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CN111655031A - 包含人源化trkb基因座的非人动物 - Google Patents

包含人源化trkb基因座的非人动物 Download PDF

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CN111655031A CN201880087972.5A CN201880087972A CN111655031A CN 111655031 A CN111655031 A CN 111655031A CN 201880087972 A CN201880087972 A CN 201880087972A CN 111655031 A CN111655031 A CN 111655031A
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Abstract

提供了包含人源化TRKB基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物，以及提供了制备和使用这种非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物的方法。包含人源化TRKB基因座的非人动物细胞或非人动物表达人TRKB蛋白或嵌合甲状腺素视黄质运载蛋白，其片段来自人TRKB。提供了使用包含人源化TRKB基因座的此类非人动物来评估人TRKB靶向试剂(例如设计为靶向人TRKB的核酸酶试剂)的体内功效的方法。

Description

包含人源化TRKB基因座的非人动物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年11月30日提交的美国申请号62/592,905以及于2018年4月23日提交的美国申请号62/661,373的权益，出于所有目的将其每一篇均通过引用整体并入本文。
对通过EFS Web提交为文本文件的序列表的引用
写在文件523380SEQLIST.txt中的序列表为154KB，创建于2018年11月30日，通过引用并入。
背景技术
原肌球蛋白受体激酶B(TRKB)是神经退行性疾病(如青光眼)中针对神经保护的有希望的靶标。TRKB是大脑中分布最广泛的神经营养受体(NTRs)之一，其高度富含于新皮质、海马、纹状体，和脑干中。脑源性神经营养因子(BDNF)与TRKB受体的结合通过细胞内结构域中酪氨酸残基的构象变化和自磷酸化来触发其二聚化，从而导致涉及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，和磷脂酶C-γ(PLC-γ)的信号通路的激活。
TRKB对于神经元存活、分化，和起作用很重要，且TRKB激动剂可以在许多神经、精神和代谢疾病中具有治疗潜力。然而，仍然需要合适的非人动物，其提供人TRKB靶向试剂的真实人靶标或真实人靶标的近似物，从而允许测试此类试剂在活动物中的功效和作用方式以及药代动力学和药效学研究。
发明内容
提供了包含人源化TRKB基因座的非人动物，以及使用这种非人动物的方法。还提供了包含人源化TRKB基因座的非人动物基因组或细胞。
在一方面，提供了包含人源化TRKB基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物。这样的非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物可以包含编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座，其中TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的细胞外结构域由内源TrkB基因座的片段编码，该片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代。
在一方面，提供了包含人源化TrkB基因座的非人动物。这样的非人动物可以包含编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座，其中该TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的细胞外结构域由内源TrkB基因座的片段编码，该片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代。
在另一方面，提供了非人动物细胞，其在其基因组中包含编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座，其中该TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的细胞外结构域由内源TrkB基因座的片段编码，该片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代。
在另一方面，提供了非人动物基因组，其包含编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座，其中该TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的细胞外结构域由内源TrkB基因座的片段编码，该片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代。
在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物中，TRKB蛋白包含人TRKB细胞外结构域。可选地，该细胞外结构域包含SEQ ID NO：60所示的序列。可选地，所有细胞外结构域均由内源TrkB基因座的片段编码，该片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代，可选地，其中细胞外结构域的编码序列包含SEQ ID NO：72所示的序列。
在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物中，TRKB蛋白包含内源信号肽。可选地，该信号肽包含SEQ ID NO：51或55所示的序列。可选地，所有信号肽均由内源TrkB序列编码，可选地，其中信号肽的编码序列包含SEQ ID NO：63或67所示的序列。
在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物中，TRKB蛋白包含内源TRKB跨膜结构域。可选地，该跨膜结构域包含SEQ ID NO：53或57所示的序列。可选地，所有跨膜结构域均由内源TrkB序列编码，可选地，其中跨膜结构域的编码序列包含SEQ ID NO：65或69所示的序列。
在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物中，TRKB蛋白包含内源TRKB细胞质结构域。可选地，该细胞质结构域包含SEQ ID NO：54或58所示的序列。可选地，所有细胞质结构域均由内源TrkB序列编码，可选地，其中细胞质结构域的编码序列包含SEQID NO：66或70中所示的序列。
在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物中，TRKB蛋白包含内源TRKB信号肽、内源TRKB跨膜结构域，和内源TRKB细胞质结构域。可选地，该信号肽包含SEQID NO：51所示的序列，该跨膜结构域包含SEQ ID NO：53所示的序列，且该细胞质结构域包含SEQ ID NO：54所示的序列。可选地，该信号肽包含SEQ ID NO：55所示的序列，该跨膜结构域包含SEQ ID NO：57所示的序列，该细胞质结构域包含SEQ ID NO：58所示的序列。可选地，所有的信号肽、所有的跨膜结构域，和所有的细胞质结构域由内源TrkB序列编码。可选地，该信号肽的编码序列包含SEQ ID NO：63所示的序列，该跨膜结构域的编码序列包含SEQ IDNO：65所示的序列，且该细胞质结构域的编码序列包含SEQ ID NO：66所示的序列。可选地，该信号肽的编码序列包含SEQ ID NO：67所示的序列，该跨膜结构域的编码序列包含SEQ IDNO：69所示的序列，该细胞质结构域的编码序列包含SEQ ID NO：70所示的序列。
在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物中，TRKB蛋白是嵌合非人动物/人TRKB蛋白。可选地，该细胞外结构域是人TRKB细胞外结构域，该跨膜结构域是内源TRKB蛋白跨膜结构域，该细胞质结构域是内源TRKB蛋白细胞质结构域。可选地，TRKB蛋白包含SEQ ID NO：4或5所示的序列。可选地，编码TRKB蛋白的遗传修饰的TrkB基因座的编码序列包含SEQ ID NO：12或13所示的序列。
一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物的遗传修饰的内源TrkB基因座是杂合的。一些此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物的遗传修饰的内源TrkB基因座是纯合的。
一些此类非人动物是哺乳动物。可选地，该非人动物是啮齿动物。可选地，该啮齿动物是大鼠或小鼠。
一些此类非人动物是大鼠。可选地，TRKB蛋白包含SEQ ID NO：5所示的序列。可选地，编码TRKB蛋白的遗传修饰的TrkB基因座的编码序列包含SEQ ID NO：13所示的序列。
一些此类非人动物是小鼠。可选地，TRKB蛋白包含SEQ ID NO：4所示的序列。可选地，编码TRKB蛋白的遗传修饰的TrkB基因座的编码序列包含SEQ ID NO：12所示的序列。
在另一方面，提供了使用上述非人动物评估人TRKB靶向试剂在体内的活性的方法。一些这样的方法包括：(a)向非人动物施用人TRKB靶向试剂；及(b)评估在该非人动物中的人TRKB靶向试剂的活性。
在一些这样的方法中，所评估的活性是神经保护活性。
在一些这样的方法中，步骤(a)包括将该人TRKB靶向试剂注射到该非人动物中。
在一些这样的方法中，步骤(b)包括相对于对照非人动物评估体重、身体组成、代谢，和运动中的一种或多种或全部的变化。可选地，评估身体组成的变化包括相对于对照非人动物评估瘦质量(lean mass)和/或脂肪质量(fat mass)。可选地，评估代谢变化包括评估食物消耗的变化和/或水消耗的变化。
在一些这样的方法中，步骤(b)包括相对于对照非人动物评估TRKB磷酸化和/或MAPK/ERK和PI3K/Akt通路的激活。
在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估神经保护活性。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估神经保护活性，并且非人动物是大鼠。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估视网膜神经节细胞的生存力。可选地，评估视网膜神经节细胞的生存力包括评估视网膜神经节细胞的密度。可选地，在针对视网膜神经节细胞染色的解剖的视网膜中测量视网膜神经节细胞密度。可选地，视神经损伤后，可以在完全视神经横断模型中评估视网膜神经节细胞的生存力。可选地，在视神经粉碎模型中评估视网膜神经节细胞的生存力。
在一些这样的方法中，人TRKB靶向试剂是抗原结合蛋白。可选地，该抗原结合蛋白是人TRKB激动剂抗体。在一些这样的方法中，人TRKB靶向试剂是小分子。可选地，该小分子是人TRKB激动剂。
在另一方面，提供了用于产生编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座的靶向载体，其中TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分细胞外结构域由内源TrkB基因座的片段编码，该片段已经被删除并被种间同源人TRKB序列取代，且其中靶向载体包含插入核酸，该插入核酸包含种间同源人TRKB序列，其侧接靶向内源TrkB基因座处的5'靶序列的5'同源臂和靶向内源TrkB基因座处的3'靶序列的3'同源臂。
在另一方面，提供了制备上述任何非人动物的方法。一些这样的方法可以包括(a)向不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞引入：(i)外源修复模板，其包含插入核酸，该插入核酸侧接杂交至内源TrkB基因座处的5'靶序列的5'同源臂和杂交至内源TrkB基因座处的3'靶序列的3'同源臂，其中插入核酸包含种间同源人TRKB序列；以及(ii)靶向内源TrkB基因座内的靶序列的核酸酶剂，其中基因组被修饰以包含遗传修饰的内源TrkB基因座；(b)将经修饰的非人动物多能细胞引入宿主胚胎；以及(c)将宿主胚胎植入代孕母体，以产生包含遗传修饰的内源TrkB基因座的遗传修饰的F0代非人动物。可选地，多能细胞是胚胎干(ES)细胞。可选地，核酸酶剂是Cas9蛋白和靶向内源TrkB基因座内的指导RNA靶序列的指导RNA。可选地，步骤(a)还包括将第二指导RNA引入非人动物多能细胞，该第二指导RNA靶向内源TrkB基因座内的第二指导RNA靶序列。可选地，外源修复模板是长度至少为10kb的大靶向载体，或者其中外源修复模板是大靶向载体，其中5'同源臂和3'同源臂的总长度至少为10kb。
一些此类方法包括：(a)向非人动物单细胞期胚胎引入：(i)外源修复模板，其包含插入核酸，所述插入核酸侧接杂交至内源TrkB基因座处的5'靶序列的5'同源臂和杂交至内源TrkB基因座处的3'靶序列的3'同源臂，其中插入核酸包含种间同源人TRKB序列；以及(ii)靶向内源TrkB基因座内的靶序列的核酸酶剂，其中基因组被修饰以包含遗传修饰的内源TrkB基因座；(b)将经修饰的非人动物单细胞期胚胎植入代孕母体中，以产生包含遗传修饰的内源TrkB基因座的遗传修饰的F0代非人动物。可选地，核酸酶剂是Cas9蛋白和靶向内源TrkB基因座内的指导RNA靶序列的指导RNA。可选地，步骤(a)还包括将第二指导RNA引入非人动物单细胞期胚胎，该第二指导RNA靶向内源TrkB基因座内的第二指导RNA靶序列。
附图说明
图1(未按比例)示出了用于人源化编码TRKB的细胞外结构域的小鼠TrkB(小鼠Ntrk2)基因座的区域的靶向方案的示意图。图的上部示出内源小鼠TrkB(小鼠Ntrk2)基因座，图的下部示出大靶向载体。
图2(未按比例)示出了用于筛选小鼠TrkB(小鼠Ntrk2)基因座的人源化的
Figure BDA0002605767120000061
测定的示意图。等位基因获得(Gain-of-allele，GOA)测定包括7138hU和7138hD。等位基因丢失(Loss-of-allele，LOA)测定包括7138U和7138D。
图3示出了在直接海马注射TRKB激动剂抗体H4H9816P2或同种型对照抗体后1小时、4小时，和18小时，在纯合人源化TRKB小鼠中评估总TRKB水平和磷酸TRKB水平的蛋白质印迹。
图4(未按比例)示出了用于人源化编码TRKB的细胞外结构域的大鼠TrkB(大鼠Ntrk2)基因座的区域的靶向方案的示意图。图的上部示出内源大鼠TrkB(大鼠Ntrk2)基因座，图的下部示出大靶向载体。
图5(未按比例)示出了用于筛选大鼠TrkB(大鼠Ntrk2)基因座和用于靶向大鼠TrkB(大鼠Ntrk2)基因座的指导RNA位置(SEQ ID NO：41-44中列出的指导靶序列)的
Figure BDA0002605767120000062
测定的示意图。等位基因获得(GOA)测定包括7138hU和7138hD。等位基因丢失(LOA)测定包括rnoTU、rnoTM，和rnoTD。旨在涵盖被CRISPR/Cas9靶向所破坏的区域的CRISPR测定包括rnoTGU和rnoTGD。保留测定包括rnoTAU2和rnoTAD2。
图6示出了小鼠蛋白、大鼠蛋白，和人TRKB(NTRK2)蛋白的比对。
图7示出了从出生后第1天的、具有各种TrkB激动剂抗体或BDNF的纯合人源化TRKB小鼠幼崽处分离的初级皮质神经元在处理后的15分钟和2小时的磷酸TrkB、总TrkB、磷酸Akt、总AKT、磷酸ERK，和总ERK的蛋白质印迹。
图8示出了纯合TrkBhu/hu和野生型小鼠中的H4H9816P2中抗TrkB抗体的药代动力学概况。
图9示出了用不同剂量的TrkB激动剂抗体或BDNF处理的分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞存活。TrkB mAb1是H4H9816P2；TrkB mAb2是对人TrkB、大鼠TrkB，和小鼠TrkB具有亲和力的对照TrkB激动剂抗体。将人同种型对照抗体用作阴性对照。将数据标准化为无抗体的无血清培养基。
图10示出了用不同剂量的TrkB激动剂抗体或BDNF处理的原代小鼠视网膜神经节细胞中的细胞存活。TrkB mAb2是对人TrkB、大鼠TrkB，和小鼠TrkB具有亲和力的对照TrkB激动剂抗体。将数据标准化为无抗体的无血清培养基。
图11A和11B分别示出了经视神经横断并用BDNF、TrkB激动剂抗体、同种型对照抗体，或溶媒对照(vehicle control)处理后，在解剖并对视网膜神经节细胞染色的野生型大鼠和小鼠中的视网膜中的视网膜神经节细胞密度。在视神经横断后的第3天和第10天，向大鼠玻璃体内给予BDNF(5μg)、TrkB激动剂抗体(18μg)、同种型对照抗体(18μg)，或溶媒对照。在视神经横断后的第3天和第10天，向小鼠玻璃体内给予BDNF(2.5μg)、TrkB激动剂抗体(10μg)、同种型对照抗体(10μg)，或溶媒对照。TrkB mAb2是对人TrkB、大鼠TrkB，和小鼠TrkB具有亲和力的对照TrkB激动剂抗体。
图12A和12B分别示出了经视神经横断或视神经粉碎，并用不同剂量的BDNF处理后，在解剖并对视网膜神经节细胞染色的野生型小鼠和大鼠中的视网膜中的视网膜神经节细胞密度。图12A示出了WT小鼠的视神经粉碎(ONC)模型中的BDNF剂量响应。图12B示出了在WT大鼠的视神经横断模型中从0.13μg至30μg的BDNF剂量响应。
图13A示出了在视神经横断后第3天和第10天，玻璃体内给予TrkB激动剂抗体或同种型对照抗体的纯合、杂合，或野生型TrkB大鼠中经解剖并对视网膜神经节细胞染色的视网膜中的视网膜神经节细胞密度(****＝p<0.0001；***p<0.001；双向方差分析)。在横断后14天解剖视网膜。TrkB mAb1是H4H9816P2。
图13B示出了解剖自纯合、杂合，或野生型TrkB大鼠的未受伤的眼睛中的视网膜神经节细胞密度。
图13C示出了给予TrkB激动剂抗体(H4H9816P2；TrkB)或同种型对照抗体(REGN1945；对照)的人TRKB纯合小鼠的体重。
图14示出了在视神经横断后第3天和第10天，玻璃体内给予TrkB激动剂抗体(hTrkB；H4H9816P2)或同种型对照抗体(REGN1945)的人TRKB纯合大鼠中经解剖并对视网膜神经节细胞染色的视网膜中的视网膜神经节细胞密度。在横断后14天解剖视网膜。
图15A和15B示出了在视神经横断后第3天和第10天，玻璃体给予不同的TrkB激动剂抗体(H4H9816P2-L9、H4H9814P-L9、H4H9780P-L5，或所有三者的组合)或同种型对照抗体(REGN1945)的人TRKB纯合大鼠中经解剖并对视网膜神经节细胞染色的视网膜中的视网膜神经节细胞密度(**p<0.01；Kruskal-Wallis检验与同种型对照抗体相比较)。在横断后14天解剖视网膜。图15A包括未处理对照(
Figure BDA0002605767120000081
control)(未受伤的对侧(contralateral)眼)，而图15B则没有。
图16示出了在视神经横断后第3天和第10天，玻璃体内给予不同的TrkB激动剂抗体(H4H9780P和H4H9814P)或同种型对照抗体(REGN1945)的野生型大鼠中经解剖并对视网膜神经节细胞染色的视网膜中的视网膜神经节细胞密度。在横断后14天解剖视网膜。
图17A和17B示出了在视神经横断后第3天和第10天，玻璃体内给予TrkB激动剂抗体(H4H9780P)或同种型对照抗体(REGN1945)的人TRKB纯合小鼠中经解剖并对视网膜神经节细胞染色的视网膜中的视网膜神经节细胞密度。在横断后14天解剖视网膜。图17A包括未处理对照(未受伤的对侧眼)，而图17B则没有。
图17C示出了给予TrkB激动剂抗体(H4H9780P)或同种型对照抗体(REGN1945)的人TRKB纯合小鼠的体重。
具体实施方式
定义
本文可互换使用的术语“蛋白质”、“多肽”，和“肽”包括任何长度的氨基酸的聚合形式，包括编码和非编码氨基酸以及化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸。该术语还包括已被修饰的聚合物，例如具有修饰的肽主链的多肽。术语“结构域”是指具有特定功能或结构的蛋白质或多肽的任何部分。
蛋白质被称为具有“N末端”和“C末端”。术语“N末端”是指蛋白质或多肽的起始，末端为具有游离胺基(-NH2)的氨基酸。术语“C末端”是指氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端，其末端为是游离羧基(-COOH)。
本文可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”包括任何长度的核苷酸的聚合形式，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物或修饰形式。它们包括单链、双链，和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交，以及包含嘌呤碱基、嘧啶碱基，或其它天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的，或衍生的核苷酸碱基。
核酸被称为具有“5'末端”和“3'末端”，因为单核苷酸通过使一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸通过磷酸二酯键在一个方向上与其邻居的3'氧连接的方式反应生成寡核苷酸。如果寡核苷酸的5'磷酸未与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则将其称为“5'末端”。如果寡核苷酸的3'氧未与另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接，则将其末端称为“3'末端”。即使是较大的寡核苷酸内部的核酸序列也可被称为具有5'和3'末端。在线性或环状DNA分子中，离散元素被称为“下游”或3'元素的“上游”或5'。
术语“基因组整合”是指已被引入细胞以使核苷酸序列整合到细胞基因组中并且能够被其子代遗传的核酸。可以使用任何方案将核酸稳定地掺入细胞的基因组中。
术语“靶向载体”是指可以通过同源重组、非同源末端连接介导的连接，或以任何其它重组方式引入细胞基因组中的靶向位置的重组核酸。
术语“病毒载体”是指重组核酸，其包含至少一种病毒来源的元件，并且包括足以或允许包装到病毒载体颗粒中的元件。可以将载体和/或颗粒用于将DNA、RNA，或其它核酸离体或体内转移到细胞中的目的。多种形式的病毒载体是已知的。
术语“野生型”包括具有在正常(相对于突变、患病，改变等)的状态或情景中发现的结构和/或活性的实体。野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
术语“内源”是指天然存在于细胞或非人类动物体内的核酸序列。例如，非人动物的内源TrkB序列是指天然存在于非人动物的TrkB基因座处的天然TrkB序列。
“外源”分子或序列包括通常不以该形式存在于细胞中的分子或序列。通常的存在包括在细胞的特定发育阶段和环境条件的存在。例如，外源分子或序列可以包括细胞内相应内源序列的突变形式(例如内源序列的人源化版本)，或者可以包括与细胞内的内源序列相对应但形式不同(即不在染色体内)的序列。与此相对，内源分子或序列包括在特定环境条件下，在特定发育阶段的特定细胞中通常以该形式存在的分子或序列。
当在核酸或蛋白质的上下文中使用时，术语“异源的”表示该核酸或蛋白质包含在同一分子中并非天然同时出现的至少两个部分。例如，当涉及核酸的部分或蛋白质的部分使用时，术语“异源的”表示该核酸或蛋白质包含两个或更多个在自然界中彼此之间没有相同关系(例如结合在一起)的子序列。作为一个实例，核酸载体的“异源”区域是在另一核酸分子内或附着于另一核酸分子的核酸片段，其在自然界中不与另一分子相关联。例如，核酸载体的异源区域可以包括编码序列，该编码序列侧接在自然界中与该编码序列不相关联的序列。同样地，蛋白质的“异源”区域是在另一肽分子内或附着于另一肽分子的氨基酸片段，其在自然界中不与另一肽分子相关联(例如融合蛋白或带有标签的蛋白)。类似地，核酸或蛋白质可包含异源标记或异源分泌或定位序列。
“密码子优化”利用密码子的简并性，如可指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多样性所展示的，并且通常包括修饰核酸序列的过程，以在保持天然氨基酸序列的前提下，通过用宿主细胞基因中更常用或最常用的密码子替换天然序列的至少一个密码子，从而增强在特定宿主中的表达。例如，可以修饰编码Cas9蛋白的核酸，以用在给定的原核或真核细胞中(包括细菌细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞，或任何其它宿主细胞)与天然核酸序列相比具有更高使用频率的密码子替换。密码子使用情况表很容易例如在“密码子使用情况数据库(Codon UsageDatabase)”中获得。这些表可以以多种方式适用。参见Nakamura et al.(2000)NucleicAcids Research 28:292，出于所有目的通过引用整体并入本文。也可获得用于在特定宿主中表达的特定序列的密码子优化的计算机算法(参见，例如Gene Forge)。
术语“基因座”是指基因(或重要序列)、DNA序列、多肽编码序列的特定位置，或生物体基因组的染色体上的位置。例如，“TrkB基因座”可以指TrkB基因、TrkBDNA序列、TrkB编码序列，或TrkB在生物体基因组染色体上的特定位置，已识别出这类序列存在于该生物体基因组染色体的何处。“TrkB基因座”可包含TrkB基因的调节元件，包括例如增强子、启动子、5'和/或3'非翻译区(UTR)或其组合。
术语“基因”是指染色体中编码产物(例如RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列，并包括被非编码内含子打断的编码区和与5'和3'末端上的与该编码区相邻的序列，使得该基因对应于全长mRNA(包括5'和3'非翻译序列)。术语“基因”还包括其它非编码序列，包括调节序列(例如启动子、增强子，和转录因子结合位点)、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、沉默子、隔绝序列(insulating sequence)，和基质附着区。这些序列可以靠近基因的编码区(例如在10kb之内)或在远处位点，并且它们影响基因转录和翻译的水平或速率。
术语“等位基因”是指基因的变体形式。一些基因具有多种不同形式，它们位于染色体上的相同位置或遗传位点上。二倍体生物在每个遗传位点具有两个等位基因。每对等位基因代表特定遗传基因座的基因型。如果在特定位点有两个相同的等位基因，则基因型被描述为纯合子，如果两个等位基因不同，则基因型被描述为杂合子。
“启动子”是DNA的调节区，其通常包含能够引导RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列的适当转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子可以另外包含影响转录起始速率的其它区域。本文公开的启动子序列调节可操作连接(operably linked)的多核苷酸的转录。启动子可以在本文公开的一种或多种细胞类型(例如真核细胞、非人类哺乳动物细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、多能细胞、单细胞期胚胎、分化的细胞，或其组合)中具有活性。启动子可以是例如组成型活性启动子、条件启动子(conditional promoter)、诱导型启动子、时间受限的启动子(temporally restricted promoter)(例如发育调控的启动子(developmentally regulated promoter))，或空间受限的启动子(spatially restrictedpromoter)(例如细胞特异性或组织特异性启动子)。启动子的例子可以在例如WO 2013/176772中找到，其全部内容通过引用并入本文。
可操作的连接”或“可操作地连接”是指两个或更多个成分(例如启动子和另一个序列元件)的并置，使得两个成分均正常起作用，并允许至少一个成分可以介导施加在至少一个其它组件上的功能。例如，如果启动子响应一种或多种转录调节因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则该启动子可以可操作地连接至编码序列。可操作的连接可以包括这样的序列，所述序列彼此连续或反式作用(例如，调节序列可以在一定距离处起作用以控制编码序列的转录)。
术语“变体”是指不同于群体中最普遍的序列的核苷酸序列(例如一个核苷酸不同)或不同于群体中最普遍的序列的蛋白序列(例如一个氨基酸不同)。
当涉及蛋白质时，术语“片段”是指比全长蛋白质短或具有更少氨基酸的蛋白质。当涉及核酸时，术语“片段”是指比全长核酸短或具有更少核苷酸的核酸。片段可以是，例如，N末端片段(即去除蛋白质的C末端的一部分)、C末端片段(即去除蛋白质的N末端的一部分)，或内部片段。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”是指两个序列中的残基，当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时它们是相同的。当使用序列同一性百分比来表示蛋白质时，不相同的残基位置的不同之处通常为保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能特性。当序列的不同之处为保守取代时，可以向上调整序列同一性百分比以对取代的保守性质进行校正。因这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的方法是众所周知的。通常，这涉及将保守取代计为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的评分为1，非保守取代的评分为0的情况下，保守取代的评分为0与1之间的值。保守取代的得分的计算通过例如PC/GENE程序实现(加利福尼亚州，山景城，Intelligenetics)。
“序列同一性百分比”包括通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列(完美匹配残基的最大数目)而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括与参考序列(其不含添加或缺失)相比的添加或删除(即空隙)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，以得到序列同一性百分比。除非另有说明(例如较短的序列包括连接的异源序列)，否则比较窗口是被比较的两个序列中较短的序列的全长。
除非另有说明，否则序列同一性/相似性值包括使用GAP版本10，利用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵获得核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用GAP权重8和长度权重2，以及BLOSUM62评分矩阵获得氨基酸序列同一性％和相似性％；或其任何等效程序。“等效程序”包括任何序列比较程序，当与由GAP版本10生成的相应比对进行比较时，对于所讨论的任何两个序列，所述序列比较程序针对所讨论的任何两个序列生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比的序列同一性的比对。
术语“保守氨基酸取代”是指序列中通常存在的氨基酸被具有相似大小，电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括用非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸，或亮氨酸取代另一个非极性残基。同样地，保守取代的例子包括一个极性(亲水)残基被另一个所取代，例如精氨酸和赖氨酸之间的取代、谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代，或甘氨酸和丝氨酸之间的取代。另外，保守取代的其它实例是用碱性残基例如赖氨酸、精氨酸，或组氨酸取代另一种碱性残基，或用一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸替代另一种酸性残基。非保守取代的实例包括将非极性(疏水)氨基酸残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸，或蛋氨酸取代为极性(亲水)残基，如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或将极性残基取代为非极性残基。下文总结了典型的氨基酸分类。
Figure BDA0002605767120000151
“同源”序列(例如核酸序列)是指与已知参考序列相同或基本相似的序列，使得其例如与已知参考序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％相同。同源序列可以包括，例如，种间同源序列和种内同源序列。同源基因例如通常通过物种形成事件(speciation event)(种间同源基因)或遗传复制事件(genetic duplicationevent)(种内同源基因)源自共同的祖先DNA序列。“种间同源”基因包括通过物种形成从共同祖先基因进化而来的不同物种中的基因。种间同源物(orthologs)通常在进化过程中保持相同的功能。“种内同源”基因包括通过基因组内的复制而相关的基因。种内同源物(paralogs)可以在进化过程中进化出新功能。
术语“体外”包括人工环境以及在人工环境(例如试管)内发生的过程或反应。术语“体内”包括自然环境(例如细胞或生物体或身体)以及在自然环境中发生的过程或反应。术语“离体”包括已经从个体体内移出的细胞以及在这种细胞内发生的过程或反应。
术语“报告基因”是指具有编码基因产物(通常是酶)的序列的核酸，当包含与内源或异源启动子和/或增强子元件可操作地连接的报告基因序列的构建体被引入含有(或可以使其含有)该启动子和/或增强子元件的激活所必需的因子的细胞中时，该序列可被容易地和定量地测定。报告基因的例子包括但不限于编码β-半乳糖苷酶(lacZ)的基因、细菌氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因、萤火虫荧光素酶基因、编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因，和编码荧光蛋白的基因。“报道蛋白”是指由报道基因编码的蛋白。
本文所使用的术语“荧光报道蛋白”是指基于荧光可检测的报道蛋白，其中荧光可以直接来自报道蛋白、报道蛋白在荧光底物上的活性，或具有结合荧光标记的化合物的亲和力的蛋白。荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、单体Azami Green、CopGFP、AceGFP，和ZsGreenl)、黄色荧光蛋白(例如YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP，和ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如BFP、eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv，Sapphire,和T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如CFP、eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl，和Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如RFP、mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry，和Jred)、橙色荧光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine，和tdTomato)，以及可以通过流式细胞方法检测到其在细胞中的存在的任何其它合适的荧光蛋白。
术语“重组”包括两个多核苷酸之间的遗传信息交换的任何过程，并且可以通过任何机制发生。响应双链断裂(DSB)的重组主要通过两个保守的DNA修复途径发生：非同源性末端接合(NHEJ)和同源重组(HR)。参见Kasparek&Humphrey(2011)Seminars in Cell&Dev.Biol.22:886-897，出于所有目的通过引用整体并入本文。同样，由外源供体核酸介导的靶核酸的修复可以包括两个多核苷酸之间交换遗传信息的任何过程。
NHEJ包括通过将断裂末端彼此直接连接或与外源序列直接连接而不需要同源模板来修复核酸中的双链断裂。通过NHEJ对非连续序列进行连接通常会导致双链断裂位点附近的删除、插入，或易位。例如，NHEJ还可以通过将断裂末端与外源供体核酸的末端直接连接(即基于NHEJ的捕获)来导致外源供体核酸的靶向整合。当同源定向修复(HDR)途径不能立即使用时(例如，在非分裂细胞、原代细胞，以及较差地进行基于同源性的DNA修复的细胞中)，此类NHEJ介导的靶向整合可优选用于插入外源供体核酸。另外，与同源定向修复相反，不需要关于切割位点侧面的大范围的序列同一性的知识，这在尝试靶向插入到具有对基因组序列的认识有限的基因组的生物中时可能是有益的。整合可以通过在外源供体核酸与切割的基因组序列之间平端的连接或通过使用侧面为单链突出端的外源供体核酸连接黏性末端(即具有5'或3'单链突出端)来进行，所述单链突出端与在切割的基因组序列中由核酸酶剂产生的那些相容。参见，例如，US2011/020722、WO 2014/033644、WO 2014/089290和Marescaet al.(2013)GenomeRes.23(3):539-546，出于所有目的将每一篇均通过引用整体并入本文。如果连接平端，可能需要进行靶标和/或供体切除，以产生片段连接所需的微同源性区域(regions of microhomology)，这可能会在靶序列中产生不想要的改变。
重组可通过同源定向修复(HDR)或同源重组(HR)发生。HDR或HR包括一种可能需要核苷酸序列同源性的核酸修复形式，其使用“供体”分子作为模板来修复“靶标”分子(即经历双链断裂的分子)，并导致遗传信息从供体转移到目标。不希望受到任何特定理论的束缚，这种转移可能涉及在断裂的靶标和供体之间形成的异源双链DNA的错配校正，和/或合成依赖性链退火，其中供体用于重新合成遗传信息，该遗传信息将成为靶标的一部分，和/或相关过程。在一些情况下，供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝，或供体多核苷酸的拷贝的一部分整合到靶DNA中。参见Wang et al.(2013)Cell 153:910-918；Mandaloset al.(2012)PLOS ONE 7:e45768:1-9；和Wang et al.(2013)NatBiotechnol.31:530-532，出于所有目的将其每一篇均通过引用整体并入本文。
术语“抗原结合蛋白”包括与抗原结合的任何蛋白。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体的抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFV、bis-scFV，双抗体、三抗体、四抗体、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(单可变结构域抗原结合蛋白)、双特异性T-细胞接合器(BiTE)，或Davisbody(美国专利号8,586,713，出于所有目的通过引用整体并入本文)。
本文所使用的表述“抗TRKB抗体”包括具有单一特异性的单价抗体，以及包含结合TRKB的第一臂和结合第二(靶)抗原的第二臂的双特异性抗体，其中抗TRKB臂包括，例如，本文表22中列出的任何HCVR/LCVR或CDR序列。表述“抗TrkB抗体”还包括抗体药物偶联物(ADC)，其包含与药物或毒素(即细胞毒性剂)偶联的抗TRKB抗体或其抗原结合部分。表述“抗TRKB抗体”还包括抗体放射性核素偶联物(ARC)，其包含与放射性核素偶联的抗TRKB抗体或其抗原结合部分。
本文所使用的术语“抗TRKB抗体”是指包含至少一个与TRKB或TRKB的一部分特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链(通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链)及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗TRKB抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。
本文所使用的术语“抗体”还包括全长抗体分子的抗原结合片段。本文所使用的术语：抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何可酶促获得的、合成的，或基因工程的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术衍生自，例如，完整的抗体分子；所述合适的标准技术例如蛋白水解消化或重组遗传工程技术，其涉及编码抗体可变域和可选的恒定域的DNA的操作和表达。这样的DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以被合成。可以化学地或使用分子生物学技术对DNA进行测序和操作，例如，将一个或多个可变和/或恒定域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加，或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区(例如分离的互补性决定区(CDR)，例如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元，或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。其它工程化分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、迷你抗体(minibodies)，纳米抗体(nanobodies)(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)，本文所用的表述“抗原结合片段”也包括小模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域(shark variable IgNARdomains)。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，且通常含有至少一个邻近一个或多个框架序列(framework sequence)或在一个或多个框架序列中的CDR。在带有与VL结构域关联的VH结构域的抗原结合片段中，VH及VL结构域可以以任何合适的布置相对于彼此定位。举例而言，可变区是二聚体且含有VH-VH、VH-VL，或VL-VL二聚体。替代地，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含共价连接至至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内找到的可变和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变域和恒定域的任何构型中(包括上文列出的任何示例性构型)，可变域和恒定域可以彼此直接连接，或者可以通过全部或部分铰链或接头连接。铰链区可以由至少2个(例如5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中的相邻可变域和/或恒定域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含上文列出的任一可变和恒定域构型的同型二聚体或异型二聚体(或其它多聚体)，其彼此非共价缔合和/或与一个或多个单体VH或VL域非共价缔合(例如藉由二硫键)。
与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变域，其中每个可变域都能够特异性结合单独的抗原或结合相同抗原上的不同表位。任一种多特异性抗体形式(包括此处所掲示的示例性双特异性抗体形式)可使用本领域的常规技术被改造成适用于本发明的抗体的抗原结合片段。
术语“表位”意指一个与已知为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单独一个抗原可能有超过一个表位。因此，不同抗体可结合至抗原的不同区域且可能具有不同的生物效力。表位可以是构象的或线性的。构象表位可透过在空间上并列的氨基酸由线性多肽链的不同片段所产生。线性表位由多肽链中的相邻氨基酸残基所产生。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基或磺酰基部分(moiety)
术语“特异性结合”或“特异地结合”等是指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可以至少为约1x10-6M或更小的平衡解离常数为特征(例如，较小的KD表示更紧密的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法是众所周知的，并且包括，例如，平衡渗析、表面等离子激元共振等。如本文所述，已经通过表面等离子激元共振(例如BIACORETM)识别了特异性结合至TRKB的抗体。此外，如本文所用，结合至TRKB蛋白和一种或多种其它抗原的多特异性抗体或结合至TRKB的两个不同区域的双特异性抗体仍被认为是“特异性结合”的抗体。
本文公开的抗TRKB抗体可以在重链和轻链可变域的框架和/或CDR区域中包含一个或多个氨基酸取代、插入，和/或删除。通过比较本文公开的氨基酸序列和可从例如公共抗体序列数据库获得的序列，可以容易地确定此类突变。一旦获得，即可容易地测试包含一种或多种突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，例如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、改善的或增强的拮抗或对抗生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段也包括在内。
还包括抗TRKB抗体，其包含本文公开的具有一个或多个保守取代的HCVR、LCVR，和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体。例如，本发明包括具有HCVR、LCVR，和/或CDR氨基酸序列的抗TRKB抗体，其相对于表22中列出的任何HCVR、LCVR，和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或小于10个、8个或小于8个、6个或小于6个，4个或小于4个的保守氨基酸取代。
当意指核酸或其片段时，“实质同一性”或“实质同一”表示若通过任何序列同一性的公知算法(诸如FASTA、BLAST或Gap，如下所述)来测定时，当在有适当核苷酸插入或缺失的情况下与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，在至少约95％，及更优选地至少约96％、97％、98％，或99％的核苷酸碱基中有核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质同一性的核酸分子可编码具有与该参考核酸分子所编码的多肤相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
当在抗TRKB抗体的上下文中应用于多肽时，术语“实质相似性”或“实质相似”意指当两个肽序列最佳比对时(例如按照程序GAP或BESTF IT，使用默认空位权重)，共有至少95％，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置因为保守性氨基酸置换而有所差异。当在抗TRKB抗体的上下文中应用于多肽时，“保守性氨基酸置换”是一种氨基酸残基置换成另一种带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基。一般来说，保守性氨基酸置换大体上不会改变蛋白质的官能性质。在两个或多个氨基酸序列彼此因为保守性置换而有所不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可向上调整以校正置换的保守性质。用来做此调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-33，出于所有目的通过引用整体并入本文。带有具类似化学性质的侧链的氨基酸的基团实例包括：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸与苏氨酸；(3)含酰胺的的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸与组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸与谷氨酸；以及(7)含硫侧链为半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守性氨基酸置换基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。替代地，保守性置换可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science256:1443-1445中公开的PAM250对数-相似矩阵中具有正值的改变。“适度保守”置换是任何在PAM250对数-相似矩阵中具有非负值的改变。
“包含”或“包括”一个或多个所列举的要素的组合物或方法可以包括未具体列举的其它要素。例如，“包含”或“包括”蛋白质的组合物可以单独包含蛋白质或包含蛋白质以及其它成分。过渡用语“基本上由……组成”是指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的特定要素以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的要素。因此，当在本发明的权利要求书中使用时，术语“基本上由……组成”并不意图被解释为等同于“包括”。
“可选的”或“可选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不会发生，并且说明书包括事件或情况发生的情况以及事件或情况没有发生的情况。
值范围的指定包括该范围内或定义该范围的所有整数，以及该范围内的整数定义的所有子范围。
除非从上下文中另外显而易见，否则术语“约”涵盖所述值的标准测量误差范围(例如SEM)内的值。
术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当以备选方式(“或”)解释时组合的不存在。
术语“或”是指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
除非上下文另外明确指出，否则冠词“一”，“一个”和“所述”的单数形式包括复数形式。例如，术语“一种蛋白质”或“至少一种蛋白质”可包括多种蛋白质，包括其混合物。
具有统计学意义的均值意指p≤0.05。
详细说明
I.概述
本文公开了包含人源化TRKB基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物，以及使用此类非人动物细胞和非人动物的方法。包含人源化TRKB基因座的非人动物细胞或非人动物表达人TRKB蛋白或包含人TRKB蛋白的一个或多个片段(例如人TRKB细胞外结构域的全部或部分)的嵌合TRKB蛋白。
人源化TRKB等位基因(例如通过用种间同源的人类基因组DNA一对一替换全部或部分非人类动物基因组DNA而产生)将提供人TRKB靶向试剂(例如设计为靶向人TRKB的激动剂抗体或激动剂小分子)的真实的人靶标或真实的人靶标的近似，从而能够在活体动物中测试此类试剂的功效和作用方式以及进行药代动力学和药效学研究。例如，如本文公开的工作实施例中所示，人TRKB激动剂抗体的玻璃体内给药在人源化TrkB大鼠中的视神经损伤后具有显著的神经保护作用。
II.包含人源化TRKB基因座的非人动物
本文公开的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物包含人源化TRKB基因座。包含人源化TRKB基因座的细胞或非人动物表达人TRKB蛋白或部分人源化的嵌合TRKB蛋白，其中天然TRKB蛋白的一个或多个片段已被来自人TRKB的相应片段(例如细胞外结构域的全部或部分)替换。
A.TRKB
本文所述的细胞和非人动物包含人源化TRKB基因座。TRKB(也称为BDNF-NT-3生长因子受体、GP145-TrkB、Trk-B、TrkB、神经营养性酪氨酸激酶受体2型、TrkB酪氨酸激酶、原肌球蛋白相关激酶B、原肌球蛋白受体激酶B、神经营养受体酪氨酸激酶2，和NTRK2)由TRKB基因(也称为NTRK2、OBHD、TRK-B，和GP145-TRKB)编码。TRKB是一种酪氨酸激酶受体，其通过调节神经元的存活、增殖、迁移、分化以及突触形成和可塑性来参与中枢神经系统和周围神经系统的发育和成熟。TRKB是BDNF/脑源性神经营养因子和NTF4/神经营养蛋白4的受体。替代地，TRKB也可以结合NTF3/神经营养蛋白3，其激活受体的效率较低，但通过TRKB调节神经元的存活。配体结合后，TRKB经历同源二聚(homodimerization)、自磷酸化，和激活。TRKB的典型异形体(canonical isoform)在中枢和周围神经系统中表达。在中枢神经系统(CNS)中，在大脑皮层、海马、丘脑、脉络丛、小脑颗粒层、脑干，和脊髓中观察到表达。在周围神经系统中，它在许多颅神经节、眼神经、前庭系统、多个面部结构，颌下腺，和背根神经节中表达。
人TRKB映射到9号染色体上的人9q21.33(NCBI RefSeq基因ID 4915；装配体GRCh38.p7；位置NC_000009.12(84668368..85027070))。据报道，该基因有23个外显子。野生型人TRKB蛋白已被赋予UniProt登录号Q16620。已知至少七个异形体(Q16620-1至Q16620-7)。一种异形体Q16620-4的序列(与NCBI登录号NP_006171.2相同)在SEQ ID NO：3中列出。编码该典型异形体的mRNA(cDNA)被赋予NCBI登录号AF410899.1，并且如SEQ IDNO：8所示。编码人TRKB异形体的mRNA(cDNA)的另一个实例被赋予RefSeq mRNA ID NM_006180.4。示例性编码序列(CDS)示于SEQ ID NO：11。SEQ ID NO：3所示的全长人TRKB蛋白具有838个氨基酸，包括信号肽(氨基酸1-31)、细胞外结构域(氨基酸32-430)、跨膜结构域(氨基酸431-454)，和细胞质结构域(氨基酸455-838)。这些域之间的划分如UniProt中所指定。对人TRKB的提及包括典型(野生型)形式以及所有等位基因形式和异形体。人TRKB的任何其它形式的氨基酸均与野生型形式最大比对地编号，比对的氨基酸指定为相同编号。人TRKB的另一种异形体的实例是Q16620-1(与NCBI登录号NP_001018074.1相同)，如SEQ IDNO：75所示。编码该异形体的mRNA(cDNA)被赋予NCBI登录号NM_001018064.2，并在SEQ IDNO：76中列出。该异形体(CCDS ID CCDS35050.1)的示例性编码序列(CDS)在SEQ ID NO：77中列出。
大鼠TrkB映射到17号染色体上的大鼠17p14(NCBI RefSeq基因ID 25054；装配体Rnor_6.0；位置NC_005116.4(5934651..6245778，补体(complement)))。据报道，该基因有23个外显子。野生型大鼠TRKB蛋白已被赋予UniProt登录号Q63604。已知至少三个异形体(Q63604-1至Q63604-3)。在SEQ ID NO：2中列出了典型异形体，Q63604-1的序列(与NCBI登录号NP_036863.1相同)。编码典型异形体的mRNA(cDNA)被赋予NCBI登录号NM_012731.2，并在SEQ ID NO：7中列出。编码大鼠TRKB异形体的mRNA(cDNA)的另一个例子被赋予RefSeqmRNA ID M55291。示例性编码序列(CDS)在SEQ ID NO：10中列出。SEQ ID NO：2中列出的典型全长大鼠TRKB蛋白具有821个氨基酸，包括信号肽(氨基酸1-31)、细胞外结构域(氨基酸32-429)、跨膜结构域(氨基酸430-453)和细胞质结构域(氨基酸454-821)。这些域之间的划分如UniProt中所指定。对大鼠TRKB的提及包括典型(野生型)形式以及所有等位基因形式和异形体。大鼠TRKB的任何其它形式的氨基酸均与野生型形式最大比对地编号，比对的氨基酸指定为相同编号。
小鼠TrkB映射到小鼠13B1；染色体12上的13 31.2cM(NCBI RefSeq基因ID 18212；装配体GRCm38.p4(GCF_000001635.24)；位置NC_000079.6(58806569..59133970))。据报道，该基因有23个外显子。野生型小鼠TRKB蛋白已被赋予UniProt登录号P15209。已知至少四种异形体(P15209-1至P15209-4)。SEQ ID NO：1列出了典型异形体P15209-1的序列(与NCBI登录号NP_001020245.1和NP_001269890.1相同)。编码典型异形体的示例性mRNA(cDNA)异形体被赋予NCBI登录号NM_001025074.2，并在SEQ ID NO：6中列出。示例性编码序列(CDS)(CCDS ID CCDS26573.1)在SEQ ID NO：9中列出。SEQ ID NO：1所示的典型全长小鼠TRKB蛋白具有821个氨基酸，包括信号肽(氨基酸1-31)、细胞外结构域(氨基酸32-429)、跨膜结构域(氨基酸430-453)，和细胞质结构域(氨基酸454-821)。这些域之间的划分如UniProt中所指定。对小鼠TRKB的提及包括典型(野生型)形式以及所有等位基因形式和异形体。小鼠TRKB的任何其它形式的氨基酸均与野生型形式最大比对地编号，比对的氨基酸指定为相同编号。
B.人源化TRKB基因座
人源化TRKB基因座可以是其中整个TrkB基因被相应的种间同源人TRKB序列替代的TrkB基因座，或者可以是其中仅一部分的TrkB基因被相应的种间同源人TRKB序列替代的TrkB基因座(即人源化)。可选地，基于非人动物中的密码子使用，将相应的种间同源人TRKB序列修饰为密码子优化的。替换的(即人源化的)区域可以包括编码区域(例如外显子)、非编码区域(例如内含子)、非翻译区域，或调节区域(例如启动子、增强子，或转录阻遏物结合元件)，或其任何组合。作为一个例子，对应于人TRKB基因的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或全部23个外显子的外显子都可以被人源化。例如，对应于人TRKB基因的外显子3-10的外显子可以被人源化，包括来自编码信号氨基酸33的密码子的外显子2的片段(编码外显子1)，从信号肽之后开始。替代地，可以人源化编码被抗人TRKB抗原结合蛋白识别的表位的TrkB区域或被人TRKB靶向试剂(例如小分子)靶定的区域。同样，对应于人TRKB基因的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或全部22个内含子的内含子可以被人源化或保持内源。例如，对应于人TRKB基因的外显子2和10之间的内含子(即位于编码外显子1和外显子10之间的内含子2-9)的内含子可以被人源化，可选地包括外显子10之后的内含子(即内含子10)的部分。包括调节序列的侧接非翻译区也可以被人源化或保持内源。例如，5'非翻译区(UTR)、3'UTR，或5'UTR和3'UTR两者可被人源化；或5'UTR、3'UTR，或5'UTR和3'UTR两者可以保持内源。在一个特定的实施例中，5'UTR和3'UTR都是内源的。取决于通过种间同源序列替换的程度，调控序列(例如启动子)可以是内源的，也可以由替换的人种间同源序列提供。例如，人源化TRKB基因座可包括内源非人动物TrkB启动子。
编码信号肽、细胞质结构域、跨膜结构域，或细胞外(extracellular)的一个或多个或所有区域可以被人源化，或者这样的区域中的一个或多个可以保持内源。小鼠TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的示例性编码序列分别在SEQ ID NO：63-66中列出。大鼠TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的示例性编码序列分别在SEQ ID NO：67-70中列出。人TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的示例性编码序列分别在SEQ ID NO：71-74中列出。
例如，编码信号肽的TrkB基因座区域的全部或部分可以被人源化，和/或编码细胞外结构域的TrkB基因座区域的全部或部分可以被人源化，和/或编码跨膜结构域的TrkB基因座区域的全部或部分可以被人源化，和/或编码细胞质结构域的TrkB基因座区域的全部或部分可以被人源化。在一个例子中，编码细胞外结构域的TrkB基因座的全部或部分区域被人源化。可选地，人TRKB细胞外结构域的CDS包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：72至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列(或其简并(degenerate))。TRKB蛋白可以保留天然TRKB的活性(例如，保留磷酸化的能力、保留激活下游信号传导途径(如PI3K/AKT和MAPK/ERK途径)的能力，或保留调节神经元存活、增殖、迁移、分化，或突触形成和可塑性的能力，或产生本文其它各处公开的任何表型)。例如，可以将编码细胞外结构域的TrkB基因座的区域人源化，从而产生带有内源信号肽、内源细胞质结构域、内源跨膜结构域，和人源化细胞外结构域的嵌合TRKB蛋白。
编码信号肽、细胞质结构域、跨膜结构域，或细胞外(extracellular)的一个或多个区域可以保持内源。例如，编码信号肽和/或细胞质结构域和/或跨膜结构域的区域可以保持内源。任选地，内源TRKB信号肽的CDS包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：63或67至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列(或其简并)。可选地，内源TRKB跨膜结构域的CDS包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：65或69至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列(或其简并)。可选地，内源TRKB细胞质结构域的CDS包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：66或70至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列(或其简并)。在每种情况下，TRKB蛋白都可以保留天然TRKB的活性。
由人源化TRKB基因座编码的TRKB蛋白可以包含来自人TRKB蛋白的一个或多个域和/或来自内源(即天然)TRKB蛋白的一个或多个域。小鼠TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的示例性氨基酸序列分别在SEQ ID NO：51-54中列出。大鼠TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的示例性氨基酸序列分别在SEQ ID NO：55-58中列出。人TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的示例性氨基酸序列分别在SEQ ID NO：59-62中列出。
TRKB蛋白可包含人TRKB信号肽、人TRKB细胞外结构域、人TRKB跨膜结构域，和人TRKB细胞质结构域中的一个或多个或全部。作为一个实例，TRKB蛋白可包含人TRKB细胞外结构域。
由人源化的TRKB基因座编码的TRKB蛋白还可以包含一个或多个来自内源(即天然)非人动物TRKB蛋白的域。作为一个实例，由人源化TRKB基因座编码的TRKB蛋白可包含来自内源(即天然)非人动物TRKB蛋白的信号肽和/或来自内源(即天然)非人动物TRKB蛋白的细胞质结构域和/或来自内源(即天然)非人动物TRKB蛋白的跨膜结构域。
来自人TRKB蛋白的嵌合TRKB蛋白中的结构域可以由完全人源化的序列编码(即用种间同源人TRKB序列替换编码该结构域的整个序列)，或可以由部分人源化的序列编码(即用种间同源人TRKB序列替换编码该结构域的部分序列，其余的编码该结构域的内源(即天然)序列编码与种间同源人TRKB序列相同的氨基酸，从而使被编码的结构域与人TRKB蛋白中的那个结构域相同)。同样地，来自内源TRKB蛋白的嵌合蛋白结构域可以由完全内源序列编码(即编码该结构域的整个序列是内源TrkB序列)，或也可以由部分人源化序列编码(即用种间同源人TRKB序列替换编码该结构域的部分序列，但该种间同源人TRKB序列编码与被取代的内源人TrkB序列相同的氨基酸，从而使被编码的结构与内源TRKB蛋白中的那个结构域相同)。例如，可以将TrkB基因座的编码跨膜结构域(例如编码跨膜结构域的N末端区域)的区域的一部分替换为种间同源的人TRKB序列，其中被种间同源人TRKB序列编码的跨膜结构域的区域的氨基酸序列与相应的内源氨基酸序列相同。
作为一个实例，由人源化TRKB基因座编码的TRKB蛋白可包含人TRKB细胞外结构域。可选地，人TRKB细胞外结构域包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ IDNO：60至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列。TRKB蛋白保留了天然TRKB的活性(例如，保留磷酸化的能力、保留激活下游信号传导途径(如PI3K/AKT和MAPK/ERK途径)的能力，或保留调节神经元存活、增殖、迁移、分化，或突触形成和可塑性的能力，或产生本文其它各处公开的任何表型)。作为另一个实例，由人源化TRKB基因座编码的TRKB蛋白可包含内源非人动物TRKB细胞质结构域(例如小鼠TRKB细胞质结构域或大鼠TRKB细胞质结构域)。可选地，非人类动物TRKB细胞质结构域包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：54或58至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列。作为另一个实例，由人源化TRKB基因座编码的TRKB蛋白可包含内源非人动物TRKB跨膜结构域(例如小鼠TRKB跨膜结构域或大鼠TRKB跨膜结构域)。可选地，非人动物TRKB跨膜结构域包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：53或57至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列。作为另一个实例，由人源化TRKB基因座编码的TRKB蛋白可包含内源非人动物TRKB信号肽(例如小鼠TRKB信号肽或大鼠TRKB信号肽)。可选地，非人动物TRKB信号肽包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：51或55至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列。在每种情况下，TRKB蛋白都可以保留天然TRKB的活性。例如，由人源化TRKB基因座编码的TRKB蛋白可包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：4或5至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列。可选地，由人源化TRKB基因座编码的TRKB CDS可包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：12或13至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列(或其简并)。在每种情况下，TRKB蛋白都可以保留天然TRKB的活性。
可选地，人源化的TRKB基因座可包含其它元件。这样的元件的例子可以包括选择盒、报道基因、重组酶识别位点，或其它元件。替代地，人源化的TRKB基因座可以缺少其它元件(例如，可以缺少选择标记或选择盒)。合适的报道基因和报道蛋白的实例在本文其它地方公开。合适的选择标记的例子包括新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(puror)、杀稻瘟素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)，和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k)。重组酶的实例包括Cre、Flp，和Dre重组酶。Cre重组酶基因的一个例子是Crei，其中两个编码Cre重组酶的外显子被内含子隔开，以防止其在原核细胞中表达。此类重组酶可进一步包含核定位信号，以促进定位至核(例如NLS-Crei)。重组酶识别位点包括可被位点特异性重组酶识别的核苷酸序列，并可作为重组事件的底物。重组酶识别位点的例子包括FRT、FRT11、FRT71、attp、att、rox，和lox位点，例如loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2，和lox5171。
其它元件(例如报道基因或选择盒)可以是侧面为重组酶识别位点的自删除盒。参见，例如，US 8,697,851和US 2013/0312129，出于所有目的，通过引用将每一篇的全部内容整体并入本文。例如，该自删除盒可包含与小鼠Prm1启动子可操作连接的Crei基因(包含被内含子所隔开的两个编码Cre重组酶的外显子)和与人泛素启动子可操作连接的新霉素抗性基因。通过使用Prm1启动子，可以在F0动物的雄性生殖细胞中特异性删除自删除盒。可以将编码选择标记的多核苷酸可操作地连接至在被靶定的细胞中具有活性的启动子。启动子的实例在本文其它地方描述。作为另一具体实例，自删除选择盒可包含潮霉素抗性基因编码序列，所述潮霉素抗性基因编码序列可操作地连接至一个或多个启动子(例如人泛素和EM7启动子)，随后为多腺苷酸化信号，然后是可操作地连接至一个或多个启动子(例如mPrm1启动子)的Crei编码序列，然后是另一个多腺苷酸化信号，其中整个盒的侧面是loxP位点。
人源化的TRKB基因座也可以是条件等位基因。例如，条件等位基因可以是多功能等位基因，如US 2011/0104799中所述，出于所有目的通过引用整体并入本文。例如，条件等位基因可以包含：(a)相对于靶基因的转录而言呈有义方向的启动序列(actuatingsequence)；(b)呈有义或反义方向的药物选择盒(DSC)；(c)呈反义方向的目的核苷酸序列(NSI)；以及(d)呈反向方向(reverse orientation)的逆转条件模块(COIN，利用外显子断裂内含子和可逆转的基因诱捕样模块)。参见，例如，US2011/0104799。条件等位基因可进一步包含在暴露于第一重组酶时重组以形成条件等位基因的可重组单元，该条件等位基因(i)缺少启动序列和DSC；以及(ii)在有义方向包含NSI，在反义方向包含COIN。参见，例如，US2011/0104799。
一种示例性的人源化TRKB基因座(例如人源化小鼠TrkB基因座或人源化大鼠TrkB基因座)，其中的来自编码氨基酸33的密码子的外显子2/编码外显子1中的区域被相应的人序列取代；该区域从信号肽之后开始(或与小鼠TrkB、大鼠TrkB，或人TRKB CDS最佳比对时，分别对应于编码小鼠TrkB、大鼠TrkB，或人TRKB中的氨基酸33的密码子的密码子)到外显子10(或与小鼠TrkB、大鼠TrkB，或人TRKB CDS最佳比对时，分别对应于小鼠TrkB、大鼠TrkB，或人TRKB外显子10的外显子)，可选地包括内含子10的一部分。取代的区域编码TRKB的细胞外结构域。参见图1和图4以及SEQ ID NO：4和5。
C.包含人源化TRKB基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物
提供了包含如本文其它地方所述的人源化TRKB基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物。基因组、细胞，或非人动物可以是雄性或雌性。对于人源化TRKB基因座，基因组、细胞，或非人动物可以是杂合的或纯合的。二倍体生物在每个遗传位点具有两个等位基因。每对等位基因代表特定遗传基因座的基因型。如果在特定位点有两个相同的等位基因，则基因型被描述为纯合子(homozygous)；如果两个等位基因不同，则基因型被描述为杂合子(heterozygous)。
本文提供的非人动物基因组或细胞可以是，例如，包含与人TRKB基因座同源或种间同源的TrkB基因座或基因组基因座的任何非人动物基因组或细胞。基因组可以来自或细胞可以是真核细胞，其包括，例如，真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、非人哺乳动物细胞，和人类细胞。术语“动物”包括动物界的任何成员，包括，例如，哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物、鸟类，和蠕虫。哺乳动物细胞可以是，例如，非人哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞，或仓鼠细胞。其它非人类哺乳动物包括，例如，非人灵长类动物、猴子、猿、猩猩、猫、狗、兔子、马、公牛、鹿、野牛、家畜(例如牛科动物如奶牛、阉牛等；绵羊科动物如绵羊、山羊等；以及猪科动物如猪和野猪)。鸟类包括，例如，鸡、火鸡、鸵鸟、鹅、鸭等。还包括家养动物和农业动物。术语“非人”不包括人类。
细胞也可以为任何类型的未分化或分化状态。例如，细胞可以是全能细胞、多能细胞(例如人多能细胞或非人多能细胞如小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠ES细胞)，或非多能细胞。全能细胞包括可产生任何细胞类型的未分化细胞，多能细胞包括具有发展为多于一种分化细胞类型的能力的未分化细胞。这样的多能和/或全能细胞可以是，例如，ES细胞或ES样细胞，例如诱导性多能干(iPS)细胞。ES细胞包括胚胎来源的全能或多能细胞，当引入胚胎后，它们能够促进发育中的胚胎的任何组织。ES细胞可以源自胚泡的内细胞群，并且能够分化为三个脊椎动物胚层(内胚层、外胚层，和中胚层)中任何一个的细胞。
本文提供的细胞也可以是生殖细胞(例如精子或卵母细胞)。该细胞可以是有丝分裂潜能细胞(mitotically competent cells)或有丝分裂惰性细胞、减数分裂潜能细胞或减数分裂惰性细胞。类似地，细胞也可以是初级体细胞或并非初级体细胞的细胞。体细胞包括不是配子、生殖细胞、配子母细胞，或未分化干细胞的任何细胞。例如，细胞可以是神经元，例如海马神经元或皮层神经元。
本文提供的合适的细胞还包括初级细胞。初级细胞包括直接从生物体、器官，或组织分离的细胞或细胞培养物。初级细胞包括既未转化也非永生的细胞。它们包括获自生物体、器官，或组织的任何细胞，所述细胞先前没有在组织培养中进行传代或先前已经在组织培养中进行了传代但是无法在组织培养中进行无限传代。这样的细胞可以通过常规技术分离，并且包括，例如，海马神经元或皮层神经元。
本文提供的其它合适的细胞包括永生化细胞。永生化细胞包括来自多细胞生物的细胞，这些细胞通常不会无限期增殖，但由于突变或改变(alternation)，其逃避了正常的细胞衰老而可以继续分裂。这样的突变或改变可以是自然发生的或有意诱导的。永生化细胞系的具体例子是神经母细胞瘤细胞系，例如N18TG2或T48或细胞系，例如NIH-3T3细胞系。永生化细胞的许多类型是众所周知的。永生化或初级细胞包括通常用于培养或表达重组基因或蛋白质的细胞。
本文提供的细胞还包括单细胞期胚胎(即受精的卵母细胞或受精卵)。这样的单细胞期胚胎可以来自任何遗传背景(例如小鼠BALB/c、小鼠C57BL/6、小鼠129，或它们的组合)，可以是新鲜的或冷冻的，并且可以源自自然繁殖或体外受精。
本文提供的细胞可以是正常的健康细胞，或者可以是患病或携带突变的细胞。
包含本文描述的人源化TRKB基因座的非人动物可以通过本文其它地方描述的方法制备。术语“动物”包括动物界的任何成员，包括例如哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物、鸟类，和蠕虫。在具体的实施例中，非人动物是非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，非人灵长类动物、猴子、猿、猩猩、猫、狗、马、公牛、鹿、野牛、绵羊、兔子、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠，以及豚鼠)，以及家畜(例如牛科动物如奶牛和阉牛；绵羊科动物如绵羊和山羊；以及猪科动物如猪和野猪)。鸟类包括，例如，鸡、火鸡、鸵鸟、鹅、鸭等。还包括家养动物和农业动物。术语“非人”不包括人类。优选的非人动物包括例如啮齿动物，例如小鼠和大鼠。
非人动物可以来自任何遗传背景。例如，合适的小鼠可以来自129种系、C57BL/6种系、129种系和C57BL/6种系的混合、BALB/c种系，或Swiss Webster种系。129种系的实例包括129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1，和129T2。参见，例如，Festingetal.(1999)Mammalian Genome 10:836，出于所有目的通过引用整体并入本文。C57BL种系的实例包括C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/Kal_wN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr，和C57BL/Ola。合适的小鼠还可来自于前述129种系和前述C57BL/6种系的混合(例如50％129和50％C57BL/6)。类似地，合适的小鼠可来自于前述129种系的混合或前述BL/6种系的混合(例如129S6(129/SvEvTac)种系)。
类似地，大鼠可来自于任何大鼠种系，包括例如ACI大鼠种系、Dark Agouti(DA)大鼠种系、Wistar大鼠种系、LEA大鼠种系、Sprague Dawley(SD)大鼠种系，或Fischer大鼠种系(例如Fisher F344或Fisher F6)。大鼠还可获自衍生自上述两种或多种种系的混合的种系。例如，合适的大鼠可获自DA种系或ACI种系。ACI大鼠种系被表征为具有黑色刺豚鼠，其具有白色腹部和足部以及RT1av1单体型。这些种系可获自包括Harlan实验室在内的多种不同的来源。Dark Agouti(DA)大鼠种系被表征为具有刺鼠皮(agouti coat)和RT1av1单体型。这些大鼠获自包括Charles River和Harlan实验室在内的多种不同的来源。一些合适的大鼠可来自同系交配大鼠种系。参见，例如，US2014/0235933，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文。
III.使用包含人源化TRKB基因座的非人动物评估人TRKB靶向试剂的体内或体外功效的方法
提供了使用如本文其它地方所述的包含人源化TRKB基因座的非人动物，以评估或优化人TRKB靶向试剂(例如治疗性激动剂分子)的体内或体外的递送或功效的各种方法。因为非人动物包含人源化的TRKB基因座，所以该非人动物将更准确地反映人TRKB靶向试剂的功效。
A.体内或体外检测人TRKB靶向试剂功效的方法
提供了使用如本文其它地方所述的包含人源化TRKB基因座的非人动物，以评估人TRKB靶向试剂在体内的递送或功效的各种方法。这样的方法可以包括：(a)将人TRKB靶向试剂引入非人动物中；(b)评估人TRKB靶向试剂的活性。
人TRKB靶向试剂可以是人TRKB靶向抗体或抗原结合蛋白或靶向人TRKB的任何其它大分子或小分子。或者，人TRKB靶向试剂可以是靶向人TRKB基因座(人TRKB基因)、人TRKBmRNA，或人TRKB蛋白的任何生物或化学试剂。人TRKB靶向试剂的实例公开于本文其它地方。
这样的人TRKB靶向试剂可以通过如本文其它地方更详细公开的任何递送方法(例如注射、AAV、LNP，或HDD)和通过任何给药途径来给药。在本文的其它地方更详细地公开了递送治疗性分子的方式和给药途径。在特定方法中，试剂通过注射(例如直接海马注射、皮下注射，或玻璃体内注射)递送。
评估人TRKB靶向试剂的活性的方法是众所周知的，并在本文其它地方提供。在一些方法中，如本文其它地方所公开的，评估人TRKB靶向试剂的活性(例如激动剂活性或抑制活性)包括评估TRKB活性(例如TRKB磷酸化、TRKB介导的下游信号传导途径的激活，或TRKB诱导的表型)。活性的评估可以在本文其它各处公开的任何细胞类型、任何组织类型，或任何器官类型中进行。在一些方法中，在脑组织(例如海马或纹状体)或神经元(例如视网膜神经节细胞、海马神经元，或皮质神经元)中评估活性。
如果TRKB靶向试剂是基因组编辑试剂(例如核酸酶剂)，则此类方法可包括评估人源化TRKB基因座的修饰。例如，评估可以包括对从非人动物分离的一个或多个细胞中的人源化TRKB基因座进行测序(例如下一代测序(next-generation sequencing))。评估可包括从非人动物分离靶器官(例如大脑)或组织，并评估靶器官或组织中人源化TRKB基因座的修饰。评估还可包括评估靶器官或组织内两种或更多种不同细胞类型中的人源化TRKB基因座的修饰。类似地，评估可包括从非人动物中分离非靶器官或组织(例如两个或更多非靶器官或组织)，并评估该非靶器官或组织中人源化TRKB基因座的修饰。
这样的方法还可包括测量由人源化TRKB基因座产生的mRNA的表达水平，或测量由人源化TRKB基因座编码的蛋白质的表达水平。例如，可以在特定的细胞、组织，或器官类型(例如脑)中测量蛋白质水平，或者可以在血清中测量分泌水平。评估TRKB mRNA的表达或表达自人源化TRKB基因座的蛋白质的表达的方法在本文其它地方提供，并且是众所周知的。
如本文其它地方所述，上文提供的用于评估体内活性的各种方法也可用于评估体外的人TRKB靶向试剂的活性。
B.优化人TRKB靶向试剂的体内或体外递送或功效的方法
提供了各种方法来优化人TRKB靶向试剂向细胞或非人动物的递送，或优化人TRKB靶向试剂在体内的活性或功效。这样的方法可以包括，例如：(a)在第一非人动物或第一细胞中第一次执行如上文所述的测试人TRKB靶向试剂的功效的方法；(b)更改变量，并在第二非人动物(即同一物种的)或具有更改后的变量的第二细胞中第二次执行该方法；以及(c)将步骤(a)中的人TRKB靶向试剂的活性与步骤(b)中的人TRKB靶向试剂的活性进行比较，并选择产生更高功效或活性的方法。
本文中其它地方公开了测量人TRKB靶向试剂的递送、功效，或活性的方法。取决于非人动物或细胞内所需的作用，更高的功效可能意味着不同的含义。例如，更高的功效可以意味着更高的活性和/或更高的特异性。更高的活性可以是，例如，激活TRKB的活性或抑制TRKB的活性。它可以指在特定靶细胞类型(例如，诸如视网膜神经节细胞的神经元)内或在特定靶组织或器官(例如脑)内被靶向的细胞百分比更高。较高的特异性可指与脱靶作用相比的对TRKB的更高特异性、对被靶向的细胞类型的更高特异性，或对被靶向的组织或器官类型的更高特异性。
被改变的变量可以是任何参数。作为一个例子，改变的变量可以是包装或递送方法，通过所述包装或递送方法，将一种或多种人TRKB靶向试剂引入细胞或非人动物中。递送方法的实例在本文其它地方公开。作为另一个例子，改变的变量可以是用于将一种或多种人TRKB靶向试剂引入细胞或非人动物的给药途径。给药途径的实例在本文其它地方公开。
作为另一个例子，改变的变量可以是被引入的一种或多种人TRKB靶向试剂的浓度或量。作为另一个例子，改变的变量可以是相对于评估试剂的活性或功效的时机而言，引入一种或多种人TRKB靶向试剂的时间。作为另一个例子，改变的变量可以是引入一种或多种人TRKB靶向试剂的次数或频率。作为另一个例子，改变的变量可以是被引入的一种或多种人TRKB靶向试剂(例如将一种试剂与另一种试剂进行比较)。
C.人TRKB靶向试剂
人TRKB靶向试剂可以是靶向人TRKB蛋白、人TRKB基因，或人TRKB mRNA的任何试剂。人TRKB靶向试剂可以是，例如，激动剂(即间接或直接激活人TRKB的分子)，也可以是拮抗剂(即阻断人TRKB活性的抑制剂或抑制试剂)。在一个具体实例中，该人TRKB靶向试剂是TRKB激动剂。本文公开的方法中的人TRKB靶向试剂可以是已知的人TRKB靶向试剂，可以是假定的人TRKB靶向试剂(例如设计为靶向人TRKB的候选试剂)，或者可以是针对人TRKB靶向活性进行筛选的试剂。
例如，人TRKB靶向试剂可以是靶向人TRKB蛋白表位的抗原结合蛋白(例如激动剂抗体)。这种试剂的一个例子是TRKB激动剂抗体H4H9816P2。其它抗TRKB抗体在本文其它地方公开。在一些情况下，抗TRKB抗体以小于约200nM的KD结合人TRKB(通过在25℃或37℃下的表面等离激元共振测量)。在其它情况下，抗TRKB抗体以小于约600pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约150pM、小于约100pM、小于约80pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约30pM、小于约20pM、小于约10pM、小于约5pM、小于约3pM，或小于约1pM的KD结合人TRKB。在一些情况下，抗TRKB抗体以大于约10分钟的解离半衰期(t1/2)结合人TRKB(通过在25℃或37℃下的表面等离激元共振测量)。在其它情况下，抗TRKB抗体以大于约20分钟、大于约50分钟、大于约100分钟、大于约120分钟、大于约150分钟、大于约300分钟、大于约350分钟、大于约400分钟、大于约450分钟、大于约500分钟、大于约550分钟、大于约600分钟、大于约700分钟、大于约800分钟、大于约900分钟、大于约1000分钟、大于约1100分钟，或大于约1200分钟的t1/2结合人TRKB。作为一个具体例子，抗TRKB抗体可以包含一组六个CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其选自表22所列出的组或与其具有至少90％、至少95％、至少98％，或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
其它人TRKB靶向试剂包括靶向人TRKB蛋白的小分子(例如激动剂)。小分子TRKB激动剂的例子包括7,8-二羟基黄酮(7,8-DHF)、脱氧葛杜宁、LM22A-4(N，N'，N”-三(2-羟乙基)-1,3,5-苯三甲酰胺)，和LM22B-10(2-[[[4-[[4-[双(2-羟乙基)-氨基]-苯基]-(4-氯-苯基)-甲基]-苯基]-(2-羟基-乙基)-氨基]-乙醇)。参见，例如，Liu et al.(2015)Translational Neurodegeneration 5:2；Massa et al.(2010)J.Clin.Invest.120(5):1774-1785；和Yang et al.(2016)Neuropharmacology 110:343-361，出于所有目的，将其每一篇均通过引用整体并入本文。作为抑制剂的TRKB靶向试剂的实例是K252a。参见，例如，Yang et al.(2016)Neuropharmacology 110:343-361，出于所有目的通过引用整体并入本文。
其它人TRKB靶向试剂包括靶向人TRKB蛋白的肽或肽模拟物(例如激动剂)。用作人TRKB激动剂的肽模拟物的实例公开于，例如，O’Leary et al.(2003)J.Biol.Chem.278(28):25738-25744，出于所有目的通过引用整体并入本文。
其它人TRKB靶向的试剂可包括基因组编辑试剂，例如核酸酶剂(例如，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)(CRISPR/Cas9)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)，或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)，其可在人TRKB基因内切割一个识别位点。同样，人TRKB靶向试剂可以是设计为与人TRKB基因重组的外源供体核酸(例如靶向载体或单链寡脱氧核苷酸(ssODN))。
其它人TRKB靶向试剂可包括靶向人TRKB mRNA的反义寡核苷酸(例如siRNA或shRNA)。反义寡核苷酸(ASO)或反义RNA是短的合成核苷酸串，旨在通过与编码靶向蛋白的RNA选择性结合，阻止该靶向蛋白的表达，从而阻止翻译。这些化合物通过表征明确的沃森-克里克碱基配对(杂交)，以高亲和力和选择性与RNA结合。RNA干扰(RNAi)是一种控制基因表达的内源细胞机制，其中与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合的小干扰RNA(siRNA)介导靶信使RNA(mRNA)的裂解。
还可以使用本文公开的非人动物评估任何其它已知或假定的人TRKB靶向试剂的活性。类似地，可以使用本文公开的非人动物筛选任何其它分子的人TRKB靶向活性。
D.向非人动物或细胞施用人TRKB靶向试剂
本文公开的方法可以包括将各种分子(例如诸如抗体或小分子的人TRKB靶向试剂)引入非人动物或细胞中，所述分子包括核酸、蛋白质、核酸-蛋白质复合物、肽模拟物、抗原结合蛋白，或小分子。“引入”包括以某种方式向细胞或非人动物展示分子(例如核酸、蛋白质或小分子)，使其能够进入非人类动物内的一个或多个细胞的内部。该引入可以通过任何方式完成。如果引入了多个组分，则它们可以同时或以任何组合顺序引入。另外，可以通过相同的递送方法或不同的递送方法将两种或更多种组分引入细胞或非人动物中。类似地，可以通过相同的给药途径或不同的给药途径将两种或更多种组分引入非人动物。
引入非人动物或细胞的分子可被提供于包含载体的组合物中，该载体增加了被引入的分子的稳定性(例如延长降解产物的浓度在给定的储存条件下(例如-20℃、4℃，或环境温度)保持在阈值以下(例如起始核酸或蛋白质重量的0.5％以下)的时间；或增加体内稳定性)。此类载体的非限制性实例包括聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-甘醇酸)(poly(D,L-lactic-coglycolic-acid)，PLGA)微球、脂质体、胶束、反胶束、脂质卷(lipidcochleates)，和脂质微管。
本文提供了各种方法和组合物，以允许将人TRKB靶向试剂引入细胞或非人动物中。将核酸引入各种细胞类型的方法是已知的，并包括，例如，稳定转染方法、瞬时转染方法，和病毒介导的方法。
转染方案以及用于将核酸序列引入细胞的方案是多样的。非限制性转染方法包括基于化学品的转染方法，其使用脂质体；纳米粒子；磷酸钙(Graham et al.(1973)Virology52(2):456–67，Bacchettiet al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(4):1590–4，和Kriegler,M(1991).Transfer and Expression:A Laboratory Manual.New York:W.H.Freeman and Company.pp.96–97)；树状聚合物；或阳离子聚合物(例如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)。非化学方法包括电穿孔、声纳穿孔，和光学转染。基于粒子的转染包括使用基因枪或磁辅助转染(Bertram(2006)Current Pharmaceutical Biotechnology 7,277–28)。病毒方法也可以用于转染。
还可以通过电穿孔、通过卵细胞质内注射(intracytoplasmic injection)、通过病毒感染、通过腺病毒、通过腺相关病毒、通过慢病毒、通过逆转录病毒、通过转染、通过脂质介导的转染，或通过核转染将人TRKB靶向试剂引入细胞。核转染是一种改进的电穿孔技术，其使核酸底物不仅可以传递到细胞质，还可以通过核膜递送到细胞核。另外，在本文公开的方法中使用核转染通常比常规电穿孔需要更少的细胞(例如仅需约200万，而常规电穿孔则需700万)。在一实施例中，使用
Figure BDA0002605767120000401
NUCLEOFECTORTM系统进行核转染。
也可以通过显微注射来将人TRKB靶向试剂引入细胞(例如合子)。在合子(即单细胞期胚胎)中，显微注射可以注入母系和/或父系原核或注入细胞质中。如果显微注射仅进入一个原核，则父系原核因其尺寸较大是优选的。mRNA优选显微注射入细胞质(例如将mRNA直接递送至翻译系统)，而蛋白或编码蛋白质或编码RNA的多核苷酸优选显微注射入细胞核/原核。替代地，显微注射可以通过注射到细胞核/原核和细胞质中执行：可以先将针头引入细胞核/原核，然后可以注射第一量，然后当从单细胞期胚胎中取出针头时，可将第二量注入细胞质中。如果将蛋白质注射到细胞质中并且需要靶向细胞核，则它可以包含核定位信号以确保递送到细胞核/原核。进行显微注射的方法是众所周知的。参见，例如，Nagy etal.(Nagy A,Gertsenstein M,Vintersten K,Behringer R.,2003,Manipulating theMouse Embryo.Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；还参见Meyer et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:15022-15026和Meyeret al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:9354-9359。
将人TRKB靶向试剂引入细胞或非人动物的其它方法可包括，例如，载体递送、颗粒介导的递送、外体介导的递送、脂质纳米颗粒介导的递送、细胞穿膜肽介导的递送，或可植入装置介导的递送。作为具体实例，可以将核酸或蛋白质在诸如聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-甘醇酸)(PLGA)微球、脂质体、胶束、反胶束、脂质卷，或脂质微管的载体中引入细胞或非人动物。递送至非人动物的一些具体实例包括流体动力递送、病毒介导的递送(例如，腺相关病毒(AAV)介导的递送)，和脂质纳米颗粒介导的递送。
可以通过流体动力递送(HDD)来将人TRKB靶向试剂引入细胞或非人动物。流体动力递送已作为体内的细胞内DNA递送的方法而出现。为了将基因递送至实质细胞，仅需要通过选定的血管注射必需的DNA序列，从而消除了与当前的病毒和合成载体相关的安全隐患。当注入血液时，DNA能够到达血液可及的不同组织中的细胞。流体动力递送利用了将大量溶液快速注入循环里不可压缩的血液中所产生的力，从而克服了内皮和细胞膜的物理屏障；该物理屏障阻止了大的和膜不可渗透的化合物进入实质细胞。除了DNA的递送外，此方法还可用于体内的RNA、蛋白质，和其它小化合物的有效细胞内递送。参见，例如，Bonamassa etal.(2011)Pharm.Res.28(4):694-701，出于所有目的通过引用整体并入本文。
还可以通过病毒介导的递送(例如AAV介导的递送或慢病毒介导的递送)来实现人TRKB靶向试剂的引入。其它示例性病毒/病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、痘病毒，和单纯疱疹病毒。病毒可以感染分裂细胞、非分裂细胞，或分裂和非分裂细胞两者。病毒可以整合到宿主基因组中，也可以不整合到宿主基因组中。还可以对此类病毒进行工程化，使其免疫力降低。病毒可以是可复制型的，也可以是复制缺陷型的(例如，在另一轮病毒体复制和/或包装中必需的一个或多个基因中有缺陷)。病毒可引起瞬时表达、长期表达(例如至少1周、2周、1个月、2个月，或3个月)，或永久表达。示例性病毒滴度(例如AAV滴度)包括1012、1013、1014、1015，和1016载体基因组/mL。
ssDNA AAV基因组由两个开放阅读框Rep和Cap组成，其侧接允许合成互补DNA链的两个反向末端重复序列。当构建AAV转移质粒时，将转基因置于两个ITR之间，并且Rep和Cap可以反式提供。除了Rep和Cap之外，AAV还可能需要一个包含来自腺病毒的基因的辅助质粒。这些基因(E4、E2a，和VA)介导AAV复制。例如，可以将转移质粒Rep/Cap和辅助质粒转染到含有腺病毒基因E1+的HEK293细胞中，以产生感染性AAV颗粒。替代地，可以将Rep、Cap，和腺病毒辅助基因合并为一个质粒。类似的包装细胞和方法可用于其它病毒，例如逆转录病毒。
已经识别出多种血清型的AAV。这些血清型在它们感染的细胞类型(即它们的向性(tropism))上有所不同，从而允许特定细胞类型的优先转导。CNS组织的血清型包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8，和AAV9。心脏组织的血清型包括AAV1、AAV8，和AAV9。肾组织的血清型包括AAV2。肺组织的血清型包括AAV4、AAV5、AAV6，和AAV9。胰腺组织的血清型包括AAV8。感光细胞的血清型包括AAV2、AAV5，和AAV8。视网膜色素上皮组织的血清型包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5，和AAV8。骨骼肌组织的血清型包括AAV1、AAV6、AAV7、AAV8，和AAV9。肝组织的血清型包括AAV7、AAV8，和AAV9，尤其是AAV8。
可以通过假型(pseudotyping)进一步完善向性；假型是来自不同病毒血清型的衣壳和基因组的混合。例如，AAV2/5表示一种病毒，其包含包装在血清型5的衣壳中的血清型2的基因组。使用假型病毒可以提高转导效率，并改变向性。衍生自不同血清型的混合衣壳也可用于改变病毒向性。例如，AAV-DJ包含来自八种血清型的杂合衣壳，并且在体内多种细胞类型中显示出高感染性。AAV-DJ8是另一个显示AAV-DJ的属性，但具有增强的大脑摄取的示例。AAV血清型也可以通过突变进行修饰。AAV2的突变修饰的例子包括Y444F、Y500F、Y730F，和S662V。AAV3的突变修饰的例子包括Y705F、Y731F，和T492V。AAV6的突变修饰的例子包括S663V和T492V。其它假型/修饰的AAV变体包括AAV2/1、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2.5、AAV8.2，和AAV/SASTG。
为了加速转基因表达，可以使用自身互补的AAV(scAAV)变体。由于AAV依赖于细胞的DNA复制机制来合成AAV单链DNA基因组的互补链，因此转基因表达可能会延迟。为了解决此延迟，可以使用包含能够在感染后自发退火的互补序列的scAAV，从而消除了宿主细胞DNA合成的需求。
为了增加包装能力，可以在两个AAV转移质粒之间分配更长的转基因，第一个具有3'剪接供体，第二个具有5'剪接受体。细胞共同感染(co-infection)后，这些病毒形成多联体，被剪接在一起，全长转基因可以得到表达。尽管这允许更长的转基因表达，但表达效率较低。用于增加能力的类似方法利用同源重组。例如，转基因可以在两个转移质粒之间分开，但是具有实质的序列重叠，使得共同表达诱导全长转基因的同源重组和表达。
人TRKB靶向试剂的引入也可以通过脂质纳米颗粒(LNP)介导的递送来实现。脂质制剂可以保护生物分子免于降解，同时改善其细胞摄取。脂质纳米颗粒是包含通过分子间力彼此物理结合的多个脂质分子的颗粒。这些包括微球(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。此类脂质纳米颗粒可用于封装一种或多种核酸或蛋白质以进行递送。包含阳离子脂质的制剂在用于递送聚阴离子(如核酸)时是有用的。可以包括的其它脂质是中性脂质(即不带电荷的或两性离子脂质)、阴离子脂质、增强转染的辅助脂质(helper lipid)，以及隐形脂质(stealth lipid)，该隐形脂质增加了纳米粒子可以在体内存在的时间长度。合适的阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质、辅助脂质，和隐形脂质的实例可以在WO 2016/010840A1中找到，出于所有目的通过引用整体并入本文。示例性的脂质纳米颗粒可包含阳离子脂质和一种或多种其它组分。在一个实例中，其它组分可包含辅助脂质，例如胆固醇。在另一个实例中，其它组分可以包含辅助脂质，例如胆固醇和诸如DSPC的中性脂质。在另一个实例中，其它组分可以包含辅助脂质(例如胆固醇)、可选的中性脂质(例如DSPC)，以及隐形脂质(例如S010、S024、S027、S031，或S033)。
可以选择递送方式以降低免疫原性。例如，如果递送多个组分，则它们可以通过不同的模式来递送(例如双模式递送)。这些不同的模式可以赋予对象递送的分子不同的药效学或药代动力学性质。例如，不同的模式可以导致不同的组织分布、不同的半衰期，或不同的时间分布。某些递送方式(例如通过自主复制或基因组整合递送保留在细胞中的核酸载体)导致分子更持久的表达和存在，而其它递送方式是瞬时的且持久性较低(例如递送RNA或蛋白质)。
体内给药可以通过任何合适的途径进行，包括，例如，肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内，或肌肉内。全身性给药方式包括，例如，口服和肠外途径。肠外途径的实例包括静脉内、动脉内、骨内(intraosseous)，肌肉内、皮内、皮下、鼻内，和腹膜内途径。一个具体的例子是静脉输液。鼻滴注和玻璃体内注射是其它的具体实例。局部给药方式包括，例如，鞘内、脑室内、实质内(例如局部实质内递送至纹状体(例如进入尾状核(caudate)或壳核)、大脑皮层、中央前回、海马(例如进入齿状回或CA3区)、颞叶皮层(temporal cortex)、杏仁核、额叶皮层(frontal cortex)、丘脑、小脑、延髓、下丘脑、顶盖、被盖，或黑质)、眼内、眶内、结膜下、玻璃体内、视网膜下，和巩膜途径。与全身给药(例如静脉内)相比，当局部给药(例如实质内或玻璃体内)时，显著更少量的组分(与全身途径相比)即可以发挥作用。局部给药方式还可以减少或消除全身给药治疗有效量的组分时可能发生的潜在毒性副作用的发生。在一个具体的例子中，通过直接海马注射、皮下注射，或玻璃体内注射来给药人TRKB靶向试剂。
可以使用一种或多种生理和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂，或助剂配制包含人TRKB靶向试剂的组合物。该制剂可以取决于选择的给药途径。术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂，或助剂与制剂的其它成分相容，并且对其接受者基本上无害。
给药频率和剂量数目可以取决于人TRKB靶向试剂的半衰期和给药途径以及其它因素。可以在一段时间内进行一次或多次的将人TRKB靶向试剂引入细胞或非人动物中。例如，引入可以在一段时间内至少执行两次、在一段时间内至少执行三次、在一段时间内至少执行四次、在一段时间内至少执行五次、在一段时间内至少执行六次、在一段时间内至少执行七次、在一段时间内至少执行八次、在一段时间内至少执行九次、在一段时间内至少执行十次、至少执行十一次、在一段时间内至少执行十二次、在一段时间内至少执行十三次、在一段时间内至少执行十四次、在一段时间内至少执行十五次、在一段时间内至少执行十六次、在一段时间内至少执行十七次、在一段时间内至少执行十八次、在一段时间内至少执行十九次，或在一段时间内至少执行二十次。
E.体内或体外测量人TRKB靶向试剂的递送、活性，或功效
本文公开的方法可以进一步包括检测或测量人TRKB靶向试剂的活性。测量此类试剂的活性(例如激动剂活性或抑制剂活性)可以包括测量TRKB活性。可以通过任何已知方式测量TRKB活性。例如，可以评估TRKB的磷酸化(例如，在大脑或神经元中)、可以评估TRKB对下游途径(如PI3K/AKT和MAPK/ERK)的激活(例如，在大脑或神经元，例如原代皮层神经元中)，或者可以评估细胞存活(例如神经元细胞存活，如视网膜神经节细胞存活)。例如，可以在给药后15分钟、30分钟、1小时，2小时、4小时，或18小时评估下游信号传导途径的磷酸化或激活。TRKB磷酸化、下游信号通路的激活，或细胞存活的增加可能是TRKB激活的指示，而减少可能是TRKB抑制的指示。
在非人动物中，评估可包括相对于非人类对照动物评估体重、身体组成、代谢，和运动中的一项或多项或全部(例如在给药后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时，或120小时)。参见，例如，Lin et al.(2008)PLoS ONE 3(4):e1900；Rios et al.(2013)Trendsin Neurosciences 36(2):83-90；和Zorner et al.(2003)Biol.Psychiatry 54:972-982，将每一篇出于所有目的通过引用整体并入本文。评估身体组成的变化可以包括，例如，评估瘦体重(lean mass)和/或脂肪质量。评估代谢变化可以包括，例如，评估食物消耗和/或水消耗的变化。体重、脂肪量、瘦体重、食物摄入量，和水摄入量的减少可为TRKB激活的指示，而增加可为TRKB抑制的指示。运动的增加可为TRKB激活的指示，而减少可为TRKB抑制的指示。
评估可以包括评估神经保护活性。作为一个例子，可以在非人动物中评估细胞存活。例如，啮齿动物视网膜神经节细胞(RGC)通常用于研究与轴突病变相关的神经退行性过程，以及用于测定神经保护疗法。参见，例如，
Figure BDA0002605767120000461
et al.(2009)Invest.Ophthalmol.Vis.Sic.50(8):3860-3868，出于所有目的通过引用整体并入本文。可以在用人TRKB靶向试剂治疗后相对于对照非人动物评估视网膜神经节细胞的存活/生存力(例如在视神经损伤后的完全视神经横断模型中)。例如，可以在视神经损伤后在完全视神经横断模型中评估视网膜神经节细胞的存活/生存力。参见，例如，
Figure BDA0002605767120000462
et al.(2009)Invest.Ophthalmol.Vis.Sic.50(8):3860-3868，出于所有目的通过引用整体并入本文。作为另一个例子，可以在视神经粉碎模型中评估视网膜神经节细胞的存活/生存力。在该模型中，对视神经的挤压伤导致视网膜神经节细胞逐渐凋亡。参见，例如，Tang et al.(2011)J.Vis.Exp.50:2685，出于所有目的通过引用整体并入本文。视网膜神经节细胞的存活/生存力可以例如通过测量视网膜神经节细胞的密度(例如在解剖并染色视网膜神经节细胞的视网膜中)来评估。存活/生存力的提高可为TRKB激活的指示，而存活/生存力的降低可为TRKB抑制的指示。
如果人TRKB靶向试剂是基因组编辑试剂，则该测量可以包括评估该人源化TRKB基因座的修饰。可以使用多种方法来识别具有靶向遗传修饰的细胞。筛选可以包括用于评估亲本染色体的等位基因修饰(MOA)的定量测定。例如，可以通过定量PCR(例如实时PCR(qPCR))来进行定量测定。实时PCR可以利用识别靶定基因座的第一引物组和识别非靶定参考基因座的第二引物组。引物组可以包含识别扩增的序列的荧光探针。合适的定量测定的其它示例包括荧光介导的原位杂交(FISH)、比较基因组杂交、等温DNA扩增、与固定探针的定量杂交、
Figure BDA0002605767120000471
探针、
Figure BDA0002605767120000472
Molecular Beacon探针，或ECLIPSETM探针技术(参见，例如，US2005/0144655，出于所有目的通过引用整体并入本文)。下一代测序(NGS)也可以用于筛选。下一代测序也可被称为“NGS”或“大规模并行测序(massively parallelsequencing)”或“高通量测序”。除了MOA测定外，NGS也可以用作筛选工具，以定义靶定基因修饰的确切性质以及它在不同的细胞类型或组织类型或器官类型之间是否一致。
在非人动物中的评估可以在来自任何组织或器官的任何细胞类型中评估。例如，评估可以是来自相同组织或器官(例如大脑)的多种细胞类型，或是来自组织或器官(例如海马和纹状体)内的多个位置的细胞。这可以提供关于人TRKB靶向试剂靶向靶组织或器官内的哪些细胞类型或到达组织或器官的哪些部分的信息。作为另一个示例，评估可以在多种类型的组织中或在多个器官中进行。在特定组织、器官，或细胞类型被靶定的方法中，这可以提供关于该组织或器官的被靶向的效率如何以及在其它组织或器官中是否存在脱靶效应的信息。
如果试剂被设计成灭活人源化TRKB基因座、影响人源化TRKB基因座的表达，或阻止人源化TRKB mRNA的翻译，则测量可以包括评估人源化TRKB mRNA或蛋白质表达。该测量可为在大脑或特定细胞类型(例如神经元(如视网膜神经节细胞))内。
IV.制作包含人源化TRKB基因座的非人动物的方法
提供了各种方法来制备包含如本文其它地方所公开的人源化TRKB基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，或非人类动物。用于产生转基因生物的任何方便的方法或方案都适用于产生这种转基因非人动物。参见，例如，Cho et al.(2009)Current Protocols inCell Biology42:19.11:19.11.1–19.11.22和Gama Sosa et al.(2010)BrainStruct.Funct.214(2-3):91-109，其每一篇出于所有目的均通过引用整体并入本文。这样的经遗传修饰的非人类动物可以例如通过在靶定的TrkB基因座处的基因敲入来产生。
例如，产生包含人源化TRKB基因座的非人动物的方法可以包括：(1)修饰多能细胞的基因组以包含该人源化TRKB基因座；(2)识别或选择包含人源化TRKB基因座的经遗传修饰的多能细胞；(3)将该经基因修饰的多能细胞引入非人动物宿主胚胎中；以及(4)将宿主胚胎植入代孕母体中并在代孕母体中孕育宿主胚胎。例如，产生包含人源化TRKB基因座的非人动物的方法可以包括：(1)修饰多能细胞的基因组以包含人源化TRKB基因座；(2)识别或选择包含人源化TRKB基因座的经遗传修饰的多能细胞；(3)将经基因修饰的多能细胞导入非人动物宿主胚胎中；以及(4)在代孕母体中孕育宿主胚胎。可选地，可以将包含修饰的多能细胞(例如非人ES细胞)的宿主胚胎培育至胚泡阶段，然后将其植入代孕母体并在代孕母体中孕育，以产生F0非人动物。代孕母体然后可以产生包含人源化TRKB基因座的F0代非人动物。
所述方法可以进一步包括识别具有修饰的靶基因组基因座的细胞或动物。可以使用多种方法来识别具有靶向遗传修饰的细胞和动物。
修饰基因组的步骤可以例如利用外源修复模板(例如靶向载体)来修饰TrkB基因座，以包含本文所公开的人源化TRKB基因座。作为一个实例，靶向载体可以用于在内源TrkB基因座(例如内源非人动物TrkB基因座)处产生人源化TRKB基因，其中所述靶向载体包括靶向内源TrkB基因座处的5'靶序列的5'同源臂和和靶向内源TrkB基因座处的3'靶序列的3'同源臂。外源修复模板也可以包含核酸插入物，该核酸插入物包括要整合在TrkB基因座中的DNA片段。TrkB基因座中的核酸插入片段的整合可导致在TrkB基因座中添加目标核酸序列、在TrkB基因座中删除目标核酸序列，或替换TrkB基因座中的目标核酸序列(即删除和插入)。同源臂可以侧接包含人TRKB序列的插入核酸，以产生人源化的TRKB基因座(例如用于删除内源TrkB基因座的片段并用种间同源的人TRKB序列代替)。
外源修复模板可以用于非同源末端连接介导的插入或同源重组。外源修复模板可以包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，它们可以是单链或双链的，并且可以是线性或环状形式。例如，修复模板可以是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。
外源修复模板还可以包含在未靶向的内源TrkB基因座处不存在的异源序列。例如，外源修复模板可包含选择盒，例如侧面有重组酶识别位点的选择盒。
一些外源修复模板包含同源臂。如果外源修复模板酸还包含核酸插入物，则同源臂可以位于该核酸插入物的侧面。为了便于参考，在本文中将同源臂称为5'和3'(即上游和下游)同源臂。该术语涉及外源修复模板内的同源臂与核酸插入物的相对位置。5'和3'同源臂对应于TrkB基因座内的区域，其在本文分别称为“5'靶序列”和“3'靶序列”。
当两个区域彼此共享足够水平的序列同一性以充当同源重组反应的底物时，同源臂和靶序列“对应”或彼此“对应”。术语“同源”包括与相应序列相同或共享序列同一性的DNA序列。给定靶序列与外源修复模板中发现的相应同源臂之间的序列同一性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，外源修复模板(或其片段)的同源臂和靶序列(或其片段)共有的序列同一性的量可以为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％的序列同一性，以使这些序列进行同源重组。此外，同源臂和对应靶序列之间的对应同源区域可以为足以促进同源重组的任何长度。在一些靶向载体中，同源TrkB基因座中的预期突变包括在侧面为同源臂的插入核酸中。
在单细胞期胚胎以外的细胞中，外源修复模板可以是“大靶向载体”或“LTVEC”，其包括靶向载体，所述靶向载体包含对应于并衍生自核酸序列的同源臂，该核酸序列大于用于在细胞中进行同源重组的其它方法所通常使用的核酸序列。LTVEC还包括靶向载体，该靶向载体包含具有核酸序列的核酸插入物，该核酸序列大于用于在细胞中进行同源重组的其它方法所通常使用的核酸序列。例如，LTVEC使大基因座的修饰成为可能；由于其尺寸限制，传统的基于质粒的靶向载体无法容纳该大基因座。例如，靶定基因座可以是(即5'和3'同源臂可以对应于)在不存在核酸酶剂(例如Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂时使用常规方法不可靶定的或只能被错误地靶定的或仅以非常低的效率被靶定的细胞的基因座。LTVEC可以是任何长度，通常长度至少为10kb。LTVEC中5'同源臂和3'同源臂的总和通常至少为10kb。
筛选步骤可以包括例如用于评估亲代染色体的等位基因修饰(MOA)的定量测定。例如，可以通过定量PCR，例如实时PCR(qPCR)，来进行定量测定。实时PCR可以利用识别靶基因座的第一引物组和识别非靶参考基因座的第二引物组。引物组可以包含识别扩增的序列的荧光探针。
合适的定量测定的其它实例包括荧光介导原位杂交(FISH)、比较基因组杂交、等温DNA扩增、定量杂交至固定探针、
Figure BDA0002605767120000501
探针、
Figure BDA0002605767120000502
分子信标探针，或ECLIPSETM探针技术(参见例如US2005/0144655，其出于所有目的以全文引用方式并入本文)。
合适的多能细胞的例子是胚胎干(ES)细胞(例如小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)。修饰的多能细胞可通过例如重组产生，通过：(a)将一种或多种外源供体核酸(例如靶向载体)引入细胞中，该外源供体核酸包含侧面为，例如，对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂的插入核酸，其中插入核酸包含人TRKB序列，以生成人TRKB基因座；以及(b)识别至少一个细胞，所述细胞在其基因组中包含在内源TrkB基因座处整合的插入核酸(即识别包含人源化TRKB基因座的至少一个细胞)。修饰的多能细胞可以例如通过重组产生，通过：(a)将一种或多种靶向载体引入细胞中，所述靶向载体包含侧面为对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂的插入核酸，其中该插入核酸包含人源化TRKB基因座；以及(b)识别至少一个细胞，所述细胞在其基因组中包含在靶基因座处整合的插入核酸。
替代地，修饰的多能细胞可以通过以下产生：(a)向细胞中引入：(i)核酸酶剂，其中所述核酸酶剂在内源TrkB基因座内的靶位点处诱导切口或双链断裂；以及(ii)一种或多种外源供体核酸(例如靶向载体)，其可选地包含插入核酸，所述插入核酸的侧面为，例如，对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂，所述5'和3'靶位点位于与核酸酶靶位点足够接近之处，其中所述插入核酸包含人TRKB序列，以产生人源化TRKB基因座；以及(c)识别至少一个在其基因组中包含在内源TrkB基因座处整合的插入核酸的细胞(即识别至少一个包含人源化TRKB基因座的细胞)。替代地，修饰的多能细胞可以通过以下产生：(a)向细胞中引入：(i)核酸酶剂，其中所述核酸酶剂在靶基因座内的识别位点处诱导切口或双链断裂；以及(ii)一种或多种靶向载体，其包含侧面为对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂的插入核酸，所述5'和3'靶位点位于与识别位点足够接近之处，其中所述插入核酸包含人源化TRKB基因座；以及(c)识别至少一个在靶基因组基因座处包含修饰(例如插入核酸的整合)的细胞。可以使用诱导切口或双链断裂进入所需的识别位点的任何核酸酶剂。合适的核酸酶的实例包括类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、兆核酸酶，和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统(例如CRISPR/Cas9系统)或此类系统的组分(例如CRISPR/Cas9)。参见，例如，US 2013/0309670和US 2015/0159175，出于所有目的将每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。
供体细胞可以在任何期(例如胚泡期或桑椹胚前期(pre-morula stage，即4细胞期或8细胞期))引入宿主胚胎。产生能够通过种系传递遗传修饰的后代。参见，例如，美国专利号7,294,754，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
替代地，产生本文本文其它地方所述的非人动物的方法可包括：(1)使用上述修饰多能细胞的方法修饰单细胞期胚胎的基因组，以包含人源化TRKB基因座；(2)选择基因修饰的胚胎；和(3)将该基因修饰的胚胎植入代孕母体到并在代孕母体中孕育。替代地，产生本文其它地方所述的非人动物的方法可包括：(1)使用上述修饰多能细胞的方法修饰单细胞期胚胎的基因组，以包含人源化TRKB基因座；(2)选择基因修饰的胚胎；和(3)在代孕母体中孕育该基因修饰的胚胎。产生了能够通过种系传递遗传修饰的后代。
核转移技术也可以用于产生非人动物。简而言之，核转移的方法可以包括以下步骤：(1)将卵母细胞去核或提供去核卵母细胞；(2)分离或提供将与该去核卵母细胞结合的供体细胞或核；(3)将细胞或核插入去核卵母细胞中以形成重组细胞；(4)将重组细胞植入动物子宫内形成胚胎；以及(5)允许该胚胎发育。在这种方法中，卵母细胞通常是从死去的动物身上获得的，尽管它们也可以从活体动物的输卵管和/或卵巢中分离。去核之前，卵母细胞可在多种众所周知的培养基中成熟。卵母细胞的去核可以多种公知的方式进行。可以通过融合前在透明带下显微注射供体细胞，将供体细胞或核插入去核卵母细胞以形成重构细胞。可以通过在接触/融合平面上施加直流电脉冲(电融合)，通过将细胞暴露于融合促进化学物质(例如聚乙二醇)，或通过灭活病毒(例如仙台病毒)来诱导融合。重建的细胞可以在核供体和受体卵母细胞融合之前、之中，和/或之后通过电和/或非电方式激活。激活方法包括电脉冲、化学诱导的电击、精子穿透、卵母细胞中二价阳离子水平的增加，以及卵母细胞中细胞蛋白的磷酸化的降低(通过激酶抑制剂的方式)。活化的重组细胞或胚胎可以在众所周知的培养基中培养，然后转移到动物的子宫中。参见，例如，US 2008/0092249、WO1999/005266、US 2004/0177390、WO 2008/017234，和美国专利号7,612,250，出于所有目的将其每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。
本文提供的各种方法允许产生遗传修饰的非人F0动物，其中遗传修饰的F0动物的细胞包含人源化TRKB基因座。已经认识到，取决于用于产生F0动物的方法，F0动物中具有人源化TRKB基因座的细胞数量将有所不同。通过例如
Figure BDA0002605767120000521
方法将供体ES细胞从相应的生物体(例如8细胞期小鼠胚胎)导入到桑椹胚前期胚胎中，从而使F0动物的细胞群体的更高百分比包含具有目的核苷酸序列的细胞，所述目的核苷酸序列包含靶定的遗传修饰。例如，至少50％、60％、65％、70％、75％、85％、86％、87％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％,或100％的非人F0动物的细胞贡献可包括具有靶定修饰的细胞群体。
遗传修饰的F0动物的细胞对于人源化TRKB基因座可以是杂合的，或者对于人源化TRKB基因座可以是纯合的。
出于所有目的，上文或下文所引用的所有专利文件、网站、其它出版物、登录号等均以引用的方式整体并入本文，其程度与将每个单独的项目具体并单独地指示为通过引用并入本文的程度相同。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则意指着在本申请的有效申请日与登录号相关联的版本。有效申请日是指实际的申请日或提及登录号的优先权申请(如有的话)的申请日中较早的日期。同样，如果在不同时间发布了出版物，网站等的不同版本，则除非另有说明，是指在本申请的有效申请日最近发布的版本。除非另外明确指出，否则本发明的任何特征、步骤、元素、实施例，或方面可以与任何其它相结合使用。尽管出于清楚和理解的目的已经通过图示和示例的方式对本发明进行了详细描述，但是显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。
序列简述
使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出所附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列遵循从序列5'末端开始并向前(即每行从左到右)到3'末端的标准约定。每个核苷酸序列仅显示一条链，但任何对所示出的链的提及均应理解为包括互补链。当提供编码氨基酸序列的核苷酸序列时，应当理解还提供了其编码相同氨基酸序列的密码子简并变体。氨基酸序列遵循从序列的氨基末端开始并向前(即在每行中从左至右)到达羧基末端的标准约定。
表1：序列描述。
Figure BDA0002605767120000531
Figure BDA0002605767120000541
Figure BDA0002605767120000551
实施例
实施例1：包含人源化TRKB基因座的小鼠的产生。
产生了大靶向载体(LTVEC)，其包含5'同源臂和3'同源臂，所述5'同源臂包含41.6kb的小鼠TrkB基因座，所述3'同源臂包含62.4kb的小鼠TrkB基因座；所述大靶向载体(LTVEC)用于将编码小鼠TRKB细胞外结构域的小鼠TrkB基因的65.7kb的区域替换为74.4kb的相应的人TRKB序列。表2提供了有关小鼠和人TRKB的信息。表3提供了产生大靶向载体的描述。在例如US 6,586,251和Valenzuela et al.(2003)Nat.Biotechnol.21(6):652-659中描述了使用
Figure BDA0002605767120000552
基因工程技术，通过细菌同源重组(BHR)反应产生和使用衍生自细菌人工染色体(BAC)DNA的大靶向载体(LTVEC)，出于所有目的，将其每一篇均通过引用整体并入本文。在例如US 2015/0376628和WO 2015/200334中描述了通过体外组装方法产生LTVEC的方法，出于所有目的将其全部内容通过引用并入本文。
表2：小鼠和人TRKB/NTRK2。
Figure BDA0002605767120000561
表3：大鼠TrkB/Ntrk2大靶向载体。
基因组构建 开始 结束 长度(bp)
5’小鼠臂 GRCm38/mm10 Chr13:58,767,209 Chr13:58,808,821 41,613
人类插入 GRCh38/hg38 Chr9:84,670,730 Chr9:84,745,139 74,409
3’小鼠臂 GRCm38/mm10 Chr13:58,874,563 Chr13:58,936,986 62,424
具体地，从小鼠TrkB位点中删除从外显子2开始(编码外显子1；来自氨基酸32，保留信号肽)到外显子10的区域，包括内含子10的前137个碱基对以及外显子2和10之间(即编码外显子1和外显子10之间)的所有内含子(保留由外显子10和11编码的小鼠跨膜结构域)。在删除的大鼠区域的位置插入了包括外显子2/编码外显子1(来自氨基酸32，在信号肽之后开始)到外显子10的区域(保留由外显子10和11编码的大鼠跨膜结构域)，该区域包括内含子10的前177个碱基对以及外显子2和外显子10之间(即编码外显子1和外显子之间)的所有内含子。
小鼠TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的序列分别在SEQID NO：51-54中列出，相应的编码序列分别在SEQ ID NO：63-66中列出。人TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的序列分别在SEQ ID NO：59-62中列出，相应的编码序列分别在SEQ ID NO：71-74中列出。预期的编码的嵌合TRKB蛋白具有小鼠TRKB跨膜结构域和细胞内结构域、小鼠TRKB信号肽，和人TRKB细胞外结构域。参见图1。图6为小鼠和人TRKB蛋白的比对。小鼠和人TrkB/TRKB编码序列分别示于SEQ ID NO：9和11。小鼠和人TRKB蛋白序列分别示于SEQ ID NO：1和3。预期的嵌合小鼠/人TRKB编码序列和预期的嵌合小鼠/人TRKB蛋白的序列分别在SEQ ID NO：12和4中示出。
为了产生突变的等位基因，将大靶向载体引入F1H4小鼠胚胎干细胞。在抗生素选择后，通过
Figure BDA0002605767120000571
以挑选、扩增，和筛选集落(colonies)。参见图2。进行等位基因丢失测定(loss-of-allele assays)，以检测内源大鼠等位基因的丢失，并使用表4所示的引物和探针进行等位基因获得测定(gain-of-allele assays)，以检测人源化等位基因的获得。
表4.筛选测定。
Figure BDA0002605767120000572
在例如US 2014/0178879；US 2016/0145646；WO 2016/081923；和Frendeweyetal.(2010)Methods Enzymol.476:295-307中描述了包括等位基因丢失(LOA)和等位基因获得(GOA)测定的等位基因修饰(MOA)测定，出于所有目的，通过引用将其每一篇的全部内容合并于此。等位基因丢失(LOA)测定颠倒了传统的筛选逻辑，并量化了突变所针对的天然基因座的基因组DNA样本中的拷贝数。在正确靶向的杂合细胞克隆中，LOA测定检测到两个天然等位基因之一(对于不在X或Y染色体上的基因)，另一个等位基因被靶向修饰破坏。可以将相同的原理反向应用于等位基因获得(GOA)测定，以量化基因组DNA样品中插入的靶向载体的拷贝数。
使用
Figure BDA0002605767120000573
方法产生了F0小鼠。参见，例如，US7,576,259；US 7,659,442；US 7,294,754；US 2008/0078000；和Poueymirou et al.(2007)Nat.Biotechnol.25(1):91-99，出于所有目的，将其每一篇通过引用整体并入本文。在
Figure BDA0002605767120000581
方法中，通过激光辅助注射将靶向的小鼠胚胎干(ES)细胞注入前桑葚胚期(pre-morula stage)的胚胎，例如八细胞期的胚胎，从而有效地产生了完全为ES细胞衍生的F0代小鼠。如下文所述的、在人源化TRKB小鼠中进行的所有实验均在自删除选择盒被自删除的小鼠中进行。
实施例2.H4H9816和同种型对照REGN1945抗体对TrkBhu/hu小鼠(MAID7139)体重和代谢的影响的体内比较
实验过程
为了确定TRKB激动剂抗体H4H9816P2对体重和身体组成的作用，进行了对替代小鼠TRKB受体(TrkBhu/hu小鼠)的人TRKB受体的表达为纯合的小鼠的代谢研究，随后进行一次皮下抗体注射。这些研究部分基于先前对TrkB激动剂和TrkB敲除小鼠的研究而进行。参见，例如，Lin et al.(2008)PLoS ONE 3(4):e1900；Rios et al.(2013)Trends inNeurosciences36(2):83-90；和Zorner et al.(2003)Biol.Psychiatry 54:972-982，出于所有目的，将其每一篇均通过引用整体并入本文。首先将TrkBhu/hu小鼠(雄性，20周龄)从成组笼子转移到单笼壳(single-cage housing)中适应两周。在这段时间之后，将小鼠转移到代谢笼(CLAMS，Columbus Instruments)中，以评估抗体施用后的食物和水消耗、运动、能量消耗，和呼吸的变化。将普通的粉状普通饮食存储在地板室(floor chamber)中的弹簧秤(Mettler Toledo，PL602E)上，以通过普通食物总重量的变化来测量食物消耗。可以通过笼顶式出料槽获得水，并通过跟踪泵管线容积(
Figure BDA0002605767120000582
/CLAMS液体单元)的变化来测量水摄入量。在整个研究过程中，CLAMS代谢笼以连续的16-18分钟间隔测量了这些参数中的每一个。使用
Figure BDA0002605767120000583
/CLAMS软件(Columbus instruments,v5.35)分析单项测量的代谢数据，并每24小时间隔汇总，该24小时间隔包含一个完整的明暗循环。在笼子中适应了两周后，TrkBhu/hu小鼠获得了TRKB激动剂抗体、H4H9816P2，或pH7.2的PBS中的IgG4同种型对照抗体的单次50mg/kg的皮下剂量。一组正常
Figure BDA0002605767120000584
对照TrkBhu/hu小鼠未获得注射。在给药前以及给药后24、48、72、96，和120小时对小鼠称重。为了测量每只小鼠的身体成分，使用EchoMRITM-500分析仪(EchoMRI LLC)进行了核磁共振弛豫法(Nuclear MagneticResonance Relaxometry)，也称为定量磁共振。给药前，将小鼠放在透明的塑料容器中，并插入NMR-MRI设备中，以测量每个对象的瘦体重、脂肪质量，和水合状态(hydrationstatus)。每只小鼠的测量过程长0.5-3.2分钟，并在给药后约120小时再次进行测量。
结果与结论
每天进行体重监测，以确定单次皮下注射H4H9816P2是否在TrkBhu/hu小鼠中引起体重减轻。给药前，三个治疗组的平均体重没有显著差异，每组的平均给药前体重为28.39～29.85g(表5)。然而，在给药后48小时，经H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠平均损失1.70g的体重，即其给药前体重的5.96％。在同一时间点，正常和同种型对照抗体处理的TrkBhu/hu小鼠的增加了其给药前体重的1.79-2.37％。经H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠在整个研究过程中体重持续减轻，在给药后72和96小时，这些小鼠分别平均减轻了其给药前体重的8.42％和11.80％。在给药后120小时，经H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠平均损失了其给药前体重的12.67％。相反，在整个研究过程中，正常和同种型对照处理的TrkBhu/hu小鼠并未展示出给药前体重的任何下降。由于在给药后48、72、96，和120小时，相对于正常和同种型对照，经H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠的体重显著降低，因此确定TRKB激动剂抗体H4H9816P2在TrkBhu/hu小鼠中引起显著的体重减轻。
表5：用TRKB激动剂抗体H4H9816P2给药后的TrkBhu/hu小鼠的体重。
Figure BDA0002605767120000601
指示了通过双向方差分析与Tukey多重比较事后检验(Tukey’s multiple comparisonpost-hoc test)确定的统计学显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001，与同种型对照组相比：给予50mg/kg同种型对照抗体的TrkBhu/hu小鼠。
还通过在给药之前和之后对每个对象进行NMR-MRI来测量TRKB激动剂抗体H4H9816P2注射对身体组成的影响。给药前，TrkBhu/hu小鼠的三个治疗组在脂肪质量或瘦体重方面没有表现出任何显著差异，每组平均有4.19～4.75g脂肪质量和21.32～21.70g瘦体重(表6)。然而，在施用抗体后，在整个研究过程中，用H4H9816P2给药的TrkBhu/hu小鼠平均损失了其总体脂肪质量的48.90％(表6)。用正常和同种型对照抗体处理的TrkBhu/hu小鼠分别平均减少其给药前脂肪质量的8.49％和9.48％，这明显少于H4H9816P2处理的对象(表6)。此外，在整个研究过程中，用H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠平均损失了其瘦体重的7.84％，这明显大于用正常和同种型对照抗体处理后的组的分别为2.41％和1.75％的平均给药前瘦体重损失(表6)。如此，所描述的体重损失可以通过在TrkBhu/hu小鼠中注射TRKB激动剂抗体H4H9816P2之后的脂肪质量的显著损失和瘦体重的适度损失来解释。
表6：用TRKB激动剂抗体H4H9816P2给药后的TrkBhu/hu小鼠的身体组成。
Figure BDA0002605767120000611
指示了通过Kruskal-Wallis单向方差分析与Tukey多重比较事后检验确定的统计学显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001，与同种型对照组相比：给予50mg/kg同种型对照抗体的TrkBhu/hu小鼠。
除了评估TRKB激动剂抗体H4H9816P2注射对TrkBhu/hu小鼠的体重和组成的影响外，还通过代谢笼连续测量进食、饮水，和运动能力。在给药前，TrkBhu/hu小鼠每天平均消耗3.49-3.73g普通饲料。然而，在给药后24小时内，经H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠的食物摄入量显著减少为每天2.20g普通饲料。在整个研究的其余部分中，经H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠的平均食物摄入量每天不超过2.49g普通饲料，而普通和同种型抗体处理的TrkBhu/hu小鼠始终每天平均消耗3.62-4.07g普通饲料(表7)。
类似地，在给药前，治疗组之间的每日耗水量没有显著差异。在每个治疗组中，TrkBhu/hu小鼠平均每天消耗4.67～5.55mL的水(表8)。给药后，经H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠每天的水摄入量减少至2.05～3.24mL。这显著低于正常和同种型对照抗体处理的TrkBhu/hu小鼠，其在整个研究过程中每天持续消耗4.50～5.77mL水(表8)。因此，注射TRKB激动剂抗体H4H9816P2似乎导致TrkBhu/hu小鼠的食物和水摄入相对于正常和同种型对照显著减少。
表7：用TRKB激动剂抗体H4H9816P2给药后的TrkBhu/hu小鼠的食物消耗。
Figure BDA0002605767120000621
指示了通过Kruskal-Wallis单向方差分析与Tukey多重比较事后检验确定的统计学显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001，与同种型对照组相比：给予50mg/kg同种型对照抗体的TrkBhu/hu小鼠。
表8：用TrkB激动剂抗体H4H9816P2给药后的TrkBhu/hu小鼠的水消耗。
Figure BDA0002605767120000622
指示了通过Kruskal-Wallis单向方差分析与Tukey多重比较事后检验确定的统计学显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001，与同种型对照组相比：给予50mg/kg同种型对照抗体的TrkBhu/hu小鼠。
为了确定抗体处理对活性的影响，通过
Figure BDA0002605767120000623
/CLAMS软件(ColumbusInstruments，v5.35)分析运动，该软件连续测量每只小鼠的x平面行走(ambulation)总数。一只小鼠在给药前表现出活动过度，并从给药后统计分析中移出。在整个研究过程中，正常和同种型抗体处理的对象每天平均平均记录11,000-15,000次行走，而H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠在给药后24-48小时之间记录了28,260次行走，在给药后48-72小时之间和72-96小时之间分别记录了21,193和27,028次行走(表9)。H4H9816P2处理的TrkBhu/hu小鼠在施用抗体后的每个时间点记录了更多的总行走计数，表明过度活跃是H4H9816P2注射的另一种作用。结合起来，这些作用表明：TRKB激动剂抗体H4H9816P2的单次皮下注射可在TrkBhu/hu小鼠体内引起体重、身体组成、代谢，和运动的显著变化。
表9：用TrkB激动剂抗体H4H9816P2给药后的TrkBhu/hu小鼠的运动。
Figure BDA0002605767120000631
指示了通过Kruskal-Wallis单向方差分析与Tukey多重比较事后检验确定的统计学显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001，与同种型对照组相比：给予50mg/kg同种型对照抗体的TrkBhu/hu小鼠。
实施例3.在TrkBhu/hu小鼠(MAID 7139)中进行立体定向注射后，TRKB激动剂抗体H4H9816P2和IgG4同种型对照REGN1945对大脑中TRKB磷酸化的影响的体内比较
实验步骤
酪氨酸受体激酶B(TRKB)通过其配体脑源性神经营养因子(BDNF)在细胞外受体域的结合而被激活，从而诱导细胞内受体域中酪氨酸残基的二聚化和自磷酸化以及随后的细胞质信号通路活化。参见，例如，Haniu et al.(1997)J.Biol.Chem.272(40):25296-25303and Rogalski et al.(2000)J.Biol.Chem.275(33):25082-25088，出于所有目的，将每一篇均通过引用整体并入本文。为了确定TRKB激动剂抗体H4H9816P2对TRKB激活动力学的影响，在对嵌合小鼠/人TRKB受体纯合的小鼠中进行了直接海马注射后TRKB磷酸化的时程研究，在该小鼠中，细胞外结构域已被人源化(MAID 7139)(称为TrkBhu/hu小鼠)。对TrkBhu /hu mice小鼠(N＝48)进行了双侧立体定向注射，分别向海马，后部-2mm，前囟点外侧+1.5mm注射2μL的溶媒(vehicle)(PBS)，此处作为IgG4同种型对照抗体的REGN1945(终浓度27.5mg/mL)，或TRKB激动剂抗体H4H9816P2(终浓度27.5mg/mL)。为了最大程度地减少组织损伤，在5分钟的间隔内逐渐进行注射和拔针。然后在注射后约30分钟、1小时、4小时，或18小时通过CO2安乐死处死TrkBhu/hu小鼠。通过心脏穿刺进行终末流血以收集血液，然后用冷的肝素盐水对小鼠进行穿心灌注。小心地从颅骨中取出大脑，解剖注射部位周围2mm3的组织切片，收集在Eppendorf管中并保存在冰上。然后将大脑切片在含有2x蛋白酶和磷酸酶抑制剂(ThermoFisher Scientific，目录号78444)的300μLRIPA裂解缓冲液(ThermoFisherScientific，目录号89901)中裂解，并保存在冰上。然后将裂解的组织匀浆以进行进一步处理，等分并保存在-80℃下。
为了评估脑组织中的TRKB磷酸化，进行了免疫沉淀和蛋白质印迹。将不竞争与H4H9816P2的结合的抗人TRKB抗体H4H10108N偶联至NHS活化的琼脂糖珠(使用制造商的说明制备；GE Healthcare，目录号17-0906)，并用DPBS洗涤三遍，以除去任何残留的防腐液。将均质的脑裂解液在冰上融化，并在由TBST中的1％NP-40、0.1％Tween-20、蛋白酶和磷酸酶抑制剂组成的缓冲剂中稀释至浓度为1mg/mL(脑重量/缓冲剂体积)。按照制造商的说明(Thermo Scientific Pierce，目录号23225)，通过执行标准的BCA分析，对均质化的脑裂解液的蛋白质浓度进行定量。对于每100μg的蛋白质，将15μL的抗人TRKB抗体(H4H10108N)NHS活化的琼脂糖珠添加到脑裂解液中，并将混合物在4℃下以20rpm缓慢摇动(Thermorotator)孵育过夜。第二天，将样品以1000x g离心一分钟，然后小心地除去上清液。随后，将珠子用含1％Tween-20(Sigma Aldrich，目录号P9416)(TBST)的400μL Tris缓冲盐水(Bio-Rad，目录号1706435)洗涤两次。在小心吸出洗涤缓冲液后，将60μL的pH 3.0的溶于水中的0.1％三氟乙酸(TFA；Sigma-Aldrich，T62200)加入到每个样品中。将溶液混合并静置两分钟，然后收集并转移到单独的试管中。用另外的60μL，pH为3.0的0.1％TFA重复该过程。然后将每个样品的两种0.1％TFA溶液合并，并加入2μL，pH 8.5的1M Tris-HCl(ThermoFisher Scientific，目录号15567-027)。
使用高速真空干燥溶液，然后将其重新悬浮，并用20μL 1x Laemmli缓冲剂(Bio-Rad，目录号1610737)和355nM 2-巯基乙醇(BME；Gibco，目录号21985-023)的混合物还原。将样品在95℃下煮沸10分钟，然后加样到10孔Mini-Protean 4-15％Tris-甘氨酸凝胶(Bio-Rad，目录号4561086)上。电泳后，在30分钟间以1.3A和25V的恒定速率将蛋白质样品通过Trans-Blot Turbo转移系统(Bio-Rad，目录号1704156)从Tris-甘氨酸凝胶转移到PVDF膜(Bio-Rad，目录号170-4156)上。转移后，在室温下，用TBST中的2.5％牛奶(Bio-Rad，目录号170-6406)封闭膜1小时，随后用在2.5％BSA溶液中以1：1000稀释的抗磷酸TRKB抗体(Novus，目录号NB100-92656)或在2.5％牛奶TBST中以1：1000稀释的抗TRKB一级抗体(CellSignaling，目录号4603)，于4℃和30rpm的振动器上探针过夜(probed overnight)。第二天，用TBST洗涤印迹，并在室温下以1：1000在TBST的1％牛奶中将其和与辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体(Jackson，目录号111-035-144)一起孵育1小时。然后再次洗涤印迹，用ECL溶液(PerkinElmer，Inc.，目录号RPN2106)显影，然后每30秒进行随后的图像曝光。
结果与结论
免疫沉淀和随后对衍生自TrkBhu/hu小鼠脑裂解物的蛋白质的蛋白质印迹表明，在注射TRKB激动剂抗体H4H9816P2的小鼠中可检测到海马TRKB磷酸化，但在用溶媒或同种型对照抗体处理的小鼠中未检测到，如图3所示。在所评估的时间点中，在向小鼠立体定向注射H4H9816P2后的4小时，小鼠的TRKB磷酸化达到峰值。在一些但非全部小鼠中，在给药后18小时也通过蛋白质印迹检测到TRKB磷酸化。相反，注射溶媒和IgG4同种型对照抗体在任何时间点都不会诱导TRKB磷酸化。蛋白质印迹还表明，相对于溶媒和同种型对照处理的小鼠，在一些但并非所有用H4H9816P2给药的TrkBhu/hu小鼠中的总TRKB受体水平被下调。在给药后18小时，在H4H9816P2处理的对象中的总TRKB水平似乎略有下调。因此，这些结果表明直接注射TRKB激动剂抗体H4H9816P2在TrkBhu/hu小鼠中诱导海马TRJB受体的磷酸化。
实施例4：在来自出生后第1天的TrkBhu/hu小鼠的原代皮层神经元中通过TrkB激动剂抗体激活下游信号通路
实验步骤
所有程序均根据《在眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明》(the ARVOStatement for Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)和瑞泽恩制药公司的IACUC进行。从人源化TrkB小鼠(MAID 7139)分离并培养原代小鼠皮层神经元。参见，例如，Beaudoin et al.(2012)Nat.Protoc.7(9):1741-1754，出于所有目的通过引用整体并入本文。进行了蛋白质印迹，以确定TrkB激动剂抗体对Akt和Erk下游通路(p-Akt，p-Erk1/2)的影响。将来自出生后第1天(P1)的人源化TrkB小鼠幼崽的原代皮质神经元在补充了GS21神经补充剂(Global Stem，目录号GSM-3100)、Glutamax(Invitrogen，目录号35050-061)和青霉素/链霉素的NeuralQ基础培养基(Global Stem，目录号GSM-9420)中培养4天(DIV-4)。用TrkB激动剂抗体H4H9816P-L1(10μg/mL)、TrkB激动剂抗体H4H9780P-L1(10μg/mL)、TrkB激动剂抗体H4H9814P-L1(10μg/mL)、IgG4同种型对照REGN1945(10μg/mL)、对照抗体H1M8037C-L1(10μg/mL)，或BDNF(1μg/mL)处理细胞15分钟或2小时。进行蛋白质印迹以确定激动剂在下游信号传导维持和强度上是否有差异。将处理过的细胞在含有1％蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma)的冷PBS中冲洗并刮落。通过Bradford蛋白测定(Pierce)确定蛋白浓度。通过SDS-PAGE在3-8％的Tris-醋酸盐还原凝胶(Novex)中分离样品(50μg)，并转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。
将膜在包含5％牛奶和0.1％Tween-20，pH 7.6的封闭溶液中孵育1小时。随后在包含5％BSA、0.1％Tween-20，和兔抗磷酸Trk(rabbit anti-phosphoTrk)(Cell Signaling，目录号9141，1：500)、兔抗磷酸Akt(Cell Signaling，目录号9271，1：1000)，或兔抗磷酸ERK1/2抗体(Sigma，目录号E7028，1：5000)的封闭缓冲液中于4℃孵育过夜。随后，通过和与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗山羊、小鼠，或兔IgG孵育，然后用化学发光底物对HRP(Pierce)进行显影，从而可视化标记的蛋白。为了确定每条通路中存在的总TrkB、MAPK，或Akt的量，将硝酸纤维素膜上的抗体在剥离缓冲液(Pierce)中剥离20分钟，然后与兔抗TrkB(Cell Signaling，目录号4603，1：1000)、兔抗Erk1/2(Cell Signaling，目录号06-182，1：1000)，或兔抗Akt抗体(Cell Signaling，目录号9272，1：1000)孵育，然后按照上文所述可视化。β肌动蛋白(Sigma，目录号A5316，1：20000)和GAPDH(Sigma，目录号G9295)作为样品上样对照探测。
材料
表10：mAB克隆ID。
Figure BDA0002605767120000671
表11：试剂。
Figure BDA0002605767120000681
表12：Neurobasal培养基。
NeuralQ基础培养基(Global Stem,GSM-9420)50mL
GS21神经补充剂(50X)(Global Stem,GSM-3100)10mL
Glutamax(Invitrogen,35050-061)0.5mL
青霉素/链霉素5mL
表13：抗体。
H4H9816P批次1(10μg/mL)
H4H9780P批次1(10μg/mL)
H4H9814P批次1(10μg/mL)
REGN1945人IgG4批次1(10μg/mL)
C2 H1M8037C批次1(10μg/mL)
表14：蛋白质印记。
p-Trk(Cell Signaling,9141)Rb,1:500
总TrkB(Cell Signaling,4603)Rb 1:1000
p-Akt(Cell Signaling,9271)Rb 1:1000
总Akt(Cell Signaling,9272)Rb 1:1000
p-Erk1/2(Sigma,E7028)1:5000
总Erk1/2(Cell Signaling,06-182)Rb 1:1000
b肌动蛋白(Sigma,A5316)Ms 1:20000
GAPDH(Sigma,G9295)HRP偶联1:20000
结果和结论
如图7所示，尽管所有TrkB激动剂抗体在孵育后15分钟时都显示出MAPK/ERK和PI3K/Akt途径的激活，但只有BDNF和H4H9814P表现出TrkB磷酸化。在孵育后2小时时，所有TrkB激动剂抗体均显示TrkB激活。
实施例5：人源化TrkB和野生型小鼠中抗TrkB抗体的药代动力学评估
实验步骤
对抗TrkB抗体H4H9816P2(批次H4H9816P2-L7)的药代动力学评估是在人源化TrkB(对嵌合小鼠/人TrkB表达纯合的小鼠，TrkBhu/hu)(MAID7139)和野生型(WT)小鼠中进行的。同龄组(cohorts)包含每个小鼠品系5只小鼠。所有小鼠接受单次皮下(SC)10mg/kg剂量。在给药后6小时和1、2、3、6、9、16、21，和30天收集血样。将血液处理成血清，并在-80℃下冷冻直至进行分析。
使用GyroLabxPloreTM(Gyros，Uppsala，瑞典)，通过总人IgG4/hIgG1抗体分析，确定循环抗体浓度。简而言之，在GyrolabBioaffy 200CD上捕获在抗体稀释缓冲液(0.05％Tween-20+PBS)中稀释至100μg/mL的生物素化小鼠抗人IgG4/IgG1特异性单克隆抗体(REGN2567；批次RSCH15088)。GyrolabBioaffy 200CD包含预装有链霉抗生物素蛋白包被的珠子(DynospheresTM)的亲和柱。该测定中用于校准的标准是H4H9816P，其在含有0.1％正常小鼠血清(NMS)的稀释缓冲液(0.5％BSA+PBS)中的浓度为0.488至2000ng/mL。将血清样品在抗体稀释缓冲液中以1：100稀释。通过加入稀释于检测缓冲剂(Rexxip F缓冲剂)的0.5μg/mL Alexa-647偶联的小鼠抗人kappa单克隆抗体(REGN654；批次RSCH13067)，检测到在室温下运行的CD上抗REGN2567包被的亲和柱上捕获的人IgG；并通过GyroLabxPlore仪器将所得的荧光信号记录在响应单位(RU)中。通过使用Gyrolab Evaluator软件，使用5参数逻辑曲线拟合(5-parameter logistic curve fit)拟合的标准曲线，通过插值(interpolation)确定样品浓度。将来自两次重复实验的平均浓度用于随后的PK分析。
使用
Figure BDA0002605767120000701
软件版本6.3(Certara，L.P.，Princeton，NJ)和血管外给药模型，通过非房室分析(NCA)确定PK参数。使用每种抗体各自的平均浓度值，所有PK参数(包括观察到的血清中最大浓度(Cmax)、观察到的估计半衰期(t1/2)，以及浓度曲线下的面积与达到最后可测量浓度(AUClast)的时间的关系)均通过使用具有线性插值和均匀加权的线性梯形法则确定。
结果与结论
在10mg/kg s.c抗TrkB抗体H4H9816P2的给药之后，在第1天或第2天，在TrkBhu/hu和WT小鼠中观察到相似的抗体的最大浓度(Cmax)(分别为135μg/mL和131μg/mL)。到第9天，H4H9816P2在TrkBhu/hu小鼠中显示出比在野生型小鼠中更为陡峭的药物清除，表明靶标介导的效果。在第30天，TrkBhu/hu小鼠中的抗体浓度低约35倍。WT小鼠中H4H9816P2的抗体暴露(AUClast)比TrkBhu/hu中小鼠所见的高约1.7倍(分别为1730d*μg/mL和1020d*μg/mL)。与TrkBhu/hu小鼠相比，WT小鼠的半衰期(T1/2)也提高了约3倍(分别为8.4天和2.9天)。
表15总结了总抗TrkB抗体浓度的数据总结，表16描述了平均PK参数，图8示出了平均总抗体浓度与时间的关系。在图8中，在第0天给小鼠皮下注射10mg/kg的单剂量。使用Gyros免疫测定测量血清中总H4H9816P2的浓度。给药后6小时，1、2、3、6、9、16、21，和30天的数据点指示抗体的平均浓度。H4H9816P2的总抗体浓度表示为TrkBhu/hu小鼠的实心圆和野生型小鼠的实心方块。数据绘制为平均值±SD。
表15：在TrkBhu/hu和野生型小鼠中单次以10mg/kg皮下注射H4H9816P2后，随时间推移血清中总IgG的平均浓度(±SD)。
Figure BDA0002605767120000711
缩写：时间＝单剂量注射后的天数；d＝研究天；SD＝标准偏差。
表16：药代动力学参数的总结。
Figure BDA0002605767120000712
PK参数由平均浓度与时间的关系曲线得到。T1/2和AUClast基于直到第30天的浓度。
缩写：Cmax＝峰值浓度；AUC＝浓度-时间曲线下的面积；AUClast＝从时间零到最后一次正浓度的时间所计算的AUC；T1/2＝清除的末端半衰期。
实施例6：包含人源化TRKB基因座的大鼠的产生
产生了包含5'同源臂和3'同源臂的大靶向载体，以用相对应的TRKB人序列的74.4kb替换编码大鼠TRKB细胞外结构域的大鼠TrkB基因中68.5kb的区域；所述5'同源臂包含7kb大鼠TrkB基因座，所述3'同源臂包含47kb大鼠TrkB基因座。使用
Figure BDA0002605767120000722
基因工程技术，通过细菌同源重组(BHR)反应，从细菌人工染色体(BAC)DNA衍生的大靶向载体(LTVEC)的产生和使用描述于，例如，US 6,586,251和Valenzuela et al.(2003)Nat.Biotechnol.21(6):652-659，出于所有目的，将其每一篇均通过引用整体并入本文。例如在US 2015/0376628和WO 2015/200334中描述了通过体外组装方法产生LTVEC，出于所有目的将其每一篇均通过引用整体并入本文。表17提供了大鼠和人TRKB的信息。表18提供了产生大靶向载体的描述。
表17：大鼠和人TRKB/NTRK2。
Figure BDA0002605767120000721
表18：大鼠TrkB/Ntrk2大靶向载体。
基因组版本 开始 结束 长度(bp)
5’大鼠臂 RGSC 5.0/rn5 Chr17:8,470,615 Chr17:8,463,379 7,236
人类插入 GRCh38/hg38 Chr9:84,670,730 Chr9:84,745,139 74,409
3’大鼠臂 RGSC 5.0/rn5 Chr17:8,394,967 Chr17:8,347,889 47,078
具体地，将从外显子2开始(编码外显子1；来自氨基酸32，保留信号肽)到外显子10的区域，包括内含子10的前50个碱基对以及外显子2和10之间的所有内含子(即在编码外显子1和外显子10之间)从大鼠TrkB基因座中删除(保留由外显子10和11编码的大鼠跨膜结构域)。将包括外显子2/编码外显子1(来自氨基酸32，在信号肽之后开始)到外显子10的区域，包括内含子10的前66个碱基对以及外显子2和10之间(即编码外显子1和外显子10之间)的所有内含子插入删除的大鼠区域的位置(保留外显子10和11编码的大鼠跨膜结构域)。
大鼠TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的序列分别在SEQID NOS：55-58中列出，相应的编码序列分别在SEQ ID NOS：67-70中列出。人TRKB信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域，和细胞质结构域的序列分别在SEQ ID NO：59-62中列出，相应的编码序列分别在SEQ ID NO：71-74中列出。预期的编码的嵌合TRKB蛋白具有大鼠TRKB跨膜和细胞内结构域、大鼠TRKB信号肽，和人TRKB细胞外结构域。参见图4。图6为大鼠和人TRKB蛋白的比对。大鼠和人TrkB/TRKB编码序列分别列于SEQ ID NO：10和11。大鼠和人TRKB蛋白序列分别示于SEQ ID NO：2和3。预期的嵌合大鼠/人TRKB编码序列和预期的嵌合大鼠/人TRKB蛋白的序列分别在SEQ ID NO：13和5中列出。
为了产生突变的等位基因，将包括四个指导RNA(SEQ ID NO：41-44中列出的指导RNA靶序列)的CRISPR/Cas9组分与大靶向载体一起引入大鼠胚胎干细胞中。具体地，用以下物质电穿孔4x 106个大鼠ES细胞(Dark Agouti品系DA2B)：2mg TrkB LTVEC；5mg Cas9表达质粒；和分别为5mg的以下gRNA：gU、gU2、gD，和gD2。电穿孔条件为：400V电压；100mF电容；和0W电阻。使用浓度为75mg/mL的G418进行抗生素选择。通过
Figure BDA0002605767120000731
挑选、扩增，和筛选集落。参见图5。进行等位基因丢失测定，以检测内源大鼠等位基因的丢失，进行等位基因获得测定(gain-of-allele assays)以检测人源化等位基因的获得，并使用表19所列出的引物和探针组进行CRISPR和保留测定(retention assays)。
表19：筛选测定。
Figure BDA0002605767120000741
例如，在US 2014/0178879；US 2016/0145646；WO 2016/081923；和Frendeweyetal.(2010)Methods Enzymol.476:295-307中描述了包括等位基因丢失(LOA)测定和等位基因获得(GOA)测定的等位基因修饰(MOA)测定，出于所有目的将其每一篇均通过引用整体并入本文。等位基因丢失(LOA)测定颠倒了传统的筛选逻辑，并量化了突变所针对的天然基因座的基因组DNA样本中的拷贝数。在正确靶向的杂合细胞克隆中，LOA测定检测到两个天然等位基因之一(对于不在X或Y染色体上的基因)，另一个等位基因被靶向修饰破坏。可以将相同的原理反向应用于等位基因获得(GOA)测定，以量化基因组DNA样品中插入的靶向载体的拷贝数。
保留测定描述于US 2016/0145646和WO 2016/081923中，出于所有目的，将其各自通过引用整体并入本文。保留测定通过评估来自分别与靶向载体的5'和3'同源臂相对应的5'和3'靶序列的DNA模板的复制数量，以区分核酸插入物插入靶基因组位点的正确靶向插入与核酸插入物插入靶基因组位点外的基因组位置的随机转基因插入。具体而言，保留测定确定意图保留在修饰的靶基因组基因座中的5'靶序列DNA模板的基因组DNA样本中的拷贝数和/或意图保留在修饰的靶基因组基因座中的3'靶序列DNA模板。在二倍体细胞中，正确靶向的克隆将保留两个拷贝。拷贝数大于2通常表明随机地在靶基因组位点之外(而非在靶基因位点处)的靶向载体的转基因整合。拷贝数小于2通常表明大的删除，其延伸超出了靶向删除的区域。
CRISPR测定是设计为覆盖被CRISPR gRNA破坏的区域的
Figure BDA0002605767120000751
测定。当CRISPR gRNA切割并产生得失位(indel)(插入或缺失)时，
Figure BDA0002605767120000752
测定将无法扩增，从而报告CRISPR裂解。
将阳性克隆CB1解冻、扩增，并通过
Figure BDA0002605767120000753
再确认。还从人替换序列的5'末端到侧接的大鼠基因组序列，超出5'同源臂的末端进行了成功的PCR，从而证实了CB1。通过末端的测序，确认PCR扩增子是正确的。
使用US 2014/0235933、US 2014/0310828、WO 2014/130706，和WO 2014/172489中描述的方法产生F0和F1大鼠，出于所有目的将其每一篇全部内容通过引用并入本文。在这种方法中，将已确认的靶向大鼠ES细胞克隆(例如Dark Agouti ES细胞克隆)显微注射到胚泡(例如Sprague Dawley(SD)胚泡)中，然后将其转移到假孕(pseudopregnant)受体雌性(例如SD受体雌性)中，以使用标准技术进行妊娠。识别嵌合体(例如通过包被颜色)，并将雄性F0嵌合体繁殖到相同品系的雌性野生型大鼠(例如SD雌性)。然后对种系(例如刺鼠(agouti))F1幼仔进行基因型分型，确定是否存在靶定等位基因。如下所述在人源化TRKB大鼠中进行的所有实验均在其中的自删除选择盒被自删除的大鼠中进行。
实施例7：TRKB激动剂抗体H4H9816P2和IgG4同种型对照REGN1945对视网膜神经节细胞(RGC)存活TrkBhu/hu大鼠的作用的体内比较
实验步骤
所有程序均根据《在眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明》和瑞泽恩制药公司的IACUC进行。使用8-10周龄的成年雌性TrkB人源化大鼠(MAID100010)，每只体重200-250g。大鼠上的所有外科手术均在全身麻醉下腹膜内注射氯胺酮(63mg/kg)和甲苯噻嗪(6.0mg/kg)进行。施用含有红霉素(0.5％，Bausch&Lomb)的眼药膏用于保护角膜。
眶内视神经切断术和玻璃体内注射。左视神经(ON)眶内暴露，其硬膜(dura)被打开。在球后方约1.5毫米处横断ON。注意避免损害视网膜的血液供应。玻璃体腔内注射是在睫状体平坦部(pars plana)后方进行的，使用连接到50μL Hamilton注射器的玻璃吸管。注意不要损坏镜头。将具有任何重大术后并发症(例如视网膜缺血、白内障)的大鼠从进一步的分析中排除。将动物分配到不同的实验组。一个对照组接受了3μL同种型对照REGN1945(46.6μg/μL)的玻璃体内注射。另一组在ON轴切术后第3天和第10天接受了3μL抗人TRKB抗体H4H9816P2(45.7μg/μL)的注射。
活视网膜神经节细胞(RGC)的免疫组织化学染色和计数。BRN3A(脑特异性同源盒/POU结构域蛋白3A)被用作存活的视网膜神经节细胞(RGC)的标志物，因为它已被证明是一种在ON受伤后对视网膜铺片(retinal whole mounts)中的活RGC进行选择性标记的有效、可靠的方法。参见，例如，Nadal-Nicolás et al.(2009)Invest.Ophthalmol.Vis.Sic.50(8):3860-3868，出于所有目的通过引用整体并入本文。为了对BRN3A进行免疫染色，将视网膜在10％正常驴血清和0.5％Triton X-100中封闭1小时，然后与BRN3A抗体在相同的培养基中(1：400；目录号：sc-31984，圣克鲁斯)，在室温下孵育2小时。在进一步洗涤之后，将视网膜与Alexa594偶联的驴抗山羊二抗(1：400；目录号：A-11058，Invitrogen)在4℃下孵育过夜。
结果与结论
为了评估TRKB激动剂抗体对体内RGC存活的影响，我们使用了完全视神经横断模型。在手术后第3天和第10天施用TRKB激动剂抗体(H4H9816P2)或同种型对照抗体。轴切术后14天对动物实施安乐死。如表20所示，未受伤的对侧眼的RGC密度在三种TRKB基因型(纯合人源化、杂合人源化，和野生型)中相似，平均约为1600/mm2。施用BRN3A染色，在视网膜铺片中评估存活的RGC的密度。我们发现，在纯合TrkBhu/hu人源化大鼠中，TRKB激动剂抗体(H4H9816P2)与对照组相比显著(p<0.01，Mann-Whitney测试)增加RGC存活(每mm2685±106vs.255±66RGCs)。在杂合TrkBhu/+人源化大鼠中，也具有显著的(p<0.05，Mann-Whitney检验)TrkB激动剂Ab的存活效应(每mm2444±90vs.208±50RGCs)。在野生型大鼠中，与同种型对照相比，用TRKB激动剂抗体处理的大鼠中的RGC数量略有增加，但不显著(表21)。总之，TRKB激动剂抗体(H4H9816P2)显著提高了TrkBhu/hu人源化大鼠中的RGC存活。
表20：未受伤的对照眼中的RGC定量(RGCs/mm2)。
hu/hu hu/+ +/+
1637.3 1720.4 1636.3
1551.5 2064.6 1670.2
1651.4 1738.8 1873.4
1628.2 2029.8 1725.4
1804.7 1929.6 1973.4
1741.3 1645.9
1739.7 1761.5
1698.8 1787.5
1862.5 1914.0
1779.4
表21：视神经损伤后的RGC定量(RGCs/mm2)。
Figure BDA0002605767120000771
实施例8：实施例中所使用的抗TRKB抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列。
在实施例中测试了几种完全人抗TRKB抗体(即具有人可变域和人恒定域的抗体)，包括命名为H4H9780P、H4H9814P，和H4H9816P2的那些。表22列出了实施例中使用的选定的抗TRKB抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。表23列出了在实施例中使用的选定的抗TRKB抗体的重链和轻链可变区和CDR的核酸序列标识符。这些抗体在2018年11月28日提交的美国专利申请号16/202,881中进行了更详细的描述，出于所有目的，通过引用将其全文并入本文。
表22：抗TRKB抗体的氨基酸SEQ ID NO。
Ab名称 VH HCDR1 HCDR2 HCDR3 VK LCDR1 LCDR2 LCDR3
H4H9780P 79 81 83 85 87 89 91 93
H4H9814P 95 97 99 101 103 105 107 109
H4H9816P2 111 113 115 117 119 121 123 125
表23：抗TRKB抗体的核酸SEQ ID NO。
Ab Name VH HCDR1 HCDR2 HCDR3 VK LCDR1 LCDR2 LCDR3
H4H9780P 78 80 82 84 86 88 90 92
H4H9814P 94 96 98 100 102 104 106 108
H4H9816P2 110 112 114 116 118 120 122 124
抗体在本文中通常根据以下命名法提及：Fc前缀(例如“H4H”)，后跟数字标识符(例如“9780”、“9816”等，如表22所示)，后跟“P”或“P2”后缀。抗体名称中的H4H前缀表示抗体的特定Fc域同种型。因此，根据该命名法，抗体在本文中可以被称为，例如，“H4H9780P”，其指示人IgG4Fc区域。如果在抗体名称中用第一个的“H”表示，则可变区是完全人类的。如本领域普通技术人员将理解的，可以将具有特定Fc同种型的抗体转化为具有不同Fc同种型的抗体(例如，可以将具有小鼠IgG1 Fc的抗体转化为具有人IgG4的抗体等)，但无论如何，可变域(包括CDR)(由表22中示出的数字标识符表示)将保持不变，并且无论Fc结构域的性质如何，预期与抗原的结合特性相同或实质上相似。
实施例9：抗人TrkB激动剂抗体在人源化TrkB大鼠中的神经保护作用
进行以下实验以评估野生型(WT)小鼠和大鼠以及人源化TrkB小鼠和大鼠中的内源TRKB激动剂、脑源性神经营养因子(BDNF)，和TRKB激动剂单克隆抗体(mAb)的神经保护作用。
使用分化的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，通过细胞存活测定定量BDNF和TRKBAb的体外作用。在体外，BDNF或TRKB Ab显著提高了视黄酸分化的SH-SY5Y细胞的细胞存活。该效应显示出钟形的剂量响应，BDNF的最佳剂量为1μg/mL，TRKB Ab的最佳剂量为10μg/mL。将神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y在含有全反式(all-trans)10μM视黄酸的分化培养基中培养4天。将培养物更换为包含不同剂量抗体(0.01-100μg/mL)的无血清分化培养基。两天后，加入CCK8试剂，将板孵育3-4小时，并测量OD450以确定存活细胞的百分比。将数据标准化为无抗体的无血清培养基。如图9所示，TRKB mAb(TrkB mAb1是H4H9816P2；TrkB mAb2是对照TrkB激动剂抗体)剂量依赖性地增加了SH-SY5Y细胞的存活。人同种型对照对SH-SY5Y细胞存活没有影响。无抗体的无血清培养基导致100％存活。
然后解剖并分离来自P2 C57BL/6J小鼠的视网膜。通过免疫淘选(immuno-panning)纯化视网膜神经节细胞，并在96孔板中进行处理或不进行处理地培养。24小时后，将MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐加入每个孔中，以计算每个组的细胞存活。如图10所示，BDNF具有钟形的响应曲线，最佳剂量为1μg/mL。TrkB mAb2(对人TrkB、小鼠TrkB，和大鼠TrkB具有亲和力的对照TrkB激动剂抗体)在较高剂量下也可能具有钟形曲线，但显示出神经保护作用。
为了测试体内神经保护作用，使用WT和人源化TrkB小鼠和大鼠。在视神经横断(ONT)后的第3天和第10天，动物接受玻璃体内(IVT)注射的BDNF或TRKB mAb。在视网膜平铺片(retinal flat mounts)上通过Brn3a IHC横断视神经后，使用HALO软件(Indica Labs)在对于小鼠为第1周或对于大鼠为第2周时定量视网膜神经节细胞(RGC)。
在视神经横断后1或2周，TrkBhu/hu小鼠中的RGC死亡与WT小鼠相似。BDNF或TRKB Ab在WT或TrkBhu/hu小鼠中几乎没有或没有明显的神经保护作用。相反，在具有IVT TRKB Ab的TrkBhu/hu大鼠中，RGC神经保护显著。在IVT TRKB Ab处理后，在TrkBhu/hu小鼠中观察到体重降低，但在大鼠中未观察到。BDNF对小鼠或大鼠的体重均无影响。
图11A和11B示出了评估WT小鼠和大鼠中的视神经横断模型中的神经保护的实验结果。在图11A中，在横断后第3天和第10天，玻璃体内给予8-9周大的Dark Agouti大鼠BDNF(5μg)、TrkB mAb2(18μg)、同种型对照抗体(18μg)，或溶媒对照。TrkB mAb2是对人TrkB、小鼠TrkB，和大鼠TrkB具有亲和力的对照TrkB激动剂抗体。横断14天后解剖视网膜并染色视网膜神经节细胞。BDNF和TRKB mAb显示出显著的、通过视网膜神经节细胞(RGC)密度测量的神经保护。在图11B中，在横断后第3天和第10天时，玻璃体内给予8周大的C57BL/6J WT小鼠BDNF(2.5μg)、TrkB mAb2(10μg)、同种型对照抗体(10μg)，或溶媒对照。TrkB mAb2是对人TrkB、小鼠TrkB，和大鼠TrkB具有亲和力的对照TrkB激动剂抗体。没有显著的神经保护。因此，BDNF和TRKB mAb处理导致视神经横断后野生型大鼠中的解剖视网膜中RGC密度的显著增加，而在野生型小鼠的同一模型中未观察到对RGC密度的显著影响。
图12A和12B示出了WT小鼠和大鼠中的BDNF剂量反应。在图12A中，WT小鼠的视神经粉碎(ONC)模型中的BDNF剂量反应显示了小窗口的神经保护。图12B示出了在WT大鼠的视神经横断模型中的BDNF剂量响应为0.13μg至30μg。存在类似于体外数据的钟形响应，最佳剂量为0.8μg。在横断14天后解剖视网膜并染色视网膜神经节细胞。因此，在视神经横断后，与视神经粉碎后的野生型小鼠的解剖的视网膜中的RGC密度所测量的较不明显的BDNF剂量响应曲线相比，BDNF处理导致野生型大鼠的解剖的视网膜中的RGC密度所测量的剂量响应曲线更为明显。
接下来在人源化TrkB大鼠中测试TRKB Abs的神经保护作用。图13A和13B中的结果表明，在视神经横断的人源化TrkB大鼠中玻璃体注射TRKB mAb显示出对视网膜神经节细胞的显著神经保护。在视神经横断后第3天和第10天，向人TRKB纯合子、人TRKB杂合子，或野生型TrkB大鼠玻璃体内给予TrkB mAb1或同种型对照抗体(3μL)。在横断14天后，解剖视网膜并为RGC染色。大鼠是17-19周龄的雌性。如图13A所示，与用同种型对照抗体处理的相应大鼠相比，用TrkB mAb1(H4H9816P2)处理的大鼠在所有三种基因型中均表现出神经保护。同种型对照处理的人TRKB纯合和杂合的大鼠的RGC密度高于同种型对照处理的野生型大鼠。图13B示出基因型之间的RGC数在未处理的眼(
Figure BDA0002605767120000812
eyes)中没有差异。图13C显示了给予TrkB激动剂抗体(H4H9816P2)或同种型对照抗体(REGN1945)的人TRKB纯合小鼠在横断后14天的体重。
然后创建大鼠视网膜铺面RGC等密度图，其示出了三种基因型的未受伤的和处理的受伤眼睛的Brn3a标记的的细胞(数据未显示)。借助在荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti)上的电动载物台(motorized stage)进行铺面重建。使用图像分析软件(
Figure BDA0002605767120000811
IndicaLabs，科拉尔斯，NM，USA)对RGC进行计数。等密度图是通过Matlab生成的。与同种型对照处理的大鼠相比，在用TrkB mAb1(H4H9816P2)处理的人源化TrkB大鼠处观察到更高的RGC密度(数据未显示)。
综上所述，图11A、11B、12A、12B，和13A-13C中示出的数据表明，玻璃体内给药TRKB激动剂mAb在人源化TrkB大鼠视神经损伤后具有显著的神经保护作用；与之相对的是在人源化TrkB小鼠视神经损伤后观察到的很小的神经保护作用或没有显著的神经保护作用。
为了进一步评估TRKB激动剂抗体对视神经横断(ONT)模型中大鼠中的RGC存活的影响，进行了剂量响应研究。使用1-9个月大的人TRKB纯合大鼠(MAID100010；75％SD，25％DA)。每组使用六只大鼠。在视神经横断后第3天和第10天，向TRKB纯合大鼠玻璃体内(3μL)给予不同剂量的TrkB mAb1或同种型对照抗体(REGN1945)。在横断后14天，解剖视网膜并RGC染色。如图14所示，TrkB mAb1剂量依赖性地提高了TrkB人源化大鼠中RGC的存活。
接下来，在视神经横断(ONT)模型中，在人TRKB纯合大鼠中比较了不同的TrkB激动剂抗体的神经保护作用。使用8-10周龄的人源化TrkB大鼠(MAID100010；75％SD，25％DA)。每组使用五至六只大鼠。在视神经横断后第3天和第10天，向人TRKB纯合大鼠玻璃体内(3μL)给予H4H9816P2-L9(10μg)、H4H9814P-L9(10μg)、H4H9780P-L5(10μg)，所有三者的组合(各3.3μg)，或同种型对照抗体(REGN1945；10μg)。在横断14天后，解剖视网膜并RGC染色。结果示于图15A和15B中。与同种型对照抗体相比，每种TrkB激动剂抗体均具有神经保护作用。每组的体重相似(数据未显示)。
与此相对，TrkB激动剂抗体H4H9780P和H4H9814P在野生型大鼠中没有任何神经保护作用。使用视神经横断(ONT)模型评估了野生型大鼠的神经保护作用。使用8-10周龄的雌性野生型大鼠。每组使用五至六只大鼠。在视神经横断后第3天和第10天，向野生型大鼠玻璃体内(3μL)给予H4H9780P(120μg)、H4H9814P(120μg)，或同种型对照抗体(REGN1945；120μg)。横断14天后，解剖视网膜并RGC染色。如图16所示，TrkB激动剂抗体均未在野生型大鼠中具有明显的神经保护作用。
此外，TrkB激动剂抗体(H4H9780P)在人TRKB纯合小鼠中不具有神经保护作用。使用5个月大的雄性人TRKB纯合小鼠(MAID7139；75％C57BL/6，25％129)。每组使用五至六只小鼠。在视神经横断后第3天和第10天，向人TRKB纯合小鼠玻璃体内(1μL)给予H4H9780P(每只眼40μg)或同种型对照抗体(REGN1945；每只眼40μg)。横断14天后，解剖视网膜并RGC染色。如图17A和17B所示，与在人TRKB纯合大鼠中看到的神经保护作用相反，TrkB激动剂抗体在人TRKB纯合小鼠中没有神经保护作用。图17C示出了在横断后14天给予H4H9780P或同种型对照抗体的人TRKB纯合小鼠的体重。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 包含人源化TRKB基因座的非人动物
<130> 57766-523380
<150> US 62/592,905
<151> 2017-11-30
<150> US 62/661,373
<151> 2018-04-23
<160> 125
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 821
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 信号肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(429)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (430)..(453)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (454)..(821)
<223> 细胞质结构域
<400> 1
Met Ser Pro Trp Leu Lys Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ser Ala Arg Ile Trp Cys Thr Glu Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala Tyr Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Arg His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Arg His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Asp Leu Ile
130 135 140
Leu Thr Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Leu Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Met Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
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210 215 220
Leu Pro Thr Leu Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
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Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
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Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Met Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Arg Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Arg Pro Gly Val
370 375 380
Asp Tyr Glu Thr Asn Pro Asn Tyr Pro Glu Val Leu Tyr Glu Asp Trp
385 390 395 400
Thr Thr Pro Thr Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Lys Ser Asn Glu Ile
405 410 415
Pro Ser Thr Asp Val Ala Asp Gln Ser Asn Arg Glu His Leu Ser Val
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Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu Val
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Met Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys
450 455 460
Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu
465 470 475 480
His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly
485 490 495
Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn
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Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly
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Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys
545 550 555 560
Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala
565 570 575
Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr
580 585 590
Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu
595 600 605
Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu
610 615 620
Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu
625 630 635 640
Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala
645 650 655
Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val
660 665 670
His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu
675 680 685
Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp
690 695 700
Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro
705 710 715 720
Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp
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755 760 765
Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu
770 775 780
Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile Lys
785 790 795 800
Ser Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr
805 810 815
Leu Asp Ile Leu Gly
820
<210> 2
<211> 821
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 信号肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(429)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (430)..(453)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (454)..(821)
<223> 细胞质结构域
<400> 2
Met Ser Pro Trp Pro Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala Cys
20 25 30
Pro Met Ser Cys Lys Cys Ser Thr Thr Arg Ile Trp Cys Thr Glu Pro
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Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Ile Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Lys Asn Leu
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Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala Tyr Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Gly Asn Leu Arg His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
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Ser Leu Ser Arg Arg His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Asp Leu Ile
130 135 140
Leu Thr Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Leu Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
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180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
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210 215 220
Leu Pro Thr Leu Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
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Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
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Phe Thr Val Arg Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Met Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
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370 375 380
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Thr Thr Pro Thr Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Lys Ser Asn Glu Ile
405 410 415
Pro Ser Thr Asp Val Ala Asp Gln Thr Asn Arg Glu His Leu Ser Val
420 425 430
Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu Val
435 440 445
Met Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys
450 455 460
Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu
465 470 475 480
His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly
485 490 495
Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn
500 505 510
Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr Phe
515 520 525
Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly
530 535 540
Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys
545 550 555 560
Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala
565 570 575
Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr
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Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu
595 600 605
Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu
610 615 620
Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu
625 630 635 640
Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala
645 650 655
Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val
660 665 670
His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu
675 680 685
Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp
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Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro
705 710 715 720
Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp
725 730 735
Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro
740 745 750
Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly
755 760 765
Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu
770 775 780
Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile Lys
785 790 795 800
Asn Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr
805 810 815
Leu Asp Ile Leu Gly
820
<210> 3
<211> 838
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 信号肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(430)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (431)..(454)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (455)..(838)
<223> 细胞质结构域
<400> 3
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Asp Phe Ser Trp Phe Gly Phe Gly Lys Val Lys Ser Arg Gln Gly
465 470 475 480
Val Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
485 490 495
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
500 505 510
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
515 520 525
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
530 535 540
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
545 550 555 560
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
565 570 575
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
580 585 590
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
595 600 605
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
610 615 620
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
625 630 635 640
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
645 650 655
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
660 665 670
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
675 680 685
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
690 695 700
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
705 710 715 720
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
725 730 735
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
740 745 750
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
755 760 765
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
770 775 780
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
785 790 795 800
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile
805 810 815
Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
820 825 830
Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
835
<210> 4
<211> 822
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 信号肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(430)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(432)
<223> 人类序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (431)..(454)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (433)..(822)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (455)..(822)
<223> 细胞质结构域
<400> 4
Met Ser Pro Trp Leu Lys Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
465 470 475 480
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
485 490 495
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
500 505 510
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
515 520 525
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
530 535 540
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
545 550 555 560
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
565 570 575
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
580 585 590
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
595 600 605
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
610 615 620
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
625 630 635 640
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
645 650 655
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
660 665 670
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
675 680 685
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
690 695 700
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
705 710 715 720
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
725 730 735
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
740 745 750
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
755 760 765
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
770 775 780
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile
785 790 795 800
Lys Ser Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
805 810 815
Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
820
<210> 5
<211> 822
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 信号肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 大鼠序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(430)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(432)
<223> 人类序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (431)..(454)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (433)..(822)
<223> 大鼠序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (455)..(822)
<223> 细胞质结构域
<400> 5
Met Ser Pro Trp Pro Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
465 470 475 480
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
485 490 495
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
500 505 510
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
515 520 525
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
530 535 540
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
545 550 555 560
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
565 570 575
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
580 585 590
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
595 600 605
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
610 615 620
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
625 630 635 640
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
645 650 655
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
660 665 670
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
675 680 685
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
690 695 700
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
705 710 715 720
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
725 730 735
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
740 745 750
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
755 760 765
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
770 775 780
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile
785 790 795 800
Lys Asn Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
805 810 815
Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
820
<210> 6
<211> 8744
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 6
gtctggaggg tgctatgcta tgcgtgtgtg cgtgtgtgtg cgcgcgcgcg tgtgtgagcg 60
tgtgtgtttt tggatttcat actaattttc tggagtttct gcccctgctc tgcgtcagcc 120
ctcacgtcac ttcgccagca gtagcagagg cggcggcggc ggcggccgcc ggttagagcc 180
cagtcgctgc ttcagctgct gttgctgctt ctgcagcgct ctgctccctg cgcttgctac 240
gggaggccgg ggaagccgcg cggacagtcc tcggtggcct gggccggcac tgtcctgcta 300
ccgcagttgc tccccagccc tgaggtgcgc accgatatcg atattcgtgc cggtttagcg 360
gttctgcgac ccaaagagtc cagggagatc caccgagtgg tgcctggcgt ataggactat 420
gcagccgcct tgtggctcgg agcagcggcc cgcgatgtcc cagccactgt gaaccatttg 480
gtcagcgcca acctgctcag ccccagcacc gacaggctca gcctctggta cgctccactc 540
cgcgggaggc caccagcacc aagcagcaag agggcgcagg gaaggcctcc cccctccggc 600
gggggacgcc tggctcagcg tagggacacg cactccgact gactggcact ggcagctcgg 660
gatgtcgccc tggctgaagt ggcatggacc cgccatggcg cggctctggg gcttatgcct 720
gctggtcttg ggcttctgga gggcctctct cgcctgcccg acgtcctgca aatgcagttc 780
cgctaggatt tggtgtactg agccttctcc aggcatcgtg gcattcccga ggttggaacc 840
taacagcgtt gacccggaga acatcacgga aattctcatt gcaaaccaga aaaggctaga 900
aatcatcaat gaagatgacg ttgaagctta cgtggggctg agaaacctta caattgtgga 960
ttccggctta aagtttgtgg cttacaaagc gtttctgaaa aacagcaacc tgcggcacat 1020
aaatttcaca cgaaacaagc tgacgagttt gtccaggaga catttccgcc accttgactt 1080
gtctgacctg atcctgacgg gtaatccgtt cacgtgctcc tgcgacatca tgtggctcaa 1140
gactctccag gagactaaat ccagccccga cactcaggat ttgtactgcc tcaatgagag 1200
cagcaagaac atgcccctgg cgaacctgca gatacccaat tgtggtctgc catctgcacg 1260
tctggctgct cctaacctca ccgtggagga aggaaagtct gtgacccttt cctgcagtgt 1320
ggggggtgac ccactcccca ccttgtactg ggacgttggg aatttggttt ccaagcacat 1380
gaatgaaaca agccacacac agggctcctt aaggataacg aacatttcat ctgatgacag 1440
tggaaagcaa atctcttgtg tggcagaaaa ccttgtagga gaagatcaag attctgtgaa 1500
cctcactgtg cattttgcgc caactatcac gtttctcgag tctccaacct cagatcacca 1560
ctggtgcatt ccattcactg tgagaggcaa ccccaagcct gcgcttcagt ggttctacaa 1620
tggggccata ctgaatgagt ccaagtacat ctgtactaag atccacgtca ccaatcacac 1680
ggagtaccat ggctgcctcc agctggataa ccccactcat atgaataacg gagactacac 1740
cctgatggcc aagaacgagt atgggaagga tgagagacag atctccgctc acttcatggg 1800
ccggcctgga gtcgactacg agacaaaccc aaattaccct gaagtcctct atgaagactg 1860
gaccacgcca actgacattg gggatactac gaacaaaagt aatgaaatcc cctccacgga 1920
tgttgctgac caaagcaatc gggagcatct ctcggtctat gccgtggtgg tgattgcatc 1980
tgtggtggga ttctgcctgc tggtgatgtt gctcctgctc aagttggcga gacattccaa 2040
gtttggcatg aaaggcccag cttcggtcat cagcaacgac gatgactctg ccagccccct 2100
ccaccacatc tccaatggga gtaacactcc atcttcttcg gagggcggtc ccgacgctgt 2160
cattattgga atgaccaaga ttcctgttat tgaaaacccc cagtactttg gcatcaccaa 2220
cagtcagctc aagccagaca catttgttca gcatatcaag agacacaaca tcgttctgaa 2280
gagggaactt ggggaaggag ccttcgggaa agttttcctt gccgagtgct acaacctctg 2340
cccagagcag gataagatcc tggtggctgt gaagacgctg aaggacgcca gcgacaatgc 2400
acgcaaggac tttcatcggg aagctgagct gctgaccaac ctccagcacg agcacattgt 2460
caagttctac ggtgtctgtg tggagggcga cccactcatc atggtctttg agtacatgaa 2520
gcacggggac ctcaacaagt tccttagggc acacgggccc gacgcagtgc tgatggcaga 2580
gggtaacccg cccacagagc tgacgcagtc gcagatgctg cacatcgctc agcaaatcgc 2640
agcaggtatg gtctacctgg cgtcccaaca ctttgtgcac cgtgacctgg ccacccggaa 2700
ctgcctggtg ggagagaacc tgctggtgaa aattggggac tttgggatgt cccgagatgt 2760
gtacagcacc gactactatc gggtcggtgg ccacacaatg ttgcccatcc gatggatgcc 2820
tccagagagc atcatgtaca ggaaattcac caccgagagc gacgtctgga gcctgggcgt 2880
tgtgttgtgg gagatcttca cctacggcaa gcagccctgg tatcagctat cgaacaatga 2940
ggtgatagag tgcatcaccc agggaagagt ccttcagcgg cctcgaacgt gtccccagga 3000
ggtgtatgag ctcatgcttg gatgctggca gcgggaacca cacacccgga agaacatcaa 3060
gagcatccac accctccttc agaacttggc caaggcatct cccgtctacc tggatatcct 3120
aggctagggt cctccttctg cccagaccgt ccttcccaag gccctcctca gactggccta 3180
cacgacgaac ctcttgactg ccgctgacgt catgaccttg ctgtccttcg ctctgacagt 3240
gttgacagga ccaggagcgg ctctttgggg gaggcagtgt gtgcttctcc atccacagac 3300
agtattaact cgcttctggc attgtctctt tctctccctt gggtttgttt ctttcttttg 3360
ccccttcccc ttttatcatt atttattcat ttatttattt tctggtcttc accgcttcac 3420
ggccctcagt ctctccttga ccaatctggc ttctgcattc ctattaactg tacatagaca 3480
aaggccttaa caaacctaat ttgttatatc agcagacact ccagtttgcc caccacaact 3540
aacaatgcct tgttgtattc ctgcctttga cgtggatgaa aaaaagggaa aaaaaaatca 3600
aacatctgac ttaagctgtc acttccgatg tacagacgtg gggcgtttct atggattcac 3660
ttctatttat tatttattaa tttatttatt tatcactctt cttattgttt tctggtggtt 3720
ttaacctatg tgtgagaagg aaaagttgtg tacaatctgg gaaaacttta tcagtgggaa 3780
atgaaaacga gagcgagcaa gcgagcaaga gagggagaga gagagagaag cgttaccata 3840
aaccacggca tgagcgagac agagacaagc catgggatca gtcgggagtc cgttgtgctt 3900
aggaaaaccc agcagccatt agctggggga gcatgttcgg ctctgtcccc caagcacctt 3960
tctgaggagg acacaggatg ttgaactctg cttcacgggc agagcttcta atgacagata 4020
ctggcttgca ctggaaagac agttcccacg ggacctggac ggacaacaca tcctacattc 4080
agacattgtg gtcgggcacg gtgacagagt tgatccgttt ctcaagtgtt atctaccaag 4140
cttttgtgaa gttccatcga aggaggtaga ttcttgctca gatataattt caggaaaacc 4200
cgagtccttg acaaagacag gagacgctct caatttggag gcaagtttct cttaccttga 4260
actttttcag acagcaactc cgcccagccc ccatcttcca ctctcacctg tcttgtaact 4320
gtgcaaacaa aagtgtgcat ggtctttgtc aattgatacc tatgtgcacg tgtgcagaaa 4380
ctgttgttcc agctggggtg tctgattagg agggcagatc cataaaaggt ctaacctagg 4440
caacttcggg aaaggagacc agatcagtag ctggaggcac tctccagtag gcggtgaggg 4500
gtttactgag taggcatgct gaagcccgga tattcaccca tctcaaaccc cccgggctgc 4560
aggacaggca caggccatcc ctgaggagaa ggggagccct tttgggatac cacctgaggt 4620
tatgttcagt gtgctctggt caagtccctt gctcggggct ctgtttgggg agagtggttt 4680
cattccaagg tactcattat tagtatgctg ttttgttaac tatactccat taaaaagtta 4740
aaaaaaaaaa gaattaagcc ttgacactgt atggctgaca ggaggctgtg cccagactga 4800
gcctggagat ttgcgcccgc acatggtcat tggttttccg aaaagagagg gtaaatttat 4860
atagaaattt acaggtattt gggtagtcat ttagaccgag ggagaccagt gtttccattt 4920
ctctgcgccc cctctgtgag gggaagttcg atacacttga cacctttata aacggagcca 4980
gataggaagg gagtgactta attcacctta gaacatttca tttggtgttt atttctgaag 5040
gtgcaagagc tctgtgtagg tttcatttgt gcccgagcat ttctggagca ctgtgttttc 5100
tagcagaaac tccgagagcc agttctcaca atgaaacttt aaaacctgtg taaattgaca 5160
gagagcagaa ggcgatccaa gaggcccact caagtgagtg gtggcacgag gcacatgcgg 5220
tggccctttc tgttgtgctg gcccatgaga gatgggagct attttgtcct cttcgtccat 5280
taaaacaaac ccctccagaa tacctatagt aatataatga aagccatatc tctgtgatct 5340
ataccgtcag gtatagatca ttaaaggacc catggtactg tcaggcactg tggaaccgtg 5400
aggcagcgga aaggcaaggg cacatttgta catgttcctc tagcttccgc cagccgtgac 5460
ctatgaactc acataggccg gttgctccta gtctgacggg ctgccctggg aggaaaagct 5520
gcaagatgct cagcagagag caaaggagag gatagtcttg gaaaaggcca aggttgggga 5580
tgccatacag gattacacca aagggctgta ctgagaatgt gggagcattc cattccaggt 5640
ttgtattttc ctcagcaaga aaaaagagca gatagaaggg cagaggagga tagagaggaa 5700
gagaaaggag agggagaaga gagcagagaa gagagagaga gagagagaga gagagaatct 5760
ttatactttt tggcaagtcc tcgaaggtct caaaatgaaa gtgtctatgc aagtgcaaat 5820
ttttacagtt atttatacta attattatta ttgttattaa ttattattat tactagtctg 5880
ttgtctcaag aatatgtgca gatttcagag cattaaagag tatttggttt cttttaaagt 5940
agttgggtga gccaaggaca ccttaaaata attgtcactg ttcatctgct atcgcctttc 6000
tcatggtatt ttaagtttta gaaaagaaac attcttgttc taaaacatat ccctctccat 6060
agatgacaaa aaaaaatggt gttagcaaac cgaaacctcc cccgattcct gtctgacatc 6120
cgatccattt ctcaactgct tgatgatttc cgagcgcttt ttgcatatgt tgtcaaaata 6180
ttcatattat tttggtgagg gaatggagac tcagaaactc agaggacaaa cataagcttc 6240
accgaagtct gtctgccaga tacaaactaa catacaaaca agacagccgg gaaggaaatg 6300
tgctggtagc gtgtctgtgg agcagggtgg gggttagaac agaaggagac ctgggcagtg 6360
cacgcagaag agatgttaca tcatgtgctt ctgctcctgg cttctgctga ctcccaactt 6420
tgcgctcagc ctcatttaga aaacgcttca aacactgctc ttcagggttc tgtcagaact 6480
cacacacacg tgctcacacc agccccgctt gtgacgtttt tatgtacttc tatataaata 6540
tatacataat atatgttata aacacttgat ttatacatat acaaatgcac acatgtagtg 6600
tgtttgtgtg tttatgtata aacatatagg ctcatggtaa tagaataatt ataagtaggg 6660
tgcaatatga ataatttgct taatatttgc taagtaacca aaactttcca acgtcatgtg 6720
gcagttcata tttccactct cagtgtgggt aaggatgggc tacaccacac tttcagctct 6780
gtgcagccct tggatggaag atgtgttgaa aaaaaaatca catcttccct gaaacaactg 6840
actgaaagcc atcctctaca ttgaatctgt tctctggctc tttgcaaagg agaaatgcag 6900
acaaatggtc tccttgtgtc ccagtcctgg gaaggagaag tgggttttct cttcttgcac 6960
atttgggccg tgctcacctt tcctggctct atgcccttta cactgggctc agagatgaag 7020
cagtctagac ccaagctgca gggctgtagg gaggcaaatg tcttcgaggc tgatagcaaa 7080
gcatccaaaa atctatagca agatgcgcag cttgaagtca ctcctcatcc acacggcaag 7140
caagagccag ggcatgcagt gctgtccatc tctaggactg ggcagtgggg tccccggtca 7200
agggcagtct ttccctaagc ctctcctttt gcaaatggca ctgccagcag tacctggcat 7260
taagtcacga aaaatttcta aaatggcagc acagacccgt gtgccctcat tgctctgccc 7320
ccacatgcct catcattaga gggctccagt tttcaaactt gactttccat ttggccctgt 7380
atcgtggtta aaggaaatct caacagaggg atggccaatt gacctaaatc cccagatgtc 7440
caagtttgca gtgaaagcca gttcttccca aatgtataac tggaatgtag ggactcaggt 7500
tgtgatactt catacaggaa tctcagatgt tattgtaaag aactgggttg ggagggattc 7560
atcactaagc caacaataat gcaggagggc gtggctgatc gttaagccaa tagtagtgca 7620
ggagggcgtg gctgctgtga gggctggaat ccatctctgc tgctaaagtt cagggttctc 7680
aactcttttc agctgttgca gcccttcact tctttccctt cggcgttatt tatttgtgta 7740
tttatttatt tatttattta tttatctatc tatctatcaa cttttggtcc attcatcacc 7800
aacataaagc aaaaacaatt ttttacatat atgtaaatgt gttgcaagtg aaacactgtg 7860
aatctcacaa ccacctccta gcaactatgc tgccatcttg acgtgcgtct caggagtcga 7920
gacgggaaaa gacgaggacg tcattttgca gcctacgcat tctgggccag gtccgtgttc 7980
gttttatttc tttagtctgt gagttaagaa aacaatccga gtggagggtg acggatgttc 8040
ggcaagttcg gtgaagcagc acgagctctt tgcagctata ggttcgagca agaagaaaaa 8100
ccatgggaga tggagaaggg aaatttgatg gaggggtggg gtggggtggg ggctctgtct 8160
tacagctcgt gtagcttact gttgcttaaa aatgtataca acagctggaa atgttttcaa 8220
cacaaggtat ttgaaataaa tgtgaatctt aaatatgtac tcccttaagg aatgaacata 8280
ttatggtgaa atattgctcc cccgcgtccc ctacaaatct gcctagagat gtggatacct 8340
acatttgctt aagcatcaga ccagtgtttg tatatacccg ggccatacac actcatctcg 8400
acgtctctct gcggatgtat ttccccttca ctggtgacct ggtatttaga actccgtctt 8460
ttcagttggt ttatttccct ttaatgtgat gtctctgtgc cgattattac cggttcttac 8520
ttgtttttgc aatccgtttt gaggtccagt gttttactga gactcattgc atcttggctg 8580
atttcaaagt gacacccgaa tacagtgttt aaaaaaaaag tttgtttgta aatcatgtga 8640
ccagcttctc tcaccctgac atggaatgtc tcttgtacta cagtgtattt aataataaaa 8700
gaaaaaaatg atgtcttaca ataaataaca tcttccacaa gagg 8744
<210> 7
<211> 4750
<212> DNA
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 7
tgtgcgtgcg tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60
tgagcgtgtg tgtttttgga tttcatacta attttctgga gtttctgccc ctgctctgcg 120
tcagccctca cgtcacttcg ccagcagtag cagaggcggc ggcggccgcc ggttagagcc 180
cagtcgctgc ttcagctgct gttgctgctt ctgcggcgct ctgctccctg cgctggctac 240
gggaggccgg gggagccgcg ccgacagtcc tctgtggcca gggccggcac tgtcctgcta 300
ccgcagttgc tccccagccc tgaggtgcgc accgatatcg atatccgtgc cggtttagcg 360
gttctgcgac ccaaagagtc cagggagagc caccgagtgg cgcctggcgt ataggaccat 420
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<213> 人类（Homo sapiens）
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<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<220>
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<222> (1)..(93)
<223> 信号肽
<220>
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<223> 细胞外结构域
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<223> 跨膜结构域
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<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(93)
<223> 信号肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(1287)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1288)..(1359)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1360)..(2463)
<223> 细胞质结构域
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atgtcgccct ggccgaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttatgcttg 60
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ggctag 2466
<210> 11
<211> 2517
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(93)
<223> 信号肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(1290)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1291)..(1362)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1363)..(2514)
<223> 细胞质结构域
<400> 11
atgtcgtcct ggataaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttctgctgg 60
ctggttgtgg gcttctggag ggccgctttc gcctgtccca cgtcctgcaa atgcagtgcc 120
tctcggatct ggtgcagcga cccttctcct ggcatcgtgg catttccgag attggagcct 180
aacagtgtag atcctgagaa catcaccgaa attttcatcg caaaccagaa aaggttagaa 240
atcatcaacg aagatgatgt tgaagcttat gtgggactga gaaatctgac aattgtggat 300
tctggattaa aatttgtggc tcataaagca tttctgaaaa acagcaacct gcagcacatc 360
aattttaccc gaaacaaact gacgagtttg tctaggaaac atttccgtca ccttgacttg 420
tctgaactga tcctggtggg caatccattt acatgctcct gtgacattat gtggatcaag 480
actctccaag aggctaaatc cagtccagac actcaggatt tgtactgcct gaatgaaagc 540
agcaagaata ttcccctggc aaacctgcag atacccaatt gtggtttgcc atctgcaaat 600
ctggccgcac ctaacctcac tgtggaggaa ggaaagtcta tcacattatc ctgtagtgtg 660
gcaggtgatc cggttcctaa tatgtattgg gatgttggta acctggtttc caaacatatg 720
aatgaaacaa gccacacaca gggctcctta aggataacta acatttcatc cgatgacagt 780
gggaagcaga tctcttgtgt ggcggaaaat cttgtaggag aagatcaaga ttctgtcaac 840
ctcactgtgc attttgcacc aactatcaca tttctcgaat ctccaacctc agaccaccac 900
tggtgcattc cattcactgt gaaaggcaac cccaaaccag cgcttcagtg gttctataac 960
ggggcaatat tgaatgagtc caaatacatc tgtactaaaa tacatgttac caatcacacg 1020
gagtaccacg gctgcctcca gctggataat cccactcaca tgaacaatgg ggactacact 1080
ctaatagcca agaatgagta tgggaaggat gagaaacaga tttctgctca cttcatgggc 1140
tggcctggaa ttgacgatgg tgcaaaccca aattatcctg atgtaattta tgaagattat 1200
ggaactgcag cgaatgacat cggggacacc acgaacagaa gtaatgaaat cccttccaca 1260
gacgtcactg ataaaaccgg tcgggaacat ctctcggtct atgctgtggt ggtgattgcg 1320
tctgtggtgg gattttgcct tttggtaatg ctgtttctgc ttaagttggc aagacactcc 1380
aagtttggca tgaaagattt ctcatggttt ggatttggga aagtaaaatc aagacaaggt 1440
gttggcccag cctccgttat cagcaatgat gatgactctg ccagcccact ccatcacatc 1500
tccaatggga gtaacactcc atcttcttcg gaaggtggcc cagatgctgt cattattgga 1560
atgaccaaga tccctgtcat tgaaaatccc cagtactttg gcatcaccaa cagtcagctc 1620
aagccagaca catttgttca gcacatcaag cgacataaca ttgttctgaa aagggagcta 1680
ggcgaaggag cctttggaaa agtgttccta gctgaatgct ataacctctg tcctgagcag 1740
gacaagatct tggtggcagt gaagaccctg aaggatgcca gtgacaatgc acgcaaggac 1800
ttccaccgtg aggccgagct cctgaccaac ctccagcatg agcacatcgt caagttctat 1860
ggcgtctgcg tggagggcga ccccctcatc atggtctttg agtacatgaa gcatggggac 1920
ctcaacaagt tcctcagggc acacggccct gatgccgtgc tgatggctga gggcaacccg 1980
cccacggaac tgacgcagtc gcagatgctg catatagccc agcagatcgc cgcgggcatg 2040
gtctacctgg cgtcccagca cttcgtgcac cgcgatttgg ccaccaggaa ctgcctggtc 2100
ggggagaact tgctggtgaa aatcggggac tttgggatgt cccgggacgt gtacagcact 2160
gactactaca gggtcggtgg ccacacaatg ctgcccattc gctggatgcc tccagagagc 2220
atcatgtaca ggaaattcac gacggaaagc gacgtctgga gcctgggggt cgtgttgtgg 2280
gagattttca cctatggcaa acagccctgg taccagctgt caaacaatga ggtgatagag 2340
tgtatcactc agggccgagt cctgcagcga ccccgcacgt gcccccagga ggtgtatgag 2400
ctgatgctgg ggtgctggca gcgagagccc cacatgagga agaacatcaa gggcatccat 2460
accctccttc agaacttggc caaggcatct ccggtctacc tggacattct aggctag 2517
<210> 12
<211> 2469
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(93)
<223> 信号肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(93)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(1290)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(1296)
<223> 人类序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1291)..(1362)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1297)..(2466)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1363)..(2466)
<223> 细胞质结构域
<400> 12
atgtcgccct ggctgaagtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttatgcctg 60
ctggtcttgg gcttctggag ggcctctctc gcctgtccca cgtcctgcaa atgcagtgcc 120
tctcggatct ggtgcagcga cccttctcct ggcatcgtgg catttccgag attggagcct 180
aacagtgtag atcctgagaa catcaccgaa attttcatcg caaaccagaa aaggttagaa 240
atcatcaacg aagatgatgt tgaagcttat gtgggactga gaaatctgac aattgtggat 300
tctggattaa aatttgtggc tcataaagca tttctgaaaa acagcaacct gcagcacatc 360
aattttaccc gaaacaaact gacgagtttg tctaggaaac atttccgtca ccttgacttg 420
tctgaactga tcctggtggg caatccattt acatgctcct gtgacattat gtggatcaag 480
actctccaag aggctaaatc cagtccagac actcaggatt tgtactgcct gaatgaaagc 540
agcaagaata ttcccctggc aaacctgcag atacccaatt gtggtttgcc atctgcaaat 600
ctggccgcac ctaacctcac tgtggaggaa ggaaagtcta tcacattatc ctgtagtgtg 660
gcaggtgatc cggttcctaa tatgtattgg gatgttggta acctggtttc caaacatatg 720
aatgaaacaa gccacacaca gggctcctta aggataacta acatttcatc cgatgacagt 780
gggaagcaga tctcttgtgt ggcggaaaat cttgtaggag aagatcaaga ttctgtcaac 840
ctcactgtgc attttgcacc aactatcaca tttctcgaat ctccaacctc agaccaccac 900
tggtgcattc cattcactgt gaaaggcaac cccaaaccag cgcttcagtg gttctataac 960
ggggcaatat tgaatgagtc caaatacatc tgtactaaaa tacatgttac caatcacacg 1020
gagtaccacg gctgcctcca gctggataat cccactcaca tgaacaatgg ggactacact 1080
ctaatagcca agaatgagta tgggaaggat gagaaacaga tttctgctca cttcatgggc 1140
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ctaggctag 2469
<210> 13
<211> 2469
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(93)
<223> 信号肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(93)
<223> 大鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(1290)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(1296)
<223> 人类序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1291)..(1362)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1297)..(2466)
<223> 大鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1363)..(2466)
<223> 细胞质结构域
<400> 13
atgtcgccct ggccgaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttatgcttg 60
ctggtcttgg gcttctggag ggcttctctt gcctgtccca cgtcctgcaa atgcagtgcc 120
tctcggatct ggtgcagcga cccttctcct ggcatcgtgg catttccgag attggagcct 180
aacagtgtag atcctgagaa catcaccgaa attttcatcg caaaccagaa aaggttagaa 240
atcatcaacg aagatgatgt tgaagcttat gtgggactga gaaatctgac aattgtggat 300
tctggattaa aatttgtggc tcataaagca tttctgaaaa acagcaacct gcagcacatc 360
aattttaccc gaaacaaact gacgagtttg tctaggaaac atttccgtca ccttgacttg 420
tctgaactga tcctggtggg caatccattt acatgctcct gtgacattat gtggatcaag 480
actctccaag aggctaaatc cagtccagac actcaggatt tgtactgcct gaatgaaagc 540
agcaagaata ttcccctggc aaacctgcag atacccaatt gtggtttgcc atctgcaaat 600
ctggccgcac ctaacctcac tgtggaggaa ggaaagtcta tcacattatc ctgtagtgtg 660
gcaggtgatc cggttcctaa tatgtattgg gatgttggta acctggtttc caaacatatg 720
aatgaaacaa gccacacaca gggctcctta aggataacta acatttcatc cgatgacagt 780
gggaagcaga tctcttgtgt ggcggaaaat cttgtaggag aagatcaaga ttctgtcaac 840
ctcactgtgc attttgcacc aactatcaca tttctcgaat ctccaacctc agaccaccac 900
tggtgcattc cattcactgt gaaaggcaac cccaaaccag cgcttcagtg gttctataac 960
ggggcaatat tgaatgagtc caaatacatc tgtactaaaa tacatgttac caatcacacg 1020
gagtaccacg gctgcctcca gctggataat cccactcaca tgaacaatgg ggactacact 1080
ctaatagcca agaatgagta tgggaaggat gagaaacaga tttctgctca cttcatgggc 1140
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ggaactgcag cgaatgacat cggggacacc acgaacagaa gtaatgaaat cccttccaca 1260
gacgtcactg ataaaaccgg tcgggaacat ctctcggtct atgccgtggt ggtgattgcc 1320
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aagtttggca tgaaaggccc agcttccgtc atcagcaacg acgatgactc tgccagccct 1440
ctccaccaca tctccaacgg gagcaacact ccgtcttctt cggagggcgg gcccgatgct 1500
gtcatcattg ggatgaccaa gatccctgtc attgaaaacc cccagtactt cggtatcacc 1560
aacagccagc tcaagccgga cacatttgtt cagcacatca agagacacaa catcgttctg 1620
aagagggagc ttggagaagg agcctttggg aaagttttcc tagcggagtg ctataacctc 1680
tgccccgagc aggataagat cctggtggcc gtgaagacgc tgaaggacgc cagcgacaat 1740
gctcgcaagg actttcatcg cgaagccgag ctgctgacca acctccagca cgagcacatt 1800
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gagggtaacc cgcccaccga gctgacgcag tcgcagatgc tgcacatcgc tcagcaaatc 1980
gcagcaggca tggtctacct ggcatcccaa cacttcgtgc accgagacct ggccacccgg 2040
aactgcttgg taggagagaa cctgctggtg aaaattgggg acttcgggat gtcccgggat 2100
gtatacagca ccgactacta ccgggttggt ggccacacaa tgttgcccat ccgatggatg 2160
cctccagaga gcatcatgta caggaaattc accaccgaga gtgacgtctg gagcctggga 2220
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gaggtgatag aatgcatcac ccagggcaga gtccttcagc ggcctcgcac gtgtccccag 2340
gaggtgtacg agctgatgct gggatgctgg cagcgggaac cacacacaag gaagaacatc 2400
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ctaggctag 2469
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
aggtgggtag gtcctggaag tg 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
aatgctgtcc caagagtggg 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
gtcctgcatc ccttgtcttt g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
atgtgggcgt tgtgcagtct c 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
cgctgcagtg cattgaactc agca 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
ctgtggaggg acgtgaccag 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
tccgctagga tttggtgtac tg 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
agccttctcc aggcatcgtg gcat 24
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
tccgggtcaa cgctgttag 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
tcctgcgagg gttctgac 18
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
tgggtgctca tatgccagag aaattgtca 29
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
cgatctgtga tggcctgctt ac 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
gggctcaggc aggtatatgt tg 22
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
acagatgctg tcccaaacat agcaaga 27
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
ccaaccctaa gccagtgaaa cag 23
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
gtgctggaga ccaggagact 20
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
tgccatactc agtttatacg gtgctgac 28
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
gcctggtggc tcagtcaatg 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
gcagacactg gatgggtca 19
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
acagggttag ctggtgaatg ga 22
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
tcggagcaca ggactacag 19
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
caagaggaac tgtgtccagg aaagc 25
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
agcgtgcctc acctaacctc ta 22
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
gcacagcact gtaaaggca 19
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
acggaactcg aaggaattgg tattgttgt 29
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
acacagctat gggagaaaga ctg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
ccggttggcg agtgcgcatg cac 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
ccttccggtt ggcgagtgcg cat 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
ccaagggtgc gttgatggat cta 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
gaatgccaag ggtgcgttga tgg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
ctgggtgatt gggactgaga aag 23
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
cagccttgaa agtatggctt gggc 24
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
gcactcgcca accggaag 18
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
gaccagctca cccttactta tgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
actgaatgcc aagggtgcgt tga 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
tcttggaaat ccgctgaaga gtt 23
<210> 51
<211> 31
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 51
Met Ser Pro Trp Leu Lys Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala
20 25 30
<210> 52
<211> 398
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 52
Cys Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ser Ala Arg Ile Trp Cys Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val
20 25 30
Asp Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn
50 55 60
Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala Tyr Lys Ala Phe
65 70 75 80
Leu Lys Asn Ser Asn Leu Arg His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu
85 90 95
Thr Ser Leu Ser Arg Arg His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Asp Leu
100 105 110
Ile Leu Thr Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Leu
115 120 125
Lys Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr
130 135 140
Cys Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Met Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile
145 150 155 160
Pro Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr
165 170 175
Val Glu Glu Gly Lys Ser Val Thr Leu Ser Cys Ser Val Gly Gly Asp
180 185 190
Pro Leu Pro Thr Leu Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His
195 200 205
Met Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile
210 215 220
Ser Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu
225 230 235 240
Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile
260 265 270
Pro Phe Thr Val Arg Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr
275 280 285
Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His
290 295 300
Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro
305 310 315 320
Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Met Ala Lys Asn Glu Tyr
325 330 335
Gly Lys Asp Glu Arg Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Arg Pro Gly
340 345 350
Val Asp Tyr Glu Thr Asn Pro Asn Tyr Pro Glu Val Leu Tyr Glu Asp
355 360 365
Trp Thr Thr Pro Thr Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Lys Ser Asn Glu
370 375 380
Ile Pro Ser Thr Asp Val Ala Asp Gln Ser Asn Arg Glu His
385 390 395
<210> 53
<211> 24
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 53
Leu Ser Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys
1 5 10 15
Leu Leu Val Met Leu Leu Leu Leu
20
<210> 54
<211> 368
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 54
Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys Gly Pro Ala Ser Val
1 5 10 15
Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu His His Ile Ser Asn
20 25 30
Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly Pro Asp Ala Val Ile
35 40 45
Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Gly
50 55 60
Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr Phe Val Gln His Ile Lys
65 70 75 80
Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly
85 90 95
Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys Pro Glu Gln Asp Lys
100 105 110
Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala Ser Asp Asn Ala Arg
115 120 125
Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu
130 135 140
His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu Gly Asp Pro Leu Ile
145 150 155 160
Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg
165 170 175
Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu Gly Asn Pro Pro Thr
180 185 190
Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala Gln Gln Ile Ala Ala
195 200 205
Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp
225 230 235 240
Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly
245 250 255
Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met
260 265 270
Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Val
275 280 285
Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln Leu Ser
290 295 300
Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val Leu Gln Arg
305 310 315 320
Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu Met Leu Gly Cys Trp
325 330 335
Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile Lys Ser Ile His Thr Leu
340 345 350
Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
355 360 365
<210> 55
<211> 31
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 55
Met Ser Pro Trp Pro Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala
20 25 30
<210> 56
<211> 398
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 56
Cys Pro Met Ser Cys Lys Cys Ser Thr Thr Arg Ile Trp Cys Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Ile
20 25 30
Asp Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Lys Asn
50 55 60
Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala Tyr Lys Ala Phe
65 70 75 80
Leu Lys Asn Gly Asn Leu Arg His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu
85 90 95
Thr Ser Leu Ser Arg Arg His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Asp Leu
100 105 110
Ile Leu Thr Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Leu
115 120 125
Lys Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr
130 135 140
Cys Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Thr Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile
145 150 155 160
Pro Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr
165 170 175
Val Glu Glu Gly Lys Ser Val Thr Ile Ser Cys Ser Val Gly Gly Asp
180 185 190
Pro Leu Pro Thr Leu Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His
195 200 205
Met Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile
210 215 220
Ser Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu
225 230 235 240
Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile
260 265 270
Pro Phe Thr Val Arg Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr
275 280 285
Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His
290 295 300
Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro
305 310 315 320
Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Met Ala Lys Asn Glu Tyr
325 330 335
Gly Lys Asp Glu Arg Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Arg Pro Gly
340 345 350
Val Asp Tyr Glu Thr Asn Pro Asn Tyr Pro Glu Val Leu Tyr Glu Asp
355 360 365
Trp Thr Thr Pro Thr Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Lys Ser Asn Glu
370 375 380
Ile Pro Ser Thr Asp Val Ala Asp Gln Thr Asn Arg Glu His
385 390 395
<210> 57
<211> 24
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 57
Leu Ser Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys
1 5 10 15
Leu Leu Val Met Leu Leu Leu Leu
20
<210> 58
<211> 368
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 58
Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys Gly Pro Ala Ser Val
1 5 10 15
Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu His His Ile Ser Asn
20 25 30
Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly Pro Asp Ala Val Ile
35 40 45
Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Gly
50 55 60
Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr Phe Val Gln His Ile Lys
65 70 75 80
Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly
85 90 95
Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys Pro Glu Gln Asp Lys
100 105 110
Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala Ser Asp Asn Ala Arg
115 120 125
Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu
130 135 140
His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu Gly Asp Pro Leu Ile
145 150 155 160
Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg
165 170 175
Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu Gly Asn Pro Pro Thr
180 185 190
Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala Gln Gln Ile Ala Ala
195 200 205
Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp
225 230 235 240
Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly
245 250 255
Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met
260 265 270
Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Val
275 280 285
Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln Leu Ser
290 295 300
Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val Leu Gln Arg
305 310 315 320
Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu Met Leu Gly Cys Trp
325 330 335
Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile Lys Asn Ile His Thr Leu
340 345 350
Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
355 360 365
<210> 59
<211> 31
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 59
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala
20 25 30
<210> 60
<211> 399
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 60
Cys Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp
1 5 10 15
Pro Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val
20 25 30
Asp Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn
50 55 60
Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe
65 70 75 80
Leu Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu
85 90 95
Thr Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu
100 105 110
Ile Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile
115 120 125
Lys Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr
130 135 140
Cys Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile
145 150 155 160
Pro Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr
165 170 175
Val Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp
180 185 190
Pro Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His
195 200 205
Met Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile
210 215 220
Ser Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu
225 230 235 240
Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile
260 265 270
Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr
275 280 285
Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His
290 295 300
Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro
305 310 315 320
Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr
325 330 335
Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly
340 345 350
Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp
355 360 365
Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn
370 375 380
Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His
385 390 395
<210> 61
<211> 24
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 61
Leu Ser Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys
1 5 10 15
Leu Leu Val Met Leu Phe Leu Leu
20
<210> 62
<211> 384
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 62
Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys Asp Phe Ser Trp Phe
1 5 10 15
Gly Phe Gly Lys Val Lys Ser Arg Gln Gly Val Gly Pro Ala Ser Val
20 25 30
Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu His His Ile Ser Asn
35 40 45
Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly Pro Asp Ala Val Ile
50 55 60
Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Gly
65 70 75 80
Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr Phe Val Gln His Ile Lys
85 90 95
Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly
100 105 110
Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys Pro Glu Gln Asp Lys
115 120 125
Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala Ser Asp Asn Ala Arg
130 135 140
Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu
145 150 155 160
His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu Gly Asp Pro Leu Ile
165 170 175
Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg
180 185 190
Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu Gly Asn Pro Pro Thr
195 200 205
Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala Gln Gln Ile Ala Ala
210 215 220
Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala
225 230 235 240
Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp
245 250 255
Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly
260 265 270
Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met
275 280 285
Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Val
290 295 300
Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln Leu Ser
305 310 315 320
Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val Leu Gln Arg
325 330 335
Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu Met Leu Gly Cys Trp
340 345 350
Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile Lys Gly Ile His Thr Leu
355 360 365
Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
370 375 380
<210> 63
<211> 93
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 63
atgtcgccct ggctgaagtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttatgcctg 60
ctggtcttgg gcttctggag ggcctctctc gcc 93
<210> 64
<211> 1194
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 64
tgcccgacgt cctgcaaatg cagttccgct aggatttggt gtactgagcc ttctccaggc 60
atcgtggcat tcccgaggtt ggaacctaac agcgttgacc cggagaacat cacggaaatt 120
ctcattgcaa accagaaaag gctagaaatc atcaatgaag atgacgttga agcttacgtg 180
gggctgagaa accttacaat tgtggattcc ggcttaaagt ttgtggctta caaagcgttt 240
ctgaaaaaca gcaacctgcg gcacataaat ttcacacgaa acaagctgac gagtttgtcc 300
aggagacatt tccgccacct tgacttgtct gacctgatcc tgacgggtaa tccgttcacg 360
tgctcctgcg acatcatgtg gctcaagact ctccaggaga ctaaatccag ccccgacact 420
caggatttgt actgcctcaa tgagagcagc aagaacatgc ccctggcgaa cctgcagata 480
cccaattgtg gtctgccatc tgcacgtctg gctgctccta acctcaccgt ggaggaagga 540
aagtctgtga ccctttcctg cagtgtgggg ggtgacccac tccccacctt gtactgggac 600
gttgggaatt tggtttccaa gcacatgaat gaaacaagcc acacacaggg ctccttaagg 660
ataacgaaca tttcatctga tgacagtgga aagcaaatct cttgtgtggc agaaaacctt 720
gtaggagaag atcaagattc tgtgaacctc actgtgcatt ttgcgccaac tatcacgttt 780
ctcgagtctc caacctcaga tcaccactgg tgcattccat tcactgtgag aggcaacccc 840
aagcctgcgc ttcagtggtt ctacaatggg gccatactga atgagtccaa gtacatctgt 900
actaagatcc acgtcaccaa tcacacggag taccatggct gcctccagct ggataacccc 960
actcatatga ataacggaga ctacaccctg atggccaaga acgagtatgg gaaggatgag 1020
agacagatct ccgctcactt catgggccgg cctggagtcg actacgagac aaacccaaat 1080
taccctgaag tcctctatga agactggacc acgccaactg acattgggga tactacgaac 1140
aaaagtaatg aaatcccctc cacggatgtt gctgaccaaa gcaatcggga gcat 1194
<210> 65
<211> 72
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 65
ctctcggtct atgccgtggt ggtgattgca tctgtggtgg gattctgcct gctggtgatg 60
ttgctcctgc tc 72
<210> 66
<211> 1104
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 66
aagttggcga gacattccaa gtttggcatg aaaggcccag cttcggtcat cagcaacgac 60
gatgactctg ccagccccct ccaccacatc tccaatggga gtaacactcc atcttcttcg 120
gagggcggtc ccgacgctgt cattattgga atgaccaaga ttcctgttat tgaaaacccc 180
cagtactttg gcatcaccaa cagtcagctc aagccagaca catttgttca gcatatcaag 240
agacacaaca tcgttctgaa gagggaactt ggggaaggag ccttcgggaa agttttcctt 300
gccgagtgct acaacctctg cccagagcag gataagatcc tggtggctgt gaagacgctg 360
aaggacgcca gcgacaatgc acgcaaggac tttcatcggg aagctgagct gctgaccaac 420
ctccagcacg agcacattgt caagttctac ggtgtctgtg tggagggcga cccactcatc 480
atggtctttg agtacatgaa gcacggggac ctcaacaagt tccttagggc acacgggccc 540
gacgcagtgc tgatggcaga gggtaacccg cccacagagc tgacgcagtc gcagatgctg 600
cacatcgctc agcaaatcgc agcaggtatg gtctacctgg cgtcccaaca ctttgtgcac 660
cgtgacctgg ccacccggaa ctgcctggtg ggagagaacc tgctggtgaa aattggggac 720
tttgggatgt cccgagatgt gtacagcacc gactactatc gggtcggtgg ccacacaatg 780
ttgcccatcc gatggatgcc tccagagagc atcatgtaca ggaaattcac caccgagagc 840
gacgtctgga gcctgggcgt tgtgttgtgg gagatcttca cctacggcaa gcagccctgg 900
tatcagctat cgaacaatga ggtgatagag tgcatcaccc agggaagagt ccttcagcgg 960
cctcgaacgt gtccccagga ggtgtatgag ctcatgcttg gatgctggca gcgggaacca 1020
cacacccgga agaacatcaa gagcatccac accctccttc agaacttggc caaggcatct 1080
cccgtctacc tggatatcct aggc 1104
<210> 67
<211> 93
<212> DNA
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 67
atgtcgccct ggccgaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttatgcttg 60
ctggtcttgg gcttctggag ggcttctctt gcc 93
<210> 68
<211> 1194
<212> DNA
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 68
tgccccatgt cctgcaaatg cagcaccact aggatttggt gtaccgagcc ttctcctggc 60
atcgtggcat ttccgaggtt ggaacctaac agcattgacc cagagaacat caccgaaatt 120
ctcattgcaa accagaaaag gttagaaatc atcaatgaag atgatgtcga agcttacgtg 180
gggctgaaaa accttacaat tgtggattcc ggcttaaagt ttgtggctta caaggcgttt 240
ctgaagaacg gcaacctgcg gcacatcaat ttcactcgaa acaagctgac gagtttgtcc 300
aggagacatt tccgccacct tgacttgtct gacctgatcc tgacgggtaa tccgttcacg 360
tgttcctgtg acatcatgtg gctcaagact ctccaggaga cgaaatccag ccccgacact 420
caggatttgt attgcctcaa tgagagcagc aagaataccc ctctggcgaa cctgcagatt 480
cccaattgtg gtctgccgtc tgcacgtctg gccgctccta acctcacggt ggaggaaggg 540
aagtctgtga ccatttcctg cagcgtcggg ggtgacccgc tccccacctt gtactgggac 600
gttgggaatt tggtttccaa acacatgaat gaaacaagcc acacacaggg ctccttaagg 660
ataacaaaca tttcatcgga tgacagtggg aaacaaatct cttgtgtggc agaaaacctc 720
gttggagaag atcaagactc tgtgaacctc actgtgcatt ttgcaccaac catcacattt 780
ctcgaatctc caacctcaga ccaccactgg tgcatcccat tcactgtgag aggcaacccc 840
aagccagcac ttcagtggtt ctacaacgga gccatactga atgaatccaa gtacatctgt 900
accaaaatac acgtcaccaa tcacacggag taccacggct gcctccagct ggataacccc 960
actcatatga ataatggaga ctacacccta atggccaaga atgaatatgg gaaggacgag 1020
agacagattt ctgctcactt catgggccgg cctggagttg actatgagac aaacccaaat 1080
taccctgaag tcctctatga agactggacc acgccaactg acatcgggga tactacaaac 1140
aaaagtaatg agatcccctc cacggatgtt gctgaccaaa ccaatcggga gcat 1194
<210> 69
<211> 72
<212> DNA
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 69
ctctcggtct atgccgtggt ggtgattgcc tctgtggtag gattctgcct gctggtgatg 60
ctgcttctgc tc 72
<210> 70
<211> 1104
<212> DNA
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 70
aagttggcga gacattccaa gtttggcatg aaaggcccag cttccgtcat cagcaacgac 60
gatgactctg ccagccctct ccaccacatc tccaacggga gcaacactcc gtcttcttcg 120
gagggcgggc ccgatgctgt catcattggg atgaccaaga tccctgtcat tgaaaacccc 180
cagtacttcg gtatcaccaa cagccagctc aagccggaca catttgttca gcacatcaag 240
agacacaaca tcgttctgaa gagggagctt ggagaaggag cctttgggaa agttttccta 300
gcggagtgct ataacctctg ccccgagcag gataagatcc tggtggccgt gaagacgctg 360
aaggacgcca gcgacaatgc tcgcaaggac tttcatcgcg aagccgagct gctgaccaac 420
ctccagcacg agcacattgt caagttctac ggtgtctgtg tggagggcga cccactcatc 480
atggtctttg agtacatgaa gcacggggac ctcaacaagt tccttagggc acacgggcca 540
gatgcagtgc tgatggcaga gggtaacccg cccaccgagc tgacgcagtc gcagatgctg 600
cacatcgctc agcaaatcgc agcaggcatg gtctacctgg catcccaaca cttcgtgcac 660
cgagacctgg ccacccggaa ctgcttggta ggagagaacc tgctggtgaa aattggggac 720
ttcgggatgt cccgggatgt atacagcacc gactactacc gggttggtgg ccacacaatg 780
ttgcccatcc gatggatgcc tccagagagc atcatgtaca ggaaattcac caccgagagt 840
gacgtctgga gcctgggagt tgtgttgtgg gagatcttca cctacggcaa gcagccctgg 900
tatcagctat caaacaacga ggtgatagaa tgcatcaccc agggcagagt ccttcagcgg 960
cctcgcacgt gtccccagga ggtgtacgag ctgatgctgg gatgctggca gcgggaacca 1020
cacacaagga agaacatcaa gaacatccac acactccttc agaacttggc gaaggcgtcg 1080
cccgtctacc tggacatcct aggc 1104
<210> 71
<211> 93
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 71
atgtcgtcct ggataaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttctgctgg 60
ctggttgtgg gcttctggag ggccgctttc gcc 93
<210> 72
<211> 1197
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 72
tgtcccacgt cctgcaaatg cagtgcctct cggatctggt gcagcgaccc ttctcctggc 60
atcgtggcat ttccgagatt ggagcctaac agtgtagatc ctgagaacat caccgaaatt 120
ttcatcgcaa accagaaaag gttagaaatc atcaacgaag atgatgttga agcttatgtg 180
ggactgagaa atctgacaat tgtggattct ggattaaaat ttgtggctca taaagcattt 240
ctgaaaaaca gcaacctgca gcacatcaat tttacccgaa acaaactgac gagtttgtct 300
aggaaacatt tccgtcacct tgacttgtct gaactgatcc tggtgggcaa tccatttaca 360
tgctcctgtg acattatgtg gatcaagact ctccaagagg ctaaatccag tccagacact 420
caggatttgt actgcctgaa tgaaagcagc aagaatattc ccctggcaaa cctgcagata 480
cccaattgtg gtttgccatc tgcaaatctg gccgcaccta acctcactgt ggaggaagga 540
aagtctatca cattatcctg tagtgtggca ggtgatccgg ttcctaatat gtattgggat 600
gttggtaacc tggtttccaa acatatgaat gaaacaagcc acacacaggg ctccttaagg 660
ataactaaca tttcatccga tgacagtggg aagcagatct cttgtgtggc ggaaaatctt 720
gtaggagaag atcaagattc tgtcaacctc actgtgcatt ttgcaccaac tatcacattt 780
ctcgaatctc caacctcaga ccaccactgg tgcattccat tcactgtgaa aggcaacccc 840
aaaccagcgc ttcagtggtt ctataacggg gcaatattga atgagtccaa atacatctgt 900
actaaaatac atgttaccaa tcacacggag taccacggct gcctccagct ggataatccc 960
actcacatga acaatgggga ctacactcta atagccaaga atgagtatgg gaaggatgag 1020
aaacagattt ctgctcactt catgggctgg cctggaattg acgatggtgc aaacccaaat 1080
tatcctgatg taatttatga agattatgga actgcagcga atgacatcgg ggacaccacg 1140
aacagaagta atgaaatccc ttccacagac gtcactgata aaaccggtcg ggaacat 1197
<210> 73
<211> 72
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 73
ctctcggtct atgctgtggt ggtgattgcg tctgtggtgg gattttgcct tttggtaatg 60
ctgtttctgc tt 72
<210> 74
<211> 1152
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 74
aagttggcaa gacactccaa gtttggcatg aaagatttct catggtttgg atttgggaaa 60
gtaaaatcaa gacaaggtgt tggcccagcc tccgttatca gcaatgatga tgactctgcc 120
agcccactcc atcacatctc caatgggagt aacactccat cttcttcgga aggtggccca 180
gatgctgtca ttattggaat gaccaagatc cctgtcattg aaaatcccca gtactttggc 240
atcaccaaca gtcagctcaa gccagacaca tttgttcagc acatcaagcg acataacatt 300
gttctgaaaa gggagctagg cgaaggagcc tttggaaaag tgttcctagc tgaatgctat 360
aacctctgtc ctgagcagga caagatcttg gtggcagtga agaccctgaa ggatgccagt 420
gacaatgcac gcaaggactt ccaccgtgag gccgagctcc tgaccaacct ccagcatgag 480
cacatcgtca agttctatgg cgtctgcgtg gagggcgacc ccctcatcat ggtctttgag 540
tacatgaagc atggggacct caacaagttc ctcagggcac acggccctga tgccgtgctg 600
atggctgagg gcaacccgcc cacggaactg acgcagtcgc agatgctgca tatagcccag 660
cagatcgccg cgggcatggt ctacctggcg tcccagcact tcgtgcaccg cgatttggcc 720
accaggaact gcctggtcgg ggagaacttg ctggtgaaaa tcggggactt tgggatgtcc 780
cgggacgtgt acagcactga ctactacagg gtcggtggcc acacaatgct gcccattcgc 840
tggatgcctc cagagagcat catgtacagg aaattcacga cggaaagcga cgtctggagc 900
ctgggggtcg tgttgtggga gattttcacc tatggcaaac agccctggta ccagctgtca 960
aacaatgagg tgatagagtg tatcactcag ggccgagtcc tgcagcgacc ccgcacgtgc 1020
ccccaggagg tgtatgagct gatgctgggg tgctggcagc gagagcccca catgaggaag 1080
aacatcaagg gcatccatac cctccttcag aacttggcca aggcatctcc ggtctacctg 1140
gacattctag gc 1152
<210> 75
<211> 822
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> 信号肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(430)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (431)..(454)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (455)..(822)
<223> 细胞质结构域
<400> 75
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
465 470 475 480
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
485 490 495
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
500 505 510
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
515 520 525
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
530 535 540
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
545 550 555 560
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
565 570 575
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
580 585 590
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
595 600 605
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
610 615 620
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
625 630 635 640
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
645 650 655
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
660 665 670
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
675 680 685
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
690 695 700
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
705 710 715 720
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
725 730 735
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
740 745 750
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
755 760 765
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
770 775 780
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile
785 790 795 800
Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
805 810 815
Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
820
<210> 76
<211> 8498
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 76
cctcgaggtg cataccggac ccccattcgc atctaacaag gaatctgcgc cccagagagt 60
cccgggagcg ccgccggtcg gtgcccggcg cgccgggcca tgcagcgacg gccgccgcgg 120
agctccgagc agcggtagcg cccccctgta aagcggttcg ctatgccggg gccactgtga 180
accctgccgc ctgccggaac actcttcgct ccggaccagc tcagcctctg ataagctgga 240
ctcggcacgc ccgcaacaag caccgaggag ttaagagagc cgcaagcgca gggaaggcct 300
ccccgcacgg gtgggggaaa gcggccggtg cagcgcgggg acaggcactc gggctggcac 360
tggctgctag ggatgtcgtc ctggataagg tggcatggac ccgccatggc gcggctctgg 420
ggcttctgct ggctggttgt gggcttctgg agggccgctt tcgcctgtcc cacgtcctgc 480
aaatgcagtg cctctcggat ctggtgcagc gacccttctc ctggcatcgt ggcatttccg 540
agattggagc ctaacagtgt agatcctgag aacatcaccg aaattttcat cgcaaaccag 600
aaaaggttag aaatcatcaa cgaagatgat gttgaagctt atgtgggact gagaaatctg 660
acaattgtgg attctggatt aaaatttgtg gctcataaag catttctgaa aaacagcaac 720
ctgcagcaca tcaattttac ccgaaacaaa ctgacgagtt tgtctaggaa acatttccgt 780
caccttgact tgtctgaact gatcctggtg ggcaatccat ttacatgctc ctgtgacatt 840
atgtggatca agactctcca agaggctaaa tccagtccag acactcagga tttgtactgc 900
ctgaatgaaa gcagcaagaa tattcccctg gcaaacctgc agatacccaa ttgtggtttg 960
ccatctgcaa atctggccgc acctaacctc actgtggagg aaggaaagtc tatcacatta 1020
tcctgtagtg tggcaggtga tccggttcct aatatgtatt gggatgttgg taacctggtt 1080
tccaaacata tgaatgaaac aagccacaca cagggctcct taaggataac taacatttca 1140
tccgatgaca gtgggaagca gatctcttgt gtggcggaaa atcttgtagg agaagatcaa 1200
gattctgtca acctcactgt gcattttgca ccaactatca catttctcga atctccaacc 1260
tcagaccacc actggtgcat tccattcact gtgaaaggca accccaaacc agcgcttcag 1320
tggttctata acggggcaat attgaatgag tccaaataca tctgtactaa aatacatgtt 1380
accaatcaca cggagtacca cggctgcctc cagctggata atcccactca catgaacaat 1440
ggggactaca ctctaatagc caagaatgag tatgggaagg atgagaaaca gatttctgct 1500
cacttcatgg gctggcctgg aattgacgat ggtgcaaacc caaattatcc tgatgtaatt 1560
tatgaagatt atggaactgc agcgaatgac atcggggaca ccacgaacag aagtaatgaa 1620
atcccttcca cagacgtcac tgataaaacc ggtcgggaac atctctcggt ctatgctgtg 1680
gtggtgattg cgtctgtggt gggattttgc cttttggtaa tgctgtttct gcttaagttg 1740
gcaagacact ccaagtttgg catgaaaggc ccagcctccg ttatcagcaa tgatgatgac 1800
tctgccagcc cactccatca catctccaat gggagtaaca ctccatcttc ttcggaaggt 1860
ggcccagatg ctgtcattat tggaatgacc aagatccctg tcattgaaaa tccccagtac 1920
tttggcatca ccaacagtca gctcaagcca gacacatttg ttcagcacat caagcgacat 1980
aacattgttc tgaaaaggga gctaggcgaa ggagcctttg gaaaagtgtt cctagctgaa 2040
tgctataacc tctgtcctga gcaggacaag atcttggtgg cagtgaagac cctgaaggat 2100
gccagtgaca atgcacgcaa ggacttccac cgtgaggccg agctcctgac caacctccag 2160
catgagcaca tcgtcaagtt ctatggcgtc tgcgtggagg gcgaccccct catcatggtc 2220
tttgagtaca tgaagcatgg ggacctcaac aagttcctca gggcacacgg ccctgatgcc 2280
gtgctgatgg ctgagggcaa cccgcccacg gaactgacgc agtcgcagat gctgcatata 2340
gcccagcaga tcgccgcggg catggtctac ctggcgtccc agcacttcgt gcaccgcgat 2400
ttggccacca ggaactgcct ggtcggggag aacttgctgg tgaaaatcgg ggactttggg 2460
atgtcccggg acgtgtacag cactgactac tacagggtcg gtggccacac aatgctgccc 2520
attcgctgga tgcctccaga gagcatcatg tacaggaaat tcacgacgga aagcgacgtc 2580
tggagcctgg gggtcgtgtt gtgggagatt ttcacctatg gcaaacagcc ctggtaccag 2640
ctgtcaaaca atgaggtgat agagtgtatc actcagggcc gagtcctgca gcgaccccgc 2700
acgtgccccc aggaggtgta tgagctgatg ctggggtgct ggcagcgaga gccccacatg 2760
aggaagaaca tcaagggcat ccataccctc cttcagaact tggccaaggc atctccggtc 2820
tacctggaca ttctaggcta gggccctttt ccccagaccg atccttccca acgtactcct 2880
cagacgggct gagaggatga acatctttta actgccgctg gaggccacca agctgctctc 2940
cttcactctg acagtattaa catcaaagac tccgagaagc tctcgaggga agcagtgtgt 3000
acttcttcat ccatagacac agtattgact tctttttggc attatctctt tctctctttc 3060
catctccctt ggttgttcct ttttcttttt ttaaattttc tttttctttt ttttttcgtc 3120
ttccctgctt cacgattctt accctttctt ttgaatcaat ctggcttctg cattactatt 3180
aactctgcat agacaaaggc cttaacaaac gtaatttgtt atatcagcag acactccagt 3240
ttgcccacca caactaacaa tgccttgttg tattcctgcc tttgatgtgg atgaaaaaaa 3300
gggaaaacaa atatttcact taaactttgt cacttctgct gtacagatat cgagagtttc 3360
tatggattca cttctattta tttattatta ttactgttct tattgttttt ggatggctta 3420
agcctgtgta taaaaaagaa aacttgtgtt caatctgtga agcctttatc tatgggagat 3480
taaaaccaga gagaaagaag atttattatg aaccgcaata tgggaggaac aaagacaacc 3540
actgggatca gctggtgtca gtccctactt aggaaatact cagcaactgt tagctgggaa 3600
gaatgtattc ggcaccttcc cctgaggacc tttctgagga gtaaaaagac tactggcctc 3660
tgtgccatgg atgattcttt tcccatcacc agaaatgata gcgtgcagta gagagcaaag 3720
atggcttccg tgagacacaa gatggcgcat agtgtgctcg gacacagttt tgtcttcgta 3780
ggttgtgatg atagcactgg tttgtttctc aagcgctatc cacagaacct ttgtcaactt 3840
cagttgaaaa gaggtggatt catgtccaga gctcatttcg gggtcaggtg ggaaagccaa 3900
gaacttggaa aagataagac aagctataaa ttcggaggca agtttctttt acaatgaact 3960
tttcagatct cacttccctc cgacccctaa cttccatgcc cacccgtcct tttaactgtg 4020
caagcaaaat tgtgcatggt cttcgtcgat taataccttg tgtgcagaca ctactgctcc 4080
agacgtcgtt tccctgatag gtagagcaga tccataaaaa ggtatgactt atacaattag 4140
gggaagctaa tggagtttat tagctgagta tcaatgtctc tgcgttgtac ggtggtgatg 4200
ggttttaatg aatatggacc ctgaagcctg gaaatcctca tccacgtcga acccacagga 4260
ctgtgggaag ggcagaatca atccctaagg gaaaggaaac ctcaccctga gggcatcaca 4320
tgcactcatg ttcagtgtac acaggtcaag tcccttgctc tgggctctag ttgggagagt 4380
ggtttcattc caagtgtact ccattgtcag tatgctgttt ttgtttcctt cactccattc 4440
aaaaagtcaa aatacaaaat ttggcacagc atgccaacgg gaggctgtgc ccagaccaag 4500
cactggaagt gtgcttctag gcatagtcat tggttttgca aaaagagggc tcaaatttaa 4560
atagaaattt acagctattt gaatggtcag atataccaag aaagaaaaat atttctgttc 4620
ctcaagaaaa cttgctaccc tctgtgaggg gaattttgct aaacttgaca tctttataac 4680
atgagccaga ttgaaaggga gtgattttca ttcatcttag gtcatgttat ttcatatttg 4740
tttctgaagg tgcgatagct ctgttttagg ttttgcttgc gcctgttaat tactggaaca 4800
ccttattttt cattaaaggc tttgaaagcc aattctcaaa aattcaaaag tgcaaattaa 4860
cagaacaaaa ggaaatccag tagcaactgc agtcaagcga gggagttgac aagataaacc 4920
ttacgtccat tcaagttata tgctggccta tgagagatga gagttgggtc gtttgttctc 4980
tttgttgatg attttaaaaa aaccctctag aatacacata ataacataat gaaagccata 5040
tctccatgat atatatgtgc acatatatat acatacatgt gcatgtatgt atcatattaa 5100
ggacccatgg tactcttaaa acactgtaga actctgtgac gcagtaagga aggggcagat 5160
ttgtacaaaa acttttctag attccatcag caaaaaccaa cacaggtttg tcacgctgca 5220
tgtctggcca gctaatctcg ggggaaaagc tacaagttat ttattttatt ttaagagaat 5280
aaagtaggta ataatttaag ggatcaaatt caaggaggaa tgtgcaattt tagagcaaag 5340
atttgtttaa ggcaaatgag actttgggag catcccattc cagttttgtc ttttttttct 5400
ctgaaagaaa aaagcaaaaa ataaaataaa attccactta taccttctga caagtcccta 5460
aaggtcttga aataaaaggt tctatgcaag tgcaaagttt tatagttatt tttattgctg 5520
attattacta ttactatctc tgttgtctta agagtatgtg ctgatttcag agacatctca 5580
aattgaaaga atatcagatt gcttttaaag tagctgaacg agccacagaa tatctgaaat 5640
tattcattgt tgttcctcca ccaccccctt tctcatggtc tgatttttag aagagtggca 5700
tcctcgttct aaaatgtaat gatcaccaaa tacggccttc catcaaattt gtgaaaacta 5760
caacagtata acagtgacaa acctaattct ctagcccaaa cctggtctga caatcatttc 5820
catttagaag tcattgaata gttttccaaa cactttccat gtgtgttagc aaattattcc 5880
tattttgtgt agatgaggac gttgagactc agagacattc agaggcacgc tagaggtctc 5940
cagcctagct tccagcacca ttgggactga atccaagtac tctcactctg aacttcgtgg 6000
ttctgtccac tagagactct aatatgcaaa caagcagttc aggaaagaaa gcatgctaac 6060
acattcatga agcagtatat gaagttagaa gaacaaaagg aaatacagga gatgacaagc 6120
aactgagata ttgtgatata taatcatgct cttagcttca gctaaattca gctaaattct 6180
tgtacactga accaatgtca taatcaggct tatttagaaa acactttgaa ctatgctata 6240
aaagattata tcagaattca tattatacat gtgttcacat cagcgctacc tgtgatgttt 6300
tcatgtattt atgtatgtgt tataaatact tgatttatac atatacaaat gcacatacgt 6360
agtgtgtttg tgtgtttatg tataaattta taggcacaca ataatagagg taattataag 6420
taggatgcgg tatgaataat ttgcttaaaa tatgctaaat aaccaaaact gtttaacgtc 6480
atgttgctgt tagtgcttcc atactccacg tgggtaggac tacatcacac ttttcaactc 6540
tgtgcagtac tgcatgggtg gaagacatat ttaagataat gtgcttccca aaacaactga 6600
ataaaagcca tcccactaca ttgagtgctt tctctggctc cttgcaaaga aagatacttt 6660
ttgtaatggt ccaggaaagg aacattgctt tctttttgtc tttcagcaca tttgtattat 6720
gctcaccttg tctctgtctc actgtgaccc ctttacactt gagttcagag ttcaagcatt 6780
ccaaatataa attggaatgt tggcagccca gtggcttgaa ggccaatgat gagcagtcca 6840
agaccccaca gcgagatgag caactcttag gaattcccac atcctagagt gaatgcacca 6900
actaacagta tagaatgctg tccttttcaa agcgtcctaa cagcaggatt acctggtcaa 6960
gtatggactt tctttgaatc tttcttttca caaattggac tgcctgtaat accaataaca 7020
ttgttgtatc taactaaata aatgactgca tatacacaca taccctcaat tctcttgctt 7080
ccccattttc tttttcatcc cctgtctcag gacttttatt ttcaatgttg acctttggtt 7140
tggccatata tcactgttat aggaaatctc atgagaggaa tggctagtga cccaactctc 7200
caaatgtcta agttagtagt tacagctgat tttttatgat gcataattgg aatgtggagc 7260
ctctgaggtt gtgatagctt gtacatgaat ttcaaatgtc attctaaaga atgaggggtg 7320
ggagggattt atagttagaa acgacagtgc aggaaggggt attttcttgt tgtcagggct 7380
ggaatgaatc actgctgctc aagtcaaagg ttcttgaata tccttagttt ttgcatttcc 7440
cctccttttc ctttgacctt tatttattta attatgtatt tatttattta tttatatact 7500
tttgctccat tcagcacaaa cacaaagcaa agcaaaaaaa aaaatatata tatatatatc 7560
tgtatatgtg ttgtaggcaa aacactgtga atttcacaac aaccaccacc aagcaactat 7620
tttgccatct taacatacat ctcaggagac gaaatgagaa aagatgggga tgtcattttt 7680
tagtctatgc gtttgaggcc aggtccatgt ttatttattt ctttagtcta tgcattaatg 7740
aaaatgatcc tgagtggagg ttagctgaac gttcaatgta ctggagcaag catcataaaa 7800
gctgctagta gccatgtgtt tgaacaggaa aaatattaca gaaaatgaaa tgtaaaggcc 7860
tatatcttgc agcttgtata tcttactatt gcttaaaaaa tgtataaagc agctggaaat 7920
gttttaaata caaggtcttt gaattaaatg tggattttaa atatgtaatc ccttgacaaa 7980
tgaccaaatt atggtgaact attgctccct gcgttctttg atcattacct atgacttaca 8040
aatctgcctg gagatgtgga cattctgcat ttgcttctgt atctggagag atgtttgtat 8100
atatccaggc cgtatacaca cacatttcca tatctctcta cagatatatt tccccttcaa 8160
tcgtgacctg gtatttggaa ctctcctttt catttggctt atcttccttt taatgtgatg 8220
tctctgtgct aatacttacc agttcttgtt ttgcaatctg ttttgaggtc cattgcttta 8280
ctaagaccca ctgcatcttg gctgatttca aagtgacacc tgaatacagt gtttaaaaaa 8340
aaaaaagttt tgtttgtaaa tcatgtgacc agcttctctc aacctgacat ggaaagtctc 8400
ttgtactaca gtgtatttaa taaaaatgat gtcttacaat aaataacata ctccaaaaga 8460
gagactaaaa atgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 8498
<210> 77
<211> 2469
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(93)
<223> 信号肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(1290)
<223> 细胞外结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1291)..(1362)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (1363)..(2466)
<223> 细胞质结构域
<400> 77
atgtcgtcct ggataaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttctgctgg 60
ctggttgtgg gcttctggag ggccgctttc gcctgtccca cgtcctgcaa atgcagtgcc 120
tctcggatct ggtgcagcga cccttctcct ggcatcgtgg catttccgag attggagcct 180
aacagtgtag atcctgagaa catcaccgaa attttcatcg caaaccagaa aaggttagaa 240
atcatcaacg aagatgatgt tgaagcttat gtgggactga gaaatctgac aattgtggat 300
tctggattaa aatttgtggc tcataaagca tttctgaaaa acagcaacct gcagcacatc 360
aattttaccc gaaacaaact gacgagtttg tctaggaaac atttccgtca ccttgacttg 420
tctgaactga tcctggtggg caatccattt acatgctcct gtgacattat gtggatcaag 480
actctccaag aggctaaatc cagtccagac actcaggatt tgtactgcct gaatgaaagc 540
agcaagaata ttcccctggc aaacctgcag atacccaatt gtggtttgcc atctgcaaat 600
ctggccgcac ctaacctcac tgtggaggaa ggaaagtcta tcacattatc ctgtagtgtg 660
gcaggtgatc cggttcctaa tatgtattgg gatgttggta acctggtttc caaacatatg 720
aatgaaacaa gccacacaca gggctcctta aggataacta acatttcatc cgatgacagt 780
gggaagcaga tctcttgtgt ggcggaaaat cttgtaggag aagatcaaga ttctgtcaac 840
ctcactgtgc attttgcacc aactatcaca tttctcgaat ctccaacctc agaccaccac 900
tggtgcattc cattcactgt gaaaggcaac cccaaaccag cgcttcagtg gttctataac 960
ggggcaatat tgaatgagtc caaatacatc tgtactaaaa tacatgttac caatcacacg 1020
gagtaccacg gctgcctcca gctggataat cccactcaca tgaacaatgg ggactacact 1080
ctaatagcca agaatgagta tgggaaggat gagaaacaga tttctgctca cttcatgggc 1140
tggcctggaa ttgacgatgg tgcaaaccca aattatcctg atgtaattta tgaagattat 1200
ggaactgcag cgaatgacat cggggacacc acgaacagaa gtaatgaaat cccttccaca 1260
gacgtcactg ataaaaccgg tcgggaacat ctctcggtct atgctgtggt ggtgattgcg 1320
tctgtggtgg gattttgcct tttggtaatg ctgtttctgc ttaagttggc aagacactcc 1380
aagtttggca tgaaaggccc agcctccgtt atcagcaatg atgatgactc tgccagccca 1440
ctccatcaca tctccaatgg gagtaacact ccatcttctt cggaaggtgg cccagatgct 1500
gtcattattg gaatgaccaa gatccctgtc attgaaaatc cccagtactt tggcatcacc 1560
aacagtcagc tcaagccaga cacatttgtt cagcacatca agcgacataa cattgttctg 1620
aaaagggagc taggcgaagg agcctttgga aaagtgttcc tagctgaatg ctataacctc 1680
tgtcctgagc aggacaagat cttggtggca gtgaagaccc tgaaggatgc cagtgacaat 1740
gcacgcaagg acttccaccg tgaggccgag ctcctgacca acctccagca tgagcacatc 1800
gtcaagttct atggcgtctg cgtggagggc gaccccctca tcatggtctt tgagtacatg 1860
aagcatgggg acctcaacaa gttcctcagg gcacacggcc ctgatgccgt gctgatggct 1920
gagggcaacc cgcccacgga actgacgcag tcgcagatgc tgcatatagc ccagcagatc 1980
gccgcgggca tggtctacct ggcgtcccag cacttcgtgc accgcgattt ggccaccagg 2040
aactgcctgg tcggggagaa cttgctggtg aaaatcgggg actttgggat gtcccgggac 2100
gtgtacagca ctgactacta cagggtcggt ggccacacaa tgctgcccat tcgctggatg 2160
cctccagaga gcatcatgta caggaaattc acgacggaaa gcgacgtctg gagcctgggg 2220
gtcgtgttgt gggagatttt cacctatggc aaacagccct ggtaccagct gtcaaacaat 2280
gaggtgatag agtgtatcac tcagggccga gtcctgcagc gaccccgcac gtgcccccag 2340
gaggtgtatg agctgatgct ggggtgctgg cagcgagagc cccacatgag gaagaacatc 2400
aagggcatcc ataccctcct tcagaacttg gccaaggcat ctccggtcta cctggacatt 2460
ctaggctag 2469
<210> 78
<211> 354
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cagcttcagt agctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgtcagtt atatcatatg atggaattaa tacatactat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acggcctgag agctgaggac acggctcttt attactgtgt gcaagggtca 300
attggaaccg tttttgaata ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ile Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Gln Gly Ser Ile Gly Thr Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
ggattcagct tcagtagctt tggc 24
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Phe Gly
1 5
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
atatcatatg atggaattaa taca 24
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
Ile Ser Tyr Asp Gly Ile Asn Thr
1 5
<210> 84
<211> 33
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
gtgcaagggt caattggaac cgtttttgaa tac 33
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
Val Gln Gly Ser Ile Gly Thr Val Phe Glu Tyr
1 5 10
<210> 86
<211> 321
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagttc ctaaactcct gatctatgct gcatccactt tacaatcagg ggtcccatct 180
cggttcggtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataccagtg ccccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
cagggcatta gcaattat 18
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
gctgcatcc 9
<210> 91
<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
Ala Ala Ser
1
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
caaaagtata ccagtgcccc attcact 27
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Phe Thr
1 5
<210> 94
<211> 366
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctaaaactc 60
tcctgtacag cctctgggtt caccttcagt ggctctgtta ttcactgggt ccgccaggct 120
tccgggaaag ggctggagtg gattggccgt attagaaaca aggctaacag ttacgcgaca 180
gcatatggtg cgtcggtgac aggcaggttc accatctcca gagatgattc aaagaacacg 240
gcgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtttatta ctgtactttc 300
ccgggtgtag tgggacgagg aggttttgac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 95
<211> 122
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Gly Ala
50 55 60
Ser Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Phe Pro Gly Val Val Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
gggttcacct tcagtggctc tgtt 24
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Val
1 5
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
attagaaaca aggctaacag ttacgcgaca 30
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 100
<211> 39
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
actttcccgg gtgtagtggg acgaggaggt tttgactac 39
<210> 101
<211> 13
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Thr Phe Pro Gly Val Val Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 102
<211> 339
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gggggccacc 60
atcaactgca tgtccagcca gagtgtttta ttcagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccaac agaaaccagg acagcctcct aagttgctct tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcggtggc agcgggtctg ggacagattt ctctctcacc 240
atcaacagcc tgcagactga agatgtggca gtttattact gtctccaata ttatagtatt 300
ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 103
<211> 113
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Ile Asn Cys Met Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 104
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
cagagtgttt tattcagctc caacaataag aactac 36
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
Gln Ser Val Leu Phe Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 9
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
tgggcatct 9
<210> 107
<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
Trp Ala Ser
1
<210> 108
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
ctccaatatt atagtattcc gtggacg 27
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
Leu Gln Tyr Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 110
<211> 381
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgacactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caatttccgt gattatgaaa tgatctgggt ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggagtg gatttcatac attagtaata gtggttatac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaggaa ctcaatatat 240
ctgcaagtga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgttc gagacgtact 300
actatgattc ggggcattag ggcgtactac tattacggtc tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc a 381
<210> 111
<211> 127
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Ile Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Arg Thr Thr Met Ile Arg Gly Ile Arg Ala Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
ggattcaatt tccgtgatta tgaa 24
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
Gly Phe Asn Phe Arg Asp Tyr Glu
1 5
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
attagtaata gtggttatac cata 24
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
Ile Ser Asn Ser Gly Tyr Thr Ile
1 5
<210> 116
<211> 60
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
tcgagacgta ctactatgat tcggggcatt agggcgtact actattacgg tctggacgtc 60
<210> 117
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
Ser Arg Arg Thr Thr Met Ile Arg Gly Ile Arg Ala Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Val
20
<210> 118
<211> 324
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 119
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
cagagcatta gcagctat 18
<210> 121
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
gctgcatcc 9
<210> 123
<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
Ala Ala Ser
1
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10

Claims (57)

1.一种非人动物，其包含编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座，其中所述TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的所述细胞外结构域由内源TrkB基因座的片段编码，所述内源TrkB基因座的片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代。
2.根据权利要求1所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含人TRKB细胞外结构域。
3.根据权利要求2所述的非人动物，其中所述细胞外结构域包含SEQ ID NO：60所示的序列。
4.根据权利要求2或3所述的非人动物，其中全部所述细胞外结构域均由所述内源TrkB基因座的片段编码，所述内源TrkB基因座的片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代，可选地，其中所述细胞外结构域的编码序列包含SEQ ID NO：72所示的序列。
5.根据前述任一权利要求所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含内源信号肽。
6.根据权利要求5所述的非人动物，其中所述信号肽包含SEQ ID NO：51或55所示的序列。
7.根据权利要求5或6所述的非人动物，其中全部所述信号肽均由内源TrkB序列编码，可选地，其中所述信号肽的编码序列包含SEQ ID NO：63或67所示的序列。
8.根据前述任一权利要求所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含内源TRKB跨膜结构域。
9.根据权利要求8所述的非人动物，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：53或57所示的序列。
10.根据权利要求8或9所述的非人动物，其中全部所述跨膜结构域均由内源TrkB序列编码，可选地，其中所述跨膜结构域的编码序列包含SEQ ID NO：65或69所示的序列。
11.根据前述任一权利要求所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含内源TRKB细胞质结构域。
12.根据权利要求11所述的非人动物，其中所述细胞质结构域包含SEQ ID NO：54或58所示的序列。
13.根据权利要求11或12所述的非人动物，其中全部所述细胞质结构域均由内源TrkB序列编码，可选地，其中所述细胞质结构域的编码序列包含SEQ ID NO：66或70中所示的序列。
14.根据前述任一权利要求所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含内源TRKB信号肽、内源TRKB跨膜结构域，和内源TRKB细胞质结构域。
15.根据权利要求14所述的非人动物，
其中所述信号肽包含SEQ ID NO：51所示的序列，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：53所示的序列，且所述细胞质结构域包含SEQ ID NO：54所示的序列；或
其中所述信号肽包含SEQ ID NO：55所示的序列，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：57所示的序列，且所述细胞质结构域包含SEQ ID NO：58所示的序列。
16.根据权利要求14或15所述的非人动物，其中全部的所述信号肽、全部的所述跨膜结构域，和全部的所述细胞质结构域由内源TrkB序列编码，
可选地，其中所述信号肽的编码序列包含SEQ ID NO：63所示的序列，所述跨膜结构域的编码序列包含SEQ ID NO：65所示的序列，且所述细胞质结构域的编码序列包含SEQ IDNO：66所示的序列，或
可选地，其中所述信号肽的编码序列包含SEQ ID NO：67所示的序列，所述跨膜结构域的编码序列包含SEQ ID NO：69所示的序列，且所述细胞质结构域的编码序列包含SEQ IDNO：70所示的序列。
17.根据前述任一权利要求所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白是嵌合非人动物/人TRKB蛋白。
18.根据权利要求17所述的非人动物，其中所述细胞外结构域是人TRKB细胞外结构域，所述跨膜结构域是内源TRKB蛋白跨膜结构域，且所述细胞质结构域是内源TRKB蛋白细胞质结构域。
19.根据权利要求17或18所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含SEQ ID NO：4或5所示的序列。
20.根据权利要求19所述的非人动物，其中编码所述TRKB蛋白的遗传修饰的TrkB基因座的编码序列包含SEQ ID NO：12或13所示的序列。
21.根据前述任一权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物的所述遗传修饰的内源TrkB基因座是杂合的。
22.根据权利要求1-20中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的所述遗传修饰的内源TrkB基因座是纯合的。
23.根据前述任一权利要求所述的非人动物，其中所述非人动物是哺乳动物。
24.根据权利要求23所述的非人动物，其中所述非人动物是啮齿动物。
25.根据权利要求24所述的非人动物，其中所述非人动物是大鼠或小鼠。
26.根据权利要求25所述的非人动物，其中所述非人动物是大鼠。
27.根据权利要求26所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含SEQ ID NO：5所示的序列。
28.根据权利要求27所述的非人动物，其中编码所述TRKB蛋白的遗传修饰的TrkB基因座的编码序列包含SEQ ID NO：13所示的序列。
29.根据权利要求25所述的非人动物，其中所述非人动物是小鼠。
30.根据权利要求29所述的非人动物，其中所述TRKB蛋白包含SEQ ID NO：4所示的序列。
31.根据权利要求30所述的非人动物，其中编码所述TRKB蛋白的遗传修饰的TrkB基因座的编码序列包含SEQ ID NO：12所示的序列。
32.评估人TRKB靶向试剂在体内的活性的方法，包括：
(a)向权利要求1-31中任意一项所述的非人动物施用所述人TRKB靶向试剂；及
(b)评估在所述非人动物中的所述人TRKB靶向试剂的活性。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(a)包括将所述人TRKB靶向试剂注射到所述非人动物中。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中步骤(b)包括相对于对照非人动物评估体重、身体组成、代谢，和运动中的一项或多项或全部的变化。
35.根据权利要求34所述的方法，其中评估身体组成的变化包括相对于对照非人动物评估瘦质量和/或脂肪质量。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中评估代谢的变化包括评估食物消耗的变化和/或水消耗的变化。
37.根据权利要求32-36中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括相对于对照非人动物评估TRKB磷酸化和/或MAPK/ERK和PI3K/Akt通路的激活。
38.根据权利要求32-27中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估神经保护活性。
39.根据权利要求38所述的方法，其中步骤(b)包括评估神经保护活性，且其中所述非人动物是大鼠。
40.根据权利要求32-39中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估视网膜神经节细胞的生存力。
41.根据权利要求40所述的方法，其中在视神经损伤后，在完全视神经横断模型中评估视网膜神经节细胞的生存力。
42.根据权利要求40所述的方法，其中在视神经粉碎模型中评估视网膜神经节细胞的生存力。
43.根据权利要求32-42中任意一项所述的方法，其中所述人TRKB靶向试剂是抗原结合蛋白。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是人TRKB激动剂抗体。
45.根据权利要求32-42中任意一项所述的方法，其中所述人TRKB靶向试剂是小分子。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述小分子是人TRKB激动剂。
47.制备根据权利要求1-31中任意一项所述的非人动物的方法，包括(a)向不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞引入：
(i)外源修复模板，其包含插入核酸，所述插入核酸侧接杂交至内源TrkB基因座处的5'靶序列的5'同源臂和杂交至内源TrkB基因座处的3'靶序列的3'同源臂，其中所述插入核酸包含种间同源人TRKB序列；以及
(ii)靶向所述内源TrkB基因座内的靶序列的核酸酶剂，
其中基因组被修饰以包含遗传修饰的内源TrkB基因座；
(b)将经修饰的非人动物多能细胞引入宿主胚胎；以及
(c)将所述宿主胚胎植入代孕母体内，以产生包含所述遗传修饰的内源TrkB基因座的遗传修饰的F0代非人动物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述多能细胞是胚胎干(ES)细胞。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述核酸酶剂是Cas9蛋白和靶向所述内源TrkB基因座内的指导RNA靶序列的指导RNA。
50.根据权利要求49所述的方法，其中步骤(a)还包括将第二指导RNA引入所述非人动物多能细胞，所述第二指导RNA靶向所述内源TrkB基因座内的第二指导RNA靶序列。
51.根据权利要求47-50中任意一项所述的方法，其中所述外源修复模板是长度至少为10kb的大靶向载体，或者其中所述外源修复模板是大靶向载体，其中所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度至少为10kb。
52.制备根据权利要求1-31中任意一项所述的非人动物的方法，包括：
(a)向非人动物单细胞期胚胎引入：
(i)外源修复模板，其包含插入核酸，所述插入核酸侧接杂交至内源TrkB基因座处的5'靶序列的5'同源臂和杂交至所述内源TrkB基因座处的3'靶序列的3'同源臂，其中所述插入核酸包含种间同源人TRKB序列；以及
(ii)靶向所述内源TrkB基因座内的靶序列的核酸酶剂，
其中基因组被修饰以包含遗传修饰的内源TrkB基因座；以及
(b)将经修饰的非人动物单细胞期胚胎植入代孕母体中，以产生包含所述遗传修饰的内源TrkB基因座的遗传修饰的F0代非人动物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述核酸酶剂是Cas9蛋白和靶向所述内源TrkB基因座内的指导RNA靶序列的指导RNA。
54.根据权利要求53所述的方法，其中步骤(a)还包括将第二指导RNA引入所述非人动物单细胞期胚胎，所述第二指导RNA靶向所述内源TrkB基因座内的第二指导RNA靶序列。
55.非人动物细胞，其包含编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座，其中所述TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的所述细胞外结构域由所述内源TrkB基因座的片段编码，所述内源TrkB基因座的片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代。
56.非人动物基因组，其包含编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座，其中所述TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的所述细胞外结构域由所述内源TrkB基因座的片段编码，所述内源TrkB基因座的片段已被删除并被种间同源人TRKB序列取代。
57.用于产生编码TRKB蛋白的遗传修饰的内源TrkB基因座的靶向载体，
其中所述TRKB蛋白包含细胞质结构域、跨膜结构域，和细胞外结构域，且全部或部分的所述细胞外结构域由内源TrkB基因座的片段编码，所述内源TrkB基因座的片段已经被删除并被种间同源人TRKB序列取代，以及
其中所述靶向载体包含插入核酸，所述插入核酸包含所述种间同源人TRKB序列，所述种间同源人TRKB序列侧接靶向所述内源TrkB基因座处的5'靶序列的5'同源臂和靶向所述内源TrkB基因座处的3'靶序列的3'同源臂。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
CN116420679A (zh) 2018-03-26 2023-07-14 瑞泽恩制药公司 用于测试治疗剂的人源化啮齿动物
LT3823443T (lt) 2018-07-16 2024-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ditra ligos graužikų modeliai ir jų naudojimas
US20230081547A1 (en) * 2020-02-07 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020146416A1 (en) * 1994-03-18 2002-10-10 Presta Leonard G. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
CN101157730A (zh) * 2006-09-25 2008-04-09 南方医科大学珠江医院 一种携带神经营养因子穿过血脑屏障的融合蛋白及其编码基因与用途
WO2015127158A1 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods, compositions and kits for cell specific modulation of target antigens
US20150376628A1 (en) * 2014-06-23 2015-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
CN105829542A (zh) * 2013-12-20 2016-08-03 豪夫迈·罗氏有限公司 改进的重组多肽生产方法
US20160345549A1 (en) * 2014-12-05 2016-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
WO2002003071A2 (en) 2000-07-05 2002-01-10 Pangene Corporation Modulators of trk protein activity, compositions and uses
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US7060429B2 (en) * 2001-02-22 2006-06-13 University Of Maryland, Baltimore Treatment of neurodegenerative diseases by altering levels of TrkB isoforms and/or TrkC isoforms
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
CA2703329A1 (en) * 2007-10-23 2009-04-30 Novartis Ag Use of trkb antibodies for the treatment of respiratory disorders
WO2009126161A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Utc Fuel Cells, Llc Fuel cell and bipolar plate having manifold sump
KR20120027055A (ko) 2009-06-26 2012-03-20 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
RU2425880C2 (ru) 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
WO2011020005A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. miRNA-REGULATED DIFFERENTIATION-DEPENDENT SELF-DELETING CASSETTE
US20110104799A1 (en) 2009-10-29 2011-05-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional Alleles
MY172726A (en) 2011-10-28 2019-12-11 Regeneron Pharma Humanized il-6 and il-6 receptor
DK2770821T3 (da) 2011-10-28 2017-11-27 Regeneron Pharma Genetisk modificerede major histocompatibility-kompleks-mus
HUE048511T2 (hu) 2011-10-28 2020-07-28 Regeneron Pharma Kiméra fõ hisztokompatibilitási komplex (MHC) II molekulákat expresszáló, genetikailag módosított egerek
DK2847335T3 (en) 2012-04-25 2018-08-13 Regeneron Pharma NUCLEASED MEDIUM TARGETING WITH LARGE TARGET VECTORS
PT2800811T (pt) 2012-05-25 2017-08-17 Univ California Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição
WO2014033644A2 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Novartis Ag Methods of nuclease-based genetic engineering
IL311744A (en) 2012-11-05 2024-05-01 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of their use
ES2757325T3 (es) 2012-12-06 2020-04-28 Sigma Aldrich Co Llc Modificación y regulación del genoma en base a CRISPR
PT2958938T (pt) 2013-02-20 2019-07-23 Regeneron Pharma Ratinhos que expressam correcetores de células t humanizados
RU2690352C2 (ru) 2013-02-20 2019-05-31 Регенерон Фармасютикалс, Инк. Генетическая модификация крыс
KR102211267B1 (ko) 2013-02-22 2021-02-04 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람화된 주요 조직적합성 복합체를 발현하는 마우스
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
DK2986729T3 (en) 2013-04-16 2018-10-29 Regeneron Pharma TARGETED MODIFICATION OF ROOT THROUGH
PT3175706T (pt) 2013-09-23 2019-02-11 Regeneron Pharma Animais não humanos tendo um gene humanizado de proteína reguladora de sinal
MX358206B (es) 2013-11-19 2018-08-09 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen humanizado de un ligando inductor de la proliferacion.
SG10201900003WA (en) 2013-11-19 2019-02-27 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
BR112016013400B1 (pt) * 2013-12-11 2023-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método in vitro para modificar um genoma em um lócus genômico de interesse em uma célula pluripotente
HUE051088T2 (hu) 2014-04-08 2021-03-01 Regeneron Pharma Humanizált FC-gamma receptorokkal rendelkezõ nem humán élõlények
NO2785538T3 (zh) 2014-05-07 2018-08-04
RU2711744C1 (ru) 2014-05-19 2020-01-21 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Генетически модифицированные животные, отличные от человека, экспрессирующие epo человека
HUE048677T2 (hu) 2014-06-19 2020-07-28 Regeneron Pharma Humanizált programozott sejthalál 1 génnel rendelkezõ nem-humán állatok
KR102468108B1 (ko) 2014-06-26 2022-11-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 그 조성물, 및 사용 방법
EP4223285A3 (en) 2014-07-16 2023-11-22 Novartis AG Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
SG11201701040XA (en) * 2014-09-19 2017-03-30 Regeneron Pharma Chimeric antigen receptors
WO2016081923A2 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED GENETIC MODIFICATION USING PAIRED GUIDE RNAs
RS61080B1 (sr) 2014-11-24 2020-12-31 Regeneron Pharma Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks
RS65664B1 (sr) 2014-12-09 2024-07-31 Regeneron Pharma Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen klastera diferencijacije 274
CA3223798A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized t cell mediated immune responses in non-human animals
WO2017087780A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
CN116420679A (zh) 2018-03-26 2023-07-14 瑞泽恩制药公司 用于测试治疗剂的人源化啮齿动物
LT3823443T (lt) 2018-07-16 2024-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ditra ligos graužikų modeliai ir jų naudojimas

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020146416A1 (en) * 1994-03-18 2002-10-10 Presta Leonard G. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
CN101157730A (zh) * 2006-09-25 2008-04-09 南方医科大学珠江医院 一种携带神经营养因子穿过血脑屏障的融合蛋白及其编码基因与用途
CN105829542A (zh) * 2013-12-20 2016-08-03 豪夫迈·罗氏有限公司 改进的重组多肽生产方法
WO2015127158A1 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods, compositions and kits for cell specific modulation of target antigens
US20150376628A1 (en) * 2014-06-23 2015-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
US20160345549A1 (en) * 2014-12-05 2016-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EIJA KOPONEN ET AL: "Transgenic mice overexpressing the full-length neurotrophin receptor trkB exhibit increased activation of the trkB–PLC; pathway, reduced anxiety, and facilitated learning", 《MOL. CELL. NEUROSCI.》 *
MYLÈNE PERREAULT ET AL: "Activation of TrkB with TAM-163 Results in Opposite Effects on Body Weight in Rodents and Non-Human Primates", 《PLOS ONE》 *

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