CN111655451A - 无菌增材制造系统 - Google Patents

Abstract

本解决方案包括被设计为满足洁净室要求的3D打印机。可将所述打印机配置为用于3D生物打印。所述打印机可用于创建细胞支架、组织移植物和器官。所述打印机可包括用于打印物品的无菌(或洁净室样)环境。所述打印机可包括将制造过程与外部环境隔离并且可在打印操作之间被灭菌的外壳。该解决方案还包括打印套件，所述打印套件可被独立灭菌并被送入系统的外壳。

Description

无菌增材制造系统

相关申请的交叉引用

本申请根据35USC§119(e)要求2018年4月4日提交的第62/652,757号美国临时专利申请和2017年11月29日提交的第62/592,202号美国临时专利申请的权益。出于所有目的，每个前述申请通过引用并入本文。

背景技术

增材制造或3D打印一般可包括通过一层在另一层之上的方式连续沉积图形化材料层来“打印”物体。增材制造可在称为“生物打印”的过程中生成生物组件或结构，这些组件或结构可包括在所产生的构建体中具有生物学功能的细胞、蛋白质或生长因子。生物打印过程可能需要遵守良好生产规范(GMP)准则，以适用于临床或药物用途。打印材料可以通过打印喷嘴的内腔被挤出。打印材料可以在压力下从打印喷嘴被挤出。在压力下挤出打印材料会导致气溶胶液滴的形成，所述气溶胶液滴会污染打印机周围的环境。生产过程由某些步骤组成，但不限于这些步骤。

发明概述

为了打印临床或药用物质，生物打印过程可能需要符合无菌过程要求并防止交叉污染。本解决方案描述了用于以无菌方式生物打印细胞构建体或器官的系统和方法，该无菌方式基本上防止制造过程中的交叉污染。

在生物打印过程中，可能需要对细胞构建体进行许多测试。所进行的某些测试可能是破坏性的，并可能导致对测试的细胞构建体或其中的细胞的损害。本解决方案生物打印细胞构建体的多个附属物。这些附属物可作为细胞构建体的可移去样品被打印，并且可包含与细胞构建体中所包含的细胞和材料相同的细胞和材料。在预定的时间，可将附属物从细胞构建体移去并对其测试。附属物可用作细胞构建体的代替物(proxy)，并提供对细胞构建体内的细胞的健康和增殖的了解。

本解决方案包括被设计用于满足生物制品或制药应用中的洁净室要求的三维(3D)打印机。可将打印机配置为用于3D生物打印。打印机可用于创建无细胞支架或器官模板、细胞支架、组织移植物和多细胞器官。例如，打印机可用于生成细胞组织，如皮肤、骨骼和软骨，其一般可被称为细胞构建体。这些组织构建体可包括生物组分，如细胞、生长因子、药物或其组合。可以将生物组分与合成或天然聚合物、蛋白质或其他生物相容性材料混合、溶解或共挤出。可以通过在打印过程之前将生物组分混合或供选择地在打印过程之后将生物组分作为涂层或填充物引入，将生物组分包含在生物打印材料，通常为水凝胶中。可将细胞包埋在聚合物混合物中以形成具有生物学功能的细胞构建体、组织移植物或器官。可通过对物体进行喷涂或通过将生物材料渗入到打印的模板中来将细胞或其他生物组分引入打印的支架结构或模板。该打印机还可用于制造定制的药片和药物。

所产生的组织移植物在无菌环境下产生。从临床组织活检分离出哺乳动物(例如人)细胞。分离的细胞可以是原代细胞、祖细胞、干细胞或这些的组合。通过机械方法和/或化学方法破坏细胞外基质或载液以释放细胞来分离细胞。通常将收集的细胞在单层或3D培养物中扩增，直到获得足够的细胞数。根据初始分离细胞产量和应用需求，细胞可以扩增数周。可以在打印前对细胞进行转染或基因编辑以修饰基因组，从而在创建的组织中获得期望的细胞功能。然后可以将这些细胞与天然或合成聚合物混合，制成细胞生物材料混合物。生物聚合物例如但不限于透明质酸、胶原蛋白、明胶、硫酸软骨素、藻酸盐、结冷胶或任何组合可用于制备含细胞的聚合物混合物。合成聚合物如聚乙二醇(PEG)、泊洛沙姆、聚噁唑啉、聚丙二醇、聚(L/D)丙交酯、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺(polyachrylamide)或这些的组合或嵌段共聚物。例如，藻酸盐和结冷胶的聚合物混合物可用于混合细胞，以形成适合生物打印过程的细胞聚合物混合物。

在混合过程之后，可以将细胞聚合物混合物，如含有软骨细胞的藻酸盐和结冷胶装载到打印注射器中，以获得均质的最终材料。混合过程可以是手动混合，使用静态混合器的挤出或主动混合过程，其最终产品被收集至注射器。混合过程可以在注射器内部进行，或者在将材料混合物装载到注射器中之前进行。

本解决方案还可以包括打印套件。每个打印套件可包括打印材料注射器和用于打印操作的打印机组件。可以对打印套件及其组件进行灭菌，然后通过气闸室将其送到打印机的外壳中。一旦位于外壳中，这些组件就可以被组装以形成3D打印机的沉积头，并且可以给沉积头装载打印材料。可以在打印过程期间使用多个打印注射器和喷嘴来制备多材料或多细胞构建体。可以使用多个注射器，在打印过程中交替挤压注射器。套件还可以包括无菌运输单元，将完成的物品沉积在其中。该运输单元能够在保持在无菌环境中的同时将物品转移至培养箱(或其它位置)。可以将来自打印操作的废物放回套件中并从打印机除去，可以在打印操作后对其进行灭菌。

打印机可以包括用于打印物体的无菌(或洁净室样)环境。打印机可以包括将制造过程与外部环境隔离的外壳。可以用化学杀菌剂充满外壳，以在打印操作之间对外壳灭菌。外壳还可以防止气溶胶液滴(一般称为颗粒)污染外部环境。所有打印机表面均与化学酸和碱清洁循环以及气体处理兼容。打印后，可以用酸和碱清洁剂擦净隔离打印机(isoprinter)，以除去防止气体到达所有打印机表面的任何可能的溢出物或固体物质。擦拭后，使用H2O2或类似物进行气体处理以对隔离打印机进行灭菌。

由液体、半固体或凝胶样材料组成的生物打印的构建体需要经历交联过程以进一步稳定、固化或增强所创建的组织移植物的结构。在生物打印过程中或之后，可以在隔离器空间内使用多种凝胶化方法，包括但不限于热、离子、酶、自由基或化学反应。例如，结冷胶和藻酸盐生物聚合物混合物可以在单价、二价或三价阳离子的存在下交联，所述单价、二价或三价阳离子包括但不限于Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺或Fe³⁺。

根据本发明的至少一个方面，一种增材制造系统可包括与外壳连接的至少一个通过腔室。所述至少一个通过腔室可包括实现从外部环境通往所述至少一个通过腔室的内部的第一入口和实现从所述至少一个通过腔室的内部通往所述外壳的内部的第二入口。该外壳可以包括第一端口，该第一端口被配置为接收三维打印机的沉积头。该外壳可包括第一波纹管，该第一波纹管被配置为与沉积头和第一端口的周边连接。该系统可包括3D打印机。

该系统可包括打印套件。打印套件可包括基板，该基板被配置为接收从沉积头挤出的材料。打印套件可包括套筒，该套筒可包括被配置为与沉积头连接的第一端和被配置为与基板连接的第二端，以在所述外壳内形成隔离的空间。

该打印套件可包括容纳袋，该容纳袋被配置为收集来自用3D打印机打印生物支架的过程的废物。该打印套件可包括被配置为能够运输生物支架的运输单元。该打印套件可包括注射器，该注射器包含3D打印机的打印材料。所述打印材料可包含至少一种生物聚合物和多个细胞。

该系统可包括与外壳连接的第二通过腔室。该系统可包括一个或多个进入端口，其被配置为使得用户能够操作外壳内的物品。所述3D打印机可包括多个沉积头。多个沉积头中的每一个可以被配置为沉积不同的打印材料。

根据本发明的至少一个方面，一种增材制造套件可包括基板，该基板被配置为接收从三维打印机的沉积头挤出的材料。该套件可包括套筒，该套筒可包括被配置为与沉积头连接的第一端和被配置为与基板连接的第二端以形成隔离的空间。该套件可以包括注射器，该注射器可以包含打印材料。

在一些实现方式中，所述打印材料可包括含有细胞的生物聚合物混合物。该打印套件可包括用以存储所述基板、套筒和注射器的可灭菌的壳体。

根据本发明的至少一个方面，一种方法可包括从活检分离软骨细胞。该方法可包括生成生物聚合物打印材料，该生物聚合物打印材料可包含至少一种聚合物和所述软骨细胞。该方法可以包括用增材制造系统由生物聚合物打印材料形成细胞构建体。该系统可包括与外壳连接的至少一个通过腔室。所述至少一个通过腔室可包括实现从外部环境通往所述至少一个通过腔室的内部的第一入口和实现从所述至少一个通过腔室的内部通往所述外壳的内部的第二入口。该外壳可以包括第一端，该第一端被配置为接收三维打印机的沉积头。该外壳可包括第一波纹管，该第一波纹管被配置为与所述沉积头和所述第一端的周边连接。

生物聚合物打印材料可包含胶凝多糖或藻酸钠中的至少一种。该方法可以包括由生物聚合物打印材料在细胞构建体上形成至少一个附属物。该方法可以包括切除细胞构建体的所述至少一个附属物之一用于测试。该方法可以包括用氯化钙溶液使细胞构建体交联。

所述生物聚合物打印材料可包含从活检收获的分化的祖细胞或分化的干细胞中的至少一种。该方法可以包括培养来自活检软骨细胞，直到软骨细胞达到预定的细胞计数。该方法可以包括对所述外壳进行灭菌。

附图的简要说明

附图无意按比例绘制。在各个附图中，同样的附图标号和名称表示同样的要素。为了清楚起见，并非每个组件都会在每个附图中标记。在附图中：

图1A和1B示出了可用于制造细胞构建体的示例隔离打印机的不同视图。

图2示出了用于图1A和1B中所示的隔离打印机的示例套件的示意图。

图3示出了使用图1A和1B中所示的系统生物打印软骨器官的示例方法的方框图。

图4示出了使用图1A和1B中所示的隔离打印机进行增材制造的示例方法的方框图。

图5示出了用图1A和1B中所示的示例隔离打印机制造的具有可移去的附属物的示例细胞构建体。

发明详述

由于所描述的概念不限于任何特定的实现方式，所以可以以多种方式中的任何一种来实现上面介绍的以及下文更详细讨论的各种概念。主要出于说明性目的提供具体实现方式和应用的实例。

图1A和1B示出了示例隔离打印机100，其也可以被称为isoPrinter 100。isoPrinter 100可以是增材制造系统。图1A示出了isoPrinter 100的正视图。图1B示出了isoPrinter 100的横截面侧视图。

isoPrinter 100包括容纳3D打印机152的沉积头104的外壳102。沉积头104也可以称为打印头。在一些实现方式中，isoPrinter 100可以包括多个沉积头104。每个沉积头104可以连接打印喷嘴206。不同的沉积头104可以用于打印多材料或多细胞组织移植物。例如，isoPrinter 100可以由第一材料打印内部支撑结构，并围绕该内部支撑结构以第二材料打印细胞构建体。

isoPrinter 100可以包括基板106，沉积头104可以将打印材料沉积在基板106上。外壳102可包括多个气闸室108(或通过腔室108)。在一些实现方式中，可以使用一个气闸室108来将材料和就图2描述的套件送至外壳102中，并且可以使用第二气闸室108从外壳102移出材料和套件。每个气闸室108可包括一个或多个入口150。第一入口150可实现从系统100的外部通往气闸室108的内部。气闸室108可与外壳102连接。第二入口150可实现气闸室108的内部与外壳102的内部之间相通。例如，下文所述套件可经由第一入口150被送到气闸室108内，然后经由第二入口150被送到外壳102的内部。外壳102还可以包括使得用户能够操作外壳102内的材料和物品的进入端口110。

外壳102可以将通过沉积头104进行的制造过程与外部环境隔离。通过隔离制造过程，isoPrinter 100可以在洁净室环境中使用。例如，isoPrinter 100可在B-C级洁净室中使用。外壳102的壁可包含丙烯酸玻璃或可被灭菌、杀菌和/或消毒的其他透明材料。在一些实现方式中，每个壁的大部分可以是透明的。在其他实现方式中，外壳102的壁可以由金属构建，并且壁可以包括透明观察口。

外壳102可以被密封以防止外壳102的内部与外部之间的空气流动。在一些实施方式中，isoPrinter 100可以包括用于对外壳102的内部进行正向或负向加压的泵。在一些实现方式中，外壳102内部的环境可以控制为期望的温度、大气气体和湿度。

外壳102的内部可以被灭菌。外壳102可以包括入口和出口，以实现通过灭菌单元引入杀菌剂。例如，在使用之后，可以用H₂O₂气体充满外壳102的内部以对外壳102进行灭菌。

外壳102可以包括用于沉积头104的端口。例如，3D打印机的控制器和其他组件可以位于外壳102的外部。3D打印机的沉积头104可以通过该端口进入外壳102中。该端口可以包括橡胶波纹管，该橡胶波纹管连接至沉积头104并且在沉积头104和端口的周边之间形成密封。波纹管可使沉积头104在外壳102内在x、y和z方向上自由移动。

在一些实现方式中，沉积头104可以包括定位传感器和反馈传感器。传感器可以被配置为确定沉积头104(和打印喷嘴)在外壳102内和相对于基板106和已打印在基板106上的材料的位置。传感器可以包括压电传感器和基于激光的距离传感器。

外壳102还可包括气闸室108。气闸室108可通过基本上防止污染物或不期望的颗粒在外壳102的内部和外部之间通过使得用户能够将材料和设备送至外壳102中和送出外壳102，而不交叉污染isoPrinter 100和环境。例如，气闸室108可包括内门和外门(例如，入口150)。内门可以面向外壳102的内部，而外门可以面向外部环境。使用者可以首先打开外门，关闭内门，并将材料放入气闸室108的内部之中。关闭外门后，用户可以打开内门(通过进入端口110的手套)。气闸室108可包括空气喷淋器，以使空气流过气闸室108内的物品，从而从物品除去颗粒和污染物。在一些实现方式中，气闸室108可使气体杀菌剂流入气闸室108中，以对气闸室108内的物品进行消毒或灭菌。

进入端口110可包括在外壳102的壁上的开口。手套可被密封在进入端口110上，以使用户能够操作外壳102内的物品，同时仍提供外壳102的内部和外部环境之间的屏障。在一些实现方式中，进入端口110可包括波纹管，该波纹管使得能够在外壳102内使用工具或机械臂。

沉积头104可包括3D打印机的挤出机。沉积头104可包括打印喷嘴，通过该打印喷嘴挤出打印材料。打印材料可以包括塑料、金属、合成聚合物或其他生物相容性材料。在一些实现方式中，打印喷嘴可以是可移去的。打印喷嘴可包含黄铜、不锈钢、硬化钢或塑料。可以在压力下和在受控温度下将打印材料通过沉积头104送到打印喷嘴。可以通过打印喷嘴的内腔从沉积头104挤出打印材料。在一些实施方式中，打印喷嘴可以是注射器的针。在这些实现方式中，可以将填充的注射器插入沉积头104中。沉积头104可以包括按压注射器的柱塞并使打印材料被挤出的致动器，或者以螺纹从注射器的针移动材料的基于螺杆的系统。

isoPrinter 100可以包括端口151。端口151可以是在外壳102的壁上的开口，沉积头104从3D打印机152延伸通过该端口。isoPrinter 100可以包括波纹管153，其可以与位于波纹管153的第一端的端口151的周边和位于波纹管153的第二端的沉积头104连接。波纹管153可以使沉积头104在端口151内自由移动。波纹管153可以形成密封以防止污染物通过端口151并进入外壳102的内部。

isoPrinter 100可以包括基板106。沉积头104可以将材料沉积到基板106上。基板106可以连接到一个或多个致动器，以使基板106能够在x、y和z方向上移动。基板106可以是就图2描述的套件的组件。例如，在每次构建之前，可将基板106传递到外壳102内并固定至致动器。在一些实现方式中，基板106是静止的，并且仅沉积头104移动。

图2示出了示例套件200的示意图。套件200可以包括用于具体制造操作的材料、工具和其他物品。在一些实现方式中，套件200可包括套筒202、注射器204、打印喷嘴206、运输单元208、基板106或容纳袋212的任何组合。套件200包括用于存储套件的组件的壳体。套件壳体和套件200的组件可以被灭菌。

套筒202可以是柔性波纹管、管或裙。套筒202的第一端可以与沉积头104连接，而套筒202的第二端可以与基板106的周边连接。当被密封在沉积头104和底板106之间时，套筒202可以形成隔离的空间，在其中进行打印沉积。套筒202的使用可以限制污染物和颗粒从沉积头104分散并遍布整个外壳102。对颗粒的控制可以使壳102的灭菌和清洁更容易、更快和更具有成本效益。套筒202可以被配置为使得沉积头104在制造过程期间完全自由移动。套筒202可以是基于塑料、基于橡胶或基于硅的。套筒202可在其每个端部处包括密封件，如垫圈或O形环，以在沉积头104和基板106之间形成气密密封。在一些实现方式中，套件200可包括可用于将套筒202固定至沉积头104和/或基板106的夹、凸耳或锁。

套件200可以包括一个或多个打印喷嘴206。每个不同的打印喷嘴206可以包括不同内腔直径用于挤出打印材料。与较大直径的内腔相比，较小直径的内腔可使3D打印机以相对较高的分辨率打印。对于每次操作，可以更换打印喷嘴206。

套件200还可以包括注射器204。注射器204可以预填充含有或没有细胞的生物聚合物混合物或其他打印材料。使用者可以使用注射器204来以打印材料填充沉积头104。在一些实现方式中，注射器204可以被直接放置在沉积头104中，并且注射器的针可以用作打印喷嘴。套件200可以包括多个不同的注射器204。每个不同的注射器204可以填充有不同的(或另外的)打印材料。

套件200可以包括运输单元208。运输单元208可以是无菌容器，将已打印的物品直接创建在其中或一旦打印就将其置于其中。可以将打印的物品放置在运输单元208中，通过气闸室108传递到外壳102的外部，然后运输到可以对打印的物品进行进一步处理的另一位置。在一些实现方式中，当打印诸如用于耳朵的生物支架或其他细胞构建体时，可以将打印的物品从isoPrinter 100取出，通过运输单元208至培养箱，在该培养箱中生物支架中的细胞可以被孵育。在一些实现方式中，可将细胞掺入生物聚合物混合物中并打印至生物支架上。在其他实现方式中，可以在支架被打印之后将细胞接种至生物支架上。在一些实现方式中，带有打印物品的运输单元208可以在植入患者之前被灭菌。

套件200还可以包括容纳袋212。一旦完成打印操作，可以将套件200的废物和一次性物品放置在容纳袋212中，并且可以密封容纳袋212。例如，套筒202、注射器204和打印喷嘴206可以在每次操作之后被处置。在一些实现方式中，废料可以被直接放置在套件200的壳体中，而不是放置在容纳袋212中。

图3示出了用于生物打印软骨器官的示例方法300的方框图。例如，方法300可以用于制造耳朵或鼻子。方法300可以包括获得活检(步骤301)。方法300可以包括从活检分离细胞(步骤302)。方法300可以包括通过支持多个细胞倍增来扩增细胞，直到获得足够数量的细胞(步骤303)。方法300可以包括产生聚合物混合物(步骤304)并将细胞添加至聚合物混合物(步骤305)。方法300可以包括生物打印细胞构建体(步骤306)和检查构建体的附属物(步骤307)。方法300可以包括进一步培养构建体以形成成熟的组织(步骤308)。方法300可以包括构建体的植入(步骤309)。

如上所述，方法300可包括获得活检(步骤301)。可以从最终将被植入器官的患者获得活检。在一些实现方式中，活检可以从供体获得。活检可包括耳软骨、鼻软骨、髓核、半月板、气管、鼻软骨、肋软骨、关节软骨、滑液、玻璃体液、脑、脊髓、肌肉、结缔组织、小肠粘膜下层或肝组织。为了制造耳朵，活检可以是直径4-8毫米的全厚度圆形软骨活检样本，该样本取自小耳症耳朵对侧的耳朵。一旦被切除，活检可被储存在含有庆大霉素(50g/mL)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。该活检不是关键的尺寸缺陷，并将随时间痊愈。在一些情况下，组织活检可在2–8℃下运输，以增强细胞在细胞分离之前存活的能力。

方法300可以包括从活检分离细胞(步骤302)。所述细胞可以是软骨细胞。可以从活检组织除去结缔组织或其他不需要的组织，并且可以切碎样品组织(例如，软骨)。可以将组织切成约5μm至约50μm，约50μm至约200μm，或约200μm至约100μm的尺寸。可以将包含DMEM和Ham's F12、10％胎牛血清(FBS)和胶原酶0.66单位/mL酶的无菌过滤的消化培养基与切碎的软骨混合，并使其在静态条件下于37℃下孵育16-18小时。这可以产生释放的软骨细胞的悬浮液。可使释放的软骨细胞的悬浮液经过100μm的细胞过滤器并离心。成团的软骨细胞可以重悬于新鲜的无菌的补充有10％FBS和25μg/mL抗坏血酸的DMEM+Ham's F12中。在一些实现方式中，对细胞的总数计数，并通过台盼蓝染色确定细胞活力。

方法300可以包括扩增细胞(步骤303)。可以将细胞(例如，软骨细胞)以约3000个细胞/cm²的浓度接种到培养瓶中。可以根据具体细胞需要以约100至约1000个细胞/cm²或约1000至约10000个细胞/cm²的密度接种细胞。在一些实现方式中，可以将细胞冷冻保存以便于患者安排或运输。如果冷冻保存，则可以将细胞悬浮在可以包含DMEM和Ham's F12、10％FBS、10％DMSO的培养基中。在储存在液氮或气化液氮中之前，可以以每分钟2℃的受控速率将细胞冷却直到-80℃。一旦从冷冻保存移出(例如，一旦安排患者进行植入手术)，就将细胞解冻，并且继续细胞扩增直至存在约70-100x10⁶个细胞。可以收获细胞并用不含FBS的培养基洗涤。在一些实现方式中，收获一部分细胞，并测量细胞活力和基因表达。在与生物聚合物混合或以其它方式使用之前，可以在此阶段分化祖细胞和干细胞，以保证靶组织形成。可以将分化的单能细胞进一步混合到生物聚合物中或用于支架涂层。

方法300可以包括产生聚合物混合物(步骤304)。可以通过在90℃下将结冷胶(35mg/mL)和藻酸钠(25mg/mL)与葡聚糖溶液(渗透压摩尔浓度300mOsmol)机械混合来制备聚合物混合物。可以将聚合物混合物在室温下无菌保存在注射器中，以备以后用于细胞。在一些实现方式中，其他胶凝多糖可以用于结冷胶或藻酸盐。例如，可以使用瓜尔豆胶、决明胶、魔芋胶、阿拉伯胶、印度树胶、刺槐豆胶、黄原胶、硫酸黄原胶、角叉菜胶、硫酸角叉菜胶或其任何混合物。在一些实现方式中，聚合物混合物可以包括生物可吸收的聚合物，如PLA(聚乳酸或聚丙交酯)、DL-PLA(聚(DL-丙交酯))、L-PLA(聚(L-丙交酯))、聚乙二醇(PEG)、PGA(聚乙交酯)、PCL(聚-ε-己内酯)、PLCL(聚丙交酯-共-ε-己内酯)、二氢硫辛酸(DHLA)、壳聚糖。在一些实现方式中，聚合物可包括合成聚合物，如聚乙二醇、聚丙二醇、泊洛沙姆、聚噁唑啉、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚甲基乙烯基醚-共-马来酸酐、聚丙交酯、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚烯丙胺。在一些实现方式中，聚合物可以包括以上的任何组合。

方法300可以包括将细胞添加至聚合物混合物(步骤305)。将包含细胞的悬浮液以1:10的比例(细胞培养基：聚合物)添加至在步骤205生成的聚合物混合物。可通过直接连接至打印注射器的静态混合添加细胞，以在生物聚合物混合物中获得6–9x10⁶个细胞/ml的细胞浓度。

方法300可以包括生物打印细胞构建体(步骤306)。就图4进一步讨论生物打印细胞构建体的方法。概括来说，可以通过作为准备好的打印套件的部分的传递箱将填充有在步骤305中形成的生物聚合物混合物的打印注射器带至打印机。可以将打印注射器连接至或插入打印机的沉积头或注射器支架。在一些实现方式中，打印注射器可用于用生物聚合物混合物填充沉积头中的储存器。可以以增材方式，将生物聚合物从打印注射器挤出以形成细胞构建体。可以从平行注射器挤出第二聚合物混合物，用于三维支撑结构。可以在构建体完成后通过物理或化学过程例如但不限于水解溶解、pH变化或温度变换将暂时的支撑结构移去。

方法300可以包括检查细胞构建体的附属物(步骤307)。附属物的检查可以包括以预定间隔移去一个或多个附属物。检查附属物可以包括对切除的附属物进行测试。测试可以是破坏性的或非破坏性的。所述测试可以是机械和/或生物学性质，例如但不限于细胞活力、基因表达和细胞构建体中的细胞分布的测试。附属物的移去和测试可以在方法300的不同阶段期间进行，或者也可以在构建体成熟期间进行(下面的步骤308)。例如，可以在构建体的成熟过程中定期移去附属物并进行测试，以确定何时构建体准备好发放给患者。

方法300可以包括构建体成熟(步骤308)。例如，在制造细胞构建体之后，可以从打印机移去细胞构建体，以避免任何可能的交叉污染问题。可以通过将氯化钙溶液施加至细胞构建体使细胞构建体交联。可以施用氯化钙溶液240分钟，同时将细胞构建体放置在搅拌板上，以防止在交联中形成局部浓度梯度。在一些实现方式中，交联剂可以是单价、二价和三价阳离子，酶，过氧化氢，辣根过氧化物酶，可辐射聚合的单体如苯基2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。通过光引发剂交联的聚合物可以在打印过程期间逐层交联，以实现更均匀的层曝光。交联后，尽管是该技术，也可以将细胞构建体在含有10ng/mL重组人转化生长因子β3(rhTGF-β3)或已知对使用的细胞有积极影响的其他促有丝分裂生长因子的培养基中培养约2-5周。可以在培养箱中进行成熟培养，或者可以使用特定的生物反应通过机械、化学或生物刺激来刺激成熟。组织成熟后，可用无rhTGF-β3的培养基将细胞构建体洗涤3次。

在一些实现方式中，一旦细胞构建体交联，就可以按照预期细胞构建体3D模型的形状和大小来进一步测量细胞构建体。也可以对剩余测试样品进行上述过程。然后可以测试测试样品的细胞活力、PCR基因表达和机械性能。对测试样品进行无菌、内毒素和支原体测定。可以将细胞构建体包装在含有营养培养基(例如，只有DMEM和Ham's F12)的无菌容器中，然后将其在确保所运送的活体构建体的无菌和营养供应的专门设计的容器中运送到临床。

方法300可以包括构建体植入(步骤309)。方法300可以包括在植入之前将构建体运送到临床场所。该构建体可以在运输单元中被运送至临床场所。该运输单元可以保持无菌环境，直到将构建体移出用以植入患者。

图4示出了可以在上述方法300中使用的增材制造的示例方法400的方框图。方法400可以包括将3D模型输入isoPrinter中(步骤402)。方法400可以包括对套件进行灭菌(步骤404)。方法400可以包括将套件送至isoPrinter中(步骤406)。方法400可以包括组装沉积头(步骤408)。方法400可以包括打印物品(步骤410)。方法400可以包括从isoPrinter移出打印的物品(步骤412)。方法400可以包括处理废物(步骤414)和对isoPrinter灭菌(步骤416)。

还参考图1和图2，并且如上所述，方法400可以包括将3D计算机模型输入到isoPrinter 100中(步骤402)。可以通过计算机辅助设计(CAD)程序生成计算机模型。在一些实现方式中，可以通过光学扫描物理模型以生成数字模型来生成计算机模型。可以通过直接连接(例如，使用闪存驱动器)或通过网络将包括待成为打印物品的物品的3D几何形状的文件存入isoPrinter 100中。

方法400可以包括对套件200进行灭菌(步骤404)。如上所述，套件200可包括打印材料和沉积头104的一次性或可重复使用的组件。例如，套件200可包括套筒202、一个或多个注射器204和打印喷嘴206、运输单元208、基板106和容纳袋212。套件200还可包括可装载打印材料，如生物墨水或生物聚合物混合物的打印丝(printing filament)和/或注射器204。一旦套件200被组装用于打印操作，就可对套件200进行灭菌。套件200及其中的组件可以用热灭菌、化学灭菌、辐射灭菌或其任意组合来灭菌。

方法400可以包括将套件200传递到isoPrinter 100中(步骤406)。套件200可通过气闸室108被送到外壳102内。一旦位于外壳102内，就可使用套件200的组件组装沉积头104(步骤408)。组装沉积头104可以包括将注射器204或打印材料装载到沉积头104中。打印喷嘴206也可以被应用于沉积头104。基板106可以被固定至外壳102的底板(或底板中的致动器)。套筒202可以与沉积头104和基板106连接以形成在其中进行增材制造过程的隔离的空间。在一些实现方式中，方法400不包括使用套筒202。然后3D打印机可以打印物品(步骤410)。

一旦打印操作完成，就可以从isoPrinter 100移出打印的物品(步骤412)。在一些实现方式中，在从isoPrinter 100移出打印的物品之前，可以将打印的物品放置在运输单元208中。运输单元208可以将打印的物品保持在无菌环境中，直到打印的物品被进一步处理(例如，放置在培养箱中或交联)或植入患者。在一些实现方式中，可以在植入或进一步处理之前对运输单元208和打印的物品进行再灭菌。可以经由外壳气闸室108之一以运输单元208将打印的物品从外壳102移出。

一旦操作完成，用户就可以处置废物(步骤414)。废物可以包括用过的套筒202、注射器204、基板106和打印喷嘴206。用户可以将用过的物品放入容纳袋212。用户可以通过气闸室108将容纳袋212从isoPrinter 100送出来。然后，可以将用过的组件丢弃或清洁、灭菌和重新使用。例如，套筒202可以被蒸汽清洁并在随后的打印操作中重新使用。然后可以对外壳102的内部进行灭菌(步骤416)。外壳102的内部可以被化学灭菌或用例如蒸汽热灭菌。在化学灭菌的实例中，外壳102可以充满环氧乙烷或过氧化氢气体。在一些实现方式中，可以为下次打印操作重新校准isoPrinter100。

图5示出了制造的具有可移去附属物52的示例构建体50。构建体50可包括主体51和一个或多个附属物52。主体51可包括形成植入患者的最终部分的构建体50部分。例如，主体51可以包括被输送至患者的耳朵、鼻子或其它部分。附属物52可与主体51连接或可从主体51延伸。

可以制造具有一个或多个附属物52的构建体50。可以跨构建体50的一个或多个边缘分布附属物52。例如，可以将附属物52放置在主体51的边缘周围的位置，在这里，当移出附属物52时，附属物52的移出对主体51的物理或外观损害将最小或将不对主体51造成物理或外观损坏。在一些实现方式中，附属物52可以被打印到打印平台上(主体51打印于打印平台上)并且不连接至主体51。附属物52可以由与主体51相同的材料制成。附属物52可包括结合到主体51中的内部支撑结构或其他组件。附属物52可被配置为匹配主体51的机械和生物学性质。附属物52由与主体51相同的材料制成(并且具有与主体51相同的性质)，可以在发放前测试期间作为主体51的代替物。

例如，可以由包含细胞的混合物的聚合物基体打印构建体50。一旦构建体50被3D打印，就可以孵育构建体50以使细胞成熟和繁殖。随着成熟过程，可以在不同的时间点从主体51顺序地移去附属物52。在每个不同的时间点，可以测试移去的附属物52以确定例如细胞分化、细胞的密度、细胞的机械性质、细胞活力、基因表达、细胞构建体50中的细胞分布、药物相互作用测试、或其任何组合。

附属物52可具有约10mm²至约500mm²，约50mm²至约1000mm²，约100mm²至约750mm²，约200mm²至约500mm²，或约300mm²至约500mm²的表面积。

尽管在附图中以特定顺序描绘了操作，但是不必需以所示的特定顺序或以相继顺序来进行这样的操作，并且不必需进行所有示出的操作。本文描述的动作可以以不同的顺序进行。

各个系统组件的分离并不需要在所有实现方式中分离，并且所描述的程序组件可以被包括在单个硬件或软件产品中。

现在已经描述了一些说明性实现方式，显然前述内容是说明性的而非限制性的，已经通过实施例的方式给出。特别地，尽管本文呈现的许多实施例涉及方法动作或系统要素的特定组合，但是可以以其他方式组合那些动作和那些要素以实现相同的目的。结合一个实现方式讨论的动作、要素和特征不要被排除在其它实现方式中的类似作用或其他实现方式之外。

本文使用的措词和术语是出于描述的目的的，并且不应被视为限制性的。本文中“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”、“特征为”、“特征在于”及其变体的使用意在涵盖其后列出的项目、其等同物以及其他项目，以及由其后排他性地列出的项目组成的供选择的实现方式。在一种实现方式中，本文所述的系统和方法由所述要素、动作或组件中的一个、多于一个的每种组合或所有组成。

如本文所用的，术语“约”和“基本上”将被本领域普通技术人员理解，并且将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如果在给定的使用其的上下文中存在对于本领域普通技术人员来说不清楚的术语使用，则“约”将表示具体术语的正或负10％。

在本文中任何以单数提及的系统和方法的实现方式或要素或动作也可以包含包括多个这些要素的实现方式，并且在本文中任何以复数提及的任何实现方式或要素或动作也可以包含包括仅单个元素的实现方式。以单数或复数形式提及并非意在将当前公开的系统或方法、它们的组件、动作或要素限制为单个或多个配置。对基于任何信息、动作或要素的任何动作或要素的提及可以包括其中该动作或要素至少部分地基于任何信息、动作或要素的实现方式。

本文公开的任何实现方式可以与任何其他实现方式或实施方案组合，并且提及“一种实现方式”、“一些实现方式”、“一个实现方式”等不一定是互相排斥的，并且旨在表明结合实现方式描述的具体特征、结构或特性可以被包括在至少一个实现方式或实施方案中。如本文所使用的这样的术语不一定全部指代相同的实现方式。任何实现方式可以以与本文公开的方面和实现方式一致的任何方式与任何其他实现方式包含性地或排他性地组合。

除非明确相反地指出，否则在本文的说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”应理解为是指“至少一个”。

对“或”的提及可以被解释为包括性的，使得使用“或”描述的任何术语可以指示单个、多于一个以及所有所描述的术语中的任何一种。例如，提及“‘A’和‘B’中的至少一个”可以包括仅‘A’、仅‘B’以及‘A’和‘B’两者。与“包含”或其他开放式术语结合使用的这样的提及可包括另外的项目。

在附图、详细描述或任何权利要求中的技术特征后有附图标记的地方，已经包括了附图标记以增加附图、详细描述和权利要求的可理解性。因此，附图标记或不存在附图标记对任何权利要求要素的范围都没有任何限制作用。

本文中描述的系统和方法可以以其他具体形式来体现而不脱离其特征。前述实现方式是说明性的，而不是对所描述的系统和方法的限制。因此，本文所描述的系统和方法的范围由所附权利要求书，而不是前述说明来显示，并且落入权利要求的等同含义和范围内的改变被包含在其中。

Claims (20)

1.一种增材制造系统，其包括：

三维(3D)打印机，其包括被配置为挤出生物聚合物打印材料的沉积头；

被配置为保持无菌环境的外壳，所述外壳包括：

第一端口，其被配置为接收所述3D打印机的沉积头；

第一波纹管，其被配置为与所述沉积头和所述第一端口的周边连接；和

与所述外壳连接的至少一个通过腔室，所述至少一个通过腔室包括实现从外部环境通往所述至少一个通过腔室的内部的第一入口和实现从所述至少一个通过腔室的内部通往所述外壳的内部的第二入口。

2.权利要求1所述的系统，其还包括打印套件，所述打印套件包括：

基板，其被配置为接收从所述沉积头挤出的材料；和

套筒，其包括被配置为与所述沉积头连接的第一端和被配置为与所述基板连接的第二端，以在所述外壳内形成隔离的空间。

3.权利要求2所述的系统，其中所述打印套件还包括：

容纳袋，其被配置为收集来自采用3D打印机打印生物支架的过程的废物；和

运输单元，其被配置为能够运输所述生物支架。

4.权利要求1所述的系统，其还包括打印套件，所述打印套件包括注射器，所述注射器包含所述3D打印机的打印材料。

5.权利要求4所述的系统，其中所述打印材料包括至少一种生物聚合物和多个细胞。

6.权利要求1所述的系统，其还包括与所述外壳连接的第二通过腔室。

7.权利要求1所述的系统，其配置一个或多个进入端口使得用户能够操作所述外壳内的物品。

8.权利要求1所述的系统，其中所述3D打印机包括多个沉积头。

9.权利要求8所述的系统，其中所述多个沉积头中的每个被配置为沉积不同的打印材料。

10.一种增材制造套件，其包括：

基板，其被配置为接收从三维(3D)打印机的沉积头挤出的材料；

套筒，其包括被配置为与所述沉积头连接的第一端和被配置为与所述基板连接的第二端，以形成隔离的空间；和

包含打印材料的注射器。

11.权利要求10所述的套件，其中所述打印材料是具有细胞的生物聚合物混合物。

12.权利要求10所述的套件，其还包括存储所述基板、套筒和注射器的可灭菌壳体。

13.一种方法，其包括：

从活检分离软骨细胞；

生成包含至少一种聚合物和所述软骨细胞的生物聚合物打印材料；

采用增材制造系统由所述生物聚合物打印材料形成细胞构建体，所述增材制造系统包括：

与外壳连接的至少一个通过腔室，所述至少一个通过腔室包括实现从外部环境通往所述至少一个通过腔室的内部的第一入口和实现从所述至少一个通过腔室的内部通往所述外壳的内部的第二入口；

所述外壳包括：

第一端口，其被配置为接收所述增材制造系统的沉积头；和

第一波纹管，其被配置为与所述沉积头和所述第一端口的周边连接。

14.权利要求13所述的方法，其中所述生物聚合物打印材料包含胶凝多糖或藻酸钠中的至少一种。

15.权利要求13所述的方法，其还包括由所述生物聚合物打印材料在所述细胞构建体上形成至少一个附属物。

16.权利要求15所述的方法，其还包括切除所述细胞构建体的所述至少一个附属物之一用于测试。

17.权利要求13所述的方法，其还包括采用氯化钙溶液使所述细胞构建体交联。

18.权利要求13所述的方法，其中所述生物聚合物打印材料包含从活检收获的分化的祖细胞或分化的干细胞中的至少一种。

19.权利要求13所述的方法，其还包括培养来自所述活检的软骨细胞，直到所述软骨细胞达到预定的细胞计数为止。

20.权利要求13所述的方法，其还包括对所述外壳进行灭菌。

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