CN111579685A - 一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用，属于药物分析技术领域。针对抗凝血药物达比加群、利伐沙班和阿哌沙班，待测血浆样本经蛋白沉淀处理后，先利用超高效液相色谱将待测物质与血浆基质进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算待测物的含量。本发明的试剂盒灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，4.5 min之内可完成分离和检测，准确度和精密度基本满足要求。

Description

一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用。

背景技术

治疗药物监测(TDM)是针对不同患者个体、量体裁衣式地制定给药方案的一种方法，通过定量测定血浆中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。LC-MS/MS的方法可以实现快速、高通量、准确的检测体内抗凝血药物浓度，为临床上实时监测体内抗凝血药物浓度，达到最佳的治疗效果，尽可能的减少不良反应的发生。

达比加群(DBT)是一种强极性的两性化合物，不溶于有机溶剂，达比加群酯是DBT的前药，在体内可被转化为达比加群从而发挥抗凝作用。达比加群酯是一种人工合成的新型口服抗凝抑制剂，它能可逆地竞争性抑制凝血酶活性，属于非肽类凝血酶抑制剂，其口服后通过消化道迅速吸收，在血浆和肝脏内通过酯酶水解可以产生活性代谢产物达比加群，通过抑制凝血酶发挥抗凝活性。利伐沙班(RXB)和阿哌沙班(AXB)均属于选择性Ⅹa因子抑制剂，它不需要抗凝血酶Ⅲ参与，可直接拮抗游离和结合的Ⅹa因子，临床用于择期髋关节或膝关节置换术的成年患者，以预防静脉血栓形成。

目前，已有文献报道采用HPLC-UV和LC-MS/MS法测定血浆中的药物含量。中国临床药理学杂志第35卷第10期2019年5月，题为“液质联用法同时测定人血浆中达比加群和利伐沙班的浓度”的文章使用同位素内标定量，且前处理简单，血浆样品200μL进行蛋白沉淀处理，定量下限为2ng/mL，运行时间为6min，进样量10μL。国外已报道同时测定这三种药的LC-MS/MS方法(Bioanalysis,2016,8(4),275-283)，虽然定量下限为1ng/mL，但采用固相萃取处理样本，操作繁琐，而且运行时间为10min。专利CN104730165B公开了一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法，该发明分析时间8min，采用外标法定量，缺乏准确性。

目前现有的方法存在操作步骤繁琐、血浆用量大、单个样品分析时间长、灵敏度低或使用外标法准确性差，检测项目单一等缺点。此外，由于临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量要少，且进样量过大会严重污染仪器，增加仪器维护成本。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，可大大简化现有方法，且便于实验室检测，可满足临床需要。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，包括：流动相、校准品溶液、混合内标工作液和质控品；

所述抗凝血药物包括达比加群(Dabigatran，DBT)、利伐沙班(Rivaroxaban，RXB)、阿哌沙班(Apixaban，AXB)；

所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液、流动相B为甲酸甲醇溶液；

所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液；

所述混合内标工作液包括浓度已知的由乙腈溶液配制的达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的混合溶液；

所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液。

进一步地，所述试剂盒还包括蛋白沉淀剂。

进一步地，所述蛋白沉淀剂为甲醇或乙腈中的一种或两种的混合液。

进一步地，所述蛋白沉淀剂为乙腈。

进一步地，所述流动相A为0.001％-0.01％甲酸水溶液，流动相B为0.001％～0.01％甲酸甲醇溶液。

进一步地，所述流动相A为0.004％甲酸水溶液，流动相B为0.004％甲酸甲醇溶液。

进一步地，所述校准品溶液包括七种浓度配比的混合液。

进一步地，所述混合内标工作液中达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的浓度分别为：达比加群-13C6 50ng/mL、利伐沙班-d4 25ng/mL、阿哌沙班-13C,d350ng/mL。

进一步地，所述质控品包括低、中、高三种浓度配比的混合液。

上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物含量中的应用。

有益效果：

1、采用本发明的试剂盒检测血浆中抗凝血药物含量，前处理过程简单、灵敏度高、分析时间短、样本用量少，4.5min之内即可完成3种抗凝血药物的分离和检测；

2、本发明的试剂盒采用同位素内标法进行定量，可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗凝血药物的定量分析，为临床上抗凝血药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

附图说明

图1为实施例1中抗凝血药物的标准品提取离子流色谱图

图2为实施例1中血浆中抗凝血药物的提取离子流色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，所述抗凝血药物包括达比加群(Dabigatran，DBT)、利伐沙班(Rivaroxaban，RXB)和阿哌沙班(Apixaban，AXB)，

上述抗凝血药物对应的同位素内标物分别为：达比加群-13C6(DBT-13C6)、利伐沙班-d4(RXB-d4)、阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)。

所述的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：水(含0.001％～0.01％甲酸)；流动相B：甲醇(含0.001％～0.01％甲酸)；

(2)校准品溶液：

将包含有20000ng/mL DBT、10000ng/mL RXB和20000ng/mL AXB的混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

DBT和AXB的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

RXB的浓度依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；

(3)混合内标工作液：

包含有50ng/mL DBT-13C6、25ng/mL RXB-d4和50ng/mL AXB-13C,d3的混合内标工作液；

(4)蛋白质沉淀剂；

(5)质控品：

含有抗凝血药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，

QC(L)为中浓度质控用空白血浆稀释10倍；

QC(M)为空白血浆稀释混合标准溶液500倍；

QC(H)为空白血浆稀释混合标准溶液50倍。

在一种优选方案中，上述流动相A为0.001％-0.01％甲酸水溶液，优选为0.004％甲酸-水溶液；流动相B为0.001％-0.01％甲酸甲醇溶液，优选为0.004％甲酸-甲醇溶液。

在一种方案中，蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或甲醇和乙腈的混合溶剂，优选为乙腈。

本发明提及的混合标准溶液按照如下方法制备：将2mg/mL DBT、1mg/mL RXB和1mg/mL AXB标准品母液以80％乙腈配制成含有20000ng/mL DBT、10000ng/mL RXB和20000ng/mL AXB的混合标准溶液。

本发明提及的混合内标工作液按照如下方法制备：将50μg/mL的DBT-13C6、25μg/mL的RXB-d4和50μg/mL AXB-13C,d3的同位素内标母液以80％乙腈配制成含有500ng/mLDBT-13C6、250ng/mL RXB-d4和500ng/mL AXB-13C,d3的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL 80％乙腈溶液，混合均匀得混合内标工作液。

本发明提及的血浆为人血浆或动物血浆。

本发明提及的空白血浆基质为无抗凝血药物的空白血浆。

在一种优选方案中，超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：0.004％甲酸-水溶液；流动相B：0.004％甲酸-甲醇溶液；

(2)校准品溶液：

将2mg/mL DBT、1mg/mL RXB和1mg/mL AXB标准品母液以80％乙腈配制成含有20000ng/mL DBT、10000ng/mL RXB和20000ng/mL AXB的混合标准溶液，将所述混合标准溶液以无抗抗凝血药物的空白血浆配制成七个不同浓度点的校准品溶液；

所述校准品溶液的七个浓度点为：

DBT和AXB的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

RXB的浓度依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；

(3)混合内标工作液：

将50μg/mL的DBT-13C6、25μg/mL的RXB-d4和50μg/mL AXB-13C,d3的同位素内标母液以80％乙腈配制成含有500ng/mL DBT-13C6、250ng/mL RXB-d4和500ng/mL AXB-13C,d3的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL 80％乙腈溶液，混合均匀得混合内标工作液；

(4)蛋白质沉淀剂：

乙腈；

(5)质控品：

含有抗凝血药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：QC(L)为中浓度质控用空白血浆稀释10倍；QC(M)为空白血浆稀释混合标准溶液500倍；QC(H)为空白血浆稀释混合标准溶液50倍。

在一种更优选方案中，超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：0.004％甲酸-水溶液；流动相B：0.004％甲酸-甲醇溶液；

(2)校准品溶液：

将2mg/mL DBT、1mg/mL RXB和1mg/mL AXB标准品母液以80％乙腈配制成含有20000ng/mL DBT、10000ng/mL RXB和20000ng/mL AXB的混合标准溶液。将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

DBT和AXB的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

RXB的浓度依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；

(3)混合内标工作液：

将50μg/mL的DBT-13C6、25μg/mL的RXB-d4和50μg/mL AXB-13C,d3的同位素内标母液以80％乙腈配制成含有500ng/mL DBT-13C6、250ng/mL RXB-d4和500ng/mL AXB-13C,d3的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL 80％乙腈溶液，混合均匀得混合内标工作液。

(4)蛋白质沉淀剂：

乙腈；

(5)质控品：

取上述混合标准溶液以无抗凝血药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中抗凝血药物质控品对应浓度见表1；

表1抗凝血药物质控品对应浓度(单位ng/mL)

QC(L)中包含：4ng/mL DBT、2ng/mL RXB、4ng/mL AXB；

QC(M)中包含：40ng/mL DBT、20ng/mL RXB、40ng/mL AXB；

QC(H)中包含：400ng/mL DBT、200ng/mL RXB、400ng/mL AXB。

在一种更优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：

依次取10μL的50μg/mL DBT-13C6、25μg/mL RXB-d4和50μg/mL AXB-13C,d3的同位素内标母液，加入970μL 80％乙腈水溶液，配制成含有500ng/mL DBT-13C6、250ng/mL RXB-d4和500ng/mL AXB-13C,d3的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL 80％乙腈溶液，混合均匀得混合内标工作液。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。

在一种更优选方案中，校准品溶液按照如下方法制备：

采用梯度稀释法进行校准品(即标曲)的配制，从-20℃冰箱取出混合标准溶液后，涡旋10s，2min内使用混合标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后将混合标准溶液放入-80℃保存。具体配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点；

所述校准品溶液的七个浓度点为：

DBT和AXB的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

RXB的浓度依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的应用也在本发明的保护范围之内。

具体检测方法如下：

超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的方法，

所述抗凝血药物分别为：达比加群(Dabigatran，DBT)、利伐沙班(Rivaroxaban，RXB)、阿哌沙班(Apixaban，AXB)；

上述抗凝血药物对应的同位素内标物分别为：达比加群-13C6(DBT-13C6)、利伐沙班-d4(RXB-d4)、阿哌沙班-13C(AXB-13C,d3)。

血浆加入混合内标工作液及蛋白沉淀剂，离心后进样，先利用超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗凝血药物的含量。

具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：0.004％甲酸-水溶液；

流动相B：0.004％甲酸-甲醇溶液；

色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90:10；流速为0.3mL/min，每个样品采集时间为4.5min，柱温为40℃，进样体积为1μL。

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为0.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物DBT(472.2→289.1)、RXB(436.3→144.8)和AXB(460.3→199.1)以及同位素内标DBT-13C6(478.2→295.1)、RXB-d4(440.3→144.9)和AXB-13C,d3(464.4→447.3)。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A和B中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗凝血药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，4.5min之内完成抗凝血药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.001％～0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.001％-0.01％甲酸甲醇溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.004％甲酸水溶液，流动相B为0.004％甲酸-甲醇溶液。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.001％～0.01％甲酸水溶液和0.001％～0.01％甲酸甲醇作为流动相，色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、分析时间短且前处理过程简单，4.5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用待测的稳定同位素DBT-13C6、RXB-d4和AXB-13C,d3作为内标，和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中抗凝血药物时的重现性、准确度均较好。

在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。

进一步地，柱温为30～50℃，优选为40℃。

更进一步地，进样体积为0.2～10μL，优选为1μL。

在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物时，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：水(含0.001％～0.01％甲酸)；

流动相B：甲醇(含0.001％～0.01％甲酸)；

色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，见表2；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90:10；流速为0.3mL/min，每个样品采集时间为4.5min，柱温为40℃，进样体积为1μL。

表2流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为0.5kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标；各个目标物的去簇电压和碰撞电压等参数见表3。

表3抗凝血药物检测质谱参数

本发明提及的血浆为人或动物的血浆。

在一种方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为甲醇、乙腈或甲醇与乙腈的混合溶液。

优选地，蛋白质沉淀剂使用纯乙腈溶液。

在一种优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈或甲醇与乙腈的体积比1:1～1:3)，在12000～15000r/min，1～15℃离心4～10min后，取60μL上清液。

在一种更优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈，高速振荡(最大振速)5min；14000r/min 4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

在一种方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：

将50μg/mL的DBT-13C6、25μg/mL的RXB-d4和50μg/mL AXB-13C,d3的同位素内标母液以80％乙腈配制成含有500ng/mL DBT-13C6、250ng/mL RXB-d4和500ng/mL AXB-13C,d3的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL 80％乙腈溶液，混合均匀得混合内标工作液。

在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：

将2mg/mL DBT、1mg/mL RXB和1mg/mL AXB标准品母液以80％乙腈配制成含有20000ng/mL DBT、10000ng/mL RXB和20000ng/mL AXB的混合标准溶液。

将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。

所述校准品溶液的七个浓度点为：

DBT和AXB的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

RXB的浓度依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

每个浓度的校准品样本取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合工作内标液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈，高速振荡(最大振速)5min；14000r/min 4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

一、实验材料与仪器

方法学研究实验的样本来自于上海中山医院2019年9月份门诊收集的血浆样本。

(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。

(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm,2.7μm)。

(3)标准品：达比加群、利伐沙班、利伐沙班-d4、阿哌沙班和阿哌沙班-13C,d3均购自于TRC，达比加群-13C6购自于ALSACHIM。

(4)质控品：含有抗凝血药物的血浆基质溶液，分低中高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表1所示。

试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为标准液、质控品和内标工作液；右边放置50mL蛋白沉淀剂。

二、液质条件

(1)色谱条件：流动相A：0.004％甲酸-水溶液；流动相B：0.004％甲酸-甲醇溶液。色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表2。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。

(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为0.5kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标，各目标物的去簇电压和碰撞电压等参数见表3。

三、实验过程

(1)标准品配制

依次取10μL 2mg/mL DBT、10μL 1mg/mL RXB和20μL 1mg/mL AXB的标准品母液，加入960μL 80％乙腈水溶液，配制成含有20000ng/mL DBT、10000ng/mL RXB和20000ng/mLAXB的混合标准溶液。

(2)标曲的配制

将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点；

所述校准品溶液的七个浓度点为：

DBT和AXB的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

RXB的浓度依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

(3)混合内标工作液配制

依次取10μL的50μg/mL DBT-13C6、25μg/mL RXB-d4和50μg/mL AXB-13C,d3的同位素内标母液，加入970μL 80％乙腈水溶液，配制成含有500ng/mL DBT-13C6、250ng/mL RXB-d4和500ng/mL AXB-13C,d3的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL 80％乙腈溶液，混合均匀得混合内标工作液。

(4)质控品的配制

含有抗凝血药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：C(L)为中浓度质控用空白血浆稀释10倍；QC(M)为空白血浆稀释混合标准溶液500倍；QC(H)为空白血浆稀释混合标准溶液50倍。

QC(L)中包含：4ng/mL DBT、2ng/mL RXB、4ng/mL AXB；

QC(M)中包含：40ng/mL DBT、20ng/mL RXB、40ng/mL AXB；

QC(H)中包含：400ng/mL DBT、200ng/mL RXB、400ng/mL AXB。

(5)样品处理

1)校准品前处理：各浓度点分别取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈，高速振荡(最大振速)5min；14000r/min 4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

2)血浆样品前处理：

取50μL血浆样品于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈，高速振荡(最大振速)5min；14000r/min 4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

3)质控品前处理：

分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后跟血浆样品前处理方法一致，此处不再赘述。

分析试剂盒中各组分见表4。

表4抗凝血类药物分析试剂盒组分的制备(100人份)

四、方法验证

1.提取离子流色谱图：抗凝血药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗凝血药物的标准品提取离子流色谱图，图2为血浆中抗凝血药物的提取离子流色谱图。

2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。抗凝血药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.999以上，满足定量要求，见表5。

表5抗凝血药物线性回归方程及线性相关系数

3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。随机选取一例人血浆样品，其中1个不加标准品，其它3个分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果经计算如表5所示。结果显示，抗凝血药物的加标回收率在93.84％-106.42％之间，之间，5次重复试验的RSD在2.57％-8.22％范围，统计结果见表6。

表6抗凝血药物加标回收率结果

4.精密度试验：取无干扰空白血浆样本，加入不同浓度抗凝血药物标准品，得到低、中、高三个浓度血浆样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗凝血药物的浓度，批内精密度为1.65-9.51％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.82-8.02％，结果见表7。

表7批内批间精密度测试结果

本发明提供的利用超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)同时测定人体血浆中3种抗凝血药物的试剂盒，可针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。再者，因为临床样本极其珍贵，因此前处理样本用量尽量要少，且进样量大也会严重污染仪器，增加仪器维护成本。本试剂盒的方法血浆用量少(仅需50μL)，进样量1μL，且前处理简单，蛋白沉淀一步到位，且一针分析多种物质只需4.5min，简单快速。

以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗凝血药物的加标回收率为93.84％-106.42％之间，5次重复试验的RSD为2.57％-8.22％，准确度良好。方法的重现性结果表明，抗凝血药物批内精密度为为1.65-9.51％，批间精密度为2.82-8.02％，方法的重现性良好。

本发明试剂盒的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，4.5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆抗凝血药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。

Claims (10)

1.一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括流动相、校准品溶液、混合内标工作液和质控品；

所述抗凝血药物包括达比加群、利伐沙班和阿哌沙班；

所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液、流动相B为甲酸甲醇溶液；

所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液；

所述混合内标工作液包括浓度已知的由乙腈溶液配制的达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的混合溶液；

所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括蛋白沉淀剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为甲醇或乙腈中的一种或两种的混合液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为乙腈。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.001%-0.01%甲酸水溶液，流动相B为0.001%~0.01%甲酸甲醇溶液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.004%甲酸水溶液，流动相B为0.004%甲酸甲醇溶液。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品溶液包括以下七种浓度配比的混合液：

混合液1：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群2 ng/mL、利伐沙班1ng/mL、阿哌沙班2 ng/mL；

混合液2：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群5 ng/mL、利伐沙班2.5 ng/mL、阿哌沙班5 ng/mL；

混合液3：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群10 ng/mL、利伐沙班5 ng/mL、阿哌沙班10 ng/mL；

混合液4：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群50 ng/mL、利伐沙班25 ng/mL、阿哌沙班50 ng/mL；

混合液5：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群100 ng/mL、利伐沙班50 ng/mL、阿哌沙班100 ng/mL；

混合液6：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群500 ng/mL、利伐沙班250 ng/mL、阿哌沙班500 ng/mL；

混合液7：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群1000 ng/mL、利伐沙班500 ng/mL、阿哌沙班1000 ng/mL。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述混合内标工作液中达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的浓度分别为：达比加群-13C6 50 ng/mL、利伐沙班-d425 ng/mL、阿哌沙班-13C,d3 50 ng/mL。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述质控品包括以下三种浓度配比的混合液：

低浓度质控品：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群4 ng/mL、利伐沙班2 ng/mL、阿哌沙班4 ng/mL；

中浓度质控品：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群40 ng/mL、利伐沙班20 ng/mL、阿哌沙班40 ng/mL；

高浓度质控品：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群400 ng/mL、利伐沙班200 ng/mL、阿哌沙班400 ng/mL。

10.权利要求1所述的试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物中的应用。

Images