CN111647521A - 一种乳杆菌gm_1及其选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种乳杆菌GM_1及其选育方法，所述乳杆菌GM_1的选育方法包括：待选育乳杆菌菌株的活化培养；制备乳杆菌接种液；加入亚硝基胍母液和灭菌磷酸缓冲液，离心、洗涤、稀释，得亚硝基胍处理过的菌液；将亚硝基胍处理过的菌液进行培养，得到乳杆菌突变群体；挑选形态规则、特征明显、菌落明显大于其它菌落的菌落接种培养后，冷冻离心、冻干粉碎，得到选育后的乳杆菌GM_1冻干粉。本发明利用化学诱变的方法开发出的较大规模的乳杆菌突变群体，不存在生物安全风险，遗传稳定，耗时短，成本低，可作为新的乳杆菌遗传种质资源库，用于筛选任意性状的优质乳杆菌菌种，且能够满足各种特征产品生产的需求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种乳杆菌GM_1及其选育方法。
背景技术
目前，乳杆菌是与人类生活关系密切的益生菌之一，广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域。其中，乳杆菌GM_1具有较强的耐酸、耐胆盐能力，在消化道中有较强生命力，并对其有较强的粘附能力，同时大量动物和人体实验表明，乳杆菌GM_1具有较强的抑制致病菌、降血脂、提高有机体抗氧化、保护肝脏、预防糖耐受量受损和II型糖尿病、调节有机体免疫力及抗肿瘤等益生功能。
现有乳杆菌的选育主要通过建立菌种库、辐射诱变及基因工程改良等手段来选育优质乳杆菌菌种。建立较大规模的菌种资源库耗时，成本高，并且不一定能收集到所需的优质菌种资源。基因工程改良菌主要用于工业等方面的特定用途，但在微生物菌种的选育方面还少有应用。辐射诱变是一种物理诱变，诱变剂主要包括紫外线、X-射线、γ-射线，快速中子等，在诱变微生物菌种中较为常用，但选育出的优质益生菌种仍非常有限。因此，亟需一种新的乳杆菌选育方法，以便选育出活性高、形态规则、特征明显、快速生长、易于高密度培养的优质乳杆菌菌种。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有通过建立菌种库选育乳杆菌菌种的方法中，建立较大规模的菌种资源库耗时，成本高，并且不一定能收集到所需的优质菌种资源。
(2)现有通过基因工程改良菌主要用于工业等方面的特定用途，但在微生物菌种的选育方面还少有应用。
(3)现有辐射诱变在诱变微生物菌种中较为常用，但选育出的优质益生菌种仍非常有限。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种乳杆菌GM_1及其选育方法。
本发明是这样实现的，一种乳杆菌GM_1的选育方法，所述乳杆菌GM_1的选育方法包括以下步骤：
步骤一，菌株活化培养：将待选育的乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中，并在温度37℃与有氧的条件下暗中活化培养24h，传代培养3代后，将得到的培养液划线接种于MRS平板培养基上，并置于温度37℃的条件下培养48h；
步骤二，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落作为出发菌株，并接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～48h，传代培养3代；再按3％的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～36h得活化的菌液，冻干保藏；
步骤三，制备接种液：将步骤二得到的乳杆菌单菌落置于5～8mL的生理盐水中混合均匀得到乳杆菌悬液；用LSM培养液稀释菌悬液至在波长600～800nm条件下OD值为0.15～0.2，得到乳杆菌接种液；
步骤四，用无菌离心管中吸取乳杆菌接种液2.5ml，加入亚硝基胍母液和灭菌磷酸缓冲液定容至5.0ml，将离心管置于摇床上，温度为36.5～37℃混合均匀，5000r/min离心6min，弃去上清液，洗涤，稀释，得亚硝基胍处理过的菌液；
步骤五，将亚硝基胍处理过的菌液涂布于MRS平板培养基上于37℃培养24h后，挑选单菌落接种于液体培养基中，于37℃培养24h，得到乳杆菌突变单体，每个处理的新种质一起组成突变群体；
步骤六，将步骤五得到的突变单体在MRS平板培养基上划线，于37℃培养24～36h，挑选出形态规则、特征明显、菌落明显大于其它菌落的菌落，即可得到新的、快速生长的乳杆菌GM_1；
步骤七，将步骤六选育得到的乳杆菌GM_1接种于MRS培养基中培养后，进行冷冻离心，得到沉淀；往沉淀中加入冻干保护剂后进行冻干，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到选育后的乳杆菌GM_1冻干粉。
进一步，步骤一中，所述MRS液体培养基由20g/L葡萄糖、12g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L无水乙酸钠、2g/L磷酸氢二钾、1.5g/L柠檬酸二胺、0.5ml/L吐温-80、0.25g/L硫酸锰和浓度为0.25～1.0mol/L的KH2PO4缓冲液组成。
进一步，所述MRS液体培养基的制备方法为：
(1)将葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸二胺、吐温-80、硫酸锰混合；
(2)在混合液中加入KH2PO4缓冲液，定容至1000mL；
(3)用0.1mol/L的NaOH调节pH至7；
(4)在120℃条件下灭菌10min，得到MRS液体培养基。
进一步，所述MRS平板培养基是在MRS液体培养基基础上添加25.0g/L琼脂，高压灭菌20～30min。
进一步，步骤四中，所述稀释的方法为：弃去上清液后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤菌体2～3次后，加入等体积的灭菌磷酸缓冲液悬浮菌体，适当稀释。
进一步，步骤五中，所述乳杆菌突变群体添加20％的灭菌甘油，于-80℃长期保存。
进一步，步骤六中，所述在相同培养时间内菌落大小是未经诱变的菌落大小的2倍以上。
进一步，步骤七中，所述乳杆菌GM_1在37℃的环境下培养48h后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心；并于冷冻干燥机里冻干48小时后粉碎。
进一步，步骤七中，所述冻干保护剂由甘油15～20份，乳糖10～12份，海藻糖8～10份，酪蛋白5～8份，无菌水50～55份组成。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的乳杆菌GM_1的选育方法选育得到的乳杆菌GM_1，所述乳杆菌GM_1菌株已于2015年07月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11131。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明利用化学诱变的方法开发出较大规模的乳杆菌突变群体，然后通过高通量微生物筛选技术选育出快速生长的乳杆菌菌株，同时化学诱变的菌株不存在生物安全风险，遗传稳定。化学诱变的乳杆菌突变群体可作为新的乳杆菌遗传种质资源库，用于筛选任意性状的优质乳杆菌菌种，且能够满足各种特征产品生产的需求。本发明提供的乳杆菌的选育方法耗时短，成本低，不需要建立较大规模的菌种资源库，选育出的优质乳杆菌菌种形态规则、特征明显、菌落明显、生长快速。
附图说明
图1是本发明实施例提供的乳杆菌GM_1的选育方法流程图。
图2是本发明实施例提供的MRS液体培养基的制备方法的流程图。
图3是本发明实施例提供的乳杆菌GM_1突变群体示意图。
图4是本发明实施例提供的选育出的新的、可快速生长的乳杆菌GM_1示意图。
图5是本发明实施例提供的乳杆菌GM_1电镜示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种乳杆菌GM_1及其选育方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的乳杆菌GM_1的选育方法包括以下步骤：
S101，菌株活化培养：将待选育的乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中，并在温度37℃与有氧的条件下暗中活化培养24h，传代培养3代后，将得到的培养液划线接种于MRS平板培养基上，并置于温度37℃的条件下培养48h；
S102，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落作为出发菌株，并接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～48h，传代培养3代；再按3％的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～36h得活化的菌液，冻干保藏；
S103，制备接种液：将步骤二得到的乳杆菌单菌落置于5～8mL的生理盐水中混合均匀得到乳杆菌悬液；用LSM培养液稀释菌悬液至在波长600～800nm条件下OD值为0.15～0.2，得到乳杆菌接种液；
S104，用无菌离心管中吸取乳杆菌接种液2.5ml，加入亚硝基胍母液和灭菌磷酸缓冲液定容至5.0ml，将离心管置于摇床上，温度为36.5～37℃混合均匀，5000r/min离心6min，弃去上清液，洗涤，稀释，得亚硝基胍处理过的菌液；
S105，将亚硝基胍处理过的菌液涂布于MRS平板培养基上于37℃培养24h后，挑选单菌落接种于液体培养基中，于37℃培养24h，得到乳杆菌突变单体，每个处理的新种质一起组成突变群体；
S106，将步骤五得到的突变单体在MRS平板培养基上划线，于37℃培养24～36h，挑选出形态规则、特征明显、菌落明显大于其它菌落的菌落，即可得到新的、快速生长的乳杆菌GM_1；
S107，将步骤六选育得到的乳杆菌GM_1接种于MRS培养基中培养后，进行冷冻离心，得到沉淀；往沉淀中加入冻干保护剂后进行冻干，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到选育后的乳杆菌GM_1冻干粉。
如图2所示，本发明实施例提供的MRS液体培养基的制备方法为：
S201，将葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸二胺、吐温-80、硫酸锰混合；
S202，在混合液中加入KH2PO4缓冲液800mL；
S203，用0.1mol/L的NaOH调节pH至7；
S204，在120℃条件下灭菌10min，得到MRS液体培养基。
本发明实施例提供的步骤S101中，所述MRS液体培养基由20g/L葡萄糖、12g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L无水乙酸钠、2g/L磷酸氢二钾、1.5g/L柠檬酸二胺、0.5ml/L吐温-80和0.25g/L硫酸锰组成。
本发明实施例提供的步骤S101中，所述MRS平板培养基是在MRS液体培养基基础上添加25.0g/L琼脂，高压灭菌20～30min。
本发明实施例提供的步骤S104中，所述稀释的方法为：弃去上清液后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤菌体2～3次后，加入等体积的灭菌磷酸缓冲液悬浮菌体，适当稀释。
本发明实施例提供的步骤S105中，所述乳杆菌突变群体添加20％的灭菌甘油，于-80℃长期保存。
本发明实施例提供的步骤S106中，所述在相同培养时间内菌落大小是未经诱变的菌落大小的2倍以上。
本发明实施例提供的步骤S107中，所述乳杆菌GM_1在37℃的环境下培养48h后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心；并于冷冻干燥机里冻干48小时后粉碎。
本发明实施例提供的步骤S107中，所述冻干保护剂由甘油15～20份，乳糖10～12份，海藻糖8～10份，酪蛋白5～8份，无菌水50～55份组成。
本发明实施例提供的乳杆菌GM_1菌株已于2015年07月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11131。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实验中使用的MRS培养基以1L计，由以下量的组分组成：
将乳杆菌GM_1菌株接种至MRS培养基，纱布封口培养后得到发酵菌株。
经检测，MRS培养基有利于乳杆菌GM_1菌株的增殖培养。
把选育得到的乳杆菌GM_1菌株与乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌的冻干粉以2∶1∶0.5比例混合，进行储藏，储藏内pH值降低速度较慢，储藏温度4℃下混合物的保存时间能够达到110天。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，所述乳杆菌GM_1的选育方法包括以下步骤：
步骤一，菌株活化培养：将待选育的乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中，并在温度37℃与有氧的条件下暗中活化培养24h，传代培养3代后，将得到的培养液划线接种于MRS平板培养基上，并置于温度37℃的条件下培养48h；
步骤二，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落作为出发菌株，并接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～48h，传代培养3代；再按3％的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24～36h得活化的菌液，冻干保藏；
步骤三，制备接种液：将步骤二得到的乳杆菌单菌落置于5～8mL的生理盐水中混合均匀得到乳杆菌悬液；用LSM培养液稀释菌悬液至在波长600～800nm条件下OD值为0.15～0.2，得到乳杆菌接种液；
步骤四，用无菌离心管中吸取乳杆菌接种液2.5ml，加入亚硝基胍母液和灭菌磷酸缓冲液定容至5.0ml，将离心管置于摇床上，温度为36.5～37℃混合均匀，5000r/min离心6min，弃去上清液，洗涤，稀释，得亚硝基胍处理过的菌液；
步骤五，将亚硝基胍处理过的菌液涂布于MRS平板培养基上于37℃培养24h后，挑选单菌落接种于液体培养基中，于37℃培养24h，得到乳杆菌突变单体，每个处理的新种质一起组成突变群体；
步骤六，将步骤五得到的突变单体在MRS平板培养基上划线，于37℃培养24～36h，挑选出形态规则、特征明显、菌落明显大于其它菌落的菌落，即可得到新的、快速生长的乳杆菌GM_1；
步骤七，将步骤六选育得到的乳杆菌GM_1接种于MRS培养基中培养后，进行冷冻离心，得到沉淀；往沉淀中加入冻干保护剂后进行冻干，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到选育后的乳杆菌GM_1冻干粉。
2.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤一中，所述MRS液体培养基由20g/L葡萄糖、12g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L无水乙酸钠、2g/L磷酸氢二钾、1.5g/L柠檬酸二胺、0.5ml/L吐温-80、0.25g/L硫酸锰和浓度为0.25～1.0mol/L的KH2PO4缓冲液组成。
3.如权利要求2所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，所述MRS液体培养基的制备方法为：
(1)将葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸二胺、吐温-80、硫酸锰混合；
(2)在混合液中加入KH2PO4缓冲液，定容至1000mL；
(3)用0.1mol/L的NaOH调节pH至7；
(4)在120℃条件下灭菌10min，得到MRS液体培养基。
4.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤一中，所述MRS平板培养基是在MRS液体培养基基础上添加25.0g/L琼脂，高压灭菌20～30min。
5.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤四中，所述稀释的方法为：弃去上清液后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤菌体2～3次后，加入等体积的灭菌磷酸缓冲液悬浮菌体，适当稀释。
6.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤五中，所述乳杆菌突变群体添加20％的灭菌甘油，于-80℃长期保存。
7.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤六中，所述在相同培养时间内菌落大小是未经诱变的菌落大小的2倍以上。
8.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤七中，所述乳杆菌GM_1在37℃的环境下培养48h后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心；并于冷冻干燥机里冻干48小时后粉碎。
9.如权利要求1所述的乳杆菌GM_1的选育方法，其特征在于，步骤七中，所述冻干保护剂由甘油15～20份，乳糖10～12份，海藻糖8～10份，酪蛋白5～8份，无菌水50～55份组成。
10.一种应用如权利要求1～9任意一项所述的乳杆菌GM_1的选育方法选育得到的乳杆菌GM_1，其特征在于，所述乳杆菌GM_1菌株已于2015年07月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11131。
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