CN111646995B - 4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于化学医药领域，具体涉及4‑氨基‑嘧啶并氮杂环‑苯基脲类衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种4‑氨基‑嘧啶并氮杂环‑苯基脲类衍生物，其结构式如式Ⅰ所示。此外，本发明还提供了上述4‑氨基‑嘧啶并氮杂环‑苯基脲类衍生物的制备方法及其用途。本发明提供的4‑氨基‑嘧啶并氮杂环‑苯基脲类衍生物能够作为FLT3激酶抑制剂，具有良好的效果，为制备抗肿瘤药物提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
白血病是造血干细胞异常的克隆性疾病，因白血病细胞失去分化为成熟功能性血细胞的能力而停滞在细胞发育的不同阶段恶性增殖，在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，正常造血受到抑制，临床表现贫血、出血、感染及各器官浸润等症状。白血病属于细胞异质性恶性肿瘤，种类繁多，病因复杂，临床表现不同的症状，有的白血病具有发病快、死亡率高、存活期短、易复发、预后不良、极难治愈的特点。
蛋白激酶是催化蛋白质的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上的羟基基团磷酸化作用的酶，尤其是受体蛋白酪氨酸激酶族，作为生长因子受体，在许多细胞功能多大的信号转导途径控制方面起着重要作用，比如细胞周期、细胞生长、细胞分化和细胞死亡。受体酪氨酸激酶的失调经常在增殖紊乱、炎症紊乱、免疫系统紊乱等疾病中发现。
FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)为FMS样酪氨酸激酶3，它与c-Kit、c-FMS和PDGFR同属于III型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase III，RTK III)家族成员，FLT3的结构包括由5个免疫球蛋白样组成的细胞膜外结构域、跨膜结构域和细胞膜内酪氨酸激酶结构域。FLT3主要在正常的造血干细胞和造血祖细胞的细胞表面表达，其配体主要在骨髓基质细胞中表达。当配体与FLT3细胞膜外结构域结合后，促使FLT3受体二聚化，同时细胞膜内酪氨酸激酶域发生自身磷酸化，激活一系列下游信号传导途径，如Ras/MAPK、PI3K/Akt/mTOR和STAT5从而调控细胞的增殖和分化。FLT3突变通常会导致其异常活化，在不与配体结合的情况下，发生自身磷酸化激活下游信号通路，导致造血细胞和淋巴细胞的异常增殖，引发多种恶性血液疾病。
现已证实FLT3的激活突变主要有两种：内部串联重复(internal tandemduplication，ITD)和激酶结构域(tyrosine kinase domain，TKD)中活化环的点突变。FLT3-ITD突变出现在大约25％的急性髓细胞白血病病人中，且与一些不良预后有关，而FLT3-TKD突变出现在大约5％的急性髓细胞白血病病人中。
大量研究表明FLT3突变是AML中最常见的分子遗传学异常和不良预后的因素之一，其传导涉及到多条信号传导途径，使得FLT3成为一个理想的药物作用靶点。在以往的研究中，已经有20余种化合物显示了对FLT3酪氨酸激酶的抑制性。许多已经进入临床试验。这些小分子酪氨酸酶抑制剂多为杂环嘌呤类似物，是ATP类似物，或结构类似于与ATP以共价键结合的酪氨酸的中间产物。FLT3受体依然表达，但ATP通路被阻断，因此自身磷酸化和对底物的持续磷酸化终止，从而阻断了依赖FLT3-ITD的细胞系的信号通路，发挥细胞毒作用。
目前对FLT3-ITD和FLT3-TKD抑制剂的研究属于药物研发的热点，单靶点FLT3抑制剂AC220目前正进行临床三期试验，有望上市，但在治疗后期的耐药性成为了急需解决的问题。因此，开发对两种突变均有效的抑制剂是研发的方向。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了一种4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
其中，X为N或C；
R1为-H、-OH、卤素、C1～C10烷氧基、C1～C10卤代烷氧基、
C2～C10烯基、C2～C10炔基、C3～C10环烷基、
或取代或未取代的C1～C10烷基；所述取代C1～C10烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C8烷氧基、C3～C8环烷基、C1～C8羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C8氧羰基、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C8烷基；
R2为-H、-OH、卤素、C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10卤代烷基、氨基取代的C1～C10烷基、苄基、取代或未取代的C5～C10芳基或取代或未取代的5～10元杂芳基；所述5～10元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C10芳基或5～10元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C8烷基、C3～C8环烷基、C1～C8卤代烷基、C1～C8烷氧基、C1～C8卤代烷氧基、-OH或C1～C8羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C10烷基。
作为本发明优选的方案，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C8烷氧基、C1～C8卤代烷氧基、
C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、
或取代或未取代的C1～C8烷基；所述取代C1～C8烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C6烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C6羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C6氧羰基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C6烷基；
R2为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C3～C8环烷基、C1～C8卤代烷基、氨基取代的C1～C8烷基、苄基、取代或未取代的C5～C8芳基或取代或未取代的5～8元杂芳基；所述5～8元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C8芳基或5～8元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C6烷基、C3～C6环烷基、C1～C6卤代烷基、C1～C6烷氧基、C1～C6卤代烷氧基、-OH或C1～C6羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C8烷基。
进一步的，作为本发明优选的方案，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C6烷氧基、C1～C6卤代烷氧基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基、
或取代的C1～C6烷基；所述取代C1～C6烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R2为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C3～C6环烷基、C1～C6卤代烷基、氨基取代的C1～C6烷基、苄基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
优选的，上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R2为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C3～C6环烷基、C1～C6卤代烷基、氨基取代的C1～C6烷基、苄基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
进一步的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基、
或
R4为-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；R11为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R2为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C3～C6环烷基、C1～C6卤代烷基、氨基取代的C1～C6烷基、苄基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
更进一步的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、甲氧基、乙氧基、
甲酰基、乙酰基、
R4为-H、C1～C4烷基、叔丁基氧基或
R5～R10独立的为-H、甲基或乙基；
R2为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C3～C6环烷基、C1～C6卤代烷基、氨基取代的C1～C6烷基、苄基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
最优选的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
叔丁氧羰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、
R2为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C3～C6环烷基、C1～C6卤代烷基、氨基取代的C1～C6烷基、苄基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
优选的，上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，X为N或C；R2为苄基、C3～C6环烷基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
进一步的，X为N或C；R2为苄基、C3～C6环烷基、
R12～R19独立的为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
更进一步的，X为N或C；R2为苄基、C3～C6环烷基、
R16～R19独立的为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C1～C4卤代烷基、-OH或C1～C4羰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
再进一步的，X为N或C；R2为苄基、C3～C6环烷基、
R16～R19独立的为-H、-F、-Cl、-Br、-CF3、甲基或乙酰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
最优选的，X为N或C；R2为
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
优选的，上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，X为N或C；R3为-H、卤素、-OH或C1～C4烷基；R2为苄基、C3～C6环烷基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基。
进一步的，X为N或C；R3为-H、卤素或C1～C4烷基；R2为苄基、C3～C6环烷基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基。
更进一步的，X为N或C；R3为-H或卤素；R2为苄基、C3～C6环烷基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基。
最优选的，X为N或C；R3为-H、-F、-Cl或-Br；R2为苄基、C3～C6环烷基、取代或未取代的C5～C6芳基或取代或未取代的5～6元杂芳基；所述5～6元杂芳基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代C5～C6芳基或5～6元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基。
作为本发明优选技术方案，上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基、
R4为-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；R11为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R2为苄基、C3～C6环烷基、
R12～R19独立的为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基；
R3为-H、卤素或C1～C4烷基。
优选的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、甲氧基、乙氧基、
甲酰基、乙酰基、
R4为-H、C1～C4烷基、叔丁基氧基或
R5～R10独立的为-H、甲基或乙基；
R2为苄基、C3～C6环烷基、
R16～R19独立的为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C1～C4卤代烷基、-OH或C1～C4羰基；
R3为-H或卤素。
最优选的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
叔丁氧羰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、
R2为
R3为-H、-F、-Cl或-Br。
作为本发明优选技术方案，上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，当R2为
时，结构如式Ⅱ所示：
其中，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C10烷氧基、C1～C10卤代烷氧基、
C2～C10烯基、C2～C10炔基、C3～C10环烷基、
或取代或未取代的C1～C10烷基；所述取代C1～C10烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C8烷氧基、C3～C8环烷基、C1～C8羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C8氧羰基、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C8烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C10烷基。
优选的，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C8烷氧基、C1～C8卤代烷氧基、
C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、
或取代或未取代的C1～C8烷基；所述取代C1～C8烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C6烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C6羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C6氧羰基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C6烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C8烷基。
进一步优选的，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C6烷氧基、C1～C6卤代烷氧基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基、
或取代的C1～C6烷基；所述取代C1～C6烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C6烷基。
进一步的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；
R3为-H、-OH、卤素或C1～C4烷基。
更进一步的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基、
R4为-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；R11为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R3为-H、-OH或卤素。
更优选的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、甲氧基、乙氧基、
甲酰基、乙酰基、
R4为-H、C1～C4烷基、叔丁基氧基或
R5～R10独立的为-H、甲基或乙基；
R3为-H或卤素。
最优选的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
叔丁氧羰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、
R3为-H、-F、-Cl或-Br。
作为本发明优选技术方案，上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，当R2为
R3为-H时，结构如式Ⅲ所示：
其中，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C10烷氧基、C1～C10卤代烷氧基、
C2～C10烯基、C2～C10炔基、C3～C10环烷基、
或取代或未取代的C1～C10烷基；所述取代C1～C10烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C8烷氧基、C3～C8环烷基、C1～C8羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C8氧羰基、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C8烷基。
优选的，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C8烷氧基、C1～C8卤代烷氧基、
C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、
或取代或未取代的C1～C8烷基；所述取代C1～C8烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C6烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C6羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C6氧羰基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C6烷基。
进一步优选的，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C6烷氧基、C1～C6卤代烷氧基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基、
或取代的C1～C6烷基；所述取代C1～C6烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基。
进一步的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基或取代或未取代的5～6元杂环烷基；所述5～6元杂环烷基的杂原子为N或O，杂原子个数为1～2个；所述取代5～6元杂环烷基的取代基为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基。
更进一步的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基、
R4为-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C4烷基；R11为-H、C1～C4氧羰基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或
更优选的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、甲氧基、乙氧基、
甲酰基、乙酰基、
R4为-H、C1～C4烷基、叔丁基氧基或
R5～R10独立的为-H、甲基或乙基。
最优选的，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
叔丁氧羰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、
作为本发明优选技术方案，上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，当R2为
R3为-H、X为C、R1为
时，结构如式Ⅳ所示：
其中，R16～R19独立的为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C3～C6环烷基、C1～C4卤代烷基、C1～C4烷氧基、C1～C4卤代烷氧基、-OH或C1～C4羰基。
优选的，R16～R19独立的为-H、卤素、-NH2、C1～C4烷基、C1～C4卤代烷基、-OH或C1～C4羰基。
最优选的，R16～R19独立的为-H、-F、-Cl、-Br、-CF3、甲基或乙酰基。
本发明4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，结构式如下：
本发明还提供了上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物的合成方法，本发明主要采用如下合成路线：
本发明化合物的合成方法为：将本发明通式(I)化合物的结构如上划分为A部分和B部分，其中A部分为胺类中间体(式Ⅴ)化合物，B部分为活性脲中间体(式Ⅵ)化合物或异氰酸酯中间体。
方案一：A部分胺类中间体(式Ⅴ)化合物的合成方法如下所示：
其中，嘧啶并吡咯类中间体的合成方法如下方案所示：
步骤a：氨化：以4-氯吡咯并嘧啶(可商业购买)为起始原料SM1，在高压釜内加入氨水(g/mL≈5～7倍)，压力为10～15个大气压，反应4小时，冷却后过滤得到中间体M1，干燥后无需进一步纯化；
步骤b：碘代：室温下将中间体M1溶解在溶剂中，加入N-碘代丁二酰亚胺(NIS)(1.5倍当量)反应1小时，浓缩溶液后，加入30～40倍水进行打浆，并加入0.5当量的硫代硫酸钠，过滤后得到中间体M2，干燥后无需进一步纯化；所述溶剂为四氢呋喃、DMF或乙腈等；
步骤c：Boc保护：将中间体M2溶解在溶剂中，加入2当量有机碱，加入1当量Boc酸酐(例如：二碳酸二叔丁酯)置于50～60℃条件下反应2小时，反应结束后将反应液浓缩，并用30～40倍水进行打浆，过滤后得到中间体M3，干燥后无需进一步纯化；所述溶剂为乙腈、DMF或二氧六环等；所述有机碱为三乙胺、DIEA或吡啶等；
步骤d：Suzuki反应：将中间体M3与硼酸/硼酸频哪醇酯、碱、催化剂等混合后，加入溶剂，于氮气保护下进行反应，反应温度为70～90℃，反应2～4小时后进行处理，经过简单处理后得到中间体M4，需进一步纯化；所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾或碳酸氢钠等无机碱；所述催化剂为(dppf)PdCl2或四(三苯基膦)钯；所述溶剂为二氧六环、乙醇和水的混合溶剂或者甲苯、乙醇和水的混合溶剂；
步骤e：脱Boc：室温下将中间体M4溶解在溶剂中，加入强酸，体系pH大约为1，反应结束后用无机碱调节至碱性，pH大约为13，经过二氯甲烷萃取，将有机相浓缩后用乙醚打浆，过滤得到中间体M5，干燥后无需进一步纯化；所述溶剂为水或乙醇等；所述强酸为硫酸、甲磺酸或盐酸等无机强酸；所述无机碱为氢氧化钾或氢氧化钠等；
步骤f：取代：将中间体M5溶解在溶剂中，加入1.2当量卤代物，于70～80℃反应1小时，反应液过滤除去无机盐得到中间体M6(式Ⅴ化合物)的溶液，无需进一步纯化；所述溶剂为乙腈、甲苯、二氧六环或DMF等。
B部分胺类中间体(式Ⅵ)化合物的合成方法如下所示：
将三光气溶解在溶剂中，加入1当量的胺的原料，再将有机碱加入，反应温度为60～65℃，反应4～5小时，反应结束后过滤除去固体残渣，滤液浓缩得到中间体(式Ⅵ化合物)；所述溶剂为四氢呋喃等；所述有机碱为三乙胺或DIEA等。
然后，将中间体化合物(式Ⅴ)溶解在溶剂中，加入1当量的中间体化合物(式Ⅵ)，在70～80℃反应1小时，大量固体析出，过滤后的滤饼即为最终的脲类化合物，即通式(I)化合物；所述溶剂为乙腈、二氧六环、甲苯或DMF等；
其中，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C10烷氧基、C1～C10卤代烷氧基、
C2～C10烯基、C2～C10炔基、C3～C10环烷基、
或取代或未取代的C1～C10烷基；所述取代C1～C10烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C8烷氧基、C3～C8环烷基、C1～C8羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C8氧羰基、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C8烷基；
R2为-H、-OH、卤素、C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10卤代烷基、氨基取代的C1～C10烷基、苄基、取代或未取代的C5～C10芳基或取代或未取代的5～10元杂芳基；所述5～10元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C10芳基或5～10元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C8烷基、C3～C8环烷基、C1～C8卤代烷基、C1～C8烷氧基、C1～C8卤代烷氧基、-OH或C1～C8羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C10烷基。
方案二：
中间体化合物(式Ⅴ)的合成与方案一相同，将中间体化合物(式Ⅴ)溶解在溶剂中，加入1当量的异氰酸酯中间体，在70～80℃反应1小时，大量固体析出，过滤后的滤饼即为最终的脲类化合物，即通式(I)化合物；所述溶剂为乙腈、二氧六环、甲苯或DMF等；
其中，X为N或C；R1为-H、-OH、卤素、C1～C10烷氧基、C1～C10卤代烷氧基、
C2～C10烯基、C2～C10炔基、C3～C10环烷基、
或取代或未取代的C1～C10烷基；所述取代C1～C10烷基的取代基为-H、
-CN、-OH、苯基、卤素、C1～C8烷氧基、C3～C8环烷基、C1～C8羰基或取代或未取代的3～6元杂环烷基；所述3～6元杂环烷基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代3～6元杂环烷基的取代基为-H、-OH、卤素、C1～C8氧羰基、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R4为-H、-OH、卤素、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或
R5～R10独立的为-H或C1～C8烷基；
R2为-H、-OH、卤素、C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10卤代烷基、氨基取代的C1～C10烷基、苄基、取代或未取代的C5～C10芳基或取代或未取代的5～10元杂芳基；所述5～10元杂芳基的杂原子为N、O或S，杂原子个数为1～3个；所述取代C5～C10芳基或5～10元杂芳基的取代基为-H、卤素、-NH2、C1～C8烷基、C3～C8环烷基、C1～C8卤代烷基、C1～C8烷氧基、C1～C8卤代烷氧基、-OH或C1～C8羰基；
R3为-H、-OH、卤素、-NH2或C1～C10烷基。
本发明还提供了上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物包括其互变异构体、立体异构体及其所有比例的混合物，还包括其同位素取代的化合物。
本发明还提供了上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物药学上可接受的盐。其中与酸成盐是指，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得。无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等。有机酸包括乙酸、丙酸、丙烯酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等。
本发明所用的术语“药学上可接受的”是指在在合理的医学判断范围，能适于用来与人类和其他哺乳动物的组织接触，而没有不当毒性、刺激、过敏反应等，其在对受者给药时能直接或间接地提供本发明的化合物或化合物的前药。
本发明还提供了上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物药学上可接受的水合物。术语“水合物”表示进一步通过非共价分子间作用力结合化学计量或非化学计量的水的化合物。
本发明还提供了上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物药学上可接受的多晶型物。术语“多晶型物”表示化合物或其复合物的固体结晶形式，其可以通过物理方法，例如X.射线粉末衍射图或红外光谱进行表征。
本发明还提供了上述4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物药学上可接受的药物组合物，这种药物组合物是由式Ⅰ～Ⅳ所示的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物或其盐或水合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。所述的辅助性成分如环糊精、精氨酸或葡甲胺。所述的环糊精选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(C1-4烷基)-α-环糊精、(C1-4烷基)-β-环糊精、(C1-4烷基)-γ-环糊精、(羟基-C1-4烷基)-α-环糊精、(羟基-C1-4烷基)-β-环糊精、(羟基-C1-4烷基)-γ-环糊精、(羧基-C1-4烷基)-α-环糊精、(羧基-C1-4烷基)-β-环糊精、(羧基-C1-4烷基)-γ-环糊精、α-环糊精的糖类醚、β-环糊精的糖类醚、γ-环糊精的糖类醚、α-环糊精的磺丁基醚、β-环糊精的磺丁基醚和γ-环糊精的磺丁基醚。所述的辅助性成分还包含医学上可接受的载体、佐剂或媒剂。可用于药学上可接受的药物组合物还离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵凝脂；缓冲物质包括磷酸盐、甘氨酸、精氨酸、山梨酸等。
上述药物组合物可以为液体形式或固体形式。其中，所述的液体形式可以为水溶液形式。所述的固体形式可以为粉末、颗粒、片剂或冻干粉形式。该药物组合物还含有注射用水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、注射/输注用盐水、注射/输注用葡萄糖、格林氏溶液或含有乳酸盐的格林氏溶液。
本发明还提供了上述式Ⅰ～Ⅳ所示的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、盐、水合物或药物组合物在制备FLT3激酶抑制剂中的用途；特别是突变型FLT3激酶；尤其是FLT3/ITD突变激酶。
本发明还提供了上述式Ⅰ～Ⅳ所示的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、盐、水合物或药物组合物在制备治疗细胞增殖紊乱方面疾病的药物中的用途。
本发明还提供了上述式Ⅰ～Ⅳ所示的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、盐、水合物或药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
进一步的，所述肿瘤为实体瘤和/或血液瘤。
更进一步的，所述实体瘤包括淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、颈癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴癌、表皮过渡增生、银屑病和/或前列腺增生。
更进一步的，所述血液瘤包括：急性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性嗜中性白血病、急性未分化细胞白血病、骨髓发育不良综合征、骨髓增生异常、多发性骨髓瘤和/或脊髓肉瘤。
本发明还提供了上述式Ⅰ～Ⅳ所示的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、盐、水合物或药物组合物在制备口服或静脉注射制剂中的用途。所述的口服或静脉注射制剂至少包含一种式Ⅰ～Ⅳ所示的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、盐、水合物或药物组合物以及任意的赋形剂和/或佐剂。
本发明提供的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物能够作为FLT3激酶抑制剂，具有良好的效果，为制备抗肿瘤药物提供了新的选择。
附图说明
图1MV4-11验证靶点通路；
图2Molm-13验证靶点通路；
图3Molm-13体内药效学模型；
图4MV4-11体内药效学模型；
图5NCG小鼠生存期考察。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不限制本发明。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，即20-30℃。
实施例1：1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(4-氟苯基)脲化合物CLJ-1
步骤a：M1中间体的制备
称量原料SM1(20g,130mmol)和氨水(150mL,25％-28％工业氨水)加入到高压反应釜内，密封体系，插入温度计，将温度设置为130℃，反应4h后冷却至室温。将反应混悬液直接过滤，滤饼用乙醚淋洗后得到中间体M1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.45(s,1H),8.03(s,1H),7.06(d,J＝3.2Hz,1H),6.88(s,2H),6.51(d,J＝3.3Hz,1H).
步骤b：M2中间体的制备
室温下，将上一步的中间体M1(16g,112mmol)加入到200mL的四氢呋喃中，并分批加入NIS(37.8g,168mmol)，反应1h。将反应混悬液进行减压蒸发，得到固体混合物，加入水300mL，搅拌下计入硫代硫酸钠(8.8g,56mmol)，混合物从棕色变为黄色，持续搅拌0.5h后过滤，滤饼用乙醚淋洗后得到中间体M2。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.97(s,1H),8.07(s,1H),7.36(s,1H),6.56(s,2H).
步骤c：M3中间体的制备
将上一步的中间体M2(28g,107.7mmol)、碳酸钾(29.7g,215.4mmol)、Boc酸酐(25.8g,118.5mmol)加入到500mL乙腈中，将得到的混合物加热至60℃，反应2h。将反应液过滤后丢弃滤饼，将母液减压蒸馏，得到混合物固体，加入500mL水进行打浆，持续搅拌0.5h后过滤，滤饼抽干后转入真空干燥箱，60℃干燥5h后得到中间体M3。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:8.28(s,1H),7.73(s,1H),6.87(s,2H),1.62(s,10H).
步骤d：M4中间体的制备
将上一步中间体M3(9.56g,26.6mmol)、对氨基苯硼酸盐酸盐(5.5g,31.8mmol)、碳酸钾(7.3g,53.1mmol)和dppf(Pd2Cl2)加入到250mL三颈瓶内，加入二氧六环/乙醇/水＝7:3:4(共计120mL)作为溶剂，置换氮气三次后转入80℃的油浴内反应2h。反应结束后将反应液浓缩至干后，拌样过柱子分离，即得到中间体M4。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.57(s,1H),9.02(s,1H),8.28(s,1H),7.59(d,J＝8.6Hz,2H),7.47(s,1H),7.44(d,J＝8.5Hz,2H),6.52(s,1H),6.23(s,2H),1.61(s,9H),1.31(s,9H).
步骤e：M5中间体的制备
将上一步的中间体M4(5g,15.4mmol)加入到50mL的二氯甲烷中，加入浓盐酸(10mL,36-38％浓盐酸)，反应1h后完全。加入200mL二氯甲烷和100mL水，将混合物的pH调至碱性(pH约为10)，萃取保留有机相，旋干后可得到中间体M5。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.57(s,1H),8.07(s,1H),7.12(d,J＝8.3Hz,2H),7.03(s,1H),6.66(d,J＝8.3Hz,2H),5.94(s,2H),5.16(s,2H).
步骤f：中间体M6的制备
将上一步的中间体M5(225mg,1mmol)、碳酸铯(650mg,2mmol)、N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(223mg,1.2mmol)加入到20mL乙腈中，加热至80℃反应1h。将反应液旋干后用二氯甲烷萃取后得到较纯的中间体M6。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.68(s,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,4H),7.13(s,1H),6.80(d,J＝8.4Hz,2H),4.44(s,2H),3.72(s,4H),2.87(s,2H),2.59(s,4H).步骤g：终产物CLJ-1的制备
将上一步的中间体M6(338mg,1mmol)加入到20mL的二氯甲烷中，加入4-氟异氰酸苯酯(137mg,1mmol)，反应0.5h后有固体析出，过滤后用乙醚淋洗滤饼就可以得到高纯度的终产物CLJ-1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.56(s,1H),9.47(s,1H),8.54(s,1H),7.71(s,1H),7.62(d,J＝8.6Hz,2H),7.52–7.45(m,2H),7.40(d,J＝8.6Hz,2H),7.16–7.10(m,2H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),3.89(s,4H),3.65(t,J＝6.4Hz,4H).HRMS(ESI),m/z:476.2214[M+H]+.
实施例2 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(2-氯苯基)脲化合物CLJ-2
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用2-氯异氰酸苯酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-2。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.47(s,1H),10.10(s,1H),8.59(s,1H),8.55(s,1H),8.15(dd,J＝8.3,1.5Hz,1H),7.72(s,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.46(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.42(d,J＝8.6Hz,2H),7.34–7.28(m,1H),7.07–7.01(m,1H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),3.89(s,4H),3.65(t,J＝6.4Hz,3H).HRMS(ESI),m/z:492.1922[M+H]+.
实施例3 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-苄基脲化合物CLJ-3
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用异氰酸苄酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-3。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.58(s,1H),9.31(s,1H),8.55(s,1H),7.70(s,1H),7.59(d,J＝8.6Hz,2H),7.37–7.30(m,6H),7.27–7.20(m,1H),7.05(s,1H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),4.32(s,2H),3.87(m,9H),3.65(t,J＝6.4Hz,3H).HRMS(ESI),m/z:472.2455[M+H]+.
实施例4 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(4-氯苯基)脲化合物CLJ-4
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用4-氯异氰酸苯酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-4。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:8.86(s,1H),8.82(s,1H),8.14(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.53–7.49(m,2H),7.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.35–7.30(m,3H),6.05(s,2H),4.28(t,J＝6.5Hz,2H),3.56–3.50(m,4H),2.71(t,J＝6.4Hz,2H),2.46(s,4H).HRMS(ESI),m/z:492.1913[M+H]+.
实施例5 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-氯苯基)脲化合物CLJ-5
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用3-氯异氰酸苯酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-5。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.44(s,1H),9.33(s,1H),8.22(s,1H),7.73(s,1H),7.59(d,J＝8.5Hz,2H),7.43–7.35(m,3H),7.32–7.27(m,2H),7.05–6.98(m,1H),6.39(s,2H),4.49(s,2H),3.73(s,4H),2.98(s,4H).HRMS(ESI),m/z:492.1915[M+H]+.
实施例6 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(2-氟苯基)脲化合物CLJ-6
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用2-氟异氰酸苯酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-6。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.23(s,1H),8.62(s,1H),8.16(dd,J＝15.3,6.0Hz,2H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(s,1H),7.29–7.20(m,1H),7.15(t,J＝7.6Hz,1H),7.01(dd,J＝12.7,6.5Hz,1H),6.04(s,2H),4.28(t,J＝6.4Hz,2H),3.54(s,4H),2.70(t,J＝6.5Hz,2H),2.45(s,4H).HRMS(ESI),m/z:476.2207[M+H]+.
实施例7 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲化合物CLJ-7
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用4-氯-3-三氟甲基-异氰酸苯酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-7。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.11(s,1H),9.99(s,1H),9.66(s,1H),8.52(s,1H),8.14(d,J＝1.8Hz,1H),7.70(s,1H),7.66–7.59(m,3H),7.41(d,J＝8.6Hz,2H),4.73(t,J＝6.3Hz,2H),3.87(s,4H),3.64(m,3H),3.41–3.13(m,4H).HRMS(ESI),m/z:560.1786[M+H]+.
实施例8 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(对甲苯基)脲化合物CLJ-8
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用对甲苯异氰酸酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-8。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.46(s,1H),9.20(s,1H),8.52(s,1H),7.69(s,1H),7.62(d,J＝8.6Hz,2H),7.39(d,J＝8.6Hz,2H),7.36(d,J＝8.5Hz,2H),7.09(d,J＝8.3Hz,2H),4.73(t,J＝6.5Hz,2H),3.88(s,4H),3.64(t,J＝6.1Hz,3H),3.44–3.11(m,4H),2.25(s,3H).HRMS(ESI),m/z:472.2458[M+H]+.
实施例9 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-氯-4-甲基苯基)脲化合物CLJ-9
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用3-氯-4-甲基-苯异氰酸酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-9。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.40(s,1H),9.66(d,J＝4.5Hz,2H),8.55(s,1H),7.72(s,1H),7.71(d,J＝1.9Hz,1H),7.62(d,J＝8.6Hz,2H),7.40(d,J＝8.6Hz,2H),7.27–7.19(m,2H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),3.89(s,4H),3.66(t,J＝6.5Hz,3H),2.26(s,3H).HRMS(ESI),m/z:506.2066[M+H]+.
实施例10 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-乙酰苯基)脲化合物CLJ-10
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用3-乙酰基苯异氰酸酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-10。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.39(s,1H),9.70(d,J＝8.8Hz,2H),8.54(s,1H),8.11(t,J＝1.8Hz,1H),7.73–7.68(m,2H),7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.61–7.57(m,1H),7.48–7.42(m,1H),7.41(d,J＝8.6Hz,2H),4.75(t,J＝6.5Hz,2H),3.89(s,4H),3.66(t,J＝6.5Hz,2H),2.57(s,3H).HRMS(ESI),m/z:500.2406[M+H]+.
实施例11 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-环己基脲化合物CLJ-11
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用环己基异氰酸酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-11。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:8.38(s,1H),8.12(s,1H),7.47(d,J＝8.6Hz,2H),7.30(d,J＝8.6Hz,2H),7.28(s,1H),6.09(d,J＝7.9Hz,1H),4.27(t,J＝6.6Hz,2H),3.56–3.51(m,4H),2.69(t,J＝6.6Hz,2H),2.45(d,J＝4.1Hz,4H),1.81(dd,J＝8.5,3.9Hz,2H),1.67(dd,J＝9.0,4.0Hz,2H),1.59–1.49(m,1H),1.38–1.25(m,2H),1.24–1.12(m,4H).HRMS(ESI),m/z:464.2773[M+H]+.
实施例12 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(4-溴苯基)脲化合物CLJ-12
与实施例1的合成方法相同，在步骤g中用4-溴苯异氰酸酯替换4-氟异氰酸苯酯，得到终产物CLJ-12。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:8.86(s,1H),8.82(s,1H),8.14(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.53–7.49(m,2H),7.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.35–7.30(m,3H),6.05(s,2H),4.28(t,J＝6.5Hz,2H),3.56–3.50(m,4H),2.71(t,J＝6.4Hz,2H),2.46(s,4H).HRMS(ESI),m/z:536.1408,538.1390[M+H]+.
实施例13 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-13
活性脲中间体1,3-双(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲的制备
将三光气(47.07g,156.9mmol)加入到300mL的四氢呋喃中，置于冰浴下，将3-氨基-5-叔丁基异噁唑(20g,142.65mmol)溶解在100mL四氢呋喃中，然后滴加到三光气溶液中，最后滴加三乙胺(39.8mL,285.3mmol)。将反应转移到60℃油浴，反应5h。反应完全后，将反应混合物过滤，保留滤液，将滤液进行减压浓缩得到固体，即活性脲中间体。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:6.71(s,1H),6.35(s,1H),4.90(s,2H),1.36(s,9H),1.35(s,9H).
将步骤f和h合并为“一锅法”的反应过程
将上一步的中间体M5(225mg,1mmol)、碳酸铯(650mg,2mmol)、N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(223mg,1.2mmol)加入到20mL乙腈中，加热至80℃反应1h。将反应液过滤，保留母液。将母液转移至80℃，加入活性脲中间体(306mg,1mmol)，反应0.5h后，大量固体析出，过滤，并用乙醚淋洗，即可得到高纯度的终产物CLJ-13。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.91(s,1H),8.14(s,1H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.40(d,J＝8.2Hz,2H),7.33(s,1H),6.52(s,1H),6.06(s,2H),4.29(t,J＝6.3Hz,2H),3.54(s,4H),2.71(t,J＝6.4Hz,2H),2.46(s,4H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:505.2672[M+H]+.
实施例14 1-(4-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-14
将上一步的中间体M5(225mg,1mmol)加入到20mL乙腈中，加热至80℃反应，加入活性脲中间体(306mg,1mmol)，反应0.5h后，大量固体析出，过滤，并用乙醚淋洗，即可得到高纯度的终产物CLJ-14。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.74(s,1H),9.53(s,1H),8.93(s,1H),8.11(s,1H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.19(d,J＝2.3Hz,1H),6.52(s,1H),5.99(s,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:392.1831[M+H]+.
实施例15 1-(4-(4-氨基-7-叔丁氧羰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-15
将上一步中间体M4(325mg,1mmol)，加入到20mL乙腈中，加热至80℃反应，加入活性脲中间体(306mg,1mmol)，反应0.5h后，大量固体析出，过滤，并用乙醚淋洗，即可得到高纯度的终产物CLJ-15。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.57(s,1H),9.02(s,1H),8.28(s,1H),7.59(d,J＝8.6Hz,2H),7.47(s,1H),7.44(d,J＝8.5Hz,2H),6.52(s,1H),6.23(s,2H),1.61(s,9H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:592.2353[M+H]+.
实施例16 4-(2-(4-氨基-5-(4-(3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]叔丁基嘧啶-7-基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯化合物CLJ-16
与实施例13的合成方法相同，将N-Boc-2-乙基哌嗪替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-16.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.91(s,1H),8.14(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.39(d,J＝8.5Hz,2H),7.33(s,1H),6.52(s,1H),6.06(s,2H),4.29(t,J＝6.5Hz,2H),3.28(s,4H),2.73(t,J＝6.5Hz,2H),2.46–2.37(m,4H),1.39(s,9H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:604.3353[M+H]+.
实施例17 1-(4-(4-氨基-7-(2-哌嗪代乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-17
将化合物CLJ-16(252mg,0.5mmol)加入到20mL的二氯甲烷中，加入浓盐酸(10mL,36-38％浓盐酸)，反应1h后完全。加入200mL二氯甲烷和100mL水，将混合物的pH调至碱性(pH约为10)，萃取保留有机相，浓缩后可得到终产物CLJ-17。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.58(s,1H),9.01(s,1H),8.14(s,1H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.39(d,J＝8.5Hz,2H),7.33(s,1H),6.52(s,1H),6.05(s,2H),4.27(t,J＝6.6Hz,2H),2.75–2.63(m,6H),2.41(s,4H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:504.2829[M+H]+.
实施例18 1-(4-(4-氨基-7-(3-吗啉代丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-18
与实施例13的合成方法相同，将N-(3-氯丙基)吗啉替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-18.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.90(s,1H),8.14(s,1H),7.56(d,J＝8.6Hz,2H),7.40(d,J＝8.6Hz,2H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),6.05(s,2H),4.20(t,J＝7.0Hz,2H),3.59–3.51(m,4H),2.29(dd,J＝14.3,7.0Hz,6H),2.02–1.91(m,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:519.2825[M+H]+.
实施例19 1-(4-(4-氨基-7-(2-(二甲氨基)乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-19
与实施例13的合成方法相同，将N,N-二甲基-2-氯乙基替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-19.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.54(s,1H),8.93(s,1H),8.14(s,1H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.39(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(s,1H),6.52(s,1H),6.05(s,2H),4.26(t,J＝6.6Hz,2H),2.67(t,J＝6.5Hz,2H),2.20(s,6H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:463.2563[M+H]+.
实施例20 1-(4-(4-氨基-7-烯丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-20
与实施例13的合成方法相同，将溴丙烯替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-20.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.91(s,1H),8.15(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.25(s,1H),6.52(s,1H),6.06(m,3H),5.18(d,J＝10.1Hz,1H),5.09(d,J＝17.1Hz,1H),4.81(d,J＝5.4Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:432.2149[M+H]+.
实施例21 1-(4-(4-氨基-7-(氰基甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-21
与实施例13的合成方法相同，将氯乙腈替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-21.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.54(s,1H),8.94(s,1H),8.24(s,1H),7.58(d,J＝7.4Hz,2H),7.42(d,J＝7.6Hz,2H),7.38(s,1H),6.53(s,1H),6.26(s,2H),5.41(s,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:431.1937[M+H]+.
实施例22 1-(4-(4-氨基-7-异丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-22
与实施例13的合成方法相同，将2-碘丙烷替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-22.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.55(s,1H),8.97(s,1H),8.33(s,1H),7.65(s,1H),7.59(d,J＝8.6Hz,2H),7.43(d,J＝8.5Hz,2H),6.52(s,1H),5.10–4.93(m,1H),1.49(d,J＝6.8Hz,6H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:434.2299[M+H]+.
实施例23 1-(4-(4-氨基-7-(4-羟丁基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-23
与实施例13的合成方法相同，将4-碘丁醇替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-23.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.91(s,1H),8.14(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(s,1H),6.52(s,1H),6.05(s,2H),4.41(t,J＝5.2Hz,1H),4.17(t,J＝7.0Hz,2H),4.09(q,J＝5.2Hz,1H),3.41(dd,J＝11.8,6.2Hz,2H),3.18(d,J＝5.2Hz,2H),1.88–1.76(m,2H),1.46–1.36(m,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:464.2409[M+H]+.
实施例24 1-(4-(4-氨基-7-(N,N-二乙基甲酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-24
与实施例13的合成方法相同，将N,N-二乙基氯甲酰胺替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-24.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.55(s,1H),8.96(s,1H),8.20(s,1H),7.58(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(d,J＝8.5Hz,2H),7.41(s,1H),6.53(s,1H),6.25(s,2H),3.39(m,4H),1.31(s,9H),1.21–1.06(m,6H).HRMS(ESI),m/z:491.2493[M+H]+.
实施例25 1-(4-(4-氨基-7-(2-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-25
将化合物CLJ-17(252mg,0.5mmol)溶解在20mL二氯甲烷中，加入三乙胺(61mg,0.6mmol)，于冰浴下加入用二氯甲烷稀释的甲磺酰氯(57mg,0.5mmol)，反应1h后，用二氯甲烷和水进行萃取，将有机相旋干得到较纯的终产物CLJ-25.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.92(s,1H),8.15(s,1H),7.56(d,J＝8.6Hz,2H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.34(s,1H),6.52(s,1H),6.05(s,2H),4.30(t,J＝6.4Hz,2H),3.12–3.03(m,4H),2.85(s,3H),2.79(t,J＝6.5Hz,2H),2.62–2.54(m,4H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:582.2610[M+H]+.
实施例26 1-(4-(4-氨基-7-(2-甲氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-26
与实施例13的合成方法相同，将氯乙基甲醚替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-26.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.56(s,1H),8.95(s,1H),8.15(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.29(s,1H),6.53(s,1H),6.09(s,2H),4.33(t,J＝5.3Hz,2H),3.71(t,J＝5.4Hz,2H),3.26(s,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:450.2249[M+H]+.
实施例27 1-(4-(4-氨基-7-(丁-2-炔-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-27
与实施例13的合成方法相同，将1-溴-2-丁炔替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-27.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.55(s,1H),8.97(s,1H),8.17(s,1H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.41(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(s,1H),6.53(s,1H),6.12(s,1H),4.97(d,J＝2.3Hz,2H),1.81(dd,J＝5.3,3.1Hz,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:444.2147[M+H]+.
实施例28 1-(4-(4-氨基-7-(戊-2-炔-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-28
与实施例13的合成方法相同，将1-溴-2-戊炔替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-28.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.93(s,1H),8.16(s,1H),7.56(d,J＝8.6Hz,2H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),6.12(s,2H),4.98(t,J＝2.1Hz,2H),2.25–2.16(m,2H),1.30(s,9H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H).HRMS(ESI),m/z:458.2299[M+H]+.
实施例29 1-(4-(4-氨基-7-(丁-3-炔-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-29
与实施例13的合成方法相同，将1-溴-2-戊炔替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-29.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.57(s,1H),8.99(s,1H),8.15(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.3Hz,2H),7.32(s,1H),6.52(s,1H),6.05(s,2H),5.82(ddd,J＝23.8,10.3,6.7Hz,1H),5.14–4.93(m,2H),4.24(t,J＝7.0Hz,2H),2.56(dd,J＝13.3,6.5Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:446.2302[M+H]+.
实施例30 1-(4-(4-氨基-7-(2-乙氧基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-30
与实施例13的合成方法相同，将溴乙基乙醚替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-30.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.92(s,1H),8.15(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.29(s,1H),6.52(s,1H),6.06(s,2H),4.32(t,J＝5.4Hz,2H),3.74(t,J＝5.5Hz,2H),3.46(q,J＝6.9Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:464.2406[M+H]+.
实施例31 1-(4-(4-氨基-7-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-31
与实施例13的合成方法相同，将3,3-二甲基烯丙基溴替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-31.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.92(s,1H),8.15(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.23(s,1H),6.52(s,1H),6.05(s,2H),5.41(t,J＝6.8Hz,1H),4.76(d,J＝7.0Hz,2H),1.81(s,3H),1.72(s,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:460.2457[M+H]+.
实施例32 1-(4-(4-氨基-7-(2-甲基烯丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-32
与实施例13的合成方法相同，将2-甲基烯丙基溴替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-32.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.92(s,1H),8.15(s,1H),7.56(d,J＝8.6Hz,2H),7.40(d,J＝8.6Hz,2H),7.20(s,1H),6.52(s,1H),6.09(s,2H),4.87(s,1H),4.73(s,2H),4.61(s,1H),1.68(s,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:446.2298[M+H]+.
实施例33 1-(4-(4-氨基-7-(戊-4-烯-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-33
与实施例13的合成方法相同，将5-溴-1-戊烯替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-33.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.77(s,1H),9.58(s,1H),8.48(s,1H),7.68(s,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,2H),7.42(d,J＝8.6Hz,2H),6.53(s,1H),5.83(ddt,J＝16.8,10.2,6.4Hz,1H),5.09–4.95(m,2H),4.27(t,J＝7.0Hz,2H),2.05(dd,J＝13.7,6.7Hz,2H),1.99–1.87(m,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:460.2458[M+H]+.
实施例34 1-(4-(4-氨基-7-(己-5-烯-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-34
与实施例13的合成方法相同，将5-溴-1-戊烯替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-34.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.78(s,1H),9.60(s,1H),8.48(s,1H),7.68(s,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,2H),7.41(d,J＝8.6Hz,2H),6.53(s,1H),5.78(ddt,J＝16.9,10.2,6.7Hz,1H),5.05–4.90(m,2H),4.27(t,J＝7.0Hz,2H),2.06(q,J＝7.2Hz,2H),1.83(dt,J＝14.9,7.2Hz,2H),1.41–1.31(m,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:474.2618[M+H]+.
实施例35 1-(4-(4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-35
与实施例13的合成方法相同，将碘甲烷替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-35.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.53(s,1H),8.93(s,1H),8.11(s,1H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.19(d,J＝2.3Hz,1H),6.52(s,1H),5.99(s,2H),3.7(s,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:406.1992[M+H]+.
实施例36 1-(4-(4-氨基-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-36
与实施例13的合成方法相同，将碘乙烷替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-36.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.78(s,1H),9.61(s,1H),8.48(s,1H),7.69(s,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,2H),7.42(d,J＝8.5Hz,2H),6.53(s,1H),4.30(q,J＝7.2Hz,2H),1.43(t,J＝7.2Hz,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:420.2142[M+H]+.
实施例37 1-(4-(4-氨基-7-丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-37
与实施例13的合成方法相同，将碘丙烷替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-37.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.80(s,1H),9.66(s,1H),8.48(s,1H),7.68(s,1H),7.61(d,J＝8.5Hz,2H),7.41(d,J＝8.5Hz,2H),6.53(s,1H),4.23(t,J＝7.0Hz,2H),1.90–1.77(m,2H),1.31(s,9H),0.87(t,J＝7.4Hz,3H).HRMS(ESI),m/z:434.2303[M+H]+.
实施例38 1-(4-(4-氨基-7-丁基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-38
与实施例13的合成方法相同，将溴丁烷替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-38.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.78(s,1H),9.61(s,1H),8.48(s,1H),7.68(s,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,2H),7.41(d,J＝8.5Hz,2H),6.53(s,1H),4.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.87–1.75(m,2H),1.31(s,9H),1.26(dd,J＝14.9,7.5Hz,2H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H).HRMS(ESI),m/z:448.2460[M+H]+.
实施例39 1-(4-(4-氨基-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-39
与实施例13的合成方法相同，将溴代环戊烷替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-39.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.78(s,1H),9.62(s,1H),8.47(s,1H),7.73(s,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(d,J＝8.5Hz,2H),6.53(s,1H),5.22–5.08(m,1H),2.16(d,J＝7.9Hz,2H),2.02–1.83(m,4H),1.71(d,J＝7.0Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:460.2457[M+H]+.
实施例40 1-(4-(4-氨基-7-己基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-40
与实施例13的合成方法相同，将溴代正己烷替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-40.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.71(s,1H),9.40(s,1H),8.46(s,1H),7.67(s,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,2H),7.41(d,J＝8.5Hz,2H),6.52(s,1H),4.25(t,J＝7.1Hz,2H),1.88–1.77(m,2H),1.31(s,9H),1.28(m,6H),0.86(t,J＝6.8Hz,3H).HRMS(ESI),m/z:476.2770[M+H]+.
实施例41 1-(4-(4-氨基-7-苄基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-41
与实施例13的合成方法相同，将溴化苄替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-41.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.71(s,1H),8.49(s,1H),7.74(s,1H),7.60(d,J＝8.6Hz,2H),7.41(d,J＝8.5Hz,2H),7.38–7.27(m,5H),6.52(s,1H),5.49(s,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:482.2303[M+H]+.
实施例42 1-(4-(4-氨基-7-丙炔基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-42
与实施例13的合成方法相同，将溴丙炔替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-42.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.66(s,1H),9.28(s,1H),8.49(s,1H),7.66(s,1H),7.61(d,J＝8.5Hz,2H),7.43(d,J＝8.5Hz,2H),6.52(s,1H),5.15(d,J＝2.3Hz,2H),3.52(t,J＝2.4Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:430.1985[M+H]+.
实施例43 1-(4-(4-氨基-7-(2-氰基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-43
与实施例13的合成方法相同，将溴丙腈替换N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，即可得到高纯度终产物CLJ-43.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.71(s,1H),9.42(s,1H),8.50(s,1H),7.70(s,1H),7.63(d,J＝8.6Hz,2H),7.42(d,J＝8.5Hz,2H),6.53(s,1H),4.56(t,J＝6.4Hz,2H),3.19(t,J＝6.4Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:445.2097[M+H]+.
实施例44 1-(4-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-44
步骤i：M7中间体的制备
将上一步中间体M3(9g,25mmol)、3-氟-4-氨基苯硼酸频那醇酯(6.5g,27.5mmol)、碳酸钾(6.9g,50mmol)和dppf(PdCl2)加入到250mL三颈瓶内，加入二氧六环/乙醇/水＝7:3:4(共计120mL)作为溶剂，置换氮气三次后转入80℃的油浴内反应2h。反应结束后将反应液浓缩后拌样过柱子分离，即得到中间体M7。
步骤j：M8中间体的制备
将上一步的中间体M7(4g,11.6mmol)加入到50mL的二氯甲烷中，加入浓盐酸(10mL,36-38％浓盐酸)，反应1h后完全。加入200mL二氯甲烷和100mL水，将混合物的pH调至碱性(pH约为10)，萃取保留有机相，旋干后可得到中间体M8。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:11.66(s,1H),8.08(s,1H),7.11(d,J＝2.1Hz,1H),7.07(dd,J＝12.5,1.8Hz,1H),6.98(dd,J＝8.1,1.8Hz,1H),6.85(dd,J＝9.5,8.2Hz,1H),5.99(s,2H),5.21(s,2H).
步骤k：CLJ-44的制备
将上一步的中间体M8(243mg,1mmol)加入到20mL的乙腈中，加入活性脲中间体(306mg,1mmol)，反应0.5h后有固体析出，过滤后用乙醚淋洗滤饼就可以得到高纯度的终产物CLJ-44。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:13.04(s,1H),10.13(s,1H),9.20(s,1H),8.46(s,1H),8.23(t,J＝8.5Hz,1H),7.61(d,J＝2.3Hz,1H),7.37(dd,J＝12.0,1.7Hz,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,1H),6.51(s,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:410.1734[M+H]+.
实施例45 1-(4-(4-氨基-7-丙炔基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-45
将步骤l和m合并为“一锅法”的反应过程
将上一步的中间体M8(243mg,1mmol)、碳酸铯(650mg,2mmol)、溴丙炔(143mg,1.2mmol)加入到20mL乙腈中，加热至80℃反应1h。将反应液过滤，保留母液。将母液转移至80℃，加入活性脲中间体(306mg,1mmol)，反应0.5h后，大量固体析出，过滤，并用乙醚淋洗，即可得到高纯度的终产物CLJ-45。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:10.01(s,1H),9.08(s,1H),8.52(s,1H),8.26(t,J＝8.5Hz,1H),7.73(s,1H),7.39(dd,J＝12.0,1.8Hz,1H),7.30–7.25(m,1H),6.51(s,1H),5.16(d,J＝2.4Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:448.1891[M+H]+.
实施例46 1-(4-(4-氨基-7-烯丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-46
与实施例45的合成方法相同，将溴丙烯替换溴丙炔，即可得到高纯度终产物CLJ-46.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.86(s,1H),8.88(s,1H),8.20(t,J＝8.5Hz,1H),8.16(s,1H),7.33(s,1H),7.33(dd,J＝12.1,1.8Hz,2H),7.26(dd,J＝8.5,1.3Hz,1H),6.51(s,1H),6.19(s,2H),6.05(ddd,J＝22.5,10.6,5.5Hz,1H),5.18(dd,J＝10.2,1.3Hz,1H),5.09(dd,J＝17.1,1.4Hz,1H),4.80(d,J＝5.5Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:450.2042[M+H]+.
实施例47 1-(4-(4-氨基-7-(丁-3-烯-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-47
与实施例45的合成方法相同，将4-溴-1-丁烯替换溴丙炔，即可得到高纯度终产物CLJ-47.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:10.05(s,1H),9.12(s,1H),8.49(s,1H),8.25(t,J＝8.5Hz,1H),7.73(s,1H),7.36(dd,J＝12.0,1.7Hz,1H),7.26(d,J＝8.4Hz,1H),6.51(s,1H),5.80(ddt,J＝17.0,10.3,6.7Hz,1H),5.10–4.99(m,2H),4.34(t,J＝7.0Hz,2H),2.61(q,J＝6.8Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:464.2212[M+H]+.
实施例48 1-(4-(4-氨基-7-甲氧基乙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-48
与实施例45的合成方法相同，将氯乙基甲醚替换溴丙炔，即可得到高纯度终产物CLJ-48.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:10.10(s,1H),9.16(s,1H),8.51(s,1H),8.25(t,J＝8.5Hz,1H),7.70(s,1H),7.43–7.33(m,1H),7.26(m,1H),6.51(s,1H),4.43(t,J＝5.1Hz,2H),3.76(t,J＝5.3Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:468.2159[M+H]+.
实施例49 1-(4-(4-氨基-7-乙氧基乙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-49
与实施例45的合成方法相同，将溴乙基乙醚替换溴丙炔，即可得到高纯度终产物CLJ-49.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:10.02(s,1H),9.09(s,1H),8.48(s,1H),8.26(t,J＝8.5Hz,1H),7.68(s,1H),7.37(dd,J＝12.0,1.8Hz,1H),7.27(d,J＝8.5Hz,1H),6.51(s,1H),4.42(t,J＝5.3Hz,2H),3.78(t,J＝5.3Hz,2H),3.46(dd,J＝14.0,7.0Hz,2H),1.31(s,9H),1.06(t,J＝7.0Hz,3H).HRMS(ESI),m/z:482.2313[M+H]+.
实施例50 1-(4-(4-氨基-7-氰基甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-50
与实施例45的合成方法相同，将氯乙腈替换溴丙炔，即可得到高纯度终产物CLJ-50.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:10.10(s,1H),9.16(s,1H),8.57(s,1H),8.26(t,J＝8.5Hz,1H),7.72(s,1H),7.39(dd,J＝11.9,1.8Hz,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,1H),6.51(s,1H),5.55(s,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:449.1848[M+H]+.
实施例51 1-(4-(4-氨基-7-(2-氰基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5)-2-氟苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-51
与实施例45的合成方法相同，将溴丙腈替换溴丙炔，即可得到高纯度终产物CLJ-51.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:10.05(s,1H),9.12(s,1H),8.54(s,1H),8.28(t,J＝8.5Hz,1H),7.79(s,1H),7.65(s,1H),7.37(dd,J＝11.9,1.8Hz,1H),7.28(d,J＝8.5Hz,1H),6.51(s,1H),4.60–4.51(t,J＝6.5Hz,2H),3.19(t,J＝6.6Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:463.2004[M+H]+.
实施例52 1-(4-(4-氨基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-52
合成路线如下所示；
合成路线与实施例13基本一致，只是将起始原料换成了4-氯吡唑并[2,3-d]嘧啶，经过6步反应得到终产物CLJ-52.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:13.80(s,1H),9.35(s,1H),9.14(s,1H),8.50(s,1H),7.53(s,2H),7.24–7.18(m,2H),6.73–6.67(m,2H),6.46(s,1H),1.29(s,9H).HRMS(ESI),m/z:392.1907[M+H]+.
实施例53 1-(4-(4-氨基-7-烯丙基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-53
与实施例52路线一致，只是在g中加入溴丙烯，以及与下一步反应的活性脲中间体按照“一锅法”的合成方法，得到终产物CLJ-53.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.56(s,1H),9.02(s,1H),8.26(s,1H),7.63(t,J＝7.0Hz,4H),7.00(dd,J＝114.0,63.4Hz,2H),6.53(s,1H),6.10–6.01(m,1H),5.19(d,J＝10.3Hz,1H),5.11(d,J＝17.1Hz,1H),4.97(d,J＝5.5Hz,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:433.2099[M+H]+.
实施例54 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉乙基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-54
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把N-(2-氯乙基吗啉)盐酸盐替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-54.1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.57(s,1H),9.04(s,1H),8.25(s,1H),7.66–7.63(m,2H),7.63–7.61(m,2H),6.75(s,2H),6.53(s,1H),4.48–4.46(m,2H),3.52–3.48(m,4H),2.83–2.81(m,2H),2.49–2.46(m,4H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:506.2628[M+H]+.
实施例55 1-(4-(4-氨基-7-(2-(哌啶-1-基)乙基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-55
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把N-(2-氯乙基哌啶)盐酸盐替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-55.1H NMR(400MHz,DMSO)δ：9.58(s,1H),9.05(s,1H),8.25(s,1H),7.66–7.63(m,2H),7.63–7.61(m,2H),6.75(s,2H),6.53(s,1H),4.52–4.48(m,2H),4.44–4.40(m,2H),2.78–2.74(m,2H),2.44–2.38(m,4H),1.46–1.40(m 4H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:504.2829[M+H]+.
实施例56 1-(4-(4-氨基-7-(环丙基甲基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-56
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把2-氯代环丙烷替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-56.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.56(s,1H),9.02(s,1H),8.25(s,1H),7.66–7.63(m,2H),7.63–7.61(m,2H),6.90(s,2H),6.53(s,1H),5.84–5.76(m,1H),5.05–4.97(m,2H),4.42–4.39(m,2H),2.66–2.61(m,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:447.2257[M+H]+.
实施例57 1-(4-(4-氨基-7-炔丙基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-57
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把溴丙炔替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-57.1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.63(s,1H),9.10(s,1H),8.34(s,1H),7.72–7.68(m,4H),6.59(s,1H),5.51(s,2H),5.25(s,2H),3.43(s,1H),1.37(s,9H).HRMS(ESI),m/z:431.1944[M+H]+.
实施例58 1-(4-(4-氨基-7-甲基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-58
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把碘甲烷替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-58.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.56(s,1H),9.05(s,1H),8.26(s,1H),7.66–7.61(m,4H),6.53(s,1H),5.41(s,2H),4.03–3.99(m,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:407.1948[M+H]+.
实施例59 1-(4-(4-氨基-7-乙基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-59
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把碘乙烷替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-59.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.58(s,1H),9.05(s,1H),8.26(s,1H),7.66–7.61(m,4H),6.53(s,1H),5.41(s,2H),3.97–3.93(m,2H),1.31(s,9H),1.26–1.22(m,3H).HRMS(ESI),m/z:421.2100[M+H]+.
实施例60 1-(4-(4-氨基-7-(2-氰基乙基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-60
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把氯丙腈替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-60.1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.62(s,1H),9.10(s,1H),8.34(s,1H),7.72–7.66(m,4H),6.59(s,1H),5.67(s,2H),4.66(s,2H),3.22–3.18(m,2H),1.36(s,9H).HRMS(ESI),m/z:446.2056[M+H]+.
实施例61 1-(4-(4-氨基-7-己基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-61
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把1-溴己烷替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-61.1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.56(s,1H),9.03(s,1H),8.25(s,1H),7.65–7.59(m,4H),6.54(s,1H),5.42(s,2H),4.34–4.31(m,2H),1.84–1.82(m,4H),1.31(s,9H),0.85–0.82(m,7H).HRMS(ESI),m/z:477.2396[M+H]+.
实施例62 1-(4-(4-氨基-7-丙基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-62
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把1-溴丙基替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-62.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.56(s,1H),9.02(s,1H),8.25(s,1H),7.64–7.60(m,4H),6.53(s,1H),5.41(s,2H),4.32–4.28(m,2H),1.92–1.84(m,2H),1.31(s,9H),0.89–0.85(m,3H).HRMS(ESI),m/z:435.2256[M+H]+.
实施例63 1-(4-(4-氨基-7-环戊基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-63
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把溴代环戊烷替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-63.1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.55(s,1H),9.03(s,1H),8.23(s,1H),7.64–7.60(m,4H),6.72(s,2H),6.53(s,1H),5.28–5.19(m,1H),2.08–2.08(m,4H),1.92–1.87(m,2H),1.74–1.67(m,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:461.2407[M+H]+.
实施例64 1-(4-(4-氨基-7-(2-乙氧基乙基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-64
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把溴乙基乙醚替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-64.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.57(s,1H),9.05(s,1H),8.25(s,1H),7.67–7.61(m,4H),6.88(s,2H),6.54(s,1H),4.49–4.42(m,4H),1.31(s,9H),1.04–1.00(m,5H).HRMS(ESI),m/z:465.2361[M+H]+.
实施例65 1-(4-(4-氨基-7-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-65
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把3,3-二甲基溴丙烯替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-65.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.57(s,1H),9.05(s,1H),8.25(s,1H),7.65–7.59(m,4H),6.53(s,1H),5.42(s,2H),4.94–4.88(m,3H),1.82–1.79(m,5H),1.70(s,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:461.2407[M+H]+.
实施例66 1-(4-(4-氨基-7-(2,2-二甲氧基乙基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-66
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把2,2-二甲基溴乙基替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-66.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.57(s,1H),9.04(s,1H),8.27(s,1H),7.66–7.60(m,4H),6.54(s,1H),5.46(s,2H),4.96–4.93(m,1H),4.44–4.42(m,2H),3.33(s,6H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:481.2307[M+H]+.
实施例67 1-(4-(4-氨基-7-(4-氧代戊基)-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(5-叔丁基-异噁唑-3-基)脲化合物CLJ-67
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把2,2-二甲基溴乙基替换溴丙烯得到目标终产物CLJ-67.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:9.57(s,1H),9.05(s,1H),8.21(s,1H),7.66–7.60(m,4H),6.54(s,1H),5.42(s,2H),4.30–4.25(m,2H),2.48–2.42(m,4H),2.05(s,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:477.2396[M+H]+.
实施例68 1-(4-(4-氨基-7H-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-68
活性脲中间体1,3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲的制备
将三光气(4.71g,15.7mmol)加入到50mL的四氢呋喃中，置于冰浴下，将3-氨基-5-叔丁基吡唑(1.99g,14.3mmol)溶解在5mL四氢呋喃中，然后滴加到三光气溶液中，最后滴加三乙胺(4.0mL,28.5mmol)。将反应转移到60℃油浴，反应5h。反应完全后，将反应混合物过滤，保留滤液，将滤液进行减压浓缩得到固体，过柱子分离，即得到活性脲中间体。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:12.66(s,2H),9.51(s,2H),6.30(s,2H),1.30(s,18H).
将中间体M5(225mg,1mmol)加入到20mL乙腈中，加热至80℃反应，加入上一步的活性脲中间体(390mg,1mmol),反应0.5h后，大量固体析出，过滤，并用乙醚淋洗，即可得到高纯度的终产物CLJ-68。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:12.64(s,1H),11.54(s,1H),9.52(s,1H),8.86(s,1H),8.11(s,1H),7.80(d,J＝8.5Hz,2H),7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.19(d,J＝2.3Hz,1H),6.54(s,1H),6.01(s,2H),1.31(s,9H).HRMS(ESI),m/z:391.1924[M+H]+.
实施例69 1-(4-(4-氨基-7-(2-吗啉乙基)-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-69
该化合物的合成方法与实施例54相同，只是把吡唑脲的活性中间体替换异噁唑活性中间体得到目标终产物CLJ-69.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.00(s,1H),9.46(s,1H),9.05(s,1H),8.24(s,1H),7.61(dd,J＝21.8,8.6Hz,4H),6.78(s,2H),6.02(s,1H),4.46(t,J＝6.6Hz,2H),3.54–3.47(m,4H),2.80(t,J＝6.7Hz,2H),2.46(d,J＝3.8Hz,4H),1.27(s,9H).HRMS(ESI),m/z:505.2811[M+H]+.
实施例70 1-(4-(4-氨基-7-乙基-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-70
该化合物的合成方法与实施例59相同，只是把吡唑脲的活性中间体替换异噁唑活性中间体得到目标终产物CLJ-70.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:12.01(s,1H),9.42(s,1H),9.00(s,1H),8.25(s,1H),7.61(dd,J＝18.2,8.6Hz,4H),6.69(s,2H),6.02(s,1H),4.37(dd,J＝14.2,7.0Hz,2H),1.42(t,J＝7.1Hz,3H),1.19(s,9H).HRMS(ESI),m/z:420.2279[M+H]+.
实施例71 1-(4-(4-氨基-7-(环丙基甲基)-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-71
该化合物的合成方法与实施例56相同，只是把吡唑脲的活性中间体替换异噁唑活性中间体得到目标终产物CLJ-71.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:12.00(s,1H),9.49(s,1H),9.04(s,1H),8.25(s,1H),7.61(dd,J＝21.9,8.5Hz,4H),6.69(s,2H),6.03(s,1H),5.03(dd,J＝35.8,13.0Hz,2H),4.40(d,J＝7.1Hz,2H),2.63(dd,J＝13.6,6.8Hz,2H),1.19(s,9H),0.84(dd,J＝10.0,7.0Hz,1H).HRMS(ESI),m/z:446.2456[M+H]+.
实施例72 1-(4-(4-氨基-7-丙基-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-72
该化合物的合成方法与实施例62相同，只是把吡唑脲的活性中间体替换异噁唑活性中间体得到目标终产物CLJ-72.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:12.00(s,1H),9.43(s,1H),8.98(s,1H),8.25(s,1H),7.61(dd,J＝21.9,8.5Hz,4H),6.02(s,1H),4.29(t,J＝6.2Hz,2H),1.90–1.84(m,2H),1.27(s,9H),0.86(m,3H).HRMS(ESI),m/z:434.2419[M+H]+.
实施例73 1-(4-(4-氨基-7-环戊基-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-73
该化合物的合成方法与实施例63相同，只是把吡唑脲的活性中间体替换异噁唑活性中间体得到目标终产物CLJ-73.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.01(s,1H),9.40(s,1H),8.98(s,1H),8.23(s,1H),7.61(dd,J＝19.4,8.4Hz,4H),6.72(s,2H),6.02(s,1H),5.23(dt,J＝14.8,7.5Hz,1H),2.12–2.03(m,4H),1.90(d,J＝8.5Hz,2H),1.73–1.65(m,2H),1.27(s,9H).HRMS(ESI),m/z:460.2624[M+H]+.
实施例74 1-(4-(4-氨基-7-烯丙基-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-74
该化合物的合成方法与实施例53相同，只是把吡唑脲的活性中间体替换异噁唑活性中间体得到目标终产物CLJ-74.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:12.04(s,1H),9.41(s,1H),9.00(s,1H),8.25(s,1H),7.61(dd,J＝16.8,7.2Hz,4H),,6.72(s,2H),6.11–6.04(m,1H),6.02(s,1H),5.19(d,J＝10.4Hz,1H),5.11(d,J＝17.5Hz,1H),4.97(s,2H),1.27(s,9H).HRMS(ESI),m/z:432.2307[M+H]+.
实施例75 1-(4-(4-氨基-7-(2-氰基乙基)-吡唑并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-3-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)脲化合物CLJ-75
该化合物的合成方法与实施例60相同，只是把吡唑脲的活性中间体替换异噁唑活性中间体得到目标终产物CLJ-75.1H NMR(400MHz,DMSO)δ:12.00(s,1H),9.52(s,1H),9.05(s,1H),8.28(s,1H),7.63(dd,J＝19.1,8.1Hz,4H),6.73(s,2H),6.03(s,1H),4.61(t,J＝6.1Hz,2H),3.17(t,J＝6.0Hz,2H),1.27(s,9H).HRMS(ESI),m/z:445.2244[M+H]+.
药效学试验部分
以下代表性实验(不限于此)用于分析本发明化合物的生物活性。
MTT法测MV4-11、Molm-13和RS4；11细胞增殖抑制实验
测试本发明受试化合物对癌细胞活力的影响，在MV4-11和Molm-13细胞上进行，其为人白血病细胞系，表达构造性FLT3受体，并包含FLT3-ITD突变。如果化合物对FLT3-ITD表达的细胞的生长抑制活性强，说明该化合物对FLT3-ITD突变株效果显著。如果对FLT3-WT表达的细胞的生长抑制活性差，说明该化合物对FLT3-WT野生型效果差，说明选择性较好。本发明选用FLT3-ITD高特异性化合物AC220(CAS：950769-58-1)作为阳性对照，按照文献(J.Med.Chem.2009,52,7808-7816)制备方法由本实验室合成。
MV4-11细胞(来自美国典型培养物中心，由四川大学生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种)装于96孔培养皿中，介质为100μL IMDM，Molm-13细胞(来自美国典型培养物中心，由四川大学生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种)装于96孔培养皿中，介质为100μL RPMI1640，包含10％胎牛血清，每孔有10000-15000个细胞，受试化合物在100％DMSO中制备，加入到细胞中，获得浓度为100nM到0.032nM(按照5倍稀释浓度的6个浓度点)培养皿在37℃5％CO2中培养72h。RS4；11细胞(来自美国典型培养物中心，由四川大学生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种)装于96孔培养皿中，介质为100μL RPMI1640，包含10％胎牛血清，每孔有10000-15000个细胞，受试化合物在100％DMSO中制备，加入到细胞中，获得浓度为1000nM，培养皿在37℃5％CO2中培养72h。在终点时，向每个孔中加入20μLMTT(5mg/mL)，并将细胞再孵育1-4小时。用20％SDS处理过夜后，在分光光度计(Molecular Devices，Sunnyvale，USA)上获得波长570nM的吸光度值。使用生长百分比与未处理对照相比计算IC50值，测定结果见表1。
表1.受试化合物对白血病细胞增殖抑制的IC50值
******:0.01-0.1nM；*****:0.1-1nM；****:1-10nM；***:10-100nM；**:100-1000nM；*:>1000nM
结果表明，本发明的受试化合物对MV4-11和Molm-13细胞增殖具有较好的抑制活性，其中某些化合物比AC220展示更好的抗增殖活性，而对RS4；11抑制活性较差，是一种新型的、潜在的和具备治疗FLT3-ITD相关疾病潜力的抑制剂。
体外激酶抑制实验
在一个反应管内，以此加入缓冲液(8mM)MOPS,pH 7.0,0.2mM EDTA,10mM MnCl2),待测激酶、待测激酶的底物，10mM醋酸镁和γ33P-ATP溶液，以及不同浓度的化合物，然后向反应中加入MgATP以启动酶反应过程，并在室温下孵育40分钟。最终用5微升的3％磷酸盐缓冲液终止反应，并把10微升的反应液滴定到Filtermat A膜上，用75mM的磷酸盐溶液洗三次，每次5分钟，再用甲醇洗一次，最后干燥Filtermat A膜并对其进行闪烁计数，闪烁计数值得大小反映了底物被磷酸化的程度，从而可以表征激酶活性抑制情况。
表2本发明部分化合物FLT3激酶抑制剂活性
| 受试化合物 | FLT3(IC<sub>50</sub>,nM) |
| CLJ-13 | 20 |
| CLJ-14 | 6 |
| CLJ-20 | 7 |
| CLJ-21 | 9 |
| CLJ-22 | 20 |
| CLJ-42 | 13 |
| CLJ-44 | 4 |
结果表明，本发明化合物对FLT3具有较好的体外酶学抑制活性。
表3本发明化合物CLJ-20对FLT3突变激酶的解离常数
| 突变类型 | Kd,nM |
| FLT3 WT | 4.37 |
| FLT3(D835V) | 7.04 |
| FLT3(ITD) | 20.52 |
| FLT3(ITD,D835V) | 41.26 |
| FLT3(ITD,F691L) | 48.47 |
| FLT3(N841I) | 2.37 |
| FLT3(R834Q) | 10.15 |
| FLT3(D835H) | 5.14 |
| FLT3(D835Y) | 7.78 |
| FLT3(K663Q) | 2.48 |
结果表明，CLJ-20对FLT3激酶的多种突变也有很好的结合作用。
部分受试化合物在Western Blot上验证靶点作用
试验方法：用指定浓度的化合物处理MV4-11细胞、Molm-13细胞。然后收集细胞并用RIPA裂解缓冲液(beyotime Co.P0013B，组分：50mM Tris，pH 7.4,150mM NaCl，1％Triton X-100,1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1)提取总蛋白质。1mM原钒酸钠，氟化钠，EDTA和亮抑酶肽)。通过BCA蛋白质测定法(ThermoScientific，USA)测量蛋白质浓度。将等效样品(30μg蛋白质)进行SDS-PAGE，然后将蛋白质转移到PVDF膜(Millipore，USA)上。在室温下用5％脱脂乳封闭1小时后，将膜与指定的一抗(FLT3(Cell signaling technology,3462S),p-FLT3(Cell signaling technology,3464S),STAT5(Cell signaling technology,9363S),p-STAT5(Abcam,ab32364),ERK(Zen Bioscience,220003),p-ERK(ZenBioscience,340767),β-Actin(Abways,AB0035))在4℃温育过夜，然后用与辣根过氧化物酶偶联的适当的第二抗体(Abways,F300409)探测1小时。使用增强的化学发光(Millipore，USA)使免疫反应条带可视化。通过与相关蛋白质标记物(ThermoScientific，USA)比较来确定检测到的蛋白质的分子大小。
实验结果见图1、2，结果表明，受试化合物CLJ-20能够剂量依赖性的显著下调p-FLT3、p-STAT5、p-ERK，而AC220也表现了相同的效果，说明受试化合物确实是通过抑制了FLT3的活性，进而影响下游的信号通路的磷酸化。
化合物CLJ-20对NOD/SCID裸鼠的体内药效学实验
本实验的目的是检测本发明化合物的体内抗肿瘤效果，使用小鼠皮下瘤模型，所用细胞株为MV4-11和Molm-13细胞，并以正在开展的临床药物AC220作为阳性对照。
试验方法：使用6-8周的NOD/SCID小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，按照107个/0.1mL/只Molm-13和MV4-11细胞浓度接种于小鼠皮下后肋部位，带肿瘤涨至200-500mm3后，小鼠分组(每组6只)并进行给药，药物溶解方式为2％DMSO+2％PEG-400+96％生理盐水，实验分组为药物溶剂对照组，每天口服灌胃200微升，化合物CLJ-20按照剂量3mg/kg每天口服灌胃，化合物CLJ-20按照剂量10mg/kg每天口服灌胃，阳性药AC220按照3mg/kg每天进行口服灌胃。观察指标是每两天测量一次小鼠体重和肿瘤的长径、短径并计算肿瘤体积大小，并观察各组小鼠的生理状态。
实验结果：Molm-13模型实验结果如图3所示，MV4-11模型结果如图4所示。实验结果表明，化合物CLJ-20对Molm-13模型具有明显的体内抗肿瘤作用，在3mg/kg口服剂量下，可以明显抑制肿瘤生长，抑瘤率高达94％，在10mg/kg时抑瘤率高达96％，而AC220也表现较好的抗肿瘤效果，抑瘤率达到了98％，说明CLJ-20与AC220具有相当的体内效果。而在MV4-11模型中，受试药物CLJ-20在3mg/kg时抑瘤率高达98％，并有两只小鼠实现了肿瘤消退，10mg/kg时在给药第八天时肿瘤全部消退，而AC220 3mg/kg组也在第八天时实现了全部小鼠的肿瘤消退。给药过程中未发现小鼠出现体重降低、皮疹、腹泻等不良反应。而AC220组出现了体重的轻微下降，表明在测试剂量下，CLJ-20在给药剂量范围内毒性较低。
化合物CLJ-20在NCG小鼠模型体内生存期考察
试验方法：使用7-8周的NCG小鼠(购自江苏集萃药康生物技术有限公司)，按照106个Molm-13细胞/只浓度接种于小鼠尾静脉，细胞可以在小鼠的血液循环系统中大量增殖，导致小鼠出现后肢瘫痪甚至死亡的病症。小鼠分组(每组8只)并进行给药，药物溶解方式为2％DMSO+2％PEG-400+96％生理盐水，实验分组为药物溶剂对照组，每天口服灌胃200微升，化合物CLJ-20按照剂量10mg/kg每天口服灌胃，连续给药30天。通过观察记录小鼠在建立模型后的生存时间来考察CLJ-20的治疗效果。
实验结果表明，见图5，溶剂对照组的小鼠中位生存期(MST)为20天。10mg/kg剂量组的中位生存期达到了46.5天，相比对照组延长了26.5天，足足延长了一倍以上的生存时间。这说明CLJ-20在AML异种原位移植模型中具有显著抑制肿瘤生长的效果，大大延长生存期。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施例和实验，对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对其进行一些修改或改进，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (20)
1.4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
其中，X为N或C；
R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为
-CN、-OH、苯基、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基、
R4为C1～C4烷氧基或
R5～R6、R9～R10独立的为C1～C4烷基；R11为-H、C1～C4氧羰基或
R2为
R3为-H或卤素。
2.根据权利要求1所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为
-CN、-OH、苯基、甲氧基、乙氧基、
甲酰基、乙酰基、
R4为叔丁基氧基或
R5～R6、R9～R10独立的为甲基或乙基；
R2为
R3为-H或卤素。
3.根据权利要求2所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
叔丁氧羰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、
R2为
R3为-H、-F、-Cl或-Br。
4.根据权利要求1所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：当R2为
时，结构如式Ⅱ所示：
其中，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为
-CN、-OH、苯基、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基、
R4为C1～C4烷氧基或
R5～R6、R9～R10独立的为C1～C4烷基；R11为-H、C1～C4氧羰基或
R3为-H或卤素。
5.根据权利要求4所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为
-CN、-OH、苯基、甲氧基、乙氧基、
甲酰基、乙酰基、
R4为叔丁基氧基或
R5～R6、R9～R10独立的为甲基或乙基；
R3为-H或卤素。
6.根据权利要求5所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
叔丁氧羰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、
R3为-H、-F、-Cl或-Br。
7.根据权利要求1所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：当R2为
R3为-H时，结构如式Ⅲ所示：
其中，X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为
-CN、-OH、苯基、C1～C4烷氧基、C3～C6环烷基、C1～C4羰基、
R4为C1～C4烷氧基或
R5～R6、R9～R10独立的为C1～C4烷基；R11为-H、C1～C4氧羰基或
8.根据权利要求7所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C6环烷基或取代的C1～C4烷基；所述取代C1～C4烷基的取代基为
-CN、-OH、苯基、甲氧基、乙氧基、
甲酰基、乙酰基、
R4为叔丁基氧基或
R5～R6、R9～R10独立的为甲基或乙基。
9.根据权利要求8所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，其特征在于：X为N或C；R1为-H、C1～C8烷基、
叔丁氧羰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、
10.4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物，结构式如下：
11.权利要求1～10任一项所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物在药学上可接受的盐。
12.权利要求1～10任一项所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物在药学上可接受的水合物。
13.药物组合物，由权利要求1～10任一项所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、权利要求11所述的盐或权利要求12所述的水合物为活性成分，添加药学上可接受的载体组成。
14.权利要求1～10任一项所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、权利要求11所述的盐、权利要求12所述的水合物或权利要求13所述的药物组合物在制备FLT3激酶抑制剂中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述FLT3激酶为突变型FLT3激酶。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述突变型FLT3激酶为FLT3/ITD突变激酶。
17.权利要求1～10任一项所述的4-氨基-嘧啶并氮杂环-苯基脲类衍生物、权利要求11所述的盐、权利要求12所述的水合物或权利要求13所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
19.根据权利要求18所述的用途，所述实体瘤包括：淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、颈癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴癌、表皮过渡增生、银屑病和/或前列腺增生。
20.根据权利要求18所述的用途，所述血液瘤包括：急性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性嗜中性白血病、急性未分化细胞白血病、骨髓发育不良综合征、骨髓增生异常、多发性骨髓瘤和/或脊髓肉瘤。
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