CN111610078B

CN111610078B - 生物组织透明化试剂及生物组织透明化方法

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Publication number: CN111610078B
Application number: CN202010636139.0A
Authority: CN
Inventors: 周江宁; 单庆红; 秦新娅
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111610078A

Abstract

本发明提供了一种生物组织透明化试剂，包括山梨醇、二甲基亚砜、2，2'‑硫基二乙醇与蒸馏水；所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为15％～25％；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为15％～25％；所述2，2'‑硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40％～55％。与现有技术相比，本发明以2，2'‑硫基二乙醇为主要透明化成分，调节透明化试剂的折射率，同时利用山梨醇改变蛋白质的四级结构，产生透明化效果，利用二甲基亚砜增加组织的通透性，提高透明化速度及效果，从而使得到的生物组织透明化试剂简单处理生物样品即可实现组织透明化的同时保存和增强荧光标记信号以获得更好的成像效果，适用性广。

Description

生物组织透明化试剂及生物组织透明化方法

技术领域

本发明属于生物组织样本处理领域，尤其涉及一种生物组织透明化试剂及生物组织透明化方法。

背景技术

组织透明化技术是利用多种化学试剂对生物组织进行处理，使得生物组织的折射率均一化，透明性增加，从而提高光学显微镜的成像深度，进而可以进行生物样品形态的三维重构。

根据组织透明化技术的具体实施方案，目前比较常用的组织透明化技术主要分为四类。第一类为简单浸泡型，代表方法是2013年的Takeshi Imai实验室发明的SeeDB方法(Ke,M.T.,S.Fujimoto,and T.Imai,Nature Neuroscience,2013.16(8):p.1154-U246.)，该方法主要以高浓度的果糖进行组织的透明化。第二类为有机溶剂型，代表方法是Ali Ertürk等人在2012年发明的3DISCO方法(Ertürk,A.,et al.,Nature protocols,2012.7(11):p.1983)，该方法通过使用有机溶剂进行组织的脱水和高折射率的有机溶剂进行折射率的匹配来实现组织的透明化。第三类是水化型，代表方法是2014年Hiroki R.Ueda实验室发明的CUBIC方法(Susaki,E.A.,et al.,Cell,2014.157(3):p.726-39)，该方法采用尿素和高浓度Triton X-100以及氨基醇类进行组织的透明化。第四类为水凝胶交联的方法，代表方法是2013年Karl Deisseroth课题组发明的CLARITY方法(Chung,K.,et al.,Nature,2013.497(7449):p.332-7)，该方法利用丙烯酰胺与组织内的蛋白质形成水凝胶，随后通过十二烷基硫酸钠除去脂质，最后通过折射率匹配的方法进行组织的透明化。

综合以上技术，SeeDB技术透明程度一般较低而且需要多次的更换不同梯度的溶液，而3DISCO方法虽然透明程度较高，然而在透明中使用有毒的有机溶剂，需要进行小心的操作，而且会造成明显的荧光蛋白的荧光信号的淬灭。CUBIC技术使用无毒的试剂进行组织透明化可以实现很好的透明效果，然而该方法的中用到了高浓度的去垢剂，在透明过程中会导致大量的样品中的生物分子丢失，导致荧光信号的大量损失。CLARITY采用有毒的丙烯酰胺进行组织的交联，可以很好的保存组织中的生物分子，但需要小心操作，并且该方法需要完全去除组织中的脂质，会导致脂类的信号标记丢失，而且操作复杂，需要较高的实验技巧。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种使用方法简单且能保存和增强荧光标记信号的生物组织透明化试剂及其应用。

本发明提供了一种生物组织透明化试剂，包括山梨醇、二甲基亚砜、2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水；所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为15％～25％；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为15％～25％；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40％～55％。

优选的，还包括含氨基的小分子多元醇；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为1％～7％。

优选的，所述含氨基的小分子多元醇为氨基丁三醇。

优选的，所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为18％～22％；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为18％～22％；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40％～50％；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为4％～7％。

优选的，所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为20％；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为20％；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40％～45％；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为5％～7％。

优选的，所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为20％；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为20％；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40％；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为6％。

本发明还提供了一种生物组织透明化方法，包括：

将生物组织浸泡在上述的生物组织透明化试剂中。

优选的，所述生物组织进行处理后再浸泡在生物组织透明化试剂中。

优选的，所述处理包括组织切片、免疫染色标记、化学染料染色与病毒感染表达荧光蛋白中的一种或多种。

本发明还提供了上述的生物组织透明化试剂在生物组织透明化处理和成像中的应用。

本发明提供了一种生物组织透明化试剂，包括山梨醇、二甲基亚砜、2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水；所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为15％～25％；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为15％～25％；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40％～55％。与现有技术相比，本发明以2，2'-硫基二乙醇为主要透明化成分，调节透明化试剂的折射率，同时利用山梨醇改变蛋白质的四级结构，产生透明化效果，利用二甲基亚砜增加组织的通透性，提高透明化速度及效果，从而使得到的生物组织透明化试剂简单处理生物样品即可实现组织透明化的同时保存和增强荧光标记信号以获得更好的成像效果，适用性广。

附图说明

图1为本发明实施例1中300μm厚的C57/BL6小鼠组织切片利用不同的试剂在不同的时间点的透明效果照片；

图2为本发明实施例2中Thy1-YFP小鼠脑组织透明前后的YFP荧光成像图；

图3为本发明实施例2中Thy1-YFP小鼠脑组织透明前后的YFP荧光强度统计图；

图4为本发明实施例3中GAD-GFP小鼠脑组织切片利用不同的组织透明化方法处理后的GFP荧光成像图；

图5为本发明实施例3中GAD-GFP小鼠脑组织利用不同方法透明后的GFP荧光强度的统计图；

图6为本发明实施例4中Thy1-YFP小鼠脑组织切片透明前后的超分比率三维成像图，其中左侧为透明前，右侧为透明后；

图7为本发明实施例5中Thy1-YFP小鼠脑组织切片大体积的双光子显微镜三维成像图；

图8为本发明实施例6中Alexa-488标记的biocytin标记的脑片的经过透明后三维成像图，其中较亮的区域为注射位点。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可；在本发明中如无特殊说明，所述质量体积比指得是溶质的质量(g)与溶剂体积(ml)的百分比，如山梨醇与蒸馏水的质量体积比指的是山梨醇的质量(g)与蒸馏水体积(ml)的百分比。

本发明提供的生物组织透明化试剂中山梨醇与蒸馏水的质量体积比优选为18％～22％，更优选为19％～21％，再优选为20％。山梨醇用于改变蛋白是四级结构，产生透明化效果。

所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比优选为18％～22％，更优选为19％～21％，再优选为20％。生物组织透明化试剂中添加二甲基亚砜用于增强组织的通透性，增加透明化速度及效果。

所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比优选为40％～50％，更优选为40％～45％，再优选为40％～42％，最优选为40％。本发明提供的生物组织透明化试剂中2，2'-硫基二乙醇是主要的透明化成分，用于调节透明化试剂的折射率。

本发明提供的生物组织透明化试剂优选还包括含氨基的小分子多元醇；所述含氨基的小分子多元醇的C原子数优选为2～6，更优选为3～5，再优选为4；所述含氨基的小分子多元醇最优选为氨基丁三醇。含氨基的小分子多元醇在生物组织透明化试剂中用于产生和维持碱性环境，以维持及增强组织内荧光标记信号。所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比优选为1％～7％，更优选为2％～7％，再优选为4％～7％，再优选为5％～7％，最优选为6％。

本发明以2，2'-硫基二乙醇为主要透明化成分，调节透明化试剂的折射率，同时利用山梨醇改变蛋白质的四级结构，产生透明化效果，利用二甲基亚砜增加组织的通透性，提高透明化速度及效果，从而使得到的生物组织透明化试剂简单处理生物样品即可实现组织透明化的同时保存和增强荧光标记信号以获得更好的成像效果，适用性广。

本发明还提供了一种生物组织透明化方法，包括：将生物组织浸泡在上述的生物组织透明化试剂中。

其中，所述生物组织优选为离体后或者已经死亡的生物组织；所述生物组织优选来源于爬行类、鸟类或哺乳类动物的生物体；所述生物组织的种类优选为脑组织、肾脏、肝脏、肠道或睾丸组织。

在本发明中，所述生物组织优选为采用心脏灌流的方式获取；更优选依次采用1×PBS、4％PFA溶液对动物样本进行灌流，灌流完成后开颅取脑，放置于四度预冷的4％PFA溶液中，在2～8度的冰箱中保存12～48h。

在本发明中，所述生物组织优选先进行处理后再浸泡在生物组织透明化试剂中；所述处理包括组织切片、免疫染色标记、化学染料染色与病毒感染表达荧光蛋白中的一种或多种。

生物组织浸泡在生物组织透明化试剂中，优选静置或在摇床上孵育直至透明，得到透明化的生物组织。所述静置的时间或孵育的时间优选为5～30min。

然后，优选将透明化的生物组织进行切片和成像；所述切片的方法优选采用手动修块、震荡切片机切片或冷冻切片等方法；切片后优选采用上述的生物组织透明化试剂进行封片，然后成像；所述成像可采用多种光学显微镜进行，包括宽场荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、双光子显微镜及激光片层显微镜等。

本发明采用了一步法的组织透明化方法，步骤简单易行，相对于现有的组织透明化方法，可以极大的减少生物组织处理的时间；且本发明采用的生物组织透明化试剂采用了无毒的试剂配置，操作过程安全性高；同时采用了高浓度的氨基丁三醇产生pH值为9.5～10.5的碱性环境，可以增强绿色荧光蛋白及其变种的荧光强度；本发明的方法适用性广泛，可以用于多种类型的生物组织，可以兼容多种类型的染色方法，可以用多种类型的成像手段进行成像，从而获得更好的成像结果。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种生物组织透明化试剂及生物组织透明化方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

A)脑组织的固定和分离，实施例均采用小鼠大脑，其固定和分离方式如下：

准备1×PBS和4摄氏度预冷的4％PFA。利用质量分数为10％的水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠完全麻醉后进行心脏灌流。灌流过程为先灌流20ml 1×PBS，随后灌流20ml预冷的4％PFA，灌流速度为10ml/min。随后开颅取脑组织，灌流成功的标志是大脑完全变白，无红色血管。分离后的大脑放在4％的多聚甲醛中在4摄氏度固定24h。

B)将脑组织用震荡切片机切为300μm厚度的切片，将切片用1×PBS洗1小时。随后将组织切片放入PBS，20％山梨醇(A)、20％二甲基亚砜(B)、6％氨基丁三醇(C)、40％2,2′-硫基二乙醇(D)以及含有上述比例试剂的混合试剂中(溶液配置中山梨醇和氨基丁三醇为质量体积比，二甲基亚砜和2,2′-硫基二乙醇为体积比，溶剂为蒸馏水)，利用体视显微镜分别在0min，5min，10min和30min进行拍照，得到照片如图1所示。

图1表明经过5min的透明化处理，含有20％山梨醇、20％二甲基亚砜和40％2,2′-硫基二乙醇的溶液(A+B+D)以及含有20％山梨醇、20％二甲基亚砜、40％2,2′-硫基二乙醇和6％氨基丁三醇的溶液(A+B+C+D)具有良好的透明化效果。而在30min时，A+B+C+D的组合具有最好的透明化效果。

实施例2

A)脑组织的固定和分离，实施例采用Thy1-YFP转基因小鼠大脑，其大脑的固定及分离步骤同实施例1。

B)将脑组织用震荡切片机切为100μm厚度脑片，然后放置于1×PBS中洗10min，利用PBS进行封片，随后利用奥林巴斯FV1200激光共聚焦显微镜进行成像，成像结果如图2左图。

C)将成像后的脑片取下放入透明化试剂中，5分钟后用透明化试剂封片后再次用奥林巴斯FV1200激光共聚焦显微镜以相同参数和相同位置进行成像，成像结果如图2右图。将荧光强度以透明前的数据进行均一化，通过统计学分析，表明经过本透明化试剂处理后YFP的荧光信号显著增强，如图3。

实施例3

A)脑组织的固定和分离，实施例采用GAD-GFP转基因小鼠大脑，其大脑的固定及分离步骤同实施例1。

B)将脑组织用震荡切片机切为100μm厚度脑片，然后放置于1×PBS中洗10min，利用PBS进行封片，随后利用奥林巴斯FV1200激光共聚焦显微镜进行成像。

C)将成像后的脑片取下放入常用的快速组织透明化试剂如CUBIC-1、ScaleSQ(0)以及实施例1中透明化试剂(含有20％山梨醇、20％二甲基亚砜、40％2,2′-硫基二乙醇和6％氨基丁三醇的溶液)，5分钟后用相应的透明化试剂封片后再次用奥林巴斯FV1200激光共聚焦显微镜以相同参数和相同位置进行成像，成像结果如图4。将荧光强度以透明前的数据进行均一化，通过统计学分析，表明经过本发明的透明化试剂处理后的组织的GFP荧光信号显著强于CUBIC-1和ScaleSQ(0)处理的组织，如图5。

实施例4

B)将脑组织用震荡切片机切为300μm厚度脑片，然后放置于1×PBS中洗3次，每次10min，利用PBS进行封片，随后利用蔡司LSM880激光共聚焦显微镜的Airscan模式进行超分辨率Z轴多层扫描成像并对成像结果进行三维重构，成像结果如图6左图。

C)将成像后的脑片取下放入实施例1中透明化试剂(含有20％山梨醇、20％二甲基亚砜、40％2,2′-硫基二乙醇和6％氨基丁三醇的溶液)中5min，随后使用透明化试剂进行封片，采取与上一步骤相同的方式进行成像及重构，成像结果如图6右图。

实施例5

B)将脑组织用震荡切片机切为1mm厚度脑片，然后放置于1×PBS中洗3次，每次30min，随后放入实施例1中得到透明化试剂(含有20％山梨醇、20％二甲基亚砜、40％2,2′-硫基二乙醇和6％氨基丁三醇的溶液)中处理1h，此时脑片应当呈透明状态，利用透明化试剂进行封片。

C)对封片后的脑片用奥林巴斯FV-MPE双光子显微镜对皮层区域进行Z轴多层扫描成像并对结果进行重构，以观察大体积的三维成像效果。成像效果如图7所示。

实施例6

A)脑组织的分离，实施例采用C57/BL6J小鼠。其实施过程如下：

准备四摄氏度预冷和28摄氏度预热的人工脑脊液，持续通入95％O₂/5％CO₂的混合气体30min以上达到氧饱和。利用质量分数为10％的水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠完全麻醉后断头取脑，随后开颅取脑组织。将脑组织放置于四度预冷的人工脑脊液中1min后进行修块。对修块后的脑组织用502胶水固定于托盘上，在四摄氏度的人工脑脊液中利用震荡切片机切取厚度为300μm的急性脑切片，将切下的急性脑片放入28度预热的人工脑脊液中，孵育1h以上备用。

B)将脑片放置于膜片钳记录系统的记录槽中，用铂丝网将脑片压好，找到皮层区域。对入水阻抗为3～5MΩ的电极内注入含有0.1％Alexa-488标记的biocytin的电极内液。将电极插入皮层区域，给予正压以注射biocytin至皮层区域，持续1min后释放正压，停留十分钟后将脑片取出，放置于四度预冷的4％PFA中，在四摄氏度固定24h。

C)将脑片用1×PBS洗3次，每次10分钟，随后放入实施例1中得到透明化试剂(含有20％山梨醇、20％二甲基亚砜、40％2,2′-硫基二乙醇和6％氨基丁三醇的溶液)中处理5min，待透明后利用透明化试剂进行封片。

D)对封片后的脑片用奥林巴斯FV1200激光共聚焦显微镜对皮层区域有biocytin标记的区域进行Z轴多层扫描成像并对结果进行重构，成像效果如图8所示。

Claims

1.一种生物组织透明化试剂，其特征在于，由山梨醇、二甲基亚砜、2，2'-硫基二乙醇、含氨基的小分子多元醇与蒸馏水组成；所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为15%～25%；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为15%～25%；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40%～55%；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为1%～7%。

2.根据权利要求1所述的生物组织透明化试剂，其特征在于，所述含氨基的小分子多元醇为氨基丁三醇。

3.根据权利要求1所述的生物组织透明化试剂，其特征在于，所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为18%～22%；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为18%～22%；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40%～50%；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为4%～7%。

4.根据权利要求1所述的生物组织透明化试剂，其特征在于，所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为20%；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为20%；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40%～45%；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为5%～7%。

5.根据权利要求1所述的生物组织透明化试剂，其特征在于，所述山梨醇与蒸馏水的质量体积比为20%；所述二甲基亚砜与蒸馏水的体积比为20%；所述2，2'-硫基二乙醇与蒸馏水的体积比为40%；所述含氨基的小分子多元醇与蒸馏水的质量体积比为6%。

6.一种生物组织透明化方法，其特征在于，包括：

将生物组织浸泡在权利要求1～5任意一项所述的生物组织透明化试剂中。

7.根据权利要求6所述的生物组织透明化方法，其特征在于，所述生物组织进行处理后再浸泡在生物组织透明化试剂中。

8.根据权利要求7所述的生物组织透明化方法，其特征在于，所述处理包括组织切片、免疫染色标记、化学染料染色与病毒感染表达荧光蛋白中的一种或多种。

9.权利要求1～5任意一项所述的生物组织透明化试剂在生物组织透明化处理和成像中的应用。