛋白组分的分子的已知的平均数量，以计算该组分的总水平。例如，LDL或VLDL颗粒的每种颗粒仅包含一种apoB蛋白(而HDL颗粒中没有apoB蛋白)。
样品的脂蛋白中感兴趣的蛋白质水平可通过免疫测定法来确定，例如针对apoB100的免疫测定法。所检测到的脂蛋白颗粒中特定蛋白质的存在可通过使用特异性结合所述蛋白质的可检测的标记试剂来确定。该试剂可以包含任何合适的可检测标记物。该试剂可以是与蛋白质特异性结合的抗体。优选地，可检测的标记物使得能够通过光散射(例如通过iSCAT)在检测颗粒的同时或并行第检测蛋白质。优选地，可检测的标记物是荧光标记物(并因此例如，该试剂是荧光标记的抗体)，并且通过荧光检测并入蛋白质的颗粒。因此，本发明的方法可包括通过光散射(例如通过iSCAT)和通过荧光来检测脂蛋白颗粒。
本发明的方法还可包括进行一种或多种其他脂蛋白检测方法。其他脂蛋白检测方法包括聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(例如参见US 5925229A)、梯度密度超速离心(例如参见US20140049775A1)、核磁共振(例如参见US5343389A)、离子迁移率分析(例如参见US7259018B2)。该方法可进一步包括进行标准Friedewald测定法以确定总甘油酯(TG)、总胆固醇(TC)、HDL-胆固醇(HDL-C)、以及LDL胆固醇(LDL-C)水平中的一个或多个。Friedewald测定法需要沉淀VLDL和LDL来通过测量LDL-胆固醇水平，计算方法为：TC-(HDL-C+TG/5)。该测定法的局限性在于当TG>400mg/ml时，或者当VLDL TG/Chol的比例偏离5:1时有限的准确性。还需要获得来自空腹个体的用于脂蛋白测量的样品。
可以将通过光散射(例如通过iSCAT)获得的结果与通过其他方法获得的结果进行比较，或者使用其他方法来提供额外的信息。因此，例如，iSCAT可以用于提供关于颗粒尺寸和数量的信息，并且可通过其他方法来确定一种或多种脂蛋白组分的总浓度。
检测
根据所要求保护的方法对包括脂蛋白颗粒在内的颗粒进行的检测使用光散射，优选使用干涉散射显微技术(iSCAT)来进行。例如，该技术综述在例如Kukura et al.,NatureMethods 2009 6:923–935以及in Ortega Arroyo et al.,Physical Chemistry ChemicalPhysics 2012 14:15625–15636中。
iSCAT包括确定样品中由目标物散射的光与从样品位置反射的光之间的干涉。干涉取决于目标物的散射幅度(并进而取决于其体积)，并以iSCAT信号进行测量。因此，由脂蛋白颗粒产生的iSCAT信号可以与其体积和直径相关联，以鉴别样品中存在的脂蛋白颗粒的类型。在校准时，iSCAT信号也可用于估算颗粒的质量/浓度，如下所述。因此，本发明的方法通常包括确定iSCAT信号。iSCAT信号可以描述为存在颗粒与不存在颗粒时检测到的光的比例。更详细地说，它可以被定义为(Is-Ip)/Is，其中Is是不存在颗粒的情况下来自样品位置(例如玻璃表面)的反射强度，Ip是在存在颗粒的情况下的同一测量得到的结果。
该方法可包括使用干涉散射显微镜，其包括：用于将样品保持在样品位置的样品保持器；布置成提供照明光的照明源；检测器；和光学系统，其布置成将照明光导向到样品位置上并且布置成收集反射的输出光和将输出光导向到检测器，其中，该输出光包括从样品位置散射的光和从样品位置反射的照明光。该显微镜可进一步包括被定位成对输出光进行滤波的空间滤波器，该空间滤波器被布置成使输出光通过，但是其中强度的减小在预定数值孔径内大于在较大数值的孔径内的强度减小。这种空间滤波器有利地使图像对比度最大化，如PCT/GB2017/052070以及Cole等人(ACS Photonics,2017,4(2),pp 211-216)中所记载的，各文献都通过引用并入本文。
所使用的光可以是：紫外光(其在本文中可定义为具有10nm至380nm范围内的波长)；可见光(其在本文中可定义为具有380nm至740nm范围内的波长)；红外光(其在本文中可定义为具有740nm至300μm范围内的波长)。该光优选是可见光。蓝光对于脂蛋白颗粒的高灵敏度检测是优选的。红光也可以有利地用于使得能够通过iSCAT对颗粒的检测与通过荧光对特定脂蛋白成分(例如感兴趣的特定蛋白质)的检测相结合，例如使用结合感兴趣蛋白质的荧光标记抗体。光可以是多种波长的混合光。照明光可以是例如由激光器提供的相干光。
图3示出了可在本发明中采用的iSCAT显微镜1，其布置如下(并且配置有如上所述的空间滤波器)。出于所讨论的原因，空间滤波器对于提高对比度是有利的，但是本发明的方法可以可替代地使用没有空间滤波器的iSCAT显微镜。
除了下面更详细描述的空间滤波器之外，显微镜1包括具有在显微镜领域中常规结构的以下部件。
显微镜1包括用于将样品3保持在样品位置的样品保持器2。样品3可以是包含待成像的目标物的液体样品，下文将对其进行更详细的描述。样品保持器2可以采取适于保持样品3的任何形式。通常，样品保持器2将样品3保持在表面上，从而在样品保持器2和样品3之间形成界面。例如，样品保持器2可以是盖玻片和/或可以由玻璃制成。样品3可以简单的方式，例如使用微量移液器提供在样品保持器2上。
显微镜1进一步包括照明源4和检测器5。
照明源4被布置成提供照明光。照明光可以是相干光。例如，照明源4可以是激光器。可根据样品3的性质和/或待检查的特性来选择照明光的波长。在一个实例中，照明光具有405nm的波长。
任选地，可在空间上对照明光进行调制，以去除由照明和激光噪声的相干性质而产生的斑纹图案，例如在Kukura等人“High-speed nanoscopic tracking of theposition and orientation of a single virus”，Nature Methods 2009 6:923–935中所详述的。
检测器5接收从样品位置反射的输出光。通常，显微镜1可以宽视野模式下操作，在这种情况下，检测器5可以是捕获样品3图像的图像传感器。可替代地，显微镜1可以以共焦模式操作，在这种情况下，检测器5可以是图像传感器或者可以是点状检测器，例如光电二极管，在这种情况下，扫描构件可以用于扫描样品3的区域以构建图像。可以用作检测器5的图像传感器的示例包括CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器或CCD(电荷耦合器件)。
显微镜1进一步包括布置在样品保持器2、照明源4和检测器5之间的光学系统10。该光学系统10按以下方式布置：将照明光导向到样品位置以对样品3进行照明、收集从样品位置反射的输出光，并将该输出光导向到检测器5。
光学系统10包括物镜11，其为设置在样品保持器2前面的透镜系统。光学系统10还包括聚光透镜12和镜筒透镜13。
聚光透镜12将来自光源11的穿过物镜11的照明光(由图1中的实线所示)会聚到样品位置处的样品3上。
物镜11收集输出光，该输出光包括(a)从样品位置反射的照明光(由图1中的实线示出)和(b)在样品位置由样品3散射的光(由图1中的虚线示出)。反射光主要来自于样品保持器2和样品3之间的界面反射。通常，这是一种相对较弱的反射，例如玻璃-水反射。例如，反射的照明光的强度可以约为入射照明光的强度的0.5％。散射光被样品3中的目标物散射。
以类似于传统iSCAT的方式，由样品表面或样品表面附近的目标物的散射光与反射光相长地干涉，因此在由检测器5捕获的图像中是可见的。这种效果不同于以透射模式操作的显微镜，在透射模式下，到达检测器的照明光会以一定的深度透过样品，从而导致小得多的成像对比度。
如图1所示，反射的照明光和散射光具有不同的方向性。特别地，反射的照明光具有由光源4输出的光束的几何形状和光学系统6产生的数值孔径(numerical aperture)。散射光在较大的角度范围内散射，因此与反射的照明光相比，填充更大的数值孔径。
镜筒透镜13将来自物镜11的输出光聚焦到检测器5上。
光学系统6还包括分束器14，其被布置成将来自光源4的照明光和导向至检测器5的输出光的光路分开。除了提供如下所述的空间滤波器之外，分束器14可具有传统结构，其提供入射到其上的光提供部分反射和部分透射。例如，分束器14可以为板状物，通常设置有膜，其可为金属的或介电的，设置为与光路成45°。可替代地，分束器14可以是由匹配的一对棱镜形成的立方体分束器，其中，该对棱镜在棱镜之间的界面处具有部分反射膜。可替代地，分束器14可以是偏振分束器，其与分束器14和样品3之间的四分之一波片组合使用。
在图1所示的实例中，光源4偏离物镜11的光路，使得来自光源4的照明光被分束器14反射到物镜11中，并且反向地，使检测器5与物镜11的光路对准，从而来自样品位置的输出光透过分束器14朝向检测器5传输。
除了上述可能具有传统结构的部件之外，显微镜1还包括空间滤波器20。在图1所示的实例中，空间滤波器20形成在分束器14上，并因此位于物镜11的后出光口(backaperture)之后，因此位于物镜11的后焦平面15正后面。因此，可以采用空间滤波器20而不会像在相差显微镜中那样进入物镜。将空间滤波器放置在物镜的入射光阑(entranceaperture)的正后面而不是在共轭平面中(例如，如下所述)具有明显的优点，即强烈抑制源自高数值孔径显微镜物镜中的众多透镜的背反射。这进而降低了成像噪声，降低了非干涉背景并降低了实验复杂性、光学器件数量和光程长度，从而提高了光学装置的稳定性，从而提高了图像质量。
然而，该位置不是必需的，并且具有等效功能的空间滤波器可以设置在其他地方，如下所述。
由此，空间滤波器20被定位为对穿过至检测器5的输出光进行滤波。在图1所示的检测器5与物镜11的光路对准的实例中，空间滤波器20因此是透射的。
空间滤波器20是部分透射的，并且因此使包括反射的照明光在内的输出光通过，但是伴随强度的降低。空间滤波器20还与光轴对准并具有预定的孔径，使得其提供在预定的数值孔径内的强度降低。本文中，数值孔径以其通常方式定义为无量纲的量，表征相对于输出光所源自的样品位置的角度范围。具体地，数值孔径NA可以由等式NA＝n·sin(θ)定义，其中，θ是聚光的半角，并且n是输出光透过的材料(例如光学系统6的部件的材料)的折射率。
在预定数值孔径之外，空间滤波器20不提供强度的降低。原则上，可替代地，空间滤波器20可提供其预定孔径外的强度降低，但是该强度的降低小于预定数值孔径内的强度的降低，尽管这是不太期望的。
空间滤波器20可以以任何合适的方式形成，通常包括沉积材料层。该材料可以是例如金属，诸如银。沉积可使用任何合适的技术来进行。
由于界面附近的亚衍射尺寸的目标物相比于反射的照明光，优先将光散射到较大的数值孔径中，因此由空间滤波器20提供的强度降低相对于散射的光优先降低了反射的照明光的检测强度。因此，通过空间滤波器20在低数值孔径处的强度降低主要影响反射的照明光，并对散射光的影响最小，从而使捕获的图像的对比度最大化。增强的成像对比度能够对为弱散射体的目标物进行高对比度检测。
对比度增强可按如下理解。当空间滤波器20以预定数值孔径使输出光的一部分通过(即，在该实例中，是部分透射)时，照明光场和散射光场的一部分到达检测器并干涉充分相干的照明源。到达检测器的光强度Idet则由Idet＝|Einc|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cosΦ}来得出，其中，Einc是入射光场，r2是界面的反射率，并且，t2是空间滤波器20的透射率，s是目标物的散射幅度，并且，Φ是透射的照明光和散射光之间的相位差。因此，散射对比度增强，尽管以检测到的光子总数为代价。
因此，尽管对比度以与传统iSCAT类似的方式提供，但其额外地受控于空间滤波器的透射率。这提供了通过选择空间滤波器20的透射率t2来直接调整参考场的振幅的能力，这与标准iSCAT中通过玻璃-水界面的反射率来固定的情况相反。在空间滤波器20是沉积材料层的情况下，可通过选择层的材料和/或厚度来选择透射率t2。例如，这种调整可根据例如感兴趣的散射目标物、相机全阱容量(full well capacity)和放大率来进行。
为了使对iSCAT的这些有益效果最大化，预定的数值孔径可以是输出光中反射的照明光的数值孔径，但这并不是必需的。例如，如果预定的数值孔径略小于或大于反射的照明光的数值孔径，则可以实现类似性质的益处。
包括脂蛋白在内的样品
样品可以是包含脂蛋白颗粒的任何样品。颗粒通常是在体内，例如人体或动物体内产生的脂蛋白颗粒。因此，脂蛋白颗粒通常存在于生物样品中。然而，也可以检测体外产生的和/或以纯化形式提供的脂蛋白颗粒，例如用于如上文所述的校准目的。样品可以包含经纯化形式的多种不同类型的脂蛋白。样品也可以是各种组分的复杂混合物或多分散溶液，例如包含多种不同离子、蛋白质和脂蛋白的溶液。
当样品是从人或动物获得的生物样品时，它可以是临床样品。该样品可以是来自如下文在本发明的治疗和诊断方法的内容中所述的任何受试者的临床样品。样品可以是包含脂蛋白颗粒的任何体液或组织的样品。通常，样品是血液或血液的组分，例如血浆或血清。样品可以是毛细血管、静脉或动脉血液，或者来自它们的血浆或血清。可以通过任何方式收集样品，包括指刺或静脉穿刺。
如上所述，根据本发明的脂蛋白的检测有利地无需将脂蛋白相对于样品的其它组分进行分离或纯化的情况下来实现。在先前的检测方法中需要进行的这种分离和纯化是耗时的，并且还可能人为地改变脂蛋白颗粒的某些性质。然而，应该理解的是，通常对生物样品，诸如血液进行稀释以降低颗粒密度并有助于得到不同类型的脂蛋白颗粒的最佳分辨率。可在任何合适的缓冲液中稀释样品。通常，合适的缓冲液具有生理pH和盐浓度。非生理缓冲条件也可用于检查这些条件对脂蛋白颗粒的影响。
技术人员通过常规实验能够选择给定样品的合适稀释率来检测感兴趣的特定脂蛋白颗粒。稀释率可凭经验进行直至根据检测仪器的成像速度和灵敏度确定出允许进行检测单颗粒的稀释率。然后将稀释因子考虑在内，外推出未稀释样品中脂蛋白颗粒的数量。
当样品为血液或血浆时，可将其在合适的缓冲液中稀释10000倍或更多倍，以能够检测HDL(在高浓度下，与LDL相比密度较高)或能够同时得到HDL和LDL的最佳检测分辨率。可采用低稀释率(1-5000倍)来用于检测LDL。
通过iSCAT检测脂蛋白所需的样品量很小，并可能低至微升，这取决于样品类型和收集方式。指刺能够收集非常少量的血液。可在任何合适的样品室中提供样品。样品室可由盖玻片上的垫片提供，如实施例中所述。可替代地，样品室可以是流动室或微流体装置或芯片，例如毛细管芯片。
诊断或确定风险的方法
基于不同类型的脂蛋白颗粒的尺寸、数量、分布和比例与疾病之间的相关性，本发明在诊断应用中具有特别的效用。因此，本发明提供了一种用于诊断个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法，或者用于确定个体将患有所述疾病或病症的风险的方法，该方法包括通过干涉散射显微技术检测来自所述个体的样品中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量。该检测可结合本发明的检测方法描述的任何方式来进行，并用于上文所述的任何类型的脂蛋白颗粒。因此，该方法可包括检测所述样品中一种以上的不同类型的脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量，或者不同类型的脂蛋白颗粒的比例。该方法优选包括检测高密度脂蛋白(HDL)颗粒和/或低密度脂蛋白(LDL)颗粒。该方法可尤其包括确定所述样品中HDL与LDL颗粒的比例。样品可以是上文所述的任何生物或临床样品，优选血液、血清或血浆。个体可以是动物、哺乳动物或人。
特定的脂蛋白颗粒水平、分布和尺寸可能与疾病相关。HDL在本领域中被描述为“好的胆固醇”，其充当将胆固醇从血液、组织和身体器官向肝脏的转运体。因此，正常的HDL水平提供了对血液胆固醇水平的适当调节。HDL水平的变化/胆固醇与其他脂蛋白颗粒的重新分布可能与疾病或疾病风险增加有关。例如，对于男性，低于40mg/dL的HDL胆固醇(HDL颗粒携带的胆固醇的浓度)水平，对于女性，低于50mg/dL的HDL胆固醇水平是心脏病的主要危险因素(Mayo Clinic,2016)。HDL颗粒通常是血液中最常见的脂蛋白部分。
相比之下，LDL是正常血液中第二常见的脂蛋白部分，它通常被认为是“坏的胆固醇”，这是因为其作用为将胆固醇分配到身体组织和器官中。具有高水平的LDL会导致动脉中斑块的形成，可能会增加心脏病和中风的风险(American Heart Association，2014)。LDL的尺寸也被证明与心血管健康有关。正常LDL胆固醇(由LDL颗粒携带的胆固醇的浓度)水平在100-129mg/dL的范围内。LDL颗粒越小，与心血管事件的相关性越大(Foroutan,MS,RDN,2015)。
其他脂蛋白部分(VLDL、IDL、UDL)的频率比LDL低10-100倍。
因此，根据本发明的检测所提供的HDL和/或LDL数量、尺寸和比例(以及其它脂蛋白颗粒的类似参数)的精确测量为与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症提供了具有诊断价值的信息。HDL和LDL数量/尺寸的测量尤其对心血管疾病具有诊断价值。根据本发明提供的直接均相测定法，而不是基于Friedewald计算方法来测定LDL-C值，还可以改善脂蛋白分析并允许得到更精确的LDL值，尤其是对于患有高脂血症的患者而言(Nauck,Warnick,&Rifai,2002)。此外，尽管血清总胆固醇水平的测定通常被用作诊断工具，但在使用标准方法测量时，大约一半患有症状性冠状动脉疾病的患者具有正常的LDL-胆固醇浓度。因此，似乎存在胆固醇的常规临床实验室测量未检测到的隐藏风险，而通过根据本发明的直接检测脂蛋白颗粒的数量和尺寸可有利地避免这种隐藏的风险。
要诊断的疾病或病症或者要确定的患有其的风险可以是与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的任何疾病或病症。该疾病或病症可能与HDL和/或LDL脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关。该疾病或病症可能与HDL与LDL脂蛋白颗粒的比例相关。可替代地或附加地，该疾病或病症可与VLDL、IDL和/或UDL脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关，或者与VLDL、IDL和/或UDL与HDL和/或LDL的比例相关。该疾病或病症可以与异常脂蛋白分布或尺寸相关。
与正常(对照或参比)水平相比，该疾病或病症可以是HDL颗粒的存在数量减少相关的疾病或病症。因此，与对照样品或参比样品/水平相比，HDL颗粒的数量减少，可能表明该个体患有所述疾病或病症，或者具有患上所述疾病或病症的风险增加。该疾病或病症可包括对于男性低于40mg/dL的血液HDL胆固醇浓度或对于女性低于50mg/dL的血液HDL胆固醇浓度。对于男性40-50mg/dL(1.0-1.3mmol/L)的血液HDL胆固醇浓度或对于女性50-59mg/dL(1.3-1.5mmol/L)的血液HDL胆固醇浓度与心脏病的平均风险相关。根据许多流行病学研究，60mg/dL(1.55mmol/L)或更高的血液HDL胆固醇浓度与心脏病风险低于平均水平相关。正常的HDL胆固醇水平通常可定义为大于1mmol/L。
可替代或附加地，该疾病或病症可以是其中与正常水平相比LDL颗粒存在的数量增加或者较小尺寸的LDL颗粒的数量增加的疾病或病症。因此，与对照样品或参比样品/水平相比，LDL颗粒的数量和/或尺寸增加，表明该个体患有所述疾病或病症，或者患上所述疾病或病症的风险增加。该疾病或病症可包括超过3mmol/L的血液LDL胆固醇浓度。如果一个人没有心血管疾病的其他危险因素，那么低于100mg/dL(2.59mmol/L)的血液LDL胆固醇水平被认为是最佳的；100-129mg/dL(2.59-3.34mmol/L)的水平可被认为接近最佳/高于最佳，并且130-159mg/dL(3.37-4.12mmol/L)的水平可被认为高到接近临界值。
在该疾病或病症中，HDL与LDL的比例可能会降低。
给定脂蛋白颗粒的正常数量和/或尺寸通过与没有患有与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的任何病症(如下文所述的病症)的个体中这种类型颗粒的基线数量和/或尺寸进行参比来确定。这样的个体因此提供了一种或多种脂蛋白颗粒的对照或参比数量和/或尺寸，其可与通过iSCAT检测到的来自对其进行上述诊断方法的个体的样品中的一种或多种脂蛋白颗粒的数量和/或尺寸进行比较。对照或参比尺寸/数量可以是多个正常个体的平均值。如上所述，个体可具有正常的总血胆固醇水平，优选正常的HDL血液胆固醇和LDL血液胆固醇水平。正常(健康)的总血胆固醇水平低于5mmol/L。
因此，本发明的诊断方法或确定风险的方法通常包括以下步骤：将来自个体的样品中的一种或多种脂蛋白颗粒的数量和/或尺寸与所述脂蛋白颗粒的对照数量和/或尺寸进行比较。脂蛋白颗粒的数量和/或尺寸的增加或减少可表明存在疾病或病症，或其风险，如下文进一步讨论。应当理解，对照或参比水平可预先通过iSCAT来确定或通过检测脂蛋白颗粒的任何其他方法，例如本文所述的任何其他已知的检测方法来确定。可替代地，通过iSCAT可同时检测对照样品中脂蛋白颗粒的数量和/或尺寸以及胆固醇水平或分布。个体可能患有任何与胆固醇相关的病症。该疾病或病症可能与增加的或高水平的总血胆固醇、HDL胆固醇和/或LDL固醇相关。正常的总胆固醇、HDL胆固醇和LDL胆固醇水平如上文所讨论。该疾病或病症可能与增加的或高水平的甘油三酯相关。该疾病或病症优选为心血管疾病。该疾病或病症可以是血管疾病。
心血管疾病(CVD)是指涉及心脏或血管的一类疾病。涉及血管的心血管疾病也称为血管疾病。该疾病或病症可以是任何血管疾病。该疾病或病症可选自冠状动脉疾病、冠心病、缺血性心脏病、外周动脉疾病、脑血管疾病、中风、小中风、肾动脉狭窄和主动脉瘤中的任何一种。该疾病或病症可以是涉及心脏的任何心血管疾病。该疾病或病症可选自高血压性心脏病、继发性高血压、高血压、心力衰竭、肺心病、心律不齐、心律异常、炎性心脏病、心内膜炎、炎性心脏肥大、心肌炎、瓣膜性心脏病和风湿性心脏病中的任何一种。该疾病或病症可以是高胆固醇血症，例如家族性高胆固醇血症。该疾病或病症可以是与胆固醇或甘油三酯增加相关的任何非心血管疾病或病症，使得脂蛋白颗粒的数量和/或尺寸的诊断可有助于该方面疾病或病症的诊断(和治疗)。这种疾病和病症的实例包括糖尿病、肾病、甲状腺机能减退或胰腺发炎(胰腺炎)。
该个体先前可能被表征为患有心血管疾病的风险，和/或被建议进行血液胆固醇水平的测试。该个体可能先前被诊断出患有心血管疾病(包括上述任何疾病)。在这方面，本发明提供了对个体中脂蛋白颗粒的数量和/或尺寸进行更精确的确定。
可基于任何风险因素，例如性别、年龄、家族史、体重、体重指数、饮食或生活方式，来选择个体以进行诊断或风险评估。个体可能超过40岁；根据NHS指南，40岁以上的人应该定期接受CVD风险评估。个体可能有早期心血管疾病的家族史—例如，父亲或兄弟在55岁之前患有心脏病、心脏病发作或中风，或者母亲或姐妹在65岁之前患有这种病症。个体可能具有家庭成员，通常是近亲家庭成员，其患有胆固醇相关的病症，如家族性高胆固醇血症。个体可能超重或肥胖。个体可能患有高血压或糖尿病。
本发明进一步提供了一种选择要向其施用物质或组合物或者要向其开具治疗方案的个体的方法，其中，所述物质或组合物或治疗方案适用于治疗或预防与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症，该方法包括根据本发明的检测方法通过干涉散射显微技术检测来自所述个体的样品中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量，以及如果所检测的脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量表明存在所述疾病或病症或其风险，则选出所述患者来进行所述施用或所述治疗方案。该方法可额外地包括基于上文所述的任何风险因素来选择个体。
用于给药的合适物质和组合物如下所述。合适的治疗方案可包括改变生活方式、饮食或锻炼。
本发明进一步提供了一种试剂盒，其提供了适合用在根据本发明的检测脂蛋白颗粒的方法、诊断方法或确定风险的方法中的构件。该试剂盒可包含适用于通过干涉散射显微技术检测脂蛋白颗粒的部件。该试剂盒可包括根据本发明的方法的试剂盒的使用说明。该说明可提供另外一种脂蛋白颗粒的数量和尺寸的参比水平，以及另外一种脂蛋白颗粒的参比单颗粒直方图。该试剂盒还可包括关于可以对哪些个体实施该方法的细节。试剂盒可包括样品室的一个或多个部件，例如盖玻片和垫片、流动池、微流体装置或芯片，例如毛细管芯片。该试剂盒可包括从个体获得样品(通常是血液样品)的构件，例如毛细血管血液收集装置、指刺收集装置或包括针头的任何器具。试剂盒可包括一种或多种标准脂蛋白样品(如本文所述的纳米盘)，其提供对根据本发明的脂蛋白颗粒的测量的校准。该试剂盒可额外包括用于测量其他实验室或临床参数的构件。使用这些试剂盒的过程可由临床实验室、实验性实验室、医疗从业者或私人进行。本发明进一步提供了适合于通过干涉散射显微技术检测脂蛋白颗粒的部件在制备用于诊断与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症或确定与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的风险的测试试剂盒中的用途。这些部件可以是如上所述的样品室的部件。测试试剂盒可包括如上所述的说明书、构件或标准样品。
治疗方法和医学用途
本发明进一步提供了一种治疗或预防个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法，该方法包括通过上文所述的方法选择所述个体，或诊断或确定在所述个体中所述疾病或病症的风险，并向所述个体施用物质或组合物，或者对其实施治疗方案，所述物质或组合物或治疗方案对于治疗或预防所述个体中所述疾病或病症是有效的。
本发明还提供了用于在个体中治疗或预防与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法中的物质或组合物，其中，所述个体通过上文所述的本发明的方法被诊断或确定为处于风险中或通过上文所述的本发明的方法所选择的。
额外地，本发明提供了物质或组合物在制备在个体中用于治疗或预防与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的药物的用途，其中，所述个体根据上文所述的本发明的方法被诊断或确定为有风险或是根据上文所述的本发明的方法所选择的。
该个体可以是上述任何个体，优选人类个体。该个体可能患有上述任何疾病或病症或处于患上上述任何疾病或病症的风险中，并且具有上述任何风险因素。优选地，该个体可能患有心血管疾病或处于患上心血管疾病的风险中，所述心血管疾病可以是上述任何特定的心血管疾病。
物质或组合物以有效预防或治疗所述疾病的量来施用。通常将治疗方案(如改变生活方式、饮食或锻炼)实施持续有效预防或治疗所述疾病的时段。合适的治疗方案可包括减肥、减少或停止吸烟或饮酒、增加锻炼和/或健康的饮食。该方案还可包括手术，例如冠状动脉血管成形术或冠状动脉搭桥术。该手术可包括引入支架。疾病的预防或治疗可以通过参考疾病发作的预防或延迟或通过减少或消除疾病的一种或多种症状来确定。预防或治疗可引起或延长疾病或病症的缓解或延迟复发(relapse)或再发(recurrence)。有效量的施用或进行有效治疗方案可通过在施用或治疗方案后测量来自个体的样品中的正常脂蛋白颗粒数量、尺寸或比例(或转变至正常脂蛋白颗粒数量、尺寸或比例)来确定。
该物质或组合物可以是适合于通过任何方式治疗或预防与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的任何物质或组合物。该物质或组合物可降低LDL浓度或减小LDL脂蛋白颗粒的尺寸。该物质或组合物可增加HDL浓度。该物质或组合物可降低血液胆固醇水平，包括总血液胆固醇水平或总LDL血液胆固醇水平。该物质或组合物可降低血压或使动脉拓宽。试剂可以是血管扩张剂。该物质或组合物可包括用于预防或治疗心血管疾病或降低血压的任何已知试剂。试剂可以是他汀类。他汀类(也称为HMG-CoA还原酶抑制剂)是能够降低血液中LDL胆固醇水平的一类药物，并且已经发现它们能够缓解心血管疾病并降低高危人群的死亡率。试剂可以是β-阻断剂、硝酸盐、ACE(血管紧张素转换酶)或血管紧张素受体II抑制剂、钙通道阻断剂或利尿剂。
该物质或组合物可以是小分子抑制剂、肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
多核苷酸，例如核酸，是包含两个或更多个核苷酸的聚合物。核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。核苷酸通常包含核碱基、糖和至少一个连接基团，例如磷酸酯基、2’O-甲基、2’甲氧基-乙基、氨基磷酸酯基、甲基膦酸酯基或硫代磷酸酯基。核碱基通常是杂环的。核碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶，更具体地说是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。糖通常是戊糖。核苷酸糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸可以是任何核苷酸或经修饰的核苷酸，通常是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或它们的经修饰的形式。核苷酸通常包括单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。磷酸酯基可以连接在核苷酸的5’侧或3’侧。多核苷酸可以是核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以是本领域已知的任何合成核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、吗啉基核酸或具有核苷酸侧链的其他合成聚合物。多核苷酸可以是单链或双链的。
多核苷酸序列可被克隆到任何合适的表达载体中。在表达载体中，编码构建体的多核苷酸序列通常可操作地连接到控制序列，该控制序列能够提供宿主细胞表达编码序列。这种表达载体可用于表达构建体。用于敲除蛋白质表达的反义和RNA干扰(RNAi)技术在本领域中是众所周知的，并且可以采用标准方法来敲除感兴趣分子的表达。反义技术和siRNA技术都会干扰mRNA。反义寡核苷酸通过与mRNA的一段结合(与之杂交)来干扰mRNA。RNAi涉及使用双链RNA，如小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，它们能与mRNA结合并抑制蛋白质表达。
当寡核苷酸优先或以高亲和力与靶序列杂交，但与其它序列基本上不杂交、不发生杂交或仅低亲和力杂交时，该寡核苷酸与靶序列“特异性杂交”。允许杂交的条件在本领域中是众所周知的(例如，Sambrook等人，2001,Molecular Cloning:a laboratorymanual,3rd edition,Cold Spring Harbour Laboratory Press；和Current Protocolsin Molecular Biology,Chapter 2,Ausubel等人，Eds.,Greene Publishing and Wiley-lnterscience,New York(1995))。杂交条件可以是如本领域所述的严格条件。
抗体可以与任何靶分子(通常是蛋白质)特异性结合。靶分子可以是脂蛋白颗粒的组分，例如载脂蛋白。当抗体优先或以高亲和力与蛋白质结合，但与其他蛋白质基本上不结合、不发生结合或仅以低亲和力结合时，该抗体与该蛋白质“特异性结合”。例如，当抗体优先或以高亲和力与靶分子结合，但与其他人蛋白质基本上不结合、不发生结合或仅以低亲和力结合时，该抗体与该靶分子“特异性结合”。
如果抗体以1×10-7M或更小，更优选5×10-8M或更小，更优选1×10-8M或更小，或更优选5×10-9M或更小的Kd进行结合时，则该抗体优先或以高亲和力结合。如果抗体以1×10- 6M或更大，更优选1×10-5M或更大，更优选1×10-4M或更大，更优选1×10-3M或更大，甚至更优选1×10-2M或更大的Kd进行结合时，则该抗体以低亲和力结合。
抗体可以是例如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、CDR接枝抗体或人源化抗体。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，如Fab、F(ab’)2或Fv片段。
施用本文所述治疗剂的具体途径、剂量和方法可由医疗从业者常规地确定。
用在本文所述治疗方法的试剂可以配制成药物组合物。除了治疗活性成分之外，这些组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这些材料应当是无毒的，并且不应影响活性成分的功效。药物载体或稀释剂可以是例如等渗溶液。
载体或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮内或皮下、鼻内、肌内和腹膜内途径。合适的组合物和施用方法的实例记载于Esseku和Adeyeye(2011)以及Van den Mooter G.(2006)中。例如，固体口服形式在包含活性物质的同时，还可以包含稀释剂，如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；解聚剂，例如淀粉、藻酸、藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；泡腾(effervescing)混合物；染料；甜味剂；湿润剂，如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸盐；以及通常用于药物制剂中的无毒和无药理活性的物质。这种药物制剂可以已知的方式制造，例如，通过混合、制粒、压片、糖衣或膜衣工艺。
口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，并含有10％至95％，优选25％至70％的活性成分。在药物组合物是冻干的情况下，在施用前可对该被冻干的材料进行重构，例如悬浮化。重构优选在缓冲液中进行。
用于口服至个体的胶囊、片剂和丸剂可提供有肠溶衣，该肠溶衣包括例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、乙酸纤维素、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素。
用于口服的液体分散剂可以是糖浆、乳液或悬浮液。糖浆可包含例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇作为载体。
悬浮液和乳液可包含例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌内注射的悬浮液或溶液在包含活性物质的同时可一起包含药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(例如丙二醇)，以及如果需要的话，适量的盐酸利多卡因。
用于静脉内施用或输注的溶液可包含例如无菌水作为载体，或者优选地，它们可以是无菌的等渗盐水的水性溶液的形式。
对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可以由含有0.5％至10％，优选1％至2％活性成分的混合物形成。
剂量可以根据各种参数来确定，特别是根据所使用的物质；接受治疗的个体的年龄、体重和状况；施用途径；和所需的方案来确定。医生将能够确定任何特定个体所需的给药途径和剂量。根据上述条件，典型的日剂量为每千克体重约0.1至50mg。该剂量可以单剂量提供，或者以多剂量提供，例如以固定建个施用，例如以每小时施用2、3或4次的剂量。
上面提到的技术和方案的实例参见Remington's Pharmaceutical Sciences,20th Edition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。
在上述方法和医学用途中使用的物质或组合物可以单独施用或与其它治疗物质、组合物或疗法(例如作为辅助疗法)组合施用。其他治疗组合物或疗法可与本发明的物质或组合物同时或依次施用。
实施例
实施例1–通过iSCAT检测纯化的脂蛋白颗粒
材料/方法
基板准备和测量
将硼硅酸盐玻璃盖玻片(No 1.5，24×50mm，VWR)用MilliQ水，然后用乙醇并再次用MilliQ水依次冲洗。然后在干燥的氮气流下对它们进行干燥。将CultureWell硅胶垫片(Grace Bio-Labs)切开并放置在刚清洁的盖玻片上，在同一基板上提供四个独立的30-50μl样品室。
纯化的HDL和LDL脂蛋白样品得自于Lee Biosystems(LDL cat#360-10；HDL cat#361-10)，例如见https://www.leebio.com/product/984/low-density-lipoprotein-ldl-human-serum-360-10中所述。通过超速离心分离HDL和LDL。将样品分别稀释500000倍和50000倍。
然后通过iSCAT进行数据采集和分析，同时将脂蛋白与玻璃基板的非特异性结合成像和记录。实验设置与上文中Cole等人图4中描述的相同。图像是在30秒(以100帧/秒)内采集的，并且由512×512像素组成，其中像素尺寸为23.4nm。在保存之前，对图像进行3×3的像素装仓(pixel-binned)，最终像素尺寸为70.2nm。
如Cole等人所述，从原始影像中生成比例图像堆栈。通过基于点扩散函数的2D高斯拟合的自动点检测程序，可在比例图像中识别出落在玻璃表面上的颗粒。
结果示于图4中，该图提供了由iSCAT检测的HDL和LDL的图像，以及由全系列图像获得的相应直方图。
实施例2–通过iSCAT检测血液和血清中的纯化的脂蛋白颗粒
对来自人类个体的血清和血液样品进行如实施例1中所述的iSCAT方法。为了获得血清，使血液处于直立定位(upright position)来凝结至少30分钟，然后进行离心分离(30分钟，1500×g)。将血清转移到塑料旋盖小瓶中。血液和血清样品的制备如下：将1μL指刺血液或血清样品在含有5mM EDTA(防止凝结)的HEPES/KCl缓冲液中稀释2000倍(见下文)。将10μl稀释后的样品加入到40μL的25mM HEPES缓冲液(pH 7.4，含100mM KCl)中，得到最终稀释10000倍的血液。
图5示出了血浆样品中HDL和LDL的检测。成像的血浆样品同时显示出与HDL和LDL对应的两种信号。正如预期的那样，HDL颗粒出现的频率高于LDL的出现频率(参见下面的直方图)。
图6A和图6B示出了全血中HDL和LDL的检测，结果与图5相似。我们还使用了“空腹样品”和餐后收集的样品。可注意的是，空腹和非空腹状态之间的差异在于较高的iSCAT信号区(插入图)，其对应于较大的脂蛋白，如VLDL。正如预期的那样，这些会在餐后出现。如前所述，VLDL部分的存在是患者在标准胆固醇测试前必须空腹的主要原因。VLDL含有胆固醇，但主要含有甘油三酯(TG)，如果TG水平过高，则不能使用标准(Friedewald)方法。因此，根据本发明能够在无需对提供样品的个体进行禁食的情况下检测脂蛋白(包括HDL、LDL和VLDL)。
实施例3–校准以计算HDL和LDL浓度
为了计算实施例2的血液样品中HDL和LDL的质量/浓度，我们构建了校准曲线，其中测量了已知质量/浓度的蛋白质，从而给出了分子量和iSCAT对比度之间的线性关系。
对于浓度校准，我们使用已知浓度的MSP1D1 DMPC脂质纳米盘。纳米盘是磷脂的脂质双层组成的合成模型膜系统，该磷脂的脂质双层具有由两种两亲性蛋白质筛选出的疏水性边缘。这些蛋白质被称为膜支架蛋白(MSP)，并以双重带形式排列。将纳米盘样品稀释至nM级范围，并加入至缓冲液中。使用iSCAT记录纳米盘与玻璃的非特异性结合，结果如图7所示。随着溶液中颗粒数量的减少以及可接近的结合位点数量的减少，结合的频率降低(如左图所示：4种不同浓度下，结合事件的数量随时间的变化)。我们拟合了指数衰减，并知晓何时加入样品(t＝0)，由此外推出初始结合速率。
然后将初始结合速率相对于浓度绘制(右图)。线性拟合的斜率是转换因子，其可用来使用以下关系式来确定样品的绝对浓度：
[样品浓度]＝[测量的初始速率]/[转换因子]×[样品稀释率]
利用该校准曲线，在初步实验中计算全血样品中HDL和LDL脂蛋白颗粒浓度，并且发现其与预期值相关。
实施例4–肌动蛋白溶液的浓度测量
本实施例中计算浓度的一般步骤：
1.将样品加入至样品保持器中，该样品保持器是具有高表面积-体积比的腔室；
2.按图7所示，在施加样品后，以固定且控制良好的时间延迟开始记录各个结合事件；
3.加入样品后，依据时间计算结合频率；
4.将观察到的结合频率随时间的衰减拟合为单指数衰减函数；
5.提取时间为零点时的截距，以确定在样品加入时的结合频率；
6.根据样品浓度重复该过程；
7.拟合观察到的初始结合频率与样品浓度，以获得线性相关性。
一旦建立了这种相关性，对于任何给定的样品，可以通过重复步骤1-5并建立初始结合频率来估算浓度，该初始结合频率可以由步骤7中的关系转换为样品浓度。
线性拟合的斜率是转换因子，其可使用以下关系式来确定样品的绝对浓度：
[样品浓度]＝[测量的初始速率]/[转换因子]×[样品稀释率]
肌动蛋白滴液稀释法的方案：
·制备被(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)涂覆的盖玻片，如其他地方所述(这些盖玻片对肌动蛋白具有特异性，其他蛋白质将使用简单的、未经处理的清洁玻璃)；
·用干净的手术刀在PDMS垫片(Grace Bio-Labs GBL103250，可通过SigmaAldrich获得)中切出直径为3mm的2×2孔；
·用milliQ(MQ)水、异丙醇、MQ水、异丙醇、MQ水冲洗垫片，并用氮气流吹干；
·将垫片附接至APTES涂覆的盖玻片的中心(PDMS与玻璃表面的接触足以使其附接)；
·在显微镜上，向APTES盖玻片上的垫片之上中加入37uL的F-肌动蛋白缓冲液滴，并将焦点位置调整至缓冲液填充的垫片的玻璃表面；
·将11.4μM的肌动蛋白(聚合成微丝的42kDa蛋白)原液在G-肌动蛋白缓冲液中稀释成333.33nM；
·将90μL的333.33nM肌动蛋白原液与10μL的10倍浓度的F-肌动蛋白缓冲液(用于启动聚合，具体取决于肌动蛋白实验)混合，得到300nM的最终肌动蛋白浓度；
·聚合15分钟后，用移液器从300nM肌动蛋白溶液中取出3μL的等分试样，将其推出并在移液器的尖端形成一个小液滴，然后使肌动蛋白小液滴与缓冲液滴在垫片中融合；
·扰动消失1分钟后，立即开始记录落下的分子。
与稀释样品和录制视频所需的时间相比，这种方法很好地适用于低聚平衡变化缓慢的体系。
缓冲液
G-肌动蛋白缓冲液
2mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris碱)
0.2mM CaCl2
0.2mM三磷酸腺苷(ATP)
2mM二硫苏糖醇(DTT)
用盐酸调至pH 8.0
F-肌动蛋白缓冲液
10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)
100mM KCl
2mM MgCl2
1mM乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)
用KOH调至pH 7.5
结果如图8A和图8B所示。图8A示出了以上述稀释法，以1kHz的帧率以及25Hz的有效帧率记录的垫片中300nM肌动蛋白的降落视频的示例帧。为了进行比较，图8B示出了在相似条件下，以1kHz的帧率以及25Hz的有效帧率记录的流动室中300nM肌动蛋白的降落视频的示例帧。
实验重复4次，并且所得累计的质量直方图如图9所示。
Claims (27)
1.一种测量溶液中颗粒的浓度的方法，所述方法包括：使所述溶液与表面接触；以及使用光散射检测所述颗粒与所述表面的结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面是经钝化的、经活化的、经涂覆的、经处理的或经衍生化的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，在一个或多个时间间隔后，重复检测所述颗粒与所述表面的结合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述重复的测量允许计算所述颗粒与所述表面的结合的初始速率。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，将所述颗粒的初始结合速率与已知浓度的颗粒的初始结合速率进行比较。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述测量允许计算所述颗粒的恒定结合速率，并且任选地，所述颗粒的恒定结合速率与已知浓度的所述颗粒的恒定结合速率进行比较。
7.根据权利要求1所述的方法，所述方法用于测量溶液中颗粒的浓度，所述方法包括：
i)使所述溶液与表面接触；
ii)检测通过光散射可视化的与所述表面结合的所述颗粒；
iii)重复所述检测步骤，并计算所述颗粒与所述表面的结合速率和/或初始结合速率随时间的变化；
iv)基于来自已知颗粒浓度的溶液的数据，提供初始结合速率相对于浓度的校准曲线；
v)使用步骤(iv)中的校准曲线将步骤(iii)中记录的样品的初始结合速率转换为溶液中颗粒的浓度。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述浓度是绝对浓度。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述颗粒还与测量溶液接触。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述溶液在校准物的存在下与所述表面接触，并且使用光散射检测所述校准物与所述表面的结合。
11.一种用于检测样品中脂蛋白颗粒的方法，所述方法包括通过光散射，任选地通过干涉散射显微技术来检测所述颗粒。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述检测包括确定所述颗粒的尺寸和/或数量。
13.根据权利要求11或12所述的方法，所述方法包括检测所述样品中多于一种不同类型的脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量，并且任选地检测所述样品中不同类型的脂蛋白颗粒的比例。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，所述方法包括检测高密度脂蛋白(HDL)颗粒和/或低密度脂蛋白(LDL)颗粒。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，所述方法包括确定所述样品中HDL颗粒与LDL颗粒的比例。
16.一种用于诊断个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症或者确定所述个体会患上所述疾病或病症的风险的方法，所述方法包括通过光散射，任选地通过干涉散射显微技术检测来自所述个体的样品中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量。
17.根据权利要求16所述的方法，所述方法包括检测所述样品中多于一种不同类型的脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量，或者不同类型的脂蛋白颗粒的比例。
18.根据权利要求16或17所述的方法，所述方法包括检测所述样品中的高密度脂蛋白(HDL)颗粒和/或低密度脂蛋白(LDL)颗粒，任选地包括确定所述样品中HDL颗粒与LDL颗粒的比例。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，与对照样品或参比样品/水平相比，HDL颗粒的数量减少表明所述个体患有所述疾病或病症，或者所述个体患上所述疾病或病症的风险增加。
20.根据权利要求17或18所述的方法，其中，与对照样品或参比样品/水平相比，LDL颗粒的数量增加和/或尺寸减小表明所述个体患有所述疾病或病症，或者所述个体患上所述疾病或病症的风险增加。
21.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中，所述疾病是心血管疾病。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，所述溶液或样品是生物样品，任选地得自于人类个体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述生物样品是血液、血浆或血清，其任选地从人类个体获得。
24.一种选择向其施用物质或组合物或者向其开具治疗方案的个体的方法，其中，所述物质、组合物或治疗方案适用于治疗或预防与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症，所述方法包括通过根据权利要求11至15中任一项所述的方法检测来自所述个体的样品中脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量，以及如果所检测的脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量表明存在所述疾病或病症或其风险，则选出所述患者进行所述施用或所述治疗方案。
25.一种治疗或预防个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：根据权利要求16至23中任一项所述的方法来在个体中诊断所述疾病或病症或确定所述疾病或病症的风险或选择所述个体；以及，向所述个体施用在所述个体中有效治疗或预防所述疾病或病症的物质或组合物，或对所述个体进行在所述个体中有效治疗或预防所述疾病或病症的治疗方案。
26.在治疗或预防个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的方法中使用的物质或组合物，其中，所述个体通过权利要求16至23中任一项所述的方法被诊断或确定为有风险或者被选出。
27.物质或组合物在制备用于治疗或预防个体中与脂蛋白颗粒的尺寸和/或数量相关的疾病或病症的药物中的用途，其中，所述个体通过权利要求16至23中任一项所述的方法被诊断或确定为有风险或者被选出。
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