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CN111643451A - 一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂及其制备方法 - Google Patents

一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂及其制备方法 Download PDF

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CN111643451A CN202010501244.3A CN202010501244A CN111643451A CN 111643451 A CN111643451 A CN 111643451A CN 202010501244 A CN202010501244 A CN 202010501244A CN 111643451 A CN111643451 A CN 111643451A
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Abstract

本发明提供了一种注射用和厚朴酚自乳化纳米微乳制剂及其制备方法，属于药物制备技术领域，所述和厚朴酚自乳化微乳制剂，包括以下重量份的原料：和厚朴酚40～60份、油相200～250份、乳化剂400～440份、助乳化剂290～330份和抗氧化剂4～8份；所述油相包括注射用级别的中链甘油三酸酯；所述乳化剂包括聚乙二醇12羟基硬脂酸15和蛋黄卵磷脂；所述助乳化剂包括注射用级别无水乙醇；所述抗氧化剂包括乙酰半胱氨酸；本发明所述注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂自乳化效果好、形成的纳米乳液粒径和PDI均很好，稳定性良好；所述注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂对延长小鼠凝血时间与增加小鼠全脑缺血均有作用。

Description

一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，尤其涉及一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂及其制备方法。
背景技术
和厚朴酚为厚朴酚异构体，为中药厚朴中的有效成分。是由一苯丙素的侧链和另一苯丙素的苯核聚合而成的二聚体，结构式如下：
Figure BDA0002524761980000011
和厚朴酚为结晶性粉末，分子量为266.33，熔点为87.5℃，解离常数pKa1＝9.64±0.30，pKa2＝10.71±0.21。
在药效学研究过程中，和厚朴酚除了具有传统功能主治作用相关的抗菌、抗炎、抗溃疡作用外，还具有抗氧化、抗心肌缺血和心律失常等作用；并且所述和厚朴酚能够透过血脑屏障，在大脑组织中有很高的含量，提示和厚朴酚可能在缺血性脑中风的治疗中发挥作用。
但是和厚朴酚口服吸收很差，口服吸收生物利用度不足10％，由于大量药物滞留在肠道中，对于肠道菌群破坏严重，容易引起肠道菌群失调。鉴于和厚朴酚的水溶性差，用pH7.4的HBSS缓冲液溶解，其饱和摩尔浓度只有27μmol·L-1，即7.19μg/mL，难以制备成注射水溶液。
微乳是一种新型的药物载体系统，是由水相、油相、表面活性剂与助表面活性剂在适当比例自发形成的一种透明半透明的、低粘度的各向同性且热力学稳定的油水混合系统。微乳乳滴的粒径通常在数百纳米以下，用于药物载体时可以显著提高难溶药物的溶解度，相比普通乳剂具有更好的稳定性，且由于高度分散和较强的组织亲和性，能够增加活性物质的体内生物利用度，作为药物载体具有广泛的应用前景。
自乳化微乳制剂(Self-emulsifying microemulsion)是基于微乳制剂的优良性能基础上开发的又一新型制剂技术，自乳化微乳制剂是由药物、油、乳化剂及助溶剂等组成的一种油状混合物，在体外轻微振荡或体内胃肠道的蠕动下可自发形成的一种热力学稳定的、均一、透明或半透明、各向同性的溶液。自乳化微乳制剂的油溶液由合适的乳化剂、助乳化剂、油相、原料药经过简单的混合制备而成，易于保存，稳定均一。使用时将油溶液与稀释液混合，轻微振摇后即可形成澄清透明并略有蓝色乳光的微乳注射剂，大大提高了原料药在制剂制备和贮存过程中的稳定性，同时又可以显著增加药物溶解度以及生物利用度，提高药物的药理功效。
目前市场上尚没有一种和厚朴酚的自乳化微乳制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂及其制备方法；所述和厚朴酚自乳化微乳制剂自乳化效果好、形成的纳米乳液粒径和PDI均很好，稳定性良好；所述和厚朴酚自乳化微乳制剂对延长小鼠凝血时间与增加小鼠全脑缺血均有作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，包括以下重量份的原料：和厚朴酚40～60份、油相200～250份、乳化剂400～440份、助乳化剂290～330份和抗氧化剂4～8份；
优选的，包括以下重量份的原料：和厚朴酚45～55份、油相210～230份、乳化剂410～430份、助乳化剂300～310份和抗氧化剂5～7份。
再优选的，所述乳化剂包括注射用级别聚乙二醇12羟基硬脂酸15，吐温80，司盘80、聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油，聚氧乙烯醚35氢化蓖麻油，普朗尼克F68，泊洛沙姆188、卵磷脂和豆磷脂中的一种或几种的混合物；
优选聚乙二醇12羟基硬脂酸15，吐温80，聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油，普朗尼克F68和卵磷脂中的一种或几种的混合物；
再优选聚乙二醇12羟基硬脂酸15，聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油，聚氧乙烯醚35氢化蓖麻油，普朗尼克F68和卵磷脂中的一种或几种的混合物；
再优选聚乙二醇12羟基硬脂酸15和蛋黄卵磷脂。
所述油相包括注射用级别的中链甘油三酸酯，优酸乙酯，十六酸异丙酯和肉豆蔻酸异丙酯中的一种或几种的混合物；
优选中链甘油三酸酯或肉豆蔻酸异丙酯；
再优选中链甘油三酸酯。
所述助乳化剂包括注射用级别无水乙醇，聚乙二醇400，聚乙二醇200，甘油，1,2-丙二醇中的一种或几种混合物。
优选无水乙醇，聚乙二醇400和1,2-丙二醇中的一种或几种混合物；
再优选无水乙醇。
所述抗氧化剂包括亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、叔丁基对羟基茴香醚、硫脲、维生素C、没食子丙酯、α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯，乙酰半胱氨酸中的一种或几种混合物；
优选焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、维生素C、α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯和乙酰半胱氨酸中的一种或几种混合物；
再优选乙酰半胱氨酸。
优选的，所述蛋黄卵磷脂的重量份为5～55份，所述聚乙二醇12羟基硬脂酸15的重量份为385～395份。
本发明还提供了所述的注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛋黄卵磷脂、抗氧化剂和助乳化剂混合后，与聚乙二醇12羟基硬脂酸15和油相混合获得溶剂溶液；
2)将和厚朴酚与所述溶剂溶液混合获得和厚朴酚自乳化微乳制剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述和厚朴酚与所述溶剂溶液混合后还包括滤膜过滤；所述滤膜的孔径为0.22μm。
本发明还提供了一种包括所述的注射用自乳化微乳制剂的注射制剂，还包括5％葡萄糖注射液或0.9％NaCl注射液。
本发明的有益效果：本发明提供的和厚朴酚自乳化微乳制剂，包括以下重量份的原料：和厚朴酚40～60份、油相200～250份、乳化剂400～440份、助乳化剂290～330份和抗氧化剂4～8份；所述乳化剂包括聚乙二醇12羟基硬脂酸15和蛋黄卵磷脂。本发明中，所述自乳化微乳制剂中和厚朴酚的浓度能够达到50mg/g，活性成分和厚朴酚的溶解度大幅提高；稳定性更好，且由于高度分散和较强的组织亲和性，能够增加活性物质和厚朴酚的体内生物利用度，避免药物对肠道正常菌群的影响。
用本发明提供的和厚朴酚自乳化微乳制剂，以70μg/kg剂量处理小鼠，对延长小鼠凝血时间与增加小鼠全脑缺血均有作用。凝血时间显示，本发明提供的和厚朴酚自乳化微乳制剂的药效学结果略优于丁苯酞与依达拉奉。全脑缺血试验则显示四者无明显差别，但本发明提供的和厚朴酚自乳化微乳制剂的使用剂量更小，约是丁苯酞和依达拉奉的1％。
本发明提供的和厚朴酚自乳化微乳制剂，在临床使用中，能够依据患者用药需求，调整不同给药浓度，釆用5％葡萄糖注射液和0.9％NaCl注射液稀释不同稀释倍数后，均能迅速形成稳定而完全澄明的纳米乳液；成乳效果、乳剂外观和粒径大小及分布未见明显变化。将上述纳米乳稀释液室温放置1个月，未发现有明显异常，说明本发明提供的微乳注射液及其稀释成乳后的微乳液稳定性良好。
具体实施方式
本发明提供了一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，包括以下重量份的原料：和厚朴酚40～60份、油相200～250份、乳化剂400～440份、助乳化剂290～330份和抗氧化剂4～8份。
在本发明中，所述和厚朴酚自乳化微乳制剂包括和厚朴酚40～60份，优选为45～55份，更优选为50份；本发明中所述和厚朴酚载所述自乳化微乳制剂中的浓度优选的大于等于50mg/g。
在本发明中，所述和厚朴酚采用市售或自制的和厚朴酚；优选的采用自制的纯度大于99％的和厚朴酚；具体的制备方法如下：1)将厚朴与乙醇混合进行提取、浓缩获得第一厚朴浸膏；2)将所述第一厚朴浸膏与氧化钙或氢氧化钙混合、静置、烘干、粉碎获得第一厚朴浸膏粉；3)将所述第一厚朴浸膏粉与乙醇混合进行第二提取获得第二厚朴浸膏；4)将所述第二厚朴浸膏与二氯甲烷混合后，用氢氧化钠溶液进行萃取获得碱性萃取液；6)将所述碱性萃取液调节至中性获得沉淀；7)用石油醚溶解所述沉淀后结晶获得和厚朴酚粗结晶；8)将所述和厚朴酚粗结晶用石油醚溶解后进行重结晶获得和厚朴酚纯品。
在本发明中，将厚朴与乙醇混合进行第一提取、浓缩获得第一厚朴浸膏。在本发明中，优选的将所述粉碎后的厚朴与乙醇混合进行第一提取；所述乙醇的体积浓度优选为85％～95％，更优选为90％；所述乙醇的体积优选为厚朴体积的5～9倍。在本发明中，所述第一提取的次数优选为2～5次，更优选为3次；在本发明中，当所述第一提取的次数优选为3次时；所述乙醇的体积比优选的分别为所述厚朴体积的8倍、6倍和6倍；在本发明中，每次提取的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h。本发明在数次所述提取后，合并提取液；并将所述提取液进行浓缩获得第一厚朴浸膏；本发明对所述浓缩的方法没有特殊限定，采用本领域常规浓缩方法即可；在本发明具体实施过程中，所述浓缩优选为减压浓缩。
本发明在获得所述第一厚朴浸膏后，将所述第一厚朴浸膏与氧化钙混合、静置、烘干、粉碎获得第一厚朴粉。在本发明中，所述氧化钙的质量优选为所述第一厚朴浸膏质量的8％～32％，优选为9％～30％，更优选为10％。在本发明中，所述氧化钙优选为细粉状的氧化钙；所述第一厚朴浸膏在与氧化钙混合之前，优选的与无水乙醇混合，所述无水乙醇的体积与所述第一厚朴浸膏的质量比优选为(0.5～1)mL:1g；在本发明中，所述无水乙醇的作用为溶解所述第一厚朴浸膏，使得所述第一厚朴浸膏能够更好的与氧化钙混合反应。在本发明中，所述第一厚朴浸膏与氧化钙混合的过程中优选的伴随搅拌，本发明对所述搅拌的转速没有特殊要求，以能够混匀为准。在本发明中，所述第一厚朴浸膏与氧化钙混合后进行静置；所述静置的时间优选为20～28h，更优选为22～26h。本发明在所述静置后，进行烘干、粉碎；本发明对所述烘干和粉碎的方法没有特殊限定，采用本领域常规的烘干和粉碎方法即可。在本发明中，所述氧化钙的作用是有效去除所述第一厚朴浸膏中的杂质；氧化钙与所述第一厚朴浸膏中树脂类成分和油状物质结合，皂化，形成不溶物，有效降低杂质含量；同时由于厚朴酚与和厚朴酚都是酸性，能够与氧化钙进行中和反应；而氧化钙首先与厚朴酚发生反应，本发明将所述氧化钙的质量控制在上述范围内，能够保证有效的去除第一厚朴浸膏中的厚朴酚，而保留和厚朴酚。
在本发明中，将所述第一厚朴粉与乙醇混合进行第二提取获得第二厚朴浸膏。在本发明中，所述乙醇的体积浓度优选为85％～95％，更优选为90％；所述乙醇的体积优选为第一厚朴粉体积的3～8倍，更优选为4～6倍。在本发明中，所述第二提取的次数优选为2～5次，更优选为3次；在本发明中，每次提取的时间优选为2～5h，更优选为2.5～4h。在本发明中，所述乙醇提取优选的在提取罐中进行；本发明在数次所述提取后，合并提取液；并将所述提取液进行浓缩获得第二浸膏；本发明对所述浓缩的方法没有特殊限定，采用本领域常规浓缩方法即可；在本发明具体实施过程中，所述浓缩优选为减压浓缩。
本发明在获得所述第二厚朴浸膏后，将所述第二厚朴浸膏与二氯甲烷混合后，用氢氧化钠溶液进行萃取获得碱性萃取液。在本发明中，所述第二厚朴浸膏与二氯甲烷的质量比优选为1:(4～7)，更优选为1:(4.5～6)。在本发明中，所述第二厚朴浸膏与二氯甲烷混合后优选的还包括过滤，在本发明中，所述过滤优选为纱布滤或滤纸过滤；本发明在获得过滤液后，用氢氧化钠溶液萃取所述过滤液获得碱性萃取液。在本发明中，所述氢氧化钠溶液萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次；在本发明中，所述氢氧化钠溶液的质量浓度优选为0.8％～5％，更优选为1.0％～3.0％；在本发明中，当所述萃取次数优选为3次时；所述氢氧化钠溶液与所述过滤液的体积比优选为1:2、1:1、1:1；所述萃取优选的在分液漏斗中进行；本发明在所述萃取结束后，收集碱性萃取液。
本发明在获得所述碱性萃取液后，将所述碱性萃取液调节至中性获得沉淀。在本发明中，优选的采用盐水进行调节，所述中性优选的pH值为7.0；本发明对所述盐酸没有特殊要求，采用本领域常规的盐酸溶液即可。本发明将所述碱性萃取液调节至中性后，会出现大量的沉淀。
本发明在获得所述沉淀后，用石油醚溶解所述沉淀后结晶获得和厚朴酚粗结晶。在本发明中，将所述沉淀与石油醚混合加热回流至溶解；本发明对所述加热回流的温度以及时间没有特殊限定，以沉淀全部溶剂为宜。在本发明中，所述石油醚的沸程优选为60～90℃；所述石油醚的体积与所述沉淀的质量比优选为(20～30)mL:1g；更优选为(22～27)mL:1g。本发明在所述沉淀全部溶解后，进行冷却获得和厚朴酚粗结晶；本发明对所述冷却的方法没有特殊限定，优选的进行自然冷却即可；本发明在所述冷却后，优选的还包括真空干燥的步骤，本发明对所述真空干燥的参数没有特殊限定，采用本领域常规的真空干燥参数即可。
本发明在获得所述和厚朴酚粗结晶后，将所述和厚朴酚粗结晶用石油醚溶解后进行重结晶获得和厚朴酚纯品。在本发明中，所述石油醚的沸程优选为60～90℃；所述石油醚的体积与所述沉淀的质量比优选为(25～40)mL:1g；更优选为(28～35)mL:1g。在本发明中，将所述和厚朴酚粗结晶与石油醚混合加热回流至溶解；本发明对所述加热回流的温度以及时间没有特殊限定，以所述和厚朴酚组结晶全部溶剂为宜；当所述和厚朴酚粗结晶完全溶解后，下层有红棕色油状体出现；过滤除去所述红棕色油状体后，进行冷却重结晶获得和厚朴酚纯品；本发明在所述冷却重结晶后，优选的还包括真空干燥的步骤，本发明对所述真空干燥的参数没有特殊限定，采用本领域常规的真空干燥参数即可。在本发明中，所述和厚朴酚纯品为针状结晶。
在本发明中，所述和厚朴酚自乳化微乳制剂包括油相200～250份，优选为210～230份，更优选为218份；在本发明中，所述油相优选为中链甘油三酸酯；本发明对所述中链甘油三酸酯的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。
在本发明中，所述和厚朴酚自乳化微乳制剂包括乳化剂400～440份；所述乳化剂优选的包括聚乙二醇12羟基硬脂酸15和蛋黄卵磷脂；所述聚乙二醇12羟基硬脂酸15优选为
Figure BDA0002524761980000081
HS 15；所述
Figure BDA0002524761980000082
HS 15的重量份优选为385～395份，更优选为388～392份，最优选为390.5份；所述蛋黄卵磷脂的重量份优选为5～55份，更优选为25～35份，最优选为29.5份。本发明对所述蛋黄卵磷脂的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。在本发明中，所述蛋黄卵磷脂的作用是乳化剂。
在本发明中，所述和厚朴酚自乳化微乳制剂包括助乳化剂290～330份，优选为300～310份，更优选为306份；所述助乳化剂优选为无水乙醇。本发明对所述无水乙醇的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。
在本发明中，所述和厚朴酚自乳化微乳制剂包括抗氧化剂4～8份，优选为5～7份，更优选为6份。在本发明中，所述抗氧化剂优选为乙酰半胱氨酸。本发明对所述乙酰半胱氨酸的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。
在本发明中，上述涉及到的原料均采用注射级的原料。
本发明提供了所述和厚朴酚自乳化微乳制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将蛋黄卵磷脂、抗氧化剂和助乳化剂混合后，与聚乙二醇12羟基硬脂酸15和油相混合获得溶剂溶液；2)将和厚朴酚与所述溶剂溶液混合获得和厚朴酚自乳化微乳制剂。
在本发明中，所述和厚朴酚自乳化微乳制剂的制备优选的在万级无菌条件下进行。本发明首先将蛋黄卵磷脂、抗氧化剂和助乳化剂混合；所述混合的过程中优选的伴随搅拌，本发明对所述搅拌的转速没有特殊限定，以实现充分溶解为宜。本发明将所述混合后的溶液、聚乙二醇12羟基硬脂酸15和油相混合获得溶剂溶液；在本发明中，获得所述溶剂溶液过程中，优选的伴随搅拌，本发明对所述搅拌的转速没有特殊限定，以实现充分溶解为宜。
本发明在获得所述溶剂溶液后，将和厚朴酚与所述溶剂溶液混合获得和厚朴酚自乳化微乳制剂；在本发明中，获得所述和厚朴酚自乳化微乳制剂的过程中优选的伴随搅拌，本发明对所述搅拌的转速没有特殊限定，以实现充分溶解为宜。
在本发明中，所述和厚朴酚与所述溶剂溶液混合后优选的还包括滤膜过滤；所述滤膜的孔径优选为0.22μm；所述滤膜优选为有机滤膜。本发明在所述滤膜过滤后优选的还包括充氮灌封的步骤；本发明对所述充氮灌封的步骤没有特殊限定，采用本领域常规的充氮灌封步骤即可。
本发明还提供了一种包括所述的自乳化微乳制剂的注射制剂，所述注射制剂还包括5％葡萄糖注射液或0.9％NaCl注射液。在本发明中，所述5％葡萄糖注射液或0.9％NaCl注射液优选为市售注射级的产品，本发明对所述注射制剂中5％葡萄糖注射液或0.9％NaCl注射液的含量没有特殊限定，根据具体的和厚朴酚使用浓度需求而定。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
和厚朴酚自乳化微乳制剂，含和厚朴酚(C18H18O2)为标示量的95.0～105.0％。
本实施例中的和厚朴酚自乳化微乳制剂规格为1.0g；自微乳注射液中含和厚朴酚(C18H18O2)50mg。
表1单位剂量和厚朴酚自微乳注射液的处方组成
Figure BDA0002524761980000091
制备方法：
①在万级无菌条件下，按处方量称取低内毒素卵磷脂和乙酰半胱氨酸，加入无水乙醇，搅拌溶解；在卵磷脂无水乙醇溶液中加入低内毒素
Figure BDA0002524761980000101
HS 15和中链甘油三酸酯(MCT)，搅拌使之混匀；最后加入和厚朴酚，搅拌，使之完全溶解；
②检测和厚朴酚的含量(应为标示量的95.0～105.0％)，合格后，在万级无菌局部百级条件下用孔径为0.22μm的微孔有机滤膜过滤；
③充氮灌封。
乳化效果评价以及制剂伍稳定性研究
在临床使用中，本发明所述自乳化微乳制剂可能需要依据患者用药需求，调整不同给药浓度，因此设计不同稀释倍数以验证乳化效果。按照油/水比例1:100和1:250，采用5％葡萄糖注射液和0.9％NaCl注射液稀释，观察成乳效果、乳剂外观和粒径大小及分布。结果如表2和表3所示，用不同量的5％葡萄糖注射液或0.9％NaCl注射液稀释，均能迅速形成稳定而完全澄明的纳米乳液，粒径和PDI均很好，乳化8h后，粒径和PDI仍然均一，未见明显变化。
将上述自乳化微乳制剂的稀释液室温放置1个月，未发现有明显异常，这表明所述自微乳微乳制剂或稀释后的注射液稳定性良好。
表2 5％葡萄糖注射液稀释不同倍数的乳化效果评价
Figure BDA0002524761980000102
表3 0.9％NaCl注射液稀释不同倍数的乳化效果评价
Figure BDA0002524761980000103
实施例2
和厚朴酚自乳化微乳制剂中试生产以及药物稳定性检测
委托有GMP生产资质的药厂进行了3批中试生产试验。通过对三批中试生产样品(批号：20110601、20110602、20110603)的质量评价，结果表明：该处方工艺制成的HP15微乳注射液质量合格，各项指标稳定，重复性好。
具体数数如下：
样品制备规模：20110601、20110602、20110603为中试规模，其中20110601批739支，20110602批705支，201100601批697支。
考察项目：外观性状(乳化前后)、乳化前可见异物、酸度、自乳化微乳粒径、乳化8h稳定性、主药含量、有关物质。
5％葡萄糖稀释。
一、影响因素试验
(1)强光照射试验
放样日期：2011.8.20
取样测定日期：2011.8.20(0天)，2011.8.24(5天)，2005.8.29(10天)
放置条件：强光照射(4500Lx)
强光照射生产样品，观察和测定外观色泽、粒径、含量等参数；结果如下：
表4和厚朴酚微乳注射液影响因素(强光照)考察结果汇总表
Figure BDA0002524761980000111
Figure BDA0002524761980000121
Figure BDA0002524761980000131
(2)高温试验
样品批号：20110601、20110602、20110603
放样日期：2011.8.30
取样测定日期：2011.8.20(0天)，2011.9.4(5天)，2011.9.9(10天)放置条件：高温(40℃)
表5和厚朴酚微乳注射液影响因素(高温)考察结果汇总表
Figure BDA0002524761980000141
Figure BDA0002524761980000151
(3)加速试验
样品批号：20110601、20110602、20110603
放样日期：2011.9.25
取样测定日期：
2011.9.26(0月)，2011.10.30(1月)，2011.11.26(2月)，2011.12.28(3月)，2011.3.21(6月)
放置条件：
因影响因素试验表明本品高温下不稳定，因此采用25℃±2℃条件进行加速实验考察。
表6和厚朴酚微乳注射剂25℃加速试验结果汇总表
Figure BDA0002524761980000161
Figure BDA0002524761980000171
(4)长期试验
样品批号：20110601、20110602、20110603
放样日期：2011.9.25
取样测定日期：
2011.9.26(0月),2011.12.28(3月)，2012.3.22(6月)
放置条件：4℃
将三批样品按上市包装条件包装，置于4℃冷藏室中，于第0、3、6、9、12、18、24、36个月测定有关指标，已检查至6个月。结果见表7。
表7和厚朴酚微乳注射剂4℃长期留样试验结果汇总表
Figure BDA0002524761980000172
Figure BDA0002524761980000181
Figure BDA0002524761980000191
*低温下本和厚朴酚自微乳注射剂(乳化前)会有少量沉淀产生，在室温条件下可重新溶解成为黄色澄明粘稠液体，且不影响其自乳化性质。
由上述试验可知：本发明制备的自乳化微乳注射制剂在光照、40℃高温条件下外观色泽(乳化前、乳化后)、pH值、有关物质、乳化8h稳定性、主药含量等方面与0天相比没有明显变化，性质稳定；选择40℃作为高温条件，主要是考虑到油溶液在高温下易氧化变质，所以在储存过程中应避免高温；25℃6个月加速试验的结果表明：本发明制备的自乳化微乳注射制剂外观色泽(乳化前、乳化后)、pH值、有关物质、乳化8h稳定性、主药含量等方面与0月相比没有明显变化，性质稳定；长期试验结果表明：在已经检测的样品批次中(6个月)本发明制备的自乳化微乳注射制剂的性状、含量、有关物质、乳化后稳定性、pH值均没有明显改变，本发明制备的自乳化微乳注射制剂在4℃下性质稳定。
实施例3
和厚朴酚静脉注射用自乳化微乳制剂安全性研究
依据国家新药审批的要求，进行了系统的制剂安全性评价，结果如下：
1.急性毒性实验：(1)ICR小鼠尾静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液单次给药毒性试验：ICR小鼠尾静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液后各给药组动物均出现中毒反应，主要表现为给药时挣扎，给药后翻正反射消失、四肢无力，俯卧等；各给药组均有动物死亡，濒死动物出现腹式呼吸、后肢僵直、抽搐、尿失禁等体征，100mg·kg-1组动物在给药后15秒左右全部死亡，41mg·kg-1组存活动物在给药后20分钟左右基本恢复正常；测定给药后存活动物的体重及摄食量，未见有明显趋势性的变化；对给药后死亡小鼠进行大体解剖检查，发现部分动物肝脏表面可见程度不等的灰白色斑块，部分动物肾脏表面可见程度不等灰白色斑块，肺脏不同程度的出血；经组织病理学检查动物肝细胞有不同程度变性，肾小球囊腔有红染的蛋白样物质，肺组织水肿或急性出血，病理检查结果表明该药物可引起动物肝细胞不同程度的变性，以及肾小球和肺泡壁毛细血管通透性一定程度的变化。
观察期结束时，对所有存活动物进行大体解剖检查，未见心脏、肝脏、脾、肺、肾及胃肠等脏器异常。经正规Bliss法计算：ICR小鼠单次尾静脉注射给予和厚朴酚自乳化微乳注射液的LD50为50.5mg·kg-1，95％可信区间为45.1～56.5mg·kg-1；LD5为34.7mg·kg-1，LD90为67.6mg·kg-1。
结论：ICR小鼠单次尾静脉注射给予和厚朴酚自乳化微乳注射液的LD50为50.5mg·kg-1。动物给药后主要毒性反应为翻正反射消失、四肢无力、俯卧等。
(2)Beagle犬静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液单次给药毒性试验：结果表明：Beagle犬静脉注射给予和厚朴酚自乳化微乳注射液，100、66.7、44.4、19.8mg·kg-1组动物在给药过程中即出现中毒反应，主要表现为流涎、嘴及爪部皮肤发红、眼眶及口部皮肤褶皱肿胀、呕吐、四肢瘫软等，100mg·kg-1组动物在给药时死亡，8.8、3.9mg·kg-1组动物给药后未见异常。给药后动物血清ALT呈有量效关系的升高，提示该药物可能对动物肝脏有损伤；66.7、44.4mg·kg-1组动物血清BUN、Cr呈可逆性轻微升高，提示药物可能对动物肾脏有一定影响；给药后各组动物TG均较给药前升高且给药后15天该指标基本恢复，这可能是药物中含较高浓度脂类物质所致。给药后各给药组动物WBC可逆性升高，心电图检查未见异常。给药后动物体重体温未见明显异常改变。100mg·kg-1组动物死亡，66.7mg·kg-1组动物存活，因此在本实验条件下Beagle犬静脉注射给予和厚朴酚自乳化微乳注射液的近似致死剂量范围为66.7～100mg·kg-1。结论：Beagle犬静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液，其近似致死剂量范围为66.7～100mg·kg-1。高剂量下动物的主要毒性反应为流涎、嘴及爪部皮肤发红、眼眶及口部皮肤褶皱肿胀、呕吐、四肢瘫软等。
2.慢性毒性实验：(1)SD大鼠尾静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液30天反复给药毒性试验：试验期间各给药组动物外观、行为等未见异常；给药后动物体重及摄食量与对照组比较均无显著性差异；给药30天，2.5mg·kg-1组雌鼠RBC、HGB、HCT较对照组降低，K+较对照组升高，恢复期结束时上述改变消失；恢复期结束时给药组雌鼠AST、CK、LDH降低，给药组雄鼠BUN降低，但这些指标降低无明显毒理学意义；凝血指标及尿液指标检测未见与给药相关的统计学改变。给药30天，2.5mg·kg-1组雌性动物脾脏重量增加，恢复期结束时给药组雄性动物肝脏重量及脏器系数升高，肾上腺重量及脏器系数降低。给药30天及14天恢复期结束时进行组织病理学检查，各给药组均有部分动物注射部位(尾静脉)发生血管内皮细胞的变性和/或坏死，以及血管壁结构的变化，主要病变为血管内皮细胞肿胀，未见动物其他脏器血管发生类似病变，提示该药物对注射部位血管有一定的刺激作用。结论：在本实验条件下，SD大鼠连续尾静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液30天，其基本无毒反应剂量为500μg·kg-1，相当于临床拟用剂量的62.5倍。该药物可能对注射部位血管有一定的刺激性，临床用药时应予以注意。
(2)Beagle犬静脉注射和厚朴酚微乳注射液30天反复给药毒性试验：试验期间各给药组动物外观、行为等未见异常；给药后动物体重、体温及摄食量与对照组比较均无显著性差异；给药15天、30天及恢复期结束时进行心电图检查，各给药组动物与对照组比较未见与药物毒性反应相关的异常变化。给药30天，1250μg·kg-1组动物CK较对照组升高(375±37**，vs278±59，U/l，**p＜0.01)；给药15天及30天，1250μg·kg-1组动物APTT较对照组有延长的趋势(10.7±1.31，vs9.7±0.9，s，p＝0.141；11.0±1.3，vs9.8±1.6，s，p＝0.166)，但无统计学差异。除上述改变外，各给药组动物个别血液学、血液生化及凝血指标与对照组比较有统计学差异，但均无剂量反应关系，为动物个体差异所致，与给药无关。给药15天、30天及恢复期结束时血液电解质及尿液检查，各给药组动物与对照组比较均无异常改变。给药30天及恢复期结束时进行大体解剖检查，各给药组及对照组动物均未见明显异常；各给药组动物各检测脏器的重量及脏器系数与对照组比较未见明显差别；给药30天及14天恢复期结束时进行组织病理学检查，检出肝脏、肺脏、注射部位以及肾脏、脾脏、膀胱等脏器病变，各给药组与对照组发生率大致相同，判定与给药无关。
结论：在本实验条件下，Beagle犬静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液30天，其无毒反应剂量为250μg·kg-1。结果提示Beagle犬以1250μg·kg-1剂量连续给药可能会导致动物可逆性的CK升高及APTT轻微延长。
3.和厚朴酚自乳化微乳注射液溶血性试验：和厚朴酚自乳化微乳注射液各剂量管及阴性对照管(0.9％氯化钠注射液)，在37℃保温4h，均未出现溶血和凝聚反应，阳性对照管(注射用水)在15分钟即出现溶血现象。结论：在本实验室条件下，和厚朴酚自乳化微乳注射液未出现溶血及凝聚作用，符合静脉注射用药物安全性检查的要求。
4.和厚朴酚自乳化微乳注射液血管刺激性试验：家兔耳缘静脉推注供试品溶液后，肉眼检查对照组和供试品组注射部位均出现肉眼可见的轻度充血现象，且在观察期逐渐恢复。病理组织检查结果显示供试品组未见明显异常。
结论：在本实验室条件下，和厚朴酚自乳化微乳注射液以浓度为5.0μg/ml，给药体积为5.0ml/kg注射，对血管未见产生刺激性反应。
5.和厚朴酚自乳化微乳注射液全身主动过敏性试验。和厚朴酚自乳化微乳注射液静脉注射给药，阳性对照组6只动物全部产生极强阳性反应，说明在本实验条件下全身主动过敏试验成立，250μg/kg剂量组和50μg/kg剂量组全部动物均未产生过敏反应。结论：在本实验室条件下，和厚朴酚自乳化微乳注射液在250μg/kg剂量范围内未见引起豚鼠全身主动过敏性反应。
6.和厚朴酚自乳化微乳注射液被动皮肤过敏性试验：经尾静脉给药激发，半小时后麻醉取皮观察测量，阴性对照组4只动物皮内均未见蓝斑，判定为阴性。阳性对照组4只动物皮内1︰2点均出现蓝斑，且直径均大于0.5㎜，1︰8点有2只动物出现蓝斑，其中1只直径为5.82㎜，另一只直径为个4.12㎜，综合判定阳性对照组阳性率为100％，表明试验系统成立。供试品高剂量组和低剂量组动物所有点均未见蓝斑，判定为阴性。结论：在本实验室条件下，和厚朴酚自乳化微乳注射液在给药剂量250.0μg/kg和50.0μg/kg情况下使用，未见发生被动皮肤过敏性反应。
7.Beagle犬单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液对其心血管系统和呼吸功能影响研究：Beagle犬单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液，25μg·kg-1剂量组在给药后60分钟内动物呼吸、血压、心电各项指标与给药前自身比较，无显著差异。100μg·kg-1剂量组在给药后60分钟内动物呼吸强度、呼吸频率、P波时程、T波时程、QRS时程、PR间期、QT间期、收缩压与给药前自身比较，无显著差异。在给药2分钟和20分钟舒张压与给药前10分钟有统计差异(P分别为0.049，0.045)，给药20分钟平均动脉压与给药前10分钟有统计差异(P＝0.045)，给药20分钟心率与给药前10分钟有统计差异(P＝0.046)，其余时间点舒张压、平均动脉压和心率与给药前自身对照无显著差异。给药组和对照组在给药后都有血压、心率下降现象，但对血压、心率下降的影响与对照组基本一致。给药组和对照组的舒张压、平均动脉压和心率变化的绝对值都较小，下降的百分比幅度也较小。
结论：在本实验条件下，Beagle犬单次静脉滴注和厚朴酚自乳化微乳注射液在25μg·kg-1时，对Beagle犬的呼吸、血压、心率、心电均无明显异常影响。在100μg·kg-1时，对Beagle犬可能导致血压、心率轻微降低。因此在临床用药时建议加强对血压和心率的监控。
8.单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液对ICR小鼠转棒试验影响研究：经统计分析，在100、300和900μg·kg-1的剂量下，ICR小鼠单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液5min后小鼠在转棒5min的潜伏时间与对照组在给药前后无显著性差异(P＞0.05)。结论：在本实验条件下，ICR小鼠单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液在100、300和900μg·kg-1剂量时，对动物的运动、协调能力无明显影响。
9.单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液对ICR小鼠自主活动影响研究：经统计分析，ICR小鼠单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液，在100、300和900μg·kg-1的剂量下，ICR小鼠自主活动次数在给药前及给药后与对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)。结论：在本实验条件下，ICR小鼠单次静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液在100、300和900μg·kg-1剂量时，对动物的自主活动次数无明显影响。
10.和厚朴酚自乳化微乳注射液致中国仓鼠肺成纤维细胞染色体畸变试验：在S9活化和非活化两种测试条件下，和厚朴酚自乳化微乳注射液在1.00～10.00mg·ml-1浓度范围内，染色体畸变率均在正常范围。直接诱变剂丝裂霉素C(MMC，0.05μg·ml-1)染色体畸变率显著增高。间接诱变剂环磷酰胺(CP，5.0μg·ml-1)有S9时染色体畸变率显著增高，表明本试验系统可靠。结论：在本试验条件下，和厚朴酚自乳化微乳注射液在1.00～10.00mg·ml-1浓度范围内，无论有无S9活化系统，均未见诱发CHL细胞染色体畸变率增高。
11.ICR小鼠尾静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液骨髓嗜多染红细胞微核试验：阳性对照组的微核发生率为26.6±4.0‰，与空白对照组(1.6±0.6‰)比较有显著差异(P＜0.01),表明本试验系统可靠。和厚朴酚自乳化微乳注射液25mg·kg-1、10mg·kg-1、4mg·kg-1各剂量组24h时间点微核发生率分别为1.8±0.8‰、1.6±0.7‰和2.1±0.6‰；25mg·kg-1剂量组48h时间点微核发生率为1.9±0.6‰，均低于4‰，而且与空白对照组比较均没有显著差异(P>0.05)。各给药组PCE/(NCE+PCE)比值与空白对照组比较均未低于空白对照组的20％。结论：在本试验条件下，ICR小鼠尾静脉注射和厚朴酚自乳化微乳注射液4～25mg·kg-1，无致骨髓嗜多染红细胞微核形成作用。
12.和厚朴酚自乳化微乳注射液致组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验：
和厚朴酚自乳化微乳注射液在0.5～5000μg/皿浓度范围内，在S9活化和非活化两种测试条件下，诱发TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535产生的回变菌落数与空白对照相比无显著差异(P＞0.05)；其中在S9活化条件下，5000μg/皿浓度在加入供试品及S9混合液后，平板呈现乳白色，结果计数时，无法精确计数，但大致观察，可见各菌株回变数均无增加现象。表明在0.5～5000μg/皿测试浓度范围内，和厚朴酚自乳化微乳注射液对五种测试菌株均无致基因突变作用。直接诱变剂4-NQO(2.0μg/皿)、MMC(0.5μg/皿)、NaN3(1.5μg/皿)和间接诱变剂2-AF(60μg/皿)、顺铂(50μg/皿)、CP(200mg/皿),在相应试验条件下，诱发五菌株产生的回变菌落数均显著超过空白对照(P＜0.01)，表明所用实验系统可靠。结论：在本试验条件下，和厚朴酚自乳化微乳注射液在0.5～5000μg/皿浓度范围内，无论有无S9活化系统，对鼠伤寒沙门氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535均无致突变性。
实施例4
和厚朴酚自乳化微乳制剂，含和厚朴酚(C18H18O2)为标示量的95.0～105.0％。本实施例中的和厚朴酚自乳化微乳制剂规格为1.0g；自微乳注射液中含和厚朴酚(C18H18O2)50mg；组成见表8。
表8本实施例中单位剂量和厚朴酚自微乳注射液的处方组成
Figure BDA0002524761980000251
制备工艺：
取和厚朴酚加入到1,2-丙二醇中，搅拌溶解，再加入二丁基苯酚，搅拌溶解；然后聚乙二醇12羟基硬脂酸15和油酸乙酯的混合液，搅拌混合至澄明，即得和厚朴酚自乳化溶液。上述溶液中经0.22μm微孔滤膜滤过，无菌充氮灌装，即得和厚朴酚注射用自乳化微乳制剂。
实施例5
和厚朴酚自乳化微乳制剂，含和厚朴酚(C18H18O2)为标示量的95.0～105.0％。本实施例中的和厚朴酚自乳化微乳制剂规格为1.0g；自微乳注射液中含和厚朴酚(C18H18O2)50mg；组成见表9。
表9本实施例中单位剂量和厚朴酚自微乳注射液的处方组成
Figure BDA0002524761980000261
制备工艺：
取和厚朴酚加入到无水乙醇中，搅拌溶解，再加入叔丁基对羟基茴香醚和抗坏血酸棕榈酸酯，搅拌溶解；然后聚乙二醇12羟基硬脂酸15、吐温-80和十六酸异丙酯的混合液，搅拌混合至澄明，即得和厚朴酚自乳化溶液。
上述溶液中经0.22μm微孔滤膜滤过，无菌充氮灌装，即得和厚朴酚注射用自乳化微乳制剂。
实施例6
和厚朴酚自乳化微乳制剂，含和厚朴酚(C18H18O2)为标示量的95.0～105.0％。本实施例中的和厚朴酚自乳化微乳制剂规格为1.0g；自微乳注射液中含和厚朴酚(C18H18O2)50mg；组成见表10。
表10本实施例中单位剂量和厚朴酚自微乳注射液的处方组成
Figure BDA0002524761980000271
制备工艺：
取和厚朴酚加入到无水乙醇中，搅拌溶解，再加入叔丁基对羟基茴香醚，搅拌溶解；取维生素C，加入到聚乙二醇200中，搅拌溶解；将上述两个溶液混合均匀；然后加入普朗尼克F68、聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油、泊洛沙姆188和肉豆蔻酸异丙酯的混合液，搅拌混合至澄明，即得和厚朴酚自乳化溶液。
上述溶液中经0.22μm微孔滤膜滤过，无菌充氮灌装，即得和厚朴酚注射用自乳化微乳制剂。
实施例7
和厚朴酚自乳化微乳制剂，含和厚朴酚(C18H18O2)为标示量的95.0～105.0％。本实施例中的和厚朴酚自乳化微乳制剂规格为1.0g；自微乳注射液中含和厚朴酚(C18H18O2)50mg；组成见表11。
表11本实施例中单位剂量和厚朴酚自微乳注射液的处方组成
Figure BDA0002524761980000281
制备工艺：
取和厚朴酚加入到无水乙醇和聚乙二醇400中，搅拌溶解，再加入叔丁基对羟基茴香醚和没食子丙酯，搅拌溶解；然后加入聚乙二醇12羟基硬脂酸15、聚氧乙烯醚35氢化蓖麻油和肉豆蔻酸异丙酯的混合液，搅拌混合至澄明，即得和厚朴酚自乳化溶液。
上述溶液中经0.22μm微孔滤膜滤过，无菌充氮灌装，即得和厚朴酚注射用自乳化微乳制剂。
实施例8
和厚朴酚自乳化微乳制剂，含和厚朴酚(C18H18O2)为标示量的95.0～105.0％。本实施例中的和厚朴酚自乳化微乳制剂规格为1.0g；自微乳注射液中含和厚朴酚(C18H18O2)50mg；组成见表12。
表12本实施例中单位剂量和厚朴酚自微乳注射液的处方组成
Figure BDA0002524761980000291
制备工艺
取和厚朴酚加入到无水乙醇和甘油中，搅拌溶解，再加入乙酰半胱氨酸和α-生育酚，搅拌溶解；然后加入聚乙二醇12羟基硬脂酸15、大豆卵磷脂和中链甘油三酸酯的混合液，搅拌混合至澄明，即得和厚朴酚自乳化溶液。
上述溶液中经0.22μm微孔滤膜滤过，无菌充氮灌装，即得和厚朴酚注射用自乳化微乳制剂。
对比例1
按照表13所示的组成，制备自微乳注射液
表13本实施例中单位剂量和厚朴酚自微乳注射液的处方组成
Figure BDA0002524761980000292
制备工艺
取和厚朴酚加入到无水乙醇中，搅拌溶解，再加入乙酰半胱氨酸，搅拌溶解；然后加入聚乙二醇12羟基硬脂酸15和中链甘油三酸酯的混合液，搅拌混合，但无法得到均匀的澄明溶液，出现浑浊和沉淀。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：和厚朴酚40～60份、油相200～250份、乳化剂400～440份、助乳化剂290～330份和抗氧化剂4～8份；
优选的，包括以下重量份的原料：和厚朴酚45～55份、油相210～230份、乳化剂410～430份、助乳化剂300～310份和抗氧化剂5～7份。
2.根据权利要求1所属的注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，其特征在于，所述乳化剂包括注射用级别聚乙二醇12羟基硬脂酸15，吐温80，司盘80、聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油，聚氧乙烯醚35氢化蓖麻油，普朗尼克F68，泊洛沙姆188、卵磷脂和豆磷脂中的一种或几种的混合物；
优选聚乙二醇12羟基硬脂酸15，吐温80，聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油，普朗尼克F68和卵磷脂中的一种或几种的混合物；
再优选聚乙二醇12羟基硬脂酸15，聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油，聚氧乙烯醚35氢化蓖麻油，普朗尼克F68和卵磷脂中的一种或几种的混合物；
再优选聚乙二醇12羟基硬脂酸15和蛋黄卵磷脂。
3.根据权利要求1或2所述的注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，其特征在于，所述油相包括注射用级别的中链甘油三酸酯，优酸乙酯，十六酸异丙酯和肉豆蔻酸异丙酯中的一种或几种的混合物；
优选中链甘油三酸酯或肉豆蔻酸异丙酯；
再优选中链甘油三酸酯。
4.根据权利要求1所述的注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，其特征在于，所述助乳化剂包括注射用级别无水乙醇，聚乙二醇400，聚乙二醇200，甘油，1,2-丙二醇中的一种或几种混合物。
优选无水乙醇，聚乙二醇400和1,2-丙二醇中的一种或几种混合物；
再优选无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，其特征在于，所述抗氧化剂包括亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、叔丁基对羟基茴香醚、硫脲、维生素C、没食子丙酯、α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯，乙酰半胱氨酸中的一种或几种混合物；
优选焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、维生素C、α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯和乙酰半胱氨酸中的一种或几种混合物；
再优选乙酰半胱氨酸。
6.根据权利要求1或2所述的注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂，其特征在于，所述蛋黄卵磷脂的重量份为5～55份，所述聚乙二醇12羟基硬脂酸15的重量份为385～395份。
7.权利要求1～6任意一项所述的注射用和厚朴酚自乳化微乳制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛋黄卵磷脂、抗氧化剂和助乳化剂混合后，与聚乙二醇12羟基硬脂酸15和油相混合获得溶剂溶液；
2)将和厚朴酚与所述溶剂溶液混合获得和厚朴酚自乳化微乳制剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述和厚朴酚与所述溶剂溶液混合后还包括滤膜过滤；所述滤膜的孔径为0.22μm。
9.一种包括权利要求1～6任意一项所述的注射用自乳化微乳制剂的注射制剂，其特征在于，还包括5％葡萄糖注射液或0.9％NaCl注射液。
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