CN111601603A - 具有抗炎活性的硫酸化寡糖 - Google Patents
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Abstract
本文提供了小分子化合物，包括非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，具有抗炎性质并能够以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。本文还提供了治疗受试者的扑热息痛(APAP)过量的方法。
Description
相关申请的引证
本申请要求2017年11月3日提交的美国临时专利申请序列号62/581,443的权益，其通过引用其全部内容并入。
技术领域
在一些实施方式中，本文公开了具有抗炎活性的新的硫酸化硫酸乙酰肝素寡糖化合物。例如，在一些实施方式中，观察到所述化合物对药物诱导的肝损伤显示出保护作用。尽管不希望受到任何特定的操作理论的束缚，但这些化合物可能抑制HMGB1/RAGE的相互作用，其是与无菌炎性损伤相关的关键信号相互作用。该发现可用于由炎症反应过度反应引起的多种疾病。
背景技术
无菌炎症是响应细胞损伤而启动组织修复的自然过程。然而，在初始损害之后的过度炎症通常会损害周围的健康组织，并且是许多疾病过程的关键因素。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是DNA结合蛋白，其调节转录并在坏死性细胞死亡时从细胞核中释放(Zitvogel，2010；Chen，2010)。在细胞外，HMGB1是损伤相关分子模式(DAMP)蛋白，其充当促炎分子、协调炎症细胞向损伤部位的迁移和活化(Bianchi，2017)。HMGB1依赖性炎症与缺血再灌注和药物诱导的肝损伤相关(Huebener，2015)。
对乙酰氨基酚(APAP)，也称为扑热息痛，是一种广泛使用的镇痛药，是
的活性药物成分。摄入超治疗剂量会导致急性肝衰竭(ALF)(Heard，2008)。滥用
或
(阿片类和APAP的共制剂)也可能导致ALF。在美国，将近50％的药物性肝损伤归因于APAP毒性(Lee，2007)，每年约有80,000例急诊就诊(Blieden，2014)。APAP毒性的机制始于其代谢转化为反应性化学物质N-乙酰基-对苯醌亚胺(NAPQI)，其导致肝细胞坏死。(Tacke，2015年)。坏死性肝细胞释放HMGB1，其通过晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体驱动中性粒细胞的趋化性，激活无菌性炎症并放大肝损伤(Huebener 2015)。
然而，本领域仍然需要用于治疗有需要的受试者的炎症的其他组合物和方法。
发明内容
该概述列出了本发明公开的主题的几个实施方式，并且在许多情况下，列出了这些实施方式的变化和置换。该概述仅仅是众多变化的实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以具有或不具有所提到的特征。同样，这些特征可以应用于本发明公开的主题的其他实施方式，无论是否在本概述中列出。为了避免过多的重复，该概述未列出或建议此类功能的所有可能组合。
在一些实施方式中，本文提供了具有抗炎性质的小分子化合物，该小分子化合物包含非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，可选地其中非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子被配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。寡糖分子可以包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。寡糖分子可以包含约18个糖单元。
在一些实施方式中，本文提供了包含如下所示的二糖结构单元的小分子化合物：
本文提供了治疗受试者的方法，其包括向要治疗的受试者提供(其中所述受试者患有炎症)以及向所述受试者给予具有抗炎性质的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，可选地其中非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子被配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。在一些实施方式中，受试者患有导致炎症加重的任何损伤。在一些实施方式中，受试者患有肝损伤。在一些实施方式中，需要治疗的受试者是遭受扑热息痛(APAP)过量的受试者。在一些实施方式中，需要治疗的受试者是人类受试者。在一些实施方式中，小分子化合物包含选自由非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素和O-脱硫酸肝素(ODSH)组成的组的二糖结构单元。在一些实施方式中，寡糖分子包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。在一些实施方式中，寡糖分子包含约18个糖单元。给予寡糖分子可以减少受试者中的中性粒细胞浸润。寡糖分子的给予可以减轻受试者的炎症。寡糖分子的给予可以保护受试者免受肝损伤和多器官系统衰竭。在一些方面，待治疗的受试者患有药物诱导的炎症。
本文提供了治疗受试者的方法，其包括向要治疗的受试者提供(其中所述受试者患有炎症)以及向所述受试者给予具有抗炎性质的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，可选地其中非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子被配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。在一些实施方式中，受试者患有导致炎症加重的任何损伤。在一些实施方式中，受试者患有肝损伤。在一些实施方式中，需要治疗的受试者是遭受扑热息痛(APAP)过量的受试者。在一些实施方式中，需要治疗的受试者是人类受试者。在一些实施方式中，小分子化合物包含选自非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素和O-脱硫酸肝素(ODSH)的二糖结构单元。在一些实施方式中，寡糖分子包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。在一些实施方式中，寡糖分子包含约18个糖单元。给予寡糖分子可以减少受试者中的中性粒细胞浸润。寡糖分子的给予可以减轻受试者的炎症。寡糖分子的给予可以保护受试者免受肝损伤和多器官系统衰竭。在一些方面，待治疗的受试者患有药物诱导的炎症。
在一些方面，本文提供了治疗受试者的扑热息痛(APAP)过量的方法，该方法包括向需要治疗APAP过量的受试者提供治疗，向受试者给予具有抗炎性质的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，可选地其中非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子被配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用，其中减轻了受试者中APAP过量的损害。在一些实施方式中，对受试者的APAP过量的治疗可以在过量后0小时至24小时，或至少在过量后12小时内有效。受试者中的APAP过量的治疗可以包括防止肝损伤和/或多器官系统衰竭。受试者中APAP过量的治疗可以包括受试者中的中性粒细胞浸润的减少。受试者中APAP过量的治疗可以包括阻断HMGB1蛋白与RAGE之间的相互作用。在一些方面，小分子化合物包含如下所示的二糖结构单元：
因此，本公开主题的目的是提供具有抗炎活性的硫酸化硫酸乙酰肝素寡糖化合物及其制备和使用方法。
该目的和其他目的通过本公开的主题整体或部分地实现。此外，在研究了以下描述、附图和实施例之后，以上已经陈述了本公开主题的目的，本公开主题的其他目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
通过参考以下附图可以更好地理解本公开的主题。附图中的组件不必按比例绘制，而是将重点放在示出本公开的主题的原理上(通常示意性地)。在附图中，贯穿不同的视图，相似的附图标记表示对应的部分。通过参考在附图的图示中阐述的实施方式，可以获得对本公开的主题的进一步理解。尽管示出的实施方式仅是用于执行本公开的主题的系统的示例，但是总体上，通过参考附图和以下描述可以更容易地理解本公开的主题的组织和操作方法以及其进一步的目的和优点。附图并非旨在限制本公开主题的范围，该主题在所附或随后修改的权利要求书中特别地阐述，而仅仅是为了阐明和举例说明本公开的主题。
为了更全面地理解本公开的主题，现在参考以下附图，其中：
图1A-1G是用于合成18聚体寡糖的化学酶合成途径的示意图；
图2是本文所公开的18聚体寡糖的化学结构的示意图；
图3A至3D是数据的图形描述，显示了18聚体寡糖对APAP过量后肝损伤的影响；
图4A至4D是数据的图形描述，显示了靶向HMGB1以减少炎症的18聚体寡糖，
图4E显示了HS寡糖的符号结构；
图4F是图4E的图例；
图5A至5D是数据的图形描述，显示了延迟的18聚体寡糖治疗对APAP过量的影响；
图6A-6D是数据的图形描述，显示了APAP过量的小鼠的生物学参数；
图7是生物素化和非生物素化寡糖的化学结构示意图：6聚体、12聚体、18聚体和18聚体AXa；
图8A-8D是数据的图形描述，显示了6聚体、12聚体、18聚体和18聚体AXa寡糖的保护作用；
图9A和9B是数据的图形描述，显示了APAP过量导致ALT水平升高，嗜中性粒细胞迁移和多配体聚糖-1脱落；和
图10A至10C是基于对来自ALF患者的多配体聚糖-1的分析以及ALF患者中ALT和HMGB1的血浆浓度的数据的图形描述。
具体实施方式
现在将在下文中更全面地描述本公开的主题，其中描述了本公开的主题的一些但不是全部实施方式。实际上，本公开的主题可以许多不同的形式来体现，并且不应被解释为限于在本文阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本公开满足适用的法律要求。
硫酸乙酰肝素(HS)是大量存在于细胞表面和细胞外基质中的硫酸化多糖。许多DAMP，包括HMGB1，是HS结合蛋白(Xu，2011)。HS参与炎症的各个方面，包括趋化因子呈递和嗜中性粒细胞跨内皮迁移(Proudfoot，2003；Wang，2005；Axelsson，2013；Sarris，2012)。HS由与带有磺基的氨基葡萄糖残基连接的葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)的二糖重复单元组成。HS的链长和硫酸化模式决定了其生物学功能(Gama，2006)。根据本公开的主题的方面，提供了发挥抗炎作用的特殊设计的HS十八糖(18聚体)的合成。18聚体通过在小鼠模型中中和HMGB1的促炎活性来保护APAP诱导的急性肝衰竭。呈现的结果为抑制HMGB1介导的炎性疾病提供了新的化学空间。
在一些实施方式中，公开了具有抗炎性质的小分子化合物。在一些实施方式中，小分子化合物包含具有抗炎性质的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子。在一些实施方式中，非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子被配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。
在一些实施方式中，根据本公开的主题的小分子化合物包含二糖结构单元，或可以是包含二糖结构单元的组合物的一部分，如下所示：
通过实例而非限制的方式，该二糖组合物可以存在于非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素或O-脱硫酸肝素(ODSH)中。根据本公开的主题的组合物可以包含非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素或O-脱硫酸肝素(ODSH)。
在一些实施方式中，寡糖分子包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。在一些实施方式中，寡糖分子包含约18个糖单元。在一些实施方式中，表现出抗炎作用的硫酸乙酰肝素寡糖的一般结构包括：
，其中R3是H或可检测的标签。在一些实施方式中，可检测的标签包含对硝基苯基。
在一些实施方式中，本公开的主题的组合物包含含有药用载体的组合物。可以使用任何合适的药物制剂来制备用于向受试者给予的组合物。在一些实施方式中，组合物和/或载体可以是在人类中药用。
例如，合适的制剂可以包括可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和溶质的水性和非水性无菌注射溶液，其使制剂与受试者的体液等渗；以及可以包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。制剂可以以单位剂量或多剂量容器形式存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件中储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。一些示例性成分是十二烷基硫酸钠(SDS)，在一个实例中为0.1至10mg/ml，在另一个实施例中为约2.0mg/ml；和/或甘露醇或另一种糖，例如在10至10mg/ml的范围内，在另一个实施例中为约30mg/ml；和/或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
应当理解，除了上面特别提到的成分之外，本发明公开的主题的制剂可以包括关于所述制剂类型的本领域中常规的其他试剂。例如，可以使用无菌无热原的水性和非水性溶液。
根据本公开的主题还提供一种受试者的治疗方法，包括但不限于治疗包括炎症的病症的方法。本公开的主题的治疗方法可以包括向受试者给予非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子。在一些实施方式中，非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子被配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。
在一些实施方式中，寡糖分子在体内保护免受肝损伤。在一些实施方式中，寡糖分子在体内减少嗜中性粒细胞浸润。在一些实施方式中，寡糖分子减少体内炎症。
在一些实施方式中，受试者患有炎症。在一些实施方式中，受试者遭受导致炎症加重的任何损伤。在一些实施方式中，受试者患有肝损伤。在一些实施方式中，需要治疗的受试者是遭受扑热息痛(对乙酰氨基酚或APAP)过量的受试者。
在一些实施方式中，本公开的主题中治疗的受试者理想地是人类受试者，尽管应理解本文所述的方法对于所有脊椎动物种(例如，哺乳动物、鸟类等)都是有效的，其旨在包含在术语“受试者”中。
更具体地，本文提供了哺乳动物，例如人类的治疗，以及由于濒临灭绝而重要的那些哺乳动物(例如，西伯利亚虎)、具有重要经济意义(在农场饲养以供人类食用的动物)和/或社交重要性(作为宠物或动物园饲养的动物)而对人类重要的那些哺乳动物，例如人类以外的食肉动物(如猫和狗)、猪(猪、生猪和野猪)、反刍动物(如牛、公牛、羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马。因此，本文描述的方法包括家畜的治疗，包括但不限于家养的猪(猪和生猪)、反刍动物、马等。
在一些实施方式中，寡糖分子减少受试者的中性粒细胞浸润。在一些实施方式中，寡糖分子的给予减轻了受试者的炎症。在一些实施方式中，寡糖分子的给予保护受试者免受肝损伤和多器官系统衰竭。在一些实施方式中，待治疗的受试者患有药物诱导的炎症。
在一些实施方式中，减轻了受试者中APAP过量引起的损伤。
在一些实施方式中，对受试者的APAP过量的治疗在过量后0小时至24小时有效，或在一些实施方式中在至少在过量后12小时内有效，并且在一些实施方式中在过量后6小时内有效。在一些实施方式中，受试者中APAP过量的治疗包括针对肝损伤和/或多器官系统衰竭的保护。在一些实施方式中，受试者中APAP过量的治疗包括减少受试者的嗜中性粒细胞浸润。在一些实施方式中，受试者中APAP过量的治疗包括阻断HMGB1蛋白与RAGE之间的相互作用。
在一些实施方式中，根据本公开的主题的小分子化合物包含二糖结构单元，如下所示：
通过实例而非限制的方式，该二糖结构单元可以存在于非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素或O-脱硫酸肝素(ODSH)中。根据本公开的方法使用的组合物可以包含非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素或O-脱硫酸肝素(ODSH)。在一些实施方式中，组合物在体内保护免受肝损伤，例如在体内提供保肝作用。在一些实施方式中，寡糖分子在体内减少嗜中性粒细胞浸润。在一些实施方式中，受试者患有肝损伤。在一些实施方式中，需要治疗的受试者是遭受扑热息痛(对乙酰氨基酚或APAP)过量的受试者。
在一些实施方式中，寡糖分子包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。在一些实施方式中，寡糖分子包含约18个糖单元。在一些实施方式中，表现出抗炎作用的硫酸乙酰肝素寡糖的一般结构包括：
，其中R3是H或可检测的标签。在一些实施方式中，可检测的标签包含对硝基苯基。
定义
本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明公开的主题。
尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了以下定义以便于解释本发明公开的主题。
除非下文另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文所用技术的引用旨在指代本领域中通常理解的技术，包括对那些技术的变型或对本领域技术人员显而易见的等效技术的替代。尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了以下定义以便于解释本发明公开的主题。
在本申请中使用的术语“非抗凝的”和短语“无抗凝性”描述了本公开的主题具有小于或等于约50单位/mg抗凝活性，其中抗凝活性归因于因子Xa和/或因子IIa的抑制。
在描述本发明公开的主题时，应理解，公开了许多技术和步骤。这些中的每一个都有各自的益处，并且每个也可以与一种或多种或在一些情况下所有其他公开技术结合使用。
因此，为了清楚起见，该描述将避免以不必要的方式重复各个步骤的每种可能的组合。然而，阅读说明书和权利要求书时应理解，这样的组合完全在本发明和权利要求书的范围内。
根据长期存在的专利法惯例，术语“一个”、“一种”和“该”在本申请包括权利要求中使用时指的是“一个或多个”。因此，例如，提及“一个晶胞”包括多个这样的晶胞等。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的数量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据寻求通过本发明公开的主题获得的所需性质而变化。
如本文所用，术语“约”在涉及组合物的值或量、质量、重量、温度、时间、体积、浓度、百分比等时，旨在涵盖在一些实施方式中从指定量的±20％，在一些实施方式中±10％，在一些实施方式中±5％，在一些实施方式中±1％，在一些实施方式中±0.5％，和在一些实施方式中±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法或采用公开的组合物。
术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的技术术语，其意味着命名的元素是必不可少的，但是可以添加其他元素并且仍然形成权利要求范围内的构造。
如本文所用，短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当短语“由...组成”出现在权利要求主体的条款中时，而不是紧接在前序之后，其仅限制该条款中规定的要素；其他要素作为整体不排除在权利要求之外。
如本文所用，短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，以及不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些材料或步骤。
关于术语“包含”，“由......组成”和“基本上由......组成”，在本文使用这三个术语之一的情况下，本发明公开和要求保护的主题可以包括使用其他两个术语中的任一个。
如本文所用，术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时，是指单独或组合存在的实体。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”分别包括A、B、C和D，但也包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合。
实施例
包括以下实施例以进一步示出本公开的主题的各种实施方式。然而，根据本公开内容，本领域普通技术人员应当理解，在不脱离本公开的主题的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1
在美国和欧洲，对乙酰氨基酚/扑热息痛(APAP)过量是药物引起的急性肝衰竭(ALF)的主要原因。该疾病的进展归因于高迁移率族蛋白1(HMGB1)的释放引起的无菌炎症。非常需要一种中和HMGB1促炎活性的特异性、有效和安全的方法。在一些实施方式中，本文公开了通过靶向HMGB1而显示有效的保肝作用的HS十八糖(18聚体)。对内源性多配体聚糖-1在响应与APAP过量中的作用的调查证实了18聚体保护的机制。本公开的数据表明18聚体增强了由多配体聚糖-1介导的宿主抗炎作用。最后，证明了在APAP过量6小时后给予的18聚体仍然具有保护性，因此对于晚期症状患者而言，其治疗效果优于N-乙酰半胱氨酸。合成HS开辟了一种治疗ALF和其他HMGB1相关的炎性疾病的新方法。
合成了一系列新型的硫酸化硫酸乙酰肝素寡糖化合物。特别地，化学酶合成用于获得没有抗凝活性的纯HS/肝素样寡糖。一种示例性的化合物，称为18聚体NS2S，用于小鼠体内的深入研究。在对乙酰氨基酚(APAP)诱导的急性肝衰竭的情况下，18聚体NS2S显着降低损伤。尽管不希望受到任何特定的操作理论的束缚，但18聚体NS2S的作用机制可能涉及HMGB1/RAGE。18聚体NS2S治疗在小鼠APAP过量后6小时仍然有效，而临床使用的解毒剂NAC此时失去效力。这些观察结果的其他描述可以在下面的实施例中找到。
化学酶合成用于产生无抗凝活性的新型纯寡糖化合物。代表性的合成路线在以下实施例中公开。在体内使用了一系列18聚体化合物和一种12聚体和一种6聚体化合物。一种示例性的18聚体NS2S在体内显示对肝损伤具有保护作用。在该实施例中，18聚体NS2S显着提高了体内存活率。18聚体NS2S减少嗜中性粒细胞浸润。观察到RAGE基因敲除小鼠对18聚体NS2S保护作用不敏感。该观察结果支持对乙酰氨基酚(APAP)过量后的延迟治疗是可能的。
实施例2
材料和方法
研究设计
该研究旨在合成HS十八糖(18聚体)，并在APAP诱导的肝衰竭小鼠模型中评估其抗炎作用。本文证明了两种HS 18聚体的化学酶合成，包括18聚体NS2S(非抗凝化合物；称为18聚体)和18聚体Axa(抗凝化合物)。使用核磁共振(NMR)和高分辨率质谱(MS)证实了两个18聚体的结构。使用抗生物素蛋白-琼脂糖柱，然后免疫印迹分析，获得了HMGB1与生物素化的18聚体和18聚体Axa之间的结合的显示。HMGB1以如表面等离振子共振(SPR)所测定的纳摩尔范围结合18聚体和18聚体AXa。在已确定的APAP诱导的肝衰竭小鼠模型中评估了合成的18聚体的保肝作用。通过两种方法评估肝损伤，包括血浆ALT水平以及苏木精和伊红(H&E)染色的肝切片检查。通过确定嗜中性粒细胞向损伤部位的迁移，可以评估APAP过量后的炎症反应。因子Xa(FXa)活性用作替代，以在体外和体内实验中评估18聚体、12聚体和6聚体的抗凝活性。图例中显示了测试组和对照组中的动物数量以及统计分析。从(NationalInstitute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases,Bethesda,Maryland,United States of America)的急性肝衰竭研究组(ALFSG)生物储备库获取匿名患者ALF血浆样品以确定脱落的多配体聚糖-1的血浆水平。在分析31例患者样品后停止分析，因为观察到健康对照组(n＝11)与AFL患者之间的明显统计学差异。
HS生物合成酶的表达
共九种酶用于合成，包括NST、C5-epi、2-OST、6-OST-1、6-OST-3、3-OST-1、3-OST-5和pmHS2。如先前描述的(Renpeng et al.，2010；Xu et al.，2008)，除C5-epi和2-OST外，所有酶均在大肠杆菌(E.coli)中表达并通过适当的亲和层析纯化。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达途径(来自Invitrogen)在昆虫细胞中表达重组C5-epi和2-OST，以获得高表达水平(19)。如前所述，使用酶方法在内部合成所有三种酶辅助因子，包括3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS)、尿苷5'-二磷酸葡糖醛酸(UDP-GlcA)、尿苷5'-二磷酸N-三氟乙酰基氨基葡萄糖(UDP-GlcNTFA)(Nam，2017)。
非生物素化的18聚体Axa的合成
18聚体Axa的合成由18聚体开始。添加了两种酶修饰，包括6-O-磺基转移酶(6-OST)修饰和3-O-磺基转移酶亚型1(3-OST-1)修饰。在6-O-硫酸化步骤中，将18聚体(0.5mM)在60ml中在含有MES(50mM,pH 7.0)、6-OST-1(50μg ml-1)、6-OST-3(50μg ml-1)和PAPS(1.5当量的6-羟基基团量)的缓冲液中在37℃下温育过夜。然后将产物通过Q-琼脂糖凝胶柱纯化，用于随后的3-O-硫酸化步骤。
3-O-硫酸化步骤由3-OST-1酶完成。将6-O-硫酸化的18聚体(0.5mM)在20ml的含有MES(50mM)缓冲液(pH 7.0)、3-OST-1(20μg ml-1)和PAPS(0.675mM)的溶液中在37℃下温育2小时。产物通过Q-琼脂糖凝胶柱纯化。在合成期间，使用DEAE-NPR柱(4.6mm×75mm，来自Tosoh)通过HPLC监测产物。
非生物素化的6聚体和非生物素化的12聚体的合成使用酶法完成，并且在先前报道(Xu，2017)。
非生物素化的寡糖转化为生物素化的寡糖
将四种非生物素化的寡糖(6聚体、12聚体、18聚体和18聚体Axa)转化为生物素化的对应物。将带有pNP标签(5-10mg)的6聚体、12聚体、18聚体和18聚体AXa和0.5mg Pd/C溶解在总体积为4ml的20mM的NaOAc(pH 5.0)中。将反应混合物抽真空并用H2回填3次。然后，将反应在室温下温育4小时。之后，将其过滤以除去木炭。使用500mM的Na2HPO4将过滤的溶液调节至pH 8.5。加入6-叠氮基己酸琥珀酰亚胺酯(20摩尔当量的起始寡糖)，并在37℃下温育过夜。通过DEAE-HPLC柱纯化反应物以产生叠氮基标记的寡糖。用N2鼓泡PBS(pH7.4)缓冲液5分钟以制备0.1M CuSO4、0.1M三(3-羟丙基-三唑基甲基)胺(THPTA)(Sigma,Burlington,Massachusetts,United States of America)、0.15M抗坏血酸钠、0.01M叠氮基标记的寡糖和0.02M生物素-PEG4-炔(Sigma)的样品溶液。将400μl的THPTA和80μl的CuSO4的混合物涡旋，然后加入160μl的抗坏血酸钠，200μl的叠氮基标记的低聚物和200μl的生物素-PEG4-炔并用N2鼓泡2分钟，然后在37℃下温育过夜。通过DEAE-HPLC柱纯化反应物以产生生物素化产物。使用HPLC和MS监测反应。
HPLC分析
DEAE-NPR HPLC和多胺基阴离子交换(PAMN)-HPLC用于分析产物的纯度。HPLC分析的洗脱条件在他处描述(Renpeng et al.，2010)。简略地，对于DEAE-HPLC方法，以0.4mlmin-1的流速用20mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中的0至1M的线性梯度的NaCl洗脱柱TSK凝胶DNA-NPR(4.6×75mm，来自Tosoh Bioscience)60分钟。对于PAMN-HPLC，使用0至1M的线性梯度的KH2PO4洗脱柱(多胺II-HPLC，4.6×250mm，来自YMC)40分钟，然后以0.5ml min-1的流速在1M下保持30分钟。
寡糖的MS分析
低分辨率分析在Thermo LCQ-Deca上进行。将寡糖直接在200:l的MeOH/H2O(9:1,vol/vol)的混合物中稀释。使用注射泵(Harvard Apparatus)通过直接输注(50μl min-1)引入样品。实验在负电离模式下进行。将合成的非硫酸化寡糖在200μl的H2O中稀释，电喷雾源设置为5kV和275℃。将硫酸化的寡糖在200μl的10mM的碳酸氢铵中稀释，电喷雾源设置为3kV和150℃。对于全扫描MS，自动增益控制设置为1×107。使用Xcalibur 1.3采集并处理MS数据。
在以下条件下，在Thermo LTQ XL Orbitrap(Breman,Germany)上进行高分辨率ESI-MS分析。使用Luna亲水性液体相互作用色谱(HILIC)柱(2.0×50mm2,
Phenomenex,Torrance,California,United States of America)分离寡糖混合物。流动相A是用高效液相色谱(HPLC)等级水制备的5mM的乙酸铵。流动相B是在98％的HPLC等级乙腈与2％的HPLC等级水中制备的5mM的乙酸铵。通过Agilent 1200自动进样器注入5.0μl的12聚体混合物(1.0μgμl-1)后，使用HPLC二元泵在10分钟内以250μl min-1的流速递送3％A到80％A的梯度。将LC柱直接在线连接到LTQ-Orbitrap XL傅里叶变换(FT)质谱仪(MS)(Thermo Fisher Scientific,San-Jose,California,United States of America)的标准电喷雾电离源。用于防止源内碎片化的优化参数包括：4.2kV的喷雾电压，-40V的毛细管电压，-50V的管透镜电压，275℃的毛细管温度，40的鞘流速和20的辅助气体流速。质谱的外部校准通常产生小于3ppm的质量准确度。所有FT质谱均以60,000的分辨率和200-2000Da的质量范围获得。
人血浆样品的LC/MS二糖分析
将健康对照受试者和APAP-ALF患者的合并个体血浆样品在300μl消化缓冲液(调节至pH 7.0的含有2mM的氯化钙的50mM的乙酸铵)中消化。将重组肝素裂合酶I、II、III(最佳pH值7.0-7.5)和重组软骨素裂合酶ABC(各10mU，最佳pH值7.4)加入每个样品中并充分混合。将样品全部置于37℃下的水浴中12小时，然后通过离心除去酶来终止酶消化。将过滤器单元用250μl蒸馏水洗涤两次，并将包含二糖产物的滤液通过真空离心干燥。通过加入在室温下温育10分钟的DMSO/乙酸(17/3,vol/vol)中的10μl 0.1M 2-氨基吖啶酮(AMAC)将干燥的样品AMAC标记，然后添加10μl的1M的氰基硼氢化钠水溶液，并在45℃下温育1小时。类似地，将包含以0.5ngμl-1制备的购自Iduron(UK)的所有17种二糖标准品的混合物AMAC标记，并在每次运行中用作外标。在AMAC标记反应之后，将样品离心，并回收每种上清液。使用Agilent Poroshell 120ECC18(2.7μm，3.0×50mm)色谱柱在45℃的Agilent 1200LC系统上进行LC。流动相A是50mM乙酸铵水溶液，且流动相B是甲醇。流动相以300μl min-1的流速通过色谱柱。梯度为0-10min，5-45％B；10-10.2min，45-100％B；10.2-14min，100％B；14-22min，100-5％B。进样体积为5μl。装有ESI源(Thermo Fisher Scientific)的三重四极杆质谱系统用作检测器。在线MS分析是在多反应监测(MRM)模式下进行。MS参数：负电离模式，喷雾电压为3000V，蒸发器温度为300℃，且毛细管温度为270℃。
NMR分析
18聚体和18聚体AXa的NMR光谱在Bruker 800MHz标准孔NMR光谱仪上使用TopSpin2.1.6软件(Bruker,Billerica,Massachusetts,United States of America)获得。将样品(3.0至6.0mg)各自溶于0.4ml的以5000×g离心1分钟的99.9％的D2O中并冻干。将该过程重复两次，并将最终样品溶解在0.45mL的99.99％的D2O中。1H光谱、1H-1H相关光谱(COSY)、1H-13C异核单量子相干光谱(HSQC)、1H-1H总相关光谱(TOCSY)和1H-1H核欧沃豪斯效应光谱(NOESY)实验均在298K下进行。
HMGB1的表达
将人HMGB1的完整开放阅读框克隆到pcDNA3.1(+)-C-6His(GenScript,Piscataway,New Jersey,United States of America)中。使用FectoPRO转染试剂(Polyplus转染)进行转染。重组HMGB1-his在31℃下在293-freestyle细胞(Thermo FisherScientific)中生产。使用Ni SepharoseTM 6快速流动凝胶(GE Healthcare,LittleChalfont,England)进行从细胞裂解物中纯化HMGB1-his，然后Superdex200凝胶过滤层析。纯化后，通过SDS-PAGE，然后银染色确定HMGB1-his的纯度>99％。使用Detoxi-Gel(ThermoFisher Scientific)进行内毒素去除，并且通过发色LAL内毒素测试(GenScript,Piscataway,New Jersey,United States of America)的最终内毒素水平为<0.1 EU/μg蛋白。重组HMGB1-his同时具有细胞因子和趋化因子活性，其分别通过细胞信号传导测定和气袋测定(下文详细描述)进行评估。
从HS寡糖中去除内毒素
通过使用50ml离心过滤器单元(Amicon Ultra-15,Ultracel-100k；MerckMillipore,Darmstadt,Germany)以4,000rpm离心30分钟，从HS寡糖中去除内毒素。通过每次用1ml无内毒素的水重新填充滤内芯来重复该过程3次。收集过滤的溶液。内毒素水平使用鲎变形细胞溶解物(LAL)试剂盒(Associated of Cape Cod Inc.)测量。通过将100μl的重构Pyrotell(敏感性0.03内毒素单位ml-1)添加到100μl的无菌盐水中的0.1mg ml-1(用于动物注射的浓度)的HS寡糖中进行LAL测试。将Pyrotell和HS寡糖添加到10mm×75mm去热原玻璃反应管(Associated of Cape Cod Inc.)中，并在37℃下温育1小时。在温育时间结束时，将管倒置。如果形成凝胶凝块，则样品对内毒素呈阳性。如果样品保留在溶液中，则阴性结果表明样品中的任何内毒素都低于Pyrotell的敏感性。所有HS寡糖溶液均检测为阴性。
组织学/免疫组织化学
将肝组织在室温下在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，石蜡包埋并切片。将肝切片(4μm)用苏木精-伊红(H&E)染色或用单克隆抗体抗嗜中性粒细胞(Abcam,Ab 2557,NIMP-R14)(Abcam,Cambridge,United Kingdom)或抗多配体聚糖-1(StemCellTechnologies,60035,克隆281.2)(StemCellTechnologies,Vancouver,Canada)和山羊抗大鼠生物素化二抗(Abcam)免疫染色。为了纤维蛋白(原)染色，使用多克隆抗纤维蛋白(原)(Dako of Agilent,Santa Clara,California,United States of America)，然后山羊抗兔生物素化二抗(Sigma)。在UNC Chapel Hill的动物组织病理学和实验室医学核心设施进行包埋、切片和H&E染色。H&E分析是由位于UNC Chapel Hill的转化病理实验室核心设施(Translational Pathology Laboratory Core Facility)使用AperioImageScope软件(Leica Biosystems,Concord,Canada)进行的。使用连接到明场显微镜(Leica DM1000LED,Leica Microsystems Inc.,IL,USA)上的高清摄像机捕获IHC图像，然后使用ImageJ进行处理。对于嗜中性白细胞定量，每个样品随机选择五张100倍图像，并报告平均嗜中性粒细胞/视野。
炎症的小鼠模型：腹膜炎和气囊
两种模型用于研究体内嗜中性粒细胞迁移：腹膜炎和气囊炎症模型。对于腹膜炎模型，在不存在或存在20μg的18聚体的情况下，将30mg的肝裂解物注射到小鼠的腹膜腔中。在20小时后，通过吸入异氟烷使小鼠安乐死，并用10ml的冰冷的PBS洗涤腹膜腔。腹腔灌洗用于通过流式细胞术确定嗜中性粒细胞迁移。
在气囊技术中，将3ml的无菌空气注入小鼠背部皮肤下。在三天后，将袋再填充无菌空气。在第六天，在不存在或存在22.3μg的18聚体的情况下，将5μg重组HMGB1注入气囊中。给对照小鼠注射在PBS中的2mg ml-1的BSA。在4小时后，通过异氟烷吸入使小鼠安乐死，并仅用PBS洗涤气囊。灌洗用于使用流式细胞仪确定嗜中性粒细胞迁移。
流式细胞术
用针对Ly-6G/Ly-6C(单克隆抗小鼠RB6-8C5，PE-Cy7，eBioscience)和Cd11b(单克隆抗小鼠M1/70，FITC，eBioscience)的荧光标记抗体对腹腔和气囊灌洗液染色。样品在Stratedigm S1000Exi流式细胞仪上运行。
免疫印迹
通过在处死时将组织速冻在液氮中来制备肝裂解物。将组织在pH 6下的含有200mM的MES，500mM的磷酸盐和1mM的EDTA的缓冲液中机械均化，然后进行三轮冻融。将裂解的样品在4℃下以10000×g离心15分钟。将生物素化的HS寡糖(终浓度为15μM)用100μl的新鲜肝裂解物(约12.5mg)混合，并在4℃下温育过夜。使用Pierce高容量链霉亲和素琼脂糖(Thermo Fisher Scientific)分离生物素化的HS寡糖结合复合物。用50mM的MES，50mM的NaCl pH 6洗涤后，用LDS缓冲液洗脱样品。使用NuPAGE 4-12％的Bis-tris蛋白凝胶分离洗脱的样品，并使用抗HMGB1抗体(Abcam，兔单克隆EPR3507)和山羊抗兔HRP(Abcam)分析。
35S-标记的HS的制备及与重组HMGB1的结合研究
使用总体积为2ml的[35S]PAPS(4×107cpm)和N-磺基转移酶(NST)(100μg ml-1)和在50mM MES中的来自牛肾脏的HS制备[35S]HS。在pH 6下，将[35S]HS(1.35×105cpm)用1μg的重组HMGB1在50mM的MES，70mM的NaCl，10mM的咪唑中的溶液温育，并在室温下温育30分钟。加入5μg的染色质免疫沉淀级抗HMGB1(Abcam)，并在4℃下温育1h。使用Dynabeads蛋白A(Thermo)纯化反应混合物，并在pH 7.5下在含有25mM的Tris，150mM的NaCl的缓冲液中洗脱。使用液体闪烁分析仪(Packard；GMI,Ramsey,Minnesota,United States of America)测量洗脱样品的[35S]计数。不存在重组HMGB1的[35S]HS用作阴性对照。
表面等离子体共振
根据制造商的方案，将生物素化的HS18聚体(18聚体和18聚体AXa)固定在链霉亲和素(SA)传感器芯片(BIAcore,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上。简言之，将20μl的生物素化的HS寡糖以10μl min-1的流速注入SA芯片的流动池2、3和4(FC2、FC3和FC4)。通过在SA芯片上分别观察563、823、505、553和176共振单位(RU)的增加，证实生物素化寡糖的成功固定。通过注入饱和生物素1分钟来制备对照流动池(FC1)。
将重组HMGB1在pH 7.4下在0.01M的HEPES、0.15M的NaCl、3mM的EDTA和0.005％的表面活性剂P20中稀释。以30μl min-1的流速注入浓度为1000、500、250、125和63nM的重组HMGB1。在重组HMGB1注射结束时，相同的缓冲液流过SA表面以促进解离。在3分钟解离时间后，通过注入30μl的2M的NaCl再生SA表面。在25℃下，将响应作为时间的函数(感应图)监视。各种重组HMGB1浓度的感应图总体上与1:1Langmuir模型拟合。在使用BIAcore 3000对照和BIAevaluation软件(版本4.0.1)操作的BIAcore 3000上执行SPR测量。
APAP-ALF患者血浆
包含1.8mg ml-1 EDTA的APAP-ALF患者血浆获自(National Institute ofDiabetes and Digestive and Kidney Diseases,Bethesda,Maryland,United States ofAmerica)的急性肝衰竭研究小组(ALFSG)生物储备库。研究设计和收集方法的细节先前已有描述(35)。简略地，从1998年开始，将符合纳入和排除标准的成年患者纳入ALFSG注册中心。入院时获得血浆样品。在这项研究中，仅分析了APAP过量患者的血浆。这项研究未揭示临床数据，包括估计的APAP摄入量、估计的从摄入到住院的时间、用药过量的意图和患者人口统计资料(年龄、性别、种族、并存病等)。使用ELISA试剂盒(人类多配体聚糖-1 ELISA，CellSciences，Newburyport Massachusetts,United States of America)测量血浆多配体聚糖-1水平。根据制造商的方案，使用HMGB1 ELISA测量血浆HMGB1水平。使用ALTInfinity试剂测量血浆ALT水平。
体外和离体抗FXa活性的测定
试验基于先前公开的方法(19)。简略地，将人FXa(Enzyme ResearchLaboratories，South Bend,Indiana,United States of America)用PBS稀释至50U ml-1。将显色底物S-2765(Diapharma,West Chester,Ohio,United States of America)在水中稀释至1mg ml-1。为了体外研究，将磺达肝癸钠(Fondaparinux)和HS寡糖(18、12、6聚体和18聚体AXa)以各种浓度(11-131nM)溶解在PBS中。将16μl的样品用60μl的35μl ml-1抗凝血酶(Cutter Biologics)在室温下温育2分钟。接下来，添加100μl的FXa并在室温下温育4分钟。添加30μl的S-2765底物，并在405nm下连续5分钟测量反应混合物的吸光度。PBS作为对照样品。通过除以对照样品的最大斜率，将每个样品的最大斜率转换为FXa活性百分比。
对于离体研究，在仅用APAP，使用18聚体和18聚体AXa处理的小鼠中，在APAP过量后24小时收集的小鼠血浆，并遵循相同的操作规程。
统计分析
所有数据均表示为平均值±SEM。实验组和对照组之间的统计学显着性通过双尾非配对学生t检验分析，多组之间通过单因素方差分析、随后Dunnett或Tukey多重比较检验分析，且通过使用GraphPad Prism软件的对数秩检验的Kaplan-Meier生存曲线进行分析(版本7.03；GraphPad Software,Inc.,LaJolla,California,United States ofAmerica)。
实施例3
HS 18聚体的合成
18聚体的合成根据先前发表的化学酶法完成的(17,31)。简略地，使用来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)的细菌肝素前体合酶-2(PmHS2)将单糖GlcA-pNP延长至合适大小的骨架。然后，对骨架进行N-磺基转移酶(NST)、C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2-OST)的修饰。整个合成涉及五个主要步骤，包括步骤a(添加GlcNTFA的延长步骤)，步骤b(添加GlcA的延长步骤)，步骤c(使用LiOH的去三氟乙酰化)，步骤d(N-硫酸化步骤)，步骤e(2-O-硫酸化/差向异构化)(图1A-1G)。
步骤a是将寡糖骨架延长至期望的大小，包括添加GlcNTFA残基。简略地，将GlcA-pNP(3.2mM)溶解在含有Tris(25mM，pH 7.2)，MnCl2(5mM)，pmHS2(60μg ml-1)和UDP-GlcNTFA(4.5mM)的缓冲液中，然后在30℃下温育过夜。反应总体积为4L。使用C18柱(3×15cm，或120g，Biotage)通过梯度洗脱方法(0-100％甲醇的H2O，0.1％三氟乙酸，5ml min-1)纯化。
步骤b是用GlcA残基延长。将二糖(3.2mM)溶解在含有Tris(25mM，pH 7.2)，MnCl2(5mM)、pmHS2(30μg ml-1)和UDP-GlcA(1.5mM)的缓冲液中，然后在30℃下温育过夜。总反应体积为3升。如上所述，将C18柱(3×15cm，或120g，Biotage)用于纯化。
步骤c是在碱性条件下将GlcNTFA残基转化为GlcNH2残基。寡糖(13mM)的去三氟乙酰化在0.1M LiOH中在冰浴下进行0.5h。产物通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)监测。反应完成后，立即用盐酸(1M)将pH调节至7.0。
步骤d是使用NST酶将GlcNH2残基转化为GlcNS残基。在一个实例中，在含有2-(N吗啉代)乙磺酸(MES，50mM)的溶液中在pH 7.0下在37℃下将去三氟乙酰化的四糖(1.3mM,GlcNH2-GlcA-GlcNH2-GlcA-pNP)与N-磺基转移酶(32μg ml-1)和PAPS(1.5当量的游离氨基量)一起温育过夜，反应体积为5.6L。
步骤e是将内部GlcA残基转化为IdoA2S残基，并且涉及C5-差向异构酶和2-O-磺基转移酶(2-OST)。例如，将寡糖GlcNTFA-GlcA-GlcNS-GlcA-GlcNS-GlcA-pNP(1.2mM)在含有Tris(25mM)缓冲液(pH 7.5)和半纯化的C5-差向异构酶(3μg ml-1)、2-OST(6.5μg ml-1)和PAPS(1.8mM)的溶液中在37℃下温育过夜，反应体积为4.9L。
使用Q-琼脂糖凝胶快速流动色谱柱(来自GE Healthcare Life Science)纯化硫酸盐产物，并在3小时内用pH 5.0、20mM的NaOAc-HOAc中的线性梯度0-100％2M的NaCl洗脱。基于产物的结合亲和力和反应规模选择不同大小的Q-琼脂糖凝胶色谱柱和盐梯度。
在每个延长合成步骤中，通过配备有多胺II色谱柱(4.6mm×250mm，来自YMC)的Shimadzu HPLC监测产物。通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)表征每个步骤的中间体的结构。
实施例4
APAP肝损伤的小鼠模型
所有动物实验均已获得美国北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理和使用委员会(Chapel Hill,North Carolina,United States of America)和美国布法罗大学的IACUC(Buffalo,New York,United States of America)批准。Ager-/-小鼠最初是由AngelikaBierhaus博士(University of Heidelberg,Heidelberg,Germany)的捐赠的(32)。在APAP(Sigma)给予之前，将C57BL/6J或Ager-/-小鼠禁食过夜(12-15h)以耗尽谷胱甘肽储存。将新鲜的APAP溶于温暖的(约50℃)无菌0.9％氯化钠溶液(无菌盐水)中，冷却至37℃，并以400或600mg kg-1腹膜内注射。在一些实验中，在APAP后30分钟向小鼠皮下注射9.5μM的HS寡糖的约200μl的无菌盐水溶液，然后在APAP后12小时再次注入4.75μM的HS寡糖的约100μl或等体积的无菌盐水溶液。
为了比较18聚体对N-乙酰半胱氨酸(NAC)的功效，在APAP后30分钟内腹膜内注射pH 7.5下的300mg kg-1 NAC的无菌盐水溶液。在单独的实验中，在APAP后6小时给予300mgkg-1 NAC或0.34mg/kg 18聚体，然后在APAP后18h将0.17mg kg-1 18聚体给予至18聚体治疗组。在APAP后24小时，对小鼠实施安乐死并收集血液和肝组织。
在存活研究中(600mg kg-1APAP)，在APAP后30分钟向小鼠注射0.4mg kg-1 18聚体，然后每12小时重复注射或等体积的无菌盐水96小时。
实施例5
APAP诱导的肝损伤的评估
按照制造商的说明，使用ALT Infinity试剂(Thermo Fisher Scientific)测量血浆ALT。根据制造商的说明，使用小鼠TNF-αDuoSet试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota,United States of America)测量血浆TNF-α。根据制造商的说明，使用HMGB1ELISA试剂盒(Tecan US of Tecan Trading AG,Mannedorf,Switzerland)确定血浆HMGB1水平。根据制造商的说明，使用小鼠多配体聚糖-1 ELISA(CellSciences)确定血浆多配体聚糖-1水平。根据制造商的说明，使用谷胱甘肽检测试剂盒(Cayman Chemicals,AnnArbor,Michigan,United States of America)测定肝脏GSH水平。
实施例6
APAP过量后36小时，18聚体显着减轻肝脏损伤
与以上实例相似，在约10周龄和约25克体重的C57Bl/6J雄性小鼠在时间0小时时通过腹膜内注射过量给药对乙酰氨基酚(APAP；400mg/kg)。
小鼠在APAP后30分钟、12小时和24小时接受重复皮下注射的18聚体。通过颈椎脱位法处死小鼠，从腔静脉中抽血，并收集肝组织用于组织学检查。丙氨酸氨基转移酶(ALT)用作肝损伤的生物标志物。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)用作炎症的标志物。苏木精和伊红染色(H&E)用作组织学染色技术以定量组织坏死区域。
所得数据表明，所有的18聚体化合物(表1)均降低了血浆ALT水平。虽然测试的所有18聚体化合物均有效，但NS2S硫酸化模式提供了最一致的ALT降低(与APAP对照相比，平均值差异最大)，其结果在表1中示出。
表1.
实施例7
结果和讨论
从天然来源分离出的HS是具有不同多糖链长和硫酸化模式的高度复杂的混合物。缺乏结构上均一的HS寡糖，特别是表现出与全长HS相似的功能的长HS寡糖，阻碍了努力开发HS作为治疗剂的兴趣(Liu，2014)。我们最近开发了一种化学酶法来极高效率地合成HS寡糖(Xu,2011,Xu 2014,Xu,2017)。在此，合成了HS寡糖，包括323mg的HS十八糖(18聚体)(图1A-1G和图2)。这代表了至今合成的最长的HS寡糖之一。18聚体的结构通过高分辨率质谱和NMR确认。通过高分辨率阴离子交换高效液相色谱法测定纯度＞98％。
在APAP诱导的ALF鼠模型中检验了18聚体的保肝作用。APAP过量后接受18聚体治疗的小鼠的肝脏比APAP对照小鼠的肝脏显著更健康，这由更高的正常肝细胞数量(图3A)和更低的丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血浆水平(肝损伤的生物标志物)(图3C)表明。18聚体治疗显示向肝脏的嗜中性粒细胞浸润减少，组织坏死因子α(TNF-α)的血浆水平降低(图3B和6A)，提示局部和全身炎症减轻。致命的APAP过量(600mg kg-1)后，18聚体的死亡率也降低，与对照组的42％生存相比，96小时生存率达90％(图3D)。在研究过程中，APAP对照和18聚体治疗小鼠的肝脏谷胱甘肽(GSH)水平基本相同(图6B)。GSH水平随着NAPQI形成而降低(Tacke，2015；Nam，2017)，因此数据表明18聚体不会影响APAP向细胞毒性中间体NAPQI的代谢转化。这些结果表明18聚体通过减少炎症反应而不是通过影响APAP代谢来改善肝损伤。
有两条证据表明18聚体靶向HMGB1以减少APAP过量后的炎症。首先，我们发现18聚体在两个体内模型中减少了HMGB1介导的嗜中性粒细胞浸润。在气囊模型中，重组HMGB1的注射诱导了广泛的嗜中性粒细胞浸润(图4A)，通过与18聚体共同给予显着降低了这种作用。18聚体还可以减少由肝裂解物诱导的腹膜炎模型中的嗜中性粒细胞浸润(图6C)，这一过程已知由HMGB1介导(4)。其次，使用RAGE基因敲除小鼠或Ager-/-小鼠来证明18聚体靶向HMGB1/RAGE轴。因为HMGB1和RAGE的相互作用对于APAP过量中的促炎反应至关重要(Huebener，2015)，预计18聚体的保肝作用取决于RAGE的存在。APAP过量后，肝脏嗜中性粒细胞浸润增加，且野生型(WT)中的增加明显大于Ager-/-小鼠(图4B)。18聚体处理的Ager-/-小鼠未能显示出嗜中性粒细胞浸润的减少，而WT小鼠则对18聚体处理产生反应(图4B)。此外，Ager-/-小鼠中的18聚体治疗无法降低ALT水平(图6D)。该数据表明在没有RAGE的情况下18聚体失去其保护作用。
进行了结构-活性关系研究，以检验与HMGB1的结合以及使用不同形式的HS在APAP模型中的保护作用。合成了四种生物素化的寡糖，包括6聚体、12聚体和两种18聚体(图4E)(对于结构和表征，请参见图7)。其中，6聚体、12聚体和18聚体仅在链长上变化，而在硫酸化模式上没有变化。这些寡糖是非抗凝的，因为它们缺乏抗因子Xa活性。18聚体Axa是高度硫酸化的抗凝血十八糖，其具有有效的抗因子Xa活性(图8A和8B)。观察到18聚体和18聚体Axa，而不是6聚体或12聚体与小鼠肝裂解物中的HMGB1结合，这表明存在结合需要的最小链长(图4C)。通过表面等离子体共振测定HMGB1结合常数(KD)为186nM(对于18聚体)和65nM(对于18聚体AXa)，但是只有18聚体表现出通过ALT(图4D)和通过嗜中性粒细胞浸润(图8C)测量的保肝作用。显然，缺乏来自6聚体和12聚体的保肝作用与无法结合HMGB1有关。然而，尽管能够结合HMGB1，18聚体AXa也缺乏保肝作用。这可能是由于其抗凝活性，因为抗凝的未分级肝素在APAP过量后也缺乏保肝作用(图8D)。Kopec及其同事报告说，APAP过量后需要纤维蛋白来激活肝脏修复(20)。给予18聚体Axa会减少血纤维蛋白形成，因此会导致保肝功能丧失。
为了进一步了解相应于APAP过量的18聚体的保护作用，研究了多配体聚糖-1(存在于肝细胞上的主要HS蛋白聚糖)的作用。多配体聚糖-1包含用HS链附接的核心蛋白，并在病理条件下通过基质金属蛋白酶从细胞表面脱落(Park，2000)。在小鼠APAP过量后的24小时时间内，观察到血浆多配体聚糖-1的含量较高，但波动较大(图5A)。同时，HMGB1(图5A)、ALT和肝脏嗜中性粒细胞浸润的血浆水平随时间增加(图9A和9B)。通过免疫染色肝切片证实细胞表面多配体聚糖-1的丢失。使用来自牛肾的35S-标记的HS作为脱落的多配体聚糖-1的HS链的替代分子，我们证明了HMGB1与HS结合(图5B)，这与以前使用不同来源的HS的报道是一致的(9)。这些结果表明，脱落的多配体聚糖-1通过其HS链与HMGB1结合。从APAP诱导的ALF患者中也观察到血浆多配体聚糖-1水平的显着增加(图5C)。值得注意的是，如通过核心蛋白分析测量的，APAP-ALF患者的脱落的多配体聚糖-1水平比APAP过量的小鼠高约200倍。HS链分析证实了ALF患者的脱落的多配体聚糖-1水平升高(图10A)，且APAP-ALF患者的HMGB1和ALT也高于健康对照组(图10B和10C)，与以前的报告一致(22)。
APAP过量后人和小鼠中多配体聚糖-1脱落与HMGB1释放之间的关系强调了内源性保护途径。多配体聚糖-1在初始损害后脱落，并中和HMGB1的促炎活性，从而限制了无菌炎症。实际上，与野生动物相比，多配体聚糖-1-/-小鼠更易受APAP诱导的ALF的影响(Nam，2017)。在广泛的APAP损害过程中，脱落的多配体聚糖-1可能不足以中和所有HMGB1，并且添加18聚体(多配体聚糖-1上的HS模拟物)提供进一步的保护。
由于NAPQI诱导的细胞损伤后会发生无菌炎症，因此我们研究了APAP过量后进一步延迟18聚体治疗的可能性。N-乙酰基半胱氨酸(NAC)是NAPQI中和的抗氧化剂，是治疗APAP过量的护理标准。然而，仅在摄入APAP的8小时内给予NAC治疗才有效(Bailey，2016年)。虽然在小鼠中APAP后六小时给予时，NAC会失去其保护作用，但18聚体仍然能够降低ALT(图5D)。这些数据表明18聚体治疗通过提供更宽的治疗窗，对于晚期呈现的APAP过量的患者具有潜在的优势。
实施例8
结论
本文公开了合成HS通过靶向HMGB1介导的无菌炎症来治疗APAP诱导的ALF的用途。均质寡糖的可用性使得有可能鉴定出潜在该作用的候选靶标和化合物。除中和HMGB1外，多配体聚糖-1的HS还可以激活肝脏修复并调节趋化因子的活性。18聚体也可以促进这些功能。HS对患者具有良好的耐受性(Shriver，2004年)，且未分级的肝素，一种HS的高度硫酸化形式，近一个世纪以来一直被用作抗凝剂(Szajek，2016年)。现在，HS寡糖的合成可以大规模且经济有效的方式实现。HMGB1中和的合成寡糖应为ALF提供有希望的治疗方法。由于HMGB1与多种疾病有关，包括癌症、中风和关节炎(Venereau，2016)，因此基于HS的新型治疗剂提供作为HMGB1的抑制剂的有希望的机会。
参考文献
本文列举的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其出版物、科学期刊文章和数据库条目(例如，
数据库条目和其中所有可用的注释)，均通过引用其全部内容并入本文，程度如同它们补充、解释、提供本文所采用的方法、技术和/或组成的背景和/或教导本文所采用的方法、技术和/或组成。
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应当理解，在不脱离本公开主题的范围的情况下，可以改变本发明公开的主题的各种细节。此外，前面的描述仅用于说明的目的，而不是为了限制的目的。
Claims (33)
1.一种具有抗炎性质的小分子化合物，所述小分子化合物包含非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，可选地其中所述非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。
2.一种具有抗炎性质的小分子化合物，所述小分子化合物包含非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，所述非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子包括以下结构式中的一种：
，其中R3是H或可检测的标签。
3.根据前述权利要求中任一项所述的小分子化合物，其中，所述寡糖分子包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。
4.根据前述权利要求中任一项所述的小分子化合物，其中，所述寡糖分子包含约18个糖单元。
5.根据前述权利要求中任一项所述的小分子化合物，其中，所述小分子化合物以组合物的形式提供，所述组合物还包含包括如下所示的二糖结构单元的小分子化合物：
其中R＝-H或-SO3H。
6.根据权利要求6所述的小分子化合物，其中，包含二糖结构单元的所述小分子化合物选自由非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素和O-脱硫酸肝素(ODSH)组成的组。
7.根据前述权利要求中任一项所述的小分子化合物，其中，所述寡糖分子在体内保护免受肝损伤。
8.根据前述权利要求中任一项所述的小分子化合物，其中，所述寡糖分子减少体内嗜中性粒细胞浸润。
9.根据前述权利要求中任一项所述的小分子化合物，其中，所述寡糖分子减轻体内炎症。
10.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
提供待治疗的受试者，其中所述受试者患有炎症；和
向所述受试者给予具有抗炎性质的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，可选地其中所述非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用。
11.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
提供待治疗的受试者，其中所述受试者患有炎症；和
向所述受试者给予具有抗炎性质的小分子化合物，所述小分子化合物包含包括以下结构式中的一种的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子：
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有导致炎症增加的任何损伤。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有肝损伤。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，需要治疗的受试者是患有扑热息痛(APAP)过量的受试者。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，需要治疗的受试者是人类受试者。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述小分子化合物包含如下所示的二糖结构单元：
其中R＝-H或-SO3H。
17.根据权利要求17所述的方法，其中，包含二糖结构单元的所述小分子化合物选自由非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素和O-脱硫酸肝素(ODSH)组成的组。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述寡糖分子包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述寡糖分子包含约18个糖单元。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述寡糖分子的给予减少所述受试者中的嗜中性粒细胞浸润。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述寡糖分子的给予减轻所述受试者的炎症。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述寡糖分子的给予保护所述受试者免受肝损伤和多器官系统衰竭。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，待治疗的受试者患有药物诱导的炎症。
24.一种治疗受试者的扑热息痛(APAP)过量的方法，所述方法包括：
提供需要治疗APAP过量的受试者；
向所述受试者给予具有抗炎性质的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子，可选地其中所述非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子配置为以足以影响HMGB1蛋白与晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体之间的相互作用的方式与高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白相互作用，
其中减轻所述受试者的来自APAP过量的损伤。
25.一种治疗受试者的扑热息痛(APAP)过量的方法，所述方法包括：
提供需要治疗APAP过量的受试者；
向所述受试者给予具有抗炎性质的小分子化合物，所述小分子化合物包含包括以下结构式中的一种的非抗凝硫酸乙酰肝素寡糖分子：
其中R3是H或可检测的标签，并且其中减轻所述受试者的来自APAP过量的损伤。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，对所述受试者的APAP过量的治疗在过量后0小时至24小时，或至少在过量后12小时内有效。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，对所述受试者的APAP过量的治疗包括针对肝损伤和/或多器官系统衰竭的保护。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，对所述受试者的APAP过量的治疗包括减少所述受试者中的嗜中性粒细胞浸润。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，对所述受试者的APAP过量的治疗包括阻断HMGB1蛋白与RAGE之间的相互作用。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述小分子化合物包含如下所示的二糖结构单元：
其中R＝-H或-SO3H。
31.根据权利要求32所述的方法，其中，包含二糖结构单元的所述小分子化合物选自由非抗凝肝素、非抗凝低分子量肝素和O-脱硫酸肝素(ODSH)组成的组。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述寡糖分子包含约10至约20个糖单元，或约12至约18个糖单元。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述寡糖分子包含约18个糖单元。
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