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CN111542605A - 核酸的回收方法 - Google Patents

核酸的回收方法 Download PDF

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CN111542605A
CN111542605A CN201880083687.6A CN201880083687A CN111542605A CN 111542605 A CN111542605 A CN 111542605A CN 201880083687 A CN201880083687 A CN 201880083687A CN 111542605 A CN111542605 A CN 111542605A
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CN
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nucleic acid
solution
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anionic surfactant
alumina
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Application number
CN201880083687.6A
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关口翔太
荒井大河
伊藤正照
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Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
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Abstract

本发明的方法是使用表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体从体液试样回收核酸的方法，该方法包括：在离液剂的存在下使载体吸附核酸，对吸附有核酸的载体添加包含阴离子性表面活性剂的溶液的工序。

Description

核酸的回收方法
技术领域
本发明涉及通过表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝载体，从体液试样中高收量地回收核酸的方法和核酸回收用试剂盒。
背景技术
由于使用核酸的实验技术的发展，新的基因探索及其分析成为可能。例如为了特定癌等疾病而分析人的基因组，为了特定病原体的感染而分析它们的基因组等，在医疗现场中也进行利用基因分析的筛选检查、临床检查等。特别是近年，从血液、尿等体液试样回收基因进行检测作为低侵袭的检查受到期待。
作为这样的基因分析的目标，不仅是基因组那样的长链核酸，而且1000碱基以下短链核酸也备受关注。近年来发现的miRNA一般是18碱基～25碱基的单链RNA，由60碱基～90碱基的pre-miRNA生物合成。它们具有调节蛋白质的合成、基因的表达的功能，因此认为与疾病有关系，作为基因分析的靶标而备受关注。另外，近年备受关注无细胞DNA(cfDNA)是具有相当于1单元组蛋白的166碱基的1～4倍程度的长度的双链DNA，在细胞死亡、分解的过程中生成。无细胞DNA中特别是癌细胞来源的被称为血中循环肿瘤DNA(ctDNA)，具有癌特有的基因突变，因此作为判定针对治疗药的效果有无、检查癌的有无的靶标备受关注。
专利文献1中公开了以使用吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝载体为特征的核酸的回收方法，显示根据该方法能够以高收量回收核酸。具体地，如后述的图2所示，在离液剂存在的条件下使载体吸附核酸，对吸附了核酸的载体加入溶出液使核酸溶出而回收。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2016/152763号
发明内容
发明要解决的课题
专利文献1记载的方法能够以高收量回收核酸，但在回收体液中极微量存在的核酸时，要求回收量的进一步提高。例如，上述的癌特有的基因突变大多数情况下在体液中仅以极微量存在。另外，预想体液中尚存在现有方法所不能回收的微量核酸。为了分析这样的核酸，需要以更高收量回收核酸的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们基于专利文献1所公开的核酸的回收方法，研究能够以更高收量回收核酸的方法。本发明者们发现，通过作为在对吸附有核酸的载体添加溶出液之前的工序，增加将吸附有核酸的载体与包含阴离子性表面活性剂的溶液混合的工序，能够进一步提高核酸的回收量，从而完成了本发明。
本发明如下。
(1)核酸的回收方法，是从体液试样回收核酸的方法，包括以下工序：
工序a)，将离液剂、表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体和包含核酸的溶液混合，使载体吸附核酸的工序，
工序b)，从工序a)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序，
工序c)，将工序b)中分离出的载体与包含阴离子性表面活性剂的溶液混合的工序，
工序d)，从工序c)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序，
工序e)，对工序d)中分离出的载体加入溶出液而回收核酸的工序。
(2)根据(1)所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述核酸是微RNA或无细胞DNA。
(3)根据(1)或(2)所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述体液试样是全血、血清、血浆、尿或唾液。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的核酸的回收方法，所述阴离子性表面活性剂是羧酸型、磺酸型或硫酸酯型。
(5)根据(4)所述的核酸的回收方法，所述羧酸型的阴离子性表面活性剂是辛酸盐、壬酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、N-癸酰肌氨酸盐或N-月桂酰肌氨酸盐。
(6)根据(4)所述的核酸的回收方法，所述磺酸型的阴离子性表面活性剂是辛基苯磺酸盐或十二烷基苯磺酸盐。
(7)根据(4)所述的核酸的回收方法，所述硫酸酯型的阴离子性表面活性剂是辛基硫酸盐、癸基硫酸盐或十二烷基硫酸盐。
(8)根据(1)～(7)的任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述水溶性的中性聚合物是在pH7的溶液中具有-10mV～+10mV的ζ电位的聚合物。
(9)根据(8)所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述聚合物是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-噁唑啉)或羟丙基甲基纤维素。
(10)根据(1)～(9)的任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述溶出液是缓冲液。
(11)核酸回收用试剂盒，其特征在于，具备表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体、包含离液剂的溶液和包含阴离子性表面活性剂的溶液。
发明的效果
根据本发明，能够以比现有方法更高的收率回收核酸，因此期待能够实现体液中极微量存在的核酸的回收、新的核酸的回收。
附图说明
图1显示本发明的核酸的回收方法的各工序的概要。
图2显示专利文献1中记载的核酸的回收方法的一例。
具体实施方式
本发明是核酸的回收方法，是从体液试样回收核酸的方法，包括以下工序：
工序a)，将离液剂、表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体和包含核酸的溶液混合，使载体吸附核酸的工序，
工序b)，从工序a)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序，
工序c)，将工序b)中分离出的载体与包含阴离子性表面活性剂的溶液混合的工序，
工序d)，从工序c)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序，
工序e)，对工序d)中分离出的载体加入溶出液而回收核酸的工序。
本说明书中有时将表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体记载为本发明的载体。
专利文献1记载的核酸的回收方法如图2所示，是以以下工序a)、工序b)和工序e)作为基本工序的方法。
工序a)，将离液剂、表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体和包含核酸的溶液混合，使载体吸附核酸的工序，
工序b)，从工序a)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序，
工序e)，对工序b)中分离出的载体加入溶出液而回收核酸的工序。
本发明者们发现，如图1所示，通过作为工序e)的对吸附有核酸的载体加入溶出液的工序的前工序，增加将吸附有核酸的载体与阴离子性表面活性剂混合的工序c)，从而核酸的回收量进一步提高。以下，对于本发明每个工序进行说明。
工序a)是将离液剂、本发明的载体和包含核酸的溶液，使本发明的载体吸附核酸的工序。工序a)中，在离液剂的存在下，将载体与包含核酸的溶液混合，使本发明的载体吸附核酸。
离液剂、本发明的载体和包含核酸的溶液的混合方法不特别限定，可以通过例如吸移、颠倒混合来进行，可以使用混合器、涡旋混合器等装置。混合时间不特别限定，只要为5分钟左右即可，可以混合5分钟以上的时间。此外，离液剂、本发明的载体和包含核酸的溶液的混合顺序不特别限定。例如，可以将本发明的载体填充至柱，使离液剂和包含核酸的溶液通过。
本发明中使用的离液剂(chaotropic agent)是产生离液离子的物质的总称，是具有使蛋白质等的分子结构不稳定化的性质的化学物质。离液离子也被称为离散剂(chaotrope)。作为离液剂的具体例，可列举例如，胍盐、异氰酸钠、碘化钠、碘化钾、脲、溴化钠、溴化钾、溴化钙、溴化铵、高氯酸钠、硫氰酸钠、硫氰酸钾、异硫氰酸铵、氯化钠、氯化钾、氯化铵等。其中，优选胍盐或脲。作为胍盐，可列举盐酸胍、胍硫氰酸盐(硫氰酸胍)、胍硫酸盐、异硫氰酸胍，其中，优选盐酸胍或胍硫氰酸盐。这些盐可以单独使用或多种组合使用。
在离液剂、本发明的载体和包含核酸的溶液的混合液中，离液剂的浓度可以为0.5M～8M，优选为1M～8M，更优选为2M～8M，最优选为4M～7M。
工序b)是从工序a)中混合而得的混合物中分离吸附有上述核酸的载体的工序。作为分离的方法，可列举将由工序a)获得的混合物离心分离，使吸附有核酸的载体沉淀，除去上清液的方法。由于吸附有核酸的载体的比重比水重，因此可以通过离心操作而使其容易地沉淀。离心分离的条件只要以6000G处理1分钟即可，更优选以10000G处理1分钟。作为其它分离方法，可列举使用超滤膜、筛网的方法。使由工序a)获得的混合物通过具有比吸附有核酸的载体的粒径小的孔径的超滤膜、筛网，将吸附有核酸的载体进行分离。这样的超滤膜已经试剂盒化，可以获得以メルク株式会社的ウルトラフリー(注册商标)、PallCorporation的ナノセップ(注册商标)为代表的离心过滤试剂盒来利用。
此外，可以在工序b)的操作之后，根据需要进行以下那样的洗涤处理。这是因为在工序a)之后，有可能目标核酸以外的体液试样来源物吸附于本发明的载体的表面。例如，为了更高纯度地分离核酸，可以进行洗涤、分解的处理。具体而言，可以进行下述各种处理：为了除去非特异性地吸附的化合物而用水进行洗涤；为了除去非特异性地吸附的蛋白质而用表面活性剂进行洗涤；为了除去离子、低分子化合物而用包含非离子性的表面活性剂的溶液进行洗涤；为了除去非特异性地吸附的疏水性化合物而用有机溶剂进行洗涤；为了分解非特异性地吸附的蛋白质而添加蛋白质分解酶；为了仅分离DNA而添加RNA分解酶；以及为了仅分离RNA而添加DNA分解酶；等。本洗涤处理在图1中作为洗涤工序1显示。
工序c)是将工序b)中分离出的载体与包含阴离子性表面活性剂的溶液混合的工序。
本发明中使用的阴离子性表面活性剂是显示表面活性的原子团形成阴离子的表面活性剂的总称，也称为阴离子性表面活性剂。阴离子与作为其反荷离子的阳离子一起形成盐。例如，优选可以使用锂盐、钠盐、钾盐、铵盐、胺盐、羟基铵盐(氨基醇盐)。
阴离子性表面活性剂可以根据离子性官能基的种类进行分类，分类成羧酸型、磺酸型、硫酸酯型、磷酸酯型等。本发明中优选羧酸型、磺酸型、硫酸酯型的阴离子性表面活性剂。
羧酸型的阴离子性表面活性剂的具体例可列举辛酸盐、壬酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、肉豆蔻酸盐、十五烷酸、棕榈酸盐、棕榈油酸盐、十七烷酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、反型异油酸盐、亚油酸盐、亚麻酸盐、桐油酸盐、花生酸盐、山萮酸盐、木蜡酸盐、胆酸盐、N-癸酰肌氨酸盐、N-月桂酰肌氨酸盐等，其中优选辛酸盐、壬酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、N-癸酰肌氨酸盐或N-月桂酰肌氨酸盐。作为这些羧酸盐的优选具体例，可列举辛酸钠、壬酸钠、癸酸钠、月桂酸钠、N-癸酰肌氨酸钠和N-月桂酰肌氨酸钠。
磺酸型的阴离子性表面活性剂的具体例可列举1-壬烷磺酸盐、1-癸烷磺酸盐、1-十二烷磺酸盐、1-十八烷磺酸盐、1-十一烷磺酸盐、异丙苯磺酸钠盐、辛基苯磺酸盐、十二烷基苯磺酸盐、1-十四烷磺酸盐、1-十五烷磺酸盐、萘磺酸盐、丁基萘磺酸盐、1-十六烷磺酸盐、磺基琥珀酸二(2-乙基己基)酯盐、5-磺基间苯二甲酸二甲基酯盐等，其中优选辛基苯磺酸盐、十二烷基苯磺酸盐。作为这些磺酸盐的优选具体例，可列举辛基苯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠。十二烷基苯磺酸有硬型、软型、混合型等种类，任一种均可以优选使用。
硫酸酯型的阴离子性表面活性剂的具体例可列举辛基硫酸盐、癸基硫酸盐、十二烷基硫酸盐、十四烷基硫酸盐、十六烷基硫酸盐等，其中优选辛基硫酸盐、癸基硫酸盐、十二烷基硫酸盐。作为这些硫酸酯盐的优选具体例，可列举辛基硫酸钠、癸基硫酸钠、十二烷基硫酸钠。
另外，本发明中使用的阴离子性表面活性剂也可以在上述化合物的烷基侧链包含醚键。
上述列举的表面活性剂可以仅使用1种，也可以混合使用多种。
阴离子性表面活性剂相对于工序c)的混合液作为终浓度优选为0.01重量％～2重量％，更优选为0.05重量％～2重量％，进一步优选为0.075重量％～2重量％，特别优选为0.075重量％～1.5重量％。阴离子性表面活性剂的浓度可以通过添加到水、缓冲液中来调整。
包含阴离子性表面活性剂的溶液可以使用溶解有阴离子性的表面活性剂的溶液。溶剂中可以使用水、中性至碱性的水溶液、缓冲液。另外，可以通过将阴离子性表面活性剂的游离体中和而形成盐，来制备包含阴离子性表面活性剂的溶液。例如，可以使十二烷基硫酸溶解在氢氧化钠水溶液、包含钠的缓冲液中，来制备包含十二烷基硫酸钠的溶液。
阴离子性表面活性剂与载体的接触可以在任意时机进行。可以在制备包含阴离子性表面活性剂的溶液之后添加载体进行混合，也可以在添加了载体的状态下制备包含阴离子性表面活性剂的溶液。
载体与包含阴离子性表面活性剂的溶液的混合方法具体地，可以将载体浸泡在包含阴离子性表面活性剂的溶液中。浸泡后，可以静置，也可以搅拌。搅拌可以通过例如吸移、颠倒搅拌来进行，可以使用混合器、涡旋混合器等装置。混合时间不特别限定，只要为1分钟左右即可，也可以混合1分钟以上的时间。另外，也可以将本发明的载体填充于柱，使包含核酸的溶液通过。
工序d)是从工序c)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序。分离的方法可以通过与工序b)同样的条件、方法进行。
进而，在工序d)的操作之后，可以根据需要通过与上述洗涤工序1同样的方法进行洗涤处理。这是因为，如果工序c)时使用的阴离子性表面活性剂残存在体系中，则可能影响之后测定回收的核酸的测定系统。本洗涤处理在图1中作为洗涤工序2显示。
工序e)是对工序d)中分离出的吸附有所述核酸的本发明的载体加入溶出液而回收核酸的工序。
在加入上述溶出液而回收核酸时，在要将本发明的载体与使核酸溶出的溶液进行分离的情况下，可以通过与工序b)同样的条件、方法来进行。
对吸附有核酸的载体与溶出液的混合方法不特别限定，可以通过例如吸移、颠倒混合来进行，可以使用混合器、涡旋混合器等装置。混合时间不特别限定，只要为5分钟左右即可，可以混合5分钟以上的时间。
回收的核酸可以根据需要进行化学修饰。化学修饰中可列举对核酸的末端的荧光色素修饰、消光剂修饰、生物素修饰、氨基化、羧基化、马来酰亚胺化、琥珀酰亚胺化、磷酸化和去磷酸化等，此外可列举利用嵌入剂进行的染色。这些修饰可以通过化学反应被导入，可以通过酶反应被导入。可以在上述定量之前导入这些修饰基团，不将回收的核酸本身进行定量，而将经过化学修饰而导入的修饰基团进行定量，从而间接地定量核酸。由于通过本发明核酸被回收，特别是短链核酸高收率地被回收，因此在上述定量时能够高灵敏度地定量。
本发明的载体通过使氧化铝的表面吸附水溶性的中性聚合物来制作。由聚合物带来的表面的被覆率优选为7％以上、更优选为10％以上、进一步优选为20％以上、特别优选为30％以上、最优选为40％以上。另外，水溶性的中性聚合物也可以不以均匀的厚度吸附。
本发明的载体中的、由聚合物带来的氧化铝的被覆率可以通过分析利用表面电位显微镜(别名开尔文探针显微镜，Kelvin probe Force Microscopy；KFM)获得的电位分布图而计算出。表面电位显微镜可以利用例如，Bruker AXS社的Digital Instruments制的NanoScope Iva AFM Dimension 3100阶段AFM系统等。
由表面电位显微镜计算表面被覆率时，测定的视野尺度在0.5μm×1μm的范围进行。表面被覆率的计算方法是首先获得氧化铝的表面电位图像，求出视野内的平均电位。接着获得水溶性的中性聚合物的表面电位图像，求出视野内的平均电位。然后，获得吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的表面电位图像，求出视野内的平均电位。将仅氧化铝的被覆率作为0％、仅水溶性的中性聚合物的被覆率作为100％，取吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的平均电位与水溶性的中性聚合物的平均电位的比，从而计算出吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的表面被覆率。在求出表面被覆率时，使用的视野内的平均电位是随机选择本发明的载体粒子3个，使用各自的测定值的平均值。
另外，本发明中，作为计算表面被覆率时的图像分析软件，可以使用Adobe社的Photoshop。这种情况下，在图像分析时，将氧化铝的表面电位的平均值作为标尺下端、将水溶性的中性聚合物的表面电位的平均值作为标尺上端，将下端色设定为黑(8bit、RGB值0)、上端色设定为红(R值255)或绿(G值255)或蓝(B值255)等。用设定的标尺显示吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的表面电位图像，将R值、G值或B值的任一项的值除以255，将其比作为表面被覆率。
作为使表面吸附水溶性的中性聚合物的前阶段，可以预先将氧化铝用水、乙醇等溶液洗涤，预先除去吸附于表面的杂质，也可以省略本洗涤操作。
使氧化铝的表面吸附水溶性的中性聚合物的方法可列举例如，溶解水溶性的中性聚合物而制备水溶性的中性聚合物溶液，使其与氧化铝接触的方法。具体地，可以在水溶性的中性聚合物溶液中浸泡氧化铝，将水溶性的中性聚合物溶液滴加到氧化铝，将水溶性的中性聚合物溶液涂布到氧化铝，将水溶性的中性聚合物溶液制成雾状而喷涂到氧化铝。
对在水溶性的中性聚合物溶液中浸泡氧化铝的方法不特别限定。例如，可以通过吹打、颠倒混合、利用搅拌机、混合器、涡流混合器、碾磨机等分散机、超声波处理装置等进行搅拌。
对水溶性的中性聚合物浓度不特别限定，优选为0.01wt％以上，更优选为0.1wt％以上。
搅拌时的混合时间只要能够将水溶性的中性聚合物与氧化铝均匀混合就不特别限定混合时间，在涡流混合器的情况下优选搅拌1分钟以上、优选为5分钟以上。
另外，也可以使用筛、笊篱等在氧化铝上浸涂水溶性的中性聚合物。浸泡于溶液时的混合时间在0.1wt％以上的聚合物浓度下可以为5分钟以上，优选为30分钟以上。
在滴加水溶性的中性聚合物溶液的情况下，可以使用吸管、滴液漏斗等。滴加聚合物溶液时，也可以振动、旋转氧化铝，也可以使用旋涂器等。
在涂布聚合物溶液的情况下，可以使用刷毛、辊、棒涂器。
在将聚合物溶液制成雾状而喷涂的情况下，可以使用空气喷雾器、气刷等。
通过上述例示的方法使氧化铝吸附水溶性的中性聚合物后，可以进行离心分离操作除去成为上清的聚合物溶液，也可以不进行离心分离操作而直接用于核酸的回收。另外，在溶剂中溶解聚合物溶液的情况下，使氧化铝吸附水溶性的中性聚合物、除去溶剂后，可以干燥，也可以不干燥而用于核酸的回收。
本发明的载体可以使用事先制作保存的，也可以用时制备而使用。
水溶性的中性聚合物溶液在获得的水溶性的中性聚合物是固体的情况下，可以通过溶解在水、有机溶剂中来制备，在获得的聚合物是溶液的情况可以通过稀释来制备。在聚合物难以溶解的情况、溶液的粘度高难以混合的情况下，可以进行加热处理、超声波处理。有机溶剂优选使用例如，乙醇、乙腈、甲醇、丙醇、叔丁醇、DMF、DMSO、丙酮、乙二醇、甘油等具有与水的双溶性的溶剂。另外，在不易溶于水的情况下，也可以添加上述的有机溶剂。
使氧化铝与水溶性的中性聚合物通过接头分子等共价结合而制作的载体不属于本发明的载体。具体的接头分子可列举硅烷偶联剂等。在利用这样的硅烷偶联剂的官能化之后，形成酰胺键、酯键、硫醇与马来酰亚胺的迈克尔加成反应物、二硫键、三唑环等，从而将聚合物等固定化而制作的载体也相当于本发明的载体。
本发明的核酸回收用试剂盒可以用于从体液试样有效地回收核酸。本发明的核酸回收用试剂盒作为其构成成分，包含表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体、包含离液剂的溶液、包含阴离子性表面活性剂的溶液，也可以进一步包含缓冲液。另外，试剂盒除此以外还可以包含试剂盒的规格文件、说明书等。
本发明的核酸回收用试剂盒所包含的、表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体可以是干燥的状态，也可以是浸泡在水溶性的中性聚合物的溶液中的状态。
本发明的核酸回收用试剂盒所包含的缓冲液可以利用在上述工序e)的溶出液中可以使用的缓冲液。
本发明中使用的体液试样可以使用包含核酸的任意体液试样。核酸可列举例如，RNA、DNA、RNA/DNA(嵌合)和人工核酸等。DNA可列举cDNA、微DNA(miDNA)、基因组DNA、和合成DNA、无细胞DNA(cfDNA)、ctDNA、线粒体DNA(mtDNA)等。另外，RNA可列举总RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、snRNA或非编码RNA、它们的前体或合成RNA等。合成DNA和合成RNA可以基于规定的碱基序列(可以是天然型序列或非天然型序列的任一种)，使用例如自动核酸合成仪人工地制作。
作为体液试样，可以利用例如血液、尿、唾液、粘膜、汗、痰、精液等体液等。上述体液试样优选为血液、尿、唾液。血液包括全血、血浆、血清、血细胞等。
这些体液试样可以在采集之后直接应用于本发明，也可以在采集之后加入溶液进行稀释。在体液试样中沉淀物、悬浮物较多的情况下，可以通过离心操作使它们成团，仅使用上清。另外，也可以使其通过过滤器等之后使用。该上清、通过后的体液试样也可以用水、缓冲液稀释之后用于本发明。
体液试样可以根据需要进行以下那样的处理。这是因为一般在包括体液的生物学试样中，大多数情况下核酸内包于细胞膜、细胞壁、小泡、脂质体、微团(micelle)、核糖体、组蛋白、核膜、线粒体、病毒的壳体、包膜(envelope)、核内体或外来体等中，或它们之间发生相互作用。为了更高收率地回收核酸，可以进行以使核酸从它们之中游离出来为目的的处理。
具体而言，为了提高核酸从包含大肠杆菌的体液试样的回收效率，可以进行以下那样的处理。例如，可以对包含大肠杆菌的体液试样添加0.2M的氢氧化钠和1％的SDS的混合液(碱变性法)，此外，还可以添加10％的十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)溶液(利用十二烷基肌氨酸钠进行的非变性法)。此外，可以向这些溶液中添加溶菌酶。此外，还可以利用蛋白酶K在37℃进行1小时处理。作为其它方法，还可以进行超声波处理。
为了提高核酸从包含酵母的体液试样的回收效率，可以进行以下那样的处理。例如，还可以用由生化学工业株式会社市售的Zymolyase(酵母裂解酶)进行处理之后添加10％的SDS。
为了提高核酸从包含细胞的体液试样的回收效率，可以进行以下那样的处理。例如，可以添加1％的SDS、TritonX。作为其它方法，可以例如以各终浓度为4M以上添加盐酸胍、硫氰酸胍和脲等。也可以对该溶液添加十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)使其为0.5％以上。此外，也可以添加巯基乙醇使其为50mM以上的浓度。
上述的操作中，为了抑制体液试样所含的核酸的分解，也可以添加核酸的分解酶的抑制剂。作为DNA分解酶的抑制剂，可以以1mM以下的浓度添加EDTA。另外，作为RNA分解酶的抑制剂可以使用市售的RNasin Plus Ribonuclease Inhibitor(プロメガ株式会社)、Ribonuclease Inhibitor(タカラバイオ株式会社)、RNase inhibitor(东洋纺株式会社)等。
在体液试样中混合存在有DNA和RNA的情况下，也可以通过苯酚/氯仿提取进行分离。例如，如果在酸性条件下进行苯酚/氯仿提取，则RNA被分离至水层，DNA被分离至氯仿层，如果在中性条件下进行苯酚/氯仿提取，则RNA和DNA被分配于水相。可以利用该性质，根据要取得的核酸的种类来选择条件。上述氯仿还可以置换成对溴茴香醚。
苯酚/氯仿提取还可以利用作为市售试剂的ISOGEN(注册商标：株式会社ニッポンジーン)、TRIzol(注册商标：ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、RNAiso(タカラバイオ株式会社)、3D-Gene(注册商标)RNA extraction reagent from liquid sample kit(东丽株式会社)。以上的处理可以仅进行其一个工序，还可以与其它操作中的工序进行组合。此外，它们所使用的溶液的浓度还可以根据需要进行改变。
在本发明中，作为包含核酸的溶液，可以使用体液试样、其稀释液。另外，也可以使用溶解有核酸、人工核酸、实施了色素、磷酸基等修饰的核酸的溶液与体液试样混合而成的溶液。对液体试样，可以直接使用进行了上述任一处理之后得到的溶液，也可以根据需要进行稀释。对稀释的溶液不特别限定，优选使用水、HEPES缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等在包含核酸的溶液中通用的溶液。
在本发明中，对回收的核酸的长度不特别限定，优选为1000碱基对以下。此外，在本发明中，现有技术难以回收的无细胞DNA、ctDNA等300碱基对以下的核酸也能够以高收率回收，100碱基对以下的pre-miRNA、miRNA也能够以高收率回收。
核酸的回收量可以如下测定。例如，可列举吸光度测定、荧光测定、发光测定、电泳、PCR、RT-PCR、使用了微阵列的分析、使用了测序仪的分析等。如果是非修饰的核酸，则可以通过测定260nm时的吸光度来定量核酸量。此外，如果是被荧光色素修饰了的核酸，则可以通过将来自该荧光色素的荧光强度与浓度已知的溶液的荧光强度进行比较来定量核酸量。此外，可以通过电泳来进行。利用电泳进行的回收率的计算方法可以通过使进行了回收操作的样品与浓度已知的样品同时泳动，将凝胶染色，通过图像分析来比较谱带的浓度从而确定。
在核酸量为极微量而难以定量的情况下，可以使用DNA芯片、实时PCR等核酸的检测方法，将检测值进行比较，从而比较核酸的收量。例如，在DNA芯片这样的检测反应中，只要是以荧光测定、发光测定为原理的测定系统，则其信号值高的可以判断为高收量。例如，如果是DNA芯片，则可以使用扫描仪获得荧光图像，通过将每个基因的荧光信号强度数值化来比较收量。如果是miRNA、mRNA这样的表达量的全面分析，则可以比较每个基因的荧光信号强度，在比较不同的方法时其信号值高的可以判断为高收量。另外，在分析多种基因的情况下，取每个基因的荧光信号的总和(荧光信号总和值)，在比较不同的方法时其信号值高的可以判断为高收量。在实时PCR中，以横轴为循环数、纵轴为荧光强度作图而得到扩增曲线。在该扩增曲线中分别求出达到一定的信号强度时的循环数(Cq值、Ct值)。此时，Ct值、Cq值小的可以判断为高收量。如果是cfDNA、基因组DNA，则设计针对测定对象的基因的引物，以同一引物比较不同的回收方法时Ct值、Cq值小的可以判断为高收量。在为miRNA、mRNA这样的RNA的情况下，除了增加逆转录的工序以外，可以与DNA同样地进行测定、检测，此时Ct值、Cq值小的可以判断为高收量。
本发明中聚合物是作为基本单位的被称为单体、monomer的重复单元多个连接而成的化合物的总称。本发明的载体中使用的聚合物包含由1种单体构成的均聚物和由2种以上的单体构成的共聚物的任一种，也包含任意聚合度的聚合物。另外，也包含天然聚合物和合成聚合物的任一种。
本发明的载体中使用的水溶性的中性聚合物具有对水可溶的性质，是相对于水的溶解度为至少0.0001wt％以上、优选为0.001wt％以上、更优选为0.01wt％以上、进一步优选为0.1wt％以上的聚合物。
本发明的载体中使用的水溶性的中性聚合物优选为在pH7的溶液中ζ电位为-10mV～+10mV的聚合物。更优选为-8mV～+8mV，进一步优选为-6mV～+6mV，特别优选为-4.0mV～+1.1mV的聚合物。
ζ电位是表示溶液中的胶体的界面的电性质的值之一。如果带电的胶体分散在溶液中，则在胶体的表面由相对于胶体的表面带电的对离子形成电双层。将此时的胶体表面的电位称为表面电位。电双层通过胶体的表面电荷的静电相互作用而形成，因而越向胶体侧离子越强地被固定。电双层中将通过静电相互作用而对离子被强地固定在胶体表面的层称为固定层，将固定层的电位称为固定电位。如果相对于溶液移动胶体，则固定层与胶体一起移动。此时，由胶体来观察，在固定层的外侧存在溶液由于所具有的粘性而与胶体一起移动的界面。将此称为滑动面(すべり面)或挪动面(ずり面)。以从胶体充分离开的位置的电位作为零点时的该滑动面的电位被定义为ζ电位。这样，ζ电位依赖于胶体的表面电荷而变化，表面电荷根据依赖于pH的质子的吸附脱附而变化，因此本发明中以pH7的溶液中的值作为基准。另外，一般与胶体的尺寸相比到滑动面的距离较小，所以可以将胶体的表面近似地表达为滑动面。本发明中使用的水溶性的中性聚合物的情况也同样，可以将分散在溶液中的胶体的表面电位看作ζ电位。
ζ电位可以利用电泳、电渗、逆流电位、沉淀电位等界面动电现象来求出，可以通过显微镜电泳法、基于旋转衍射光栅法的电泳法、激光-多普勒电泳法、超声波振动电位法、动电音响法(动電音響法)等方法来测定。这些测定可以通过使用ζ电位测定装置来进行。ζ电位测定装置由大塚电子株式会社、Malvern Instruments Ltd.、Ranku Brother Ltd.、PenKem Inc.等市售。
使用上述任一装置都可以测定ζ电位，但通常为激光-多普勒电泳法。激光多普勒电泳法是利用光、声波如果照射到通过电泳而运动的物体时散射或反射，则其频率数变化的多普勒效果的测定方法。
在测定聚合物的ζ电位时，可以作为胶体分散溶液调制聚合物溶液，测定ζ电位。使聚合物溶解在例如磷酸缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸缓冲液等电解质中而制备聚合物溶液，检测分散在溶液中的聚合物的散射光、反射光而进行测定。胶体的尺寸越大，则能够在越低的浓度检测散射光、反射光。
对用激光多普勒法测定聚合物的ζ电位的具体条件不特别限定，例如，可以使聚合物的浓度为1wt％～10wt％而溶解在磷酸缓冲液(10mM，pH7)中，将该溶液装入测定用池，放置在以激光多普勒电泳法为原理的ζ电位测定装置中，在室温进行测定。ζ电位测定装置例如，可以利用大塚电子株式会社的ELS-Z等。
作为本发明的载体中使用的水溶性的中性聚合物，具体可列举以下物质。例如，可以使用聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮等聚乙烯基系聚合物、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或聚(N-(羟基甲基)丙烯酰胺等聚丙烯酰胺系聚合物、聚乙二醇、聚乙二醇或聚四亚甲基醚二醇等聚亚烷基二醇系的聚合物、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、(羟基丙基)甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、2-羟基乙基纤维素或羟基丙基纤维素等纤维素等。另外，也可以使用包含上述的聚合物的共聚物。
另外，本发明的载体中使用的水溶性的中性聚合物也包含FICOLL、琼脂糖、几丁质、右旋糖酐等多糖、这些多糖的类似物、白蛋白等蛋白质、肽。
可以使水溶性的中性聚合物的官能基的一部分离子化，或替换成显示阳性、阴性的官能基，或在侧链导入乙酰基等表现水溶性的官能基。
作为水溶性的中性聚合物的分子量，例如，优选使用0.4kD以上的聚合物，更优选为6kD以上。
本发明的载体中使用的氧化铝是用Al2O3的组成式表示两性氧化物，也称为氧化铝(alumina)。
氧化铝可以使用天然产出的，也可以使用工业制作的。作为制作氧化铝的方法，可列举例如，以三水铝石作为出发原料的拜耳法(Bayer process)、经由软水铝石形态的氢氧化物的醇盐法(也称为溶胶-凝胶法)·中和法·油滴法、铝盐热分解法、阳极氧化法等。
工业制作的氧化铝可以从试剂制造商、催化剂化学制造商、一般社团法人触媒学会的参照触媒部会等获得。
氧化铝根据它们所具有的结晶结构而分类为α-氧化铝、ρ-氧化铝、χ-氧化铝、κ-氧化铝、η-氧化铝、γ-氧化铝、δ-氧化铝、θ-氧化铝等。本发明中优选使用具有高比表面积的γ-氧化铝。
氧化铝根据制作时的烧成温度，酸点(Al+、Al-OH2 +)和碱点(Al-O-)变化。氧化铝根据该酸点和碱点数进行分类，酸点多则分类为酸性氧化铝，碱点多则分类为碱性氧化铝，酸点与碱点为同程度则分类为中性氧化铝。该特性的差异可以通过添加作为pH指示剂的BTB溶液来确认。如果加入BTB溶液氧化铝呈黄色，则可以确认为酸性氧化铝，呈绿色为中性氧化铝，呈蓝色为碱性氧化铝。虽然有这样的特性上的差异，但本发明中可以使用任一氧化铝。
氧化铝可以为粒状。粒径可以均匀，也可以将不同粒径混合利用。可以优选使用粒径例如小于212μm的氧化铝，更优选使用粒径小于100μm的氧化铝。
粒径在本发明中用基于日本工业规格中规定的JIS Z-8801-1：2006的筛孔大小的尺寸定义。例如，制成基于上述JIS标准的孔大小，通过40μm的筛、不能通过32μm的筛的粒子粒径为32μm以上且小于40μm。
工序e)中使用的溶出液只要能够溶出吸附于本发明的载体的核酸就不特别限定，优选为缓冲液，缓冲液中可以包含螯合剂。具体可列举，包含柠檬酸和柠檬酸钠的柠檬酸缓冲液、包含磷酸和磷酸钠的磷酸缓冲液、在包含三羟基氨基甲烷和盐酸的Tris-盐酸缓冲液中添加了EDTA的Tris-EDTA缓冲液等。
缓冲液的pH优选为pH4～pH9，更优选为pH5～pH8。
工序e)中使用的溶出液可以使用水、缓冲液，优选为缓冲液。
缓冲液可以优选使用包含磷酸和磷酸钠的磷酸缓冲液、包含柠檬酸和柠檬酸钠的柠檬酸缓冲液、在包含三羟基氨基甲烷和盐酸的Tris-盐酸缓冲液中添加有EDTA的Tris-EDTA缓冲液等。其中，包含柠檬酸和柠檬酸钠的柠檬酸缓冲液、在包含三羟基氨基甲烷和盐酸的Tris-盐酸缓冲液中添加有EDTA的Tris-EDTA缓冲液由于是具有螯合作用的缓冲液，因而特别优选。缓冲液的pH优选为pH4～pH9，更优选为pH5～pH8。
缓冲液中可以添加螯合剂，从而对缓冲液赋予螯合作用。螯合剂是可以使用具备具有多个配位位置的配位子，与金属离子结合而形成配合物的物质的物质，包含螯合剂的缓冲液具有螯合作用。
作为添加到缓冲液中的具体的螯合剂，可列举乙二胺四乙酸(EDTA)、氮川三乙酸(NTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、磷酸、多磷酸、三磷酸、偏磷酸、植酸和/或和它们的盐等。螯合剂的终浓度优选为50mM以上，更优选为100mM以上，进一步优选为500mM以上。
另外，作为上述以外的成为螯合剂的化合物，可列举阴离子性的聚合物。侧链具有羧酸的聚合物配位金属离子，因而它们可以包含在缓冲液中。作为具有这样的功能的聚合物，可列举聚乙烯基磺酸和/或它们的盐。对其终浓度不特别限定，可以为1wt％以上，优选为10wt％以上。
上述螯合剂可以使用其1种，也可以混合使用。本发明中，优选使用磷酸―多磷酸混合液、磷酸―三磷酸混合液、磷酸―偏磷酸混合液、磷酸―植酸混合液。
实施例
通过以下的实施例更具体地说明本发明。
＜材料与方法＞
聚乙二醇从メルク株式会社获得，γ-氧化铝(N613N)从日挥触媒化成株式会社获得，十二烷基硫酸钠(SDS)作为10％水溶液从インビトロジェン株式会社获得，十二烷基苯磺酸钠、月桂酸钠、N-月桂酰肌氨酸钠从东京化成株式会社获得。
关于其他试剂，从和光纯药株式会社、东京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社购买，不特别纯化而直接使用。
混合器使用东京理化器械株式会社的CUTE MIXER CM-1000，离心机使用日立的CT15RE。
人血清和人血浆从获得了知情同意的健常者使用ベノジェクトII真空采血管VP-AS109K60(テルモ株式会社制)采集。
本发明的载体如下制备，用于以后的实施例和比较例。在1.5ml管中量取各0.5mg氧化铝。在其中作为聚合物水溶液，加入10wt％的浓度的作为水溶性的中性聚合物的聚乙二醇(PEG，10kD)50μl，用混合器搅拌10分钟。用离心机离心(10000G，1分钟)并除去上清45μl，得到表面吸附有作为水溶性的中性聚合物的聚乙二醇的氧化铝的载体。
＜实施例1、2＞
作为阴离子性表面活性剂，使用十二烷基硫酸钠(SDS)进行核酸的回收。以下，逐个工序地说明实验方法。
工序a)
作为离液剂使用7M胍硫氰酸盐(GTN)。作为包含核酸的溶液使用人血清。将7MGTN、25mM HEPES(pH7)溶液450μl、人血清100μl、上述制备的氧化铝的载体混合，用混合器搅拌15分钟。
工序b)
将工序a)中混合而得的溶液离心(10000G，1分钟)并除去上清，分离出该吸附有核酸的载体。
洗涤工序1
对工序b)所得的吸附有核酸的载体加入25mM HEPES水溶液(pH7)(实施例1)或0.05％Tween20水溶液(实施例2)400μl，进行涡旋。将溶液离心(10000G，1分钟)并除去上清，分离载体。
工序c)
对分离出的载体作为包含阴离子性表面活性剂的溶液，加入0.5％SDS、25mMHEPES(pH7)400μl，进行涡旋。
工序d)
将工序c)中混合而得的溶液离心(10000G，1分钟)并弃上清，分离出该吸附有核酸的载体。
洗涤工序2
对工序d)所得的吸附有核酸的载体加入25mM HEPES水溶液(pH7)(实施例1)或0.05％Tween20水溶液(实施例2)400μl，进行涡旋。将溶液离心(10000G，1分钟)并除去上清，分离出载体。
工序e)
对分离出的载体作为溶出液加入10μl的125mM磷酸-125mM多磷酸缓冲液(pH7)，用混合器搅拌15分钟。接着，将搅拌后的溶液离心(10000G，1分钟)，将上清作为核酸溶液回收。
核酸的回收量(荧光信号总和值)的测定
对经过上述工序从血清回收的核酸，使用3D-Gene(注册商标)miRNA Labelingkit(东丽株式会社)按照该公司制定的方案将miRNA进行荧光标记。作为寡聚DNA芯片，使用搭载了具有与在miRBase release 21中注册的miRNA中的2565种miRNA互补的序列的探针的3D-Gene(注册商标)Human miRNA Oligo chip(东丽株式会社)，基于该公司制定的方在严格条件下进行杂交和杂交后的洗涤。使用3D-Gene(注册商标)扫描仪(东丽株式会社)扫描DNA芯片，获得图像并利用3D-Gene(注册商标)Extraction(东丽株式会社)将各个miRNA量的荧光信号强度数值化。将数值化而得的各个荧光信号强度除以空白值，将该值作为S/N值。对于S/N值为1.5以上的荧光信号强度取总和(荧光信号总和值)。将实施例1、2的结果示于表1。
＜实施例3＞
通过从实施例1的回收工序中除去洗涤工序1后的工序进行核酸的回收。其他条件·操作与实施例1同样地进行，使用DNA芯片取得血液中的miRNA荧光强度的总和。结果示于表1。
由这些结果可知，即使在通过除去了洗涤工序1后的工序回收核酸的情况下，也能够与实施例1相同程度地回收核酸。
＜比较例1、2＞
本比较例1、2中，除了去除工序c)和工序d)以外，通过与实施例1、2同样的条件和操作回收核酸。即，本比较例对应于专利文献1记载的核酸的回收方法。结果示于表1。
由实施例1、2和比较例1、2的结果可知，根据实施添加阴离子性表面活性剂的工序c)的实施例1、2的方法，与比较例1、2即专利文献1的方法相比，荧光信号总和值提高，核酸回收量增加。
【表1】
Figure BDA0002554454510000211
＜比较例3＞
在实施例1的工序a)中，在不使用离液剂的条件下进行核酸的回收。工序a)中，作为包含核酸的溶液使用人血清100μl与25mM HEPES(pH7)溶液450μl的混合液。其他条件·操作与实施例1同样地进行，使用DNA芯片取得血液中的miRNA荧光强度的总和。结果示于表2。
由这些结果可知，在工序a)中不使用离液剂的情况下，即使实施工序c)，从体液试样的核酸回收量也低，荧光信号总和值也低。
＜比较例4＞
在体液试样中包含大肠杆菌、酵母、细胞等的情况下，为了提高核酸的回收效率，有时进行核酸的游离处理。这样的时候，工序a)中SDS等阴离子性表面活性剂包含到包含核酸的溶液中。于是，在工序a)中使用阴离子性表面活性剂、在工序c)中使用离液剂如下进行核酸的回收。
实施例1的回收工序中，工序a)中代替7M胍硫氰酸盐(GTN)使用0.5％SDS、25mMHEPES(pH7)。工序c)中代替0.5％SDS、25mM HEPES(pH7)使用7M胍硫氰酸盐(GTN)、25mMHEPES(pH7)。此外的条件·操作与实施例1同样地进行，使用DNA芯片取得血液中的miRNA荧光强度的总和。结果示于表2。
由这些结果可知，在不通过在离液剂的存在下使载体吸附核酸、并且使载体吸附核酸后添加阴离子性表面活性剂的方法的情况下，不能确认核酸回收量、荧光信号总和值的提高。
＜比较例5＞
在实施例1的工序a)中，使用离液剂和阴离子性表面活性剂两者使本发明的载体吸附核酸，进而去除工序c)和工序d)而进行核酸的回收。工序a)中，使用混合7M胍硫氰酸盐(GTN)和0.5％SDS、25mM HEPES(pH7)而得的溶液。其他条件·操作与比较例1同样地进行。结果示于表2。
由这些结果可知，即使在工序a)中使用阴离子性表面活性剂，在不实施工序c)、工序d)的情况下，从体液试样的核酸回收量低，荧光信号总和值低。
【表2】
Figure BDA0002554454510000221
＜实施例4、5、6＞
将实施例1中的工序c)的0.5％SDS分别置换成作为阴离子性表面活性剂的0.5％十二烷基苯磺酸钠(实施例4)、0.5％N-月桂酰肌氨酸钠(实施例5)、0.25％月桂酸钠(实施例6)，除此以外的条件·操作与实施例1同样地，进行核酸的回收。结果示于表3。
由这些结果可知，通过在工序c)中使用各种阴离子性表面活性，核酸回收量增加，荧光信号总和值提高。
【表3】
工序c)阴离子性表面活性剂 荧光信号总和值
实施例4 0.5％十二烷基苯磺酸钠 135991
实施例5 0.5％N-月桂酰肌氨酸钠 150848
实施例6 0.25％月桂酸钠 112323
<实施例7、8、9>
将实施例1中的工序c)的SDS浓度调整为1％(实施例7)、0.1％(实施例8)、0.075％(实施例9)，分别进行核酸的回收。其他条件·操作与实施例1同样地进行。结果示于表4。
由这些结果可知，任一阴离子性表面活性剂的浓度下均核酸回收量增加，荧光信号总和值提高。
【表4】
工序c)阴离子性表面活性剂 荧光信号总和值
实施例7 1％SDS 196026
实施例8 0.1％SDS 111781
实施例9 0.075％SDS 104961
<实施例10、11>
在实施例1中的工序a)中，代替7M胍硫氰酸盐，分别使用7M胍盐酸盐(实施例10)或8M脲(实施例11)，除此以外的条件·操作与实施例1同样地，进行核酸的回收。结果示于表5。
由这些结果可知，通过在工序a)中使用各种离液剂，从而从体液试样的核酸回收量增加，荧光信号总和值提高。
【表5】
工序a)离液剂 荧光信号总和值
实施例10 7M GH 157517
实施例11 8M脲 135348
<实施例12、13、14、15>
将实施例1的工序a)中使用的离液剂的胍硫氰酸盐浓度调整为4M(实施例12)、2M(实施例13)、1M(实施例14)、0.5M(实施例15)，除此以外的条件·操作与实施例1同样地，分别回收核酸。结果示于表6。
由这些结果可知，在任一离液剂的浓度，均从体液试样的核酸回收量增加，荧光信号总和值提高。
【表6】
工序a)离液剂 荧光信号总和值
实施例12 4M GTN 178474
实施例13 2M GTN 143263
实施例14 1M GTN 101124
实施例15 0.5M GTN 87999
<实施例16>
作为体液试样使用300μl的血浆，作为离液剂使用450μl的7M胍硫氰酸盐(GTN)，作为溶出液使用50μl的0.5M磷酸缓冲液(pH7)，除此以外，通过与实施例2同样的条件和操作回收核酸。接着通过以下的方法确认回收的核酸是否包含无细胞DNA。
作为确认能否回收无细胞DNA的手段，已知通过实时PCR测定血浆中所含的由编码无细胞DNA的肌动蛋白-β的基因序列的一部分组成的核酸的方法(W.SUN等，The role ofplasma cell-freeDNA detection in predicting operatiVe chemoradiotherapyresponse in rectal cancer patients.ONCOLOGY REPORTS31：1466-1472，2014)。本实施例中，基于扩增同文献中记载的编码肌动蛋白-β的基因中100bp部分的基因序列而检测无细胞DNA的方法，设计编码扩增肌动蛋白-β的基因序列中93bp部分的碱基序列的引物1和2，用于利用实时PCR的测定。
实时PCR测定使用タカラバイオ株式会社的SYBR(注册商标)Premix Ex TaqII、バイオラッド社的CFX96-Real Time System。扩增编码肌动蛋白-β的基因序列中93bp部分的核酸，作为扩增循环数(Cq值)进行分析。作为用于扩增该核酸的引物，基于PrimePCRAssays，Panels，and Controls Instruction Manual(バイオ·ラッド·ラボラトリーズ株式会社)的记载，设计序列号1和2所示的核酸，它们从ユーロフィンジェノミクス株式会社购买，不进行特别纯化而直接使用。
首先，在冰上将SYBR Premix Ex Taq 12.5μL、制备成0.5μM的序列号1和2所示的引物1.0μL、灭菌蒸馏水8.5μL、将本实施例中回收的核酸的样品用灭菌蒸馏水稀释10倍后的产物2μL在1.5mL管内混合制成总量25μL。将该总量添加到实时PCR用板中，用板片盖好，放置到装置中。实时PCR的测定条件是在95℃30秒使双链DNA分离成单链DNA后，将以95℃5秒使引物退火、以56℃1分钟进行延伸反应的循环进行40循环。由所得的扩增曲线(Amplification Curve)获得扩增循环数。PCR反应后，使反应液的温度从60℃缓缓上升到95℃，进行熔解曲线分析，由所得的熔解曲线确认了未形成引物二聚体。另外，将实时PCR测定后的样品进行电泳，通过在100bp附近有主带，从而确认了扩增了编码肌动蛋白-β的基因序列中93bp部分的碱基序列。
结果示于表7。Cq值为28.6。
＜比较例6＞
除了去除工序c)和工序d)以外，通过与实施例2同样的条件和操作回收核酸，通过与实施例16同样的方法将无细胞DNA的回收量作为实时PCR的Cq值进行分析。
结果示于表7。该结果是Cq值为30.1。
可知与实施例16相比，不实施工序c)、工序d)的情况下，从血浆试样的无细胞DNA的回收量低，Cq值大。
【表7】
Figure BDA0002554454510000261
Figure IDA0002554454560000011

Claims (11)

1.核酸的回收方法，是从体液试样回收核酸的方法，包括以下工序：
工序a)，将离液剂、表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体和包含核酸的溶液混合，使载体吸附核酸的工序，
工序b)，从工序a)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序，
工序c)，将工序b)中分离出的载体与包含阴离子性表面活性剂的溶液混合的工序，
工序d)，从工序c)中混合而得的溶液中分离吸附有所述核酸的载体的工序，
工序e)，对工序d)中分离出的载体加入溶出液而回收核酸的工序。
2.根据权利要求1所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述核酸是微RNA或无细胞DNA。
3.根据权利要求1或2所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述体液试样是全血、血清、血浆、尿或唾液。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的核酸的回收方法，所述阴离子性表面活性剂是羧酸型、磺酸型或硫酸酯型。
5.根据权利要求4所述的核酸的回收方法，所述羧酸型的阴离子性表面活性剂是辛酸盐、壬酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、N-癸酰肌氨酸盐或N-月桂酰肌氨酸盐。
6.根据权利要求4所述的核酸的回收方法，所述磺酸型的阴离子性表面活性剂是辛基苯磺酸盐或十二烷基苯磺酸盐。
7.根据权利要求4所述的核酸的回收方法，所述硫酸酯型的阴离子性表面活性剂是辛基硫酸盐、癸基硫酸盐或十二烷基硫酸盐。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述水溶性的中性聚合物是在pH7的溶液中具有-10mV～+10mV的ζ电位的聚合物。
9.根据权利要求8所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述聚合物是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-噁唑啉)或羟丙基甲基纤维素。
10.根据权利要求1～9的任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述溶出液是缓冲液。
11.核酸回收用试剂盒，其特征在于，具备表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体、包含离液剂的溶液和包含阴离子性表面活性剂的溶液。
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