CN111548327B

CN111548327B - 降碳贝壳杉烷型二萜及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途

Info

Publication number: CN111548327B
Application number: CN201910111432.2A
Authority: CN
Inventors: 胡金锋; 李�浩; 熊娟
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-02-12
Filing date: 2019-02-12
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2039-02-12
Also published as: CN111548327A

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及降碳贝壳杉烷型二萜，尤其是C‑18位降碳的贝壳杉烷型(18‑nor‑kaurane‑type)二萜类化合物其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明从穗花杉(Amentotaxus argotaenia)的枝叶中提取分离得到的C‑18位降碳且C‑4与C‑19位形成三元氧环的贝壳杉烷型二萜类化合物amentotanol A和amentotanol B，经体外生物活性测试表明，可显著抑制多种人肿瘤细胞的增殖，可制备治疗临床常见多发肿瘤，如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或结肠癌的药物，和抗肿瘤药物的先导化合物。

Description

降碳贝壳杉烷型二萜及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及降碳贝壳杉烷型二萜，尤其是C-18位降碳的贝壳杉烷型(18-nor-kaurane-type)二萜类化合物其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明从穗花杉(Amentotaxus argotaenia)的枝叶中提取分离得到的C-18位降碳且C-4与C-19位形成三元氧环的贝壳杉烷型二萜类化合物amentotanol A和amentotanol B，经体外生物活性测试表明可显著抑制多种人肿瘤细胞的增殖，可制备治疗临床常见多发癌症的药物，和抗肿瘤药物的先导化合物。

背景技术

现有技术公开了天然产物具有结构复杂性和结构多样性的特点，且毒副作用往往较小，是新药发现的重要来源；天然产物及其衍生物独特的化学结构，使其具有高药效和对特定靶点高选择性的优点以及潜在的独特的作用机制等优点(Newman,et al.,Nat.Prod.Rep.2000,17:215–34；Newman et al.,J.Nat.Prod.2012,75:311–335)。据统计，1981-2014年间已上市的小分子药物，超过50％的药物分子是直接或间接来源于天然产物(Newman et al.,J.Nat.Prod.2016,79:629-661)，因此从天然产物资源中寻找和发现具有良好生物活性分子具有重要意义。

研究表明珍稀濒危植物中的次生代谢产物具有较高的成药性，是发现新颖结构和独特作用机制的药物分子的重要来源(Zhu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2011,108:12943–12948)，目前已引起业内广泛关注，其中还有研究发现珍稀濒危植物对于人类某些重大疾病的控制具有潜在的价值(Ibrahim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U SA.2013,110:16832–16837)；穗花杉(Amentotaxus argotaenia)隶属红豆杉科(Taxaceae)穗花杉属(Amentotaxus)植物，为灌木或小乔木，是我国特有树种，于1992年被中国植物红皮书收录，记为渐危种(Fu et al.,China Plant Red Data Book I,Science Press:Beijing；New York,1992)，该植物常分布于江西西北部、湖北西部及西南部、湖南、四川东南部及中部、西藏东南部、甘肃南部、广西、广东等地海拔300-1100米地带的荫湿溪谷两旁或林内(Fu et al.,China Plant Red Data Book,Science Press:Beijing；New York,1992)。

贝壳杉烷型二萜的基本化学结构为刚性骨架的四环二萜，来源于天然产物的贝壳杉烷型二萜大多数具有较强的生理活性，可用做植物生长调节剂、抗菌剂、抗炎剂以及抗肿瘤细胞毒剂等。如从香茶菜属植物中分离得到的贝壳杉烷型二萜化合物冬凌草甲素(oridonin)，具有显著的抑制白血病细胞增殖活性，是近年抗肿瘤新药开发的热点(Zhouet al.,Blood 2007,109:3441–3450)。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供新的降碳贝壳杉烷型二萜及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途，本发明从穗花杉中提取分离得到新的降碳贝壳杉烷型二萜类化合物，经药理活性试验表明，所述化合物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖活性，可制备治疗肿瘤的药物。

发明内容

本发明目的是基于现有技术的现状，提供新的降碳贝壳杉烷型(norkaurane-type)二萜，尤其是C-18位降碳的贝壳杉烷型(18-nor-kaurane-type)二萜类化合物其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明从穗花杉中提取分离得到新的降碳贝壳杉烷型二萜类化合物，经药理活性试验表明，所述化合物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖活性，可制备治疗肿瘤的药物，以及作为潜在的抗肿瘤药物研究的先导化合物。

本发明从红豆杉科(Taxaceae)穗花杉属植物穗花杉[Amentotaxus argotaenia(Hance)Pilger]的枝叶中提取分离得到C-18位降碳且C-4与C-19位形成三元氧环的贝壳杉烷型二萜amentotanol A和amentotanol B；

本发明的贝壳杉烷型二萜类化合物具有如下化学结构式：

本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法。

本发明所述的化合物由穗花杉枝叶经由本领域所涉及常规的提取分离方法制备而来，其步骤如下：将干燥的穗花杉枝叶粉碎后用甲醇室温浸泡提取，提取液减压浓缩，多次提取浓缩后合并得浸膏，然后浸膏用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取，减压浓缩后的乙酸乙酯浸膏经硅胶、微孔树脂、凝胶及半制备高效液相分离，得到化合物amentotanol A和amentotanol B。

本发明所述的化合物可通过从植物中分离纯化得到；也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。

本发明对所得的贝壳杉烷型二萜类化合物化合物amentotanol A和amentotanolB进行了体外抗肿瘤活性实验，结果表明，所述化合物均能显著抑制人宫颈癌细胞HeLa，人肺癌细胞A549，人肝癌细胞Huh-7，人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人卵巢癌细胞SKOV3和人结肠癌细胞HCT-116等6种肿瘤细胞的增殖，结果表明，该化合物可制备抗肿瘤药物，或作为潜在的抗肿瘤药物先导化合物。

本发明所述抗肿瘤药物为治疗宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或结肠癌的药物。

本发明所述的化合物可单独应用或者合用，亦可与药学上合适的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服或者非口服剂型。

本发明具有如下优点：所述目标化合物为结构新颖的降碳贝壳杉烷型二萜化合物，其中，C-18位降碳且C-4与C-19位形成独特三元氧环；该化合物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖活性，对现在关注度很高的肿瘤疾病，如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或结肠癌等的抗肿瘤药物的开发具有应用前景。

具体实施方式

下面实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

下述制备例中，比旋光测试通过Rudolph Autopol VI旋光仪；紫外和红外分别采用日立U-2900E双光束分光光度仪和Thermo Scientific Nicolet Is5傅里叶变换红外光谱仪测定；圆二色谱采用JASCO-810分光偏振计测定；核磁共振谱采用Bruker Avance III400MHz和Bruker Avance DRX-600MHz核磁共振仪测定；化学位移以δ(ppm)表示并以残留溶剂峰作为参照；ESI-MS采用Agilent 1100series质谱仪测定；高分辨质谱采用AgilentTechnologies 6224TOF LC/MS质谱仪测定；半制备型高效液相色谱仪器：Waters e2695系列，配备Waters 2998 PDA和Waters 2424ELSD检测器；半制备型色谱柱：Sunfire C₁₈OBDPrep Column(5μm,10mm×250mm,流速：3.0Ml/min)；正相柱色谱硅胶规格为100～200目(烟台牟平区康必诺化学试剂厂和青岛海洋化工厂)；凝胶Sephadex LH-20(GEHealthcareBio-Sciences AB，瑞典)；三菱凝胶吸附树脂MCI gel CHP20P规格75-150μm(MitsubishiChemical Industries,日本东京)；薄层层析板(TLC)规格为GF₂₅₄/0.25mm(烟台牟平区康必诺化学试剂厂)；所有试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产。

实施例1：制备降碳贝壳杉烷型二萜化合物(amentotanol A和amentotanol B)

取穗花杉枝叶10kg，粉碎后用90％甲醇室温浸泡提取4次，合并提取液，减压浓缩得浸膏1.66kg，浸膏用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取液经减压浓缩后得一浸膏(134g)，该浸膏经100-200目硅胶柱层析(先后以石油醚：乙酸乙酯20:1-0:1和乙酸乙酯：甲醇10:1–0:1梯度洗脱)，得到9个组分(Fr.1-Fr.9)。亚组分Fr.7经MCI和Sephadex LH-20反复柱层析，并经HPLC进一步纯化(以65％甲醇等度洗脱，流速：3mL/min)，得到化合物amentotanol A(5.0mg t_R＝17.5min)；亚组分Fr.8经MCI和Sephadex LH-20反复柱层析，再以半制备HPLC进一步纯化(以68％甲醇等度洗脱，流速：3mL/min)，得到化合物amentotanol B(7.0mg,t_R＝22.0min)；

化合物amentotanol A和amentotanol B均为新的降碳贝壳杉烷型二萜化合物，它们的光谱和理化数据如下：

Amentotanol A：无色针晶；

UV(MeOH)λ_max(logε):232(3.51)nm；CD(c 3.3×10^-3M,MeOH):212(-19.0)nm；IR(film)ν_max 3414,2380,1569cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ1.07(1H,m,H-1a),1.92(1H,br d,J＝11.5Hz,H-1b),1.63(1H,m,H-2a),2.01(1H,br d,J＝13.4Hz,H-2b),3.79(1H,dd,J＝11.5,4.9Hz,H-3),1.58(1H,br d,J＝11.0Hz,H-5),1.06(1H,m,H-6a),1.57(1H,m,H-6b),1.32(1H,br d,J＝9.5Hz H-7a),1.88(1H,m,H-7b),1.32(1H,br d,J＝9.5Hz,H-9),1.58(1H,m,H-11a),1.70(1H,m,H-11b),1.72(1H,m,H-12a),1.84(1H,m,H-12b),3.07(1H,br s,H-13),1.41(1H,br d,J＝11.5Hz,H-14a),2.35(1H,br d,J＝11.5Hz,H-14b),5.28(1H,br s,H-17a),5.97(1H,br s,H-17b),2.65(1H,brs,H-19a),3.03(1H,br s,H-19b),1.06(3H,s,Me-20)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃):δ37.0(C-1),27.6(C-2),69.9(C-3),61.9(C-4),46.9(C-5),16.2(C-6),31.9(C-7),52.0(C-8),49.9(C-9),41.4(C-10),18.6(C-11),31.8(C-12),37.9(C-13),36.8(C-14),210.1(C-15),149.1(C-16),115.0(C-17),45.6(C-19),15.6(C-20)；ESIMSm/z 325.2[M+Na]⁺；HRESIMS m/z 303.1957[M+H]⁺(calcd for C₁₉H₂₇O₃,303.1955,Δ＝+0.7ppm).

Amentotanol B：无色无定形粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)210(3.98)nm；CD(c 3.3×10^-3M,MeOH):206(+39.8)nm；IR(film)ν_max3439(br),2930,2848,1654,1551,1455,1385,1110cm^-1；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ1.14(1H,br d,J＝10.4Hz,H-1a),1.98(1H,br dd,J＝11.2,10.4Hz,H-1b),1.64(1H,ddd,J＝12.2,11.2,15.0Hz,H-2a),2.02(1H,br d,J＝15.0Hz,H-2b),3.80(1H,br d,J＝12.2Hz,H-3),1.49(1H,br d,J＝12.0Hz,H-5),1.09(1H,ddd,J＝13.6,13.5,12.0Hz,H-6a),1.50(1H,br d,J＝13.6Hz,H-6b),1.30(1H,br d,J＝13.2Hz,H-7a),1.62(1H,dd,J＝13.5,13.2Hz,H-7b),1.50(1H,m,H-9),1.56(1H,m,H-11a),1.59(1H,m,H-11b),1.50(1H,m,H-12a),1.59(1H,m,H-12b),2.68(1H,m,H-13),1.06(1H,dd,J＝11.0,4.7Hz,H-14a),1.96(1H,br d,J＝11.0Hz,H-14b),3.79(1H,br s,H-15),4.98(1H,br s,H-17a),5.11(1H,br s,H-17b),2.65(1H,d,J＝4.5Hz,H-19a),3.03(1H,d,J＝4.5Hz,H-19b),1.06(3H,s,Me-20)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃):δ37.6(C-1),27.9(C-2),70.1(C-3),62.2(C-4),44.1(C-5),17.5(C-6),36.6(C-7),45.5(C-8),47.1(C-9),40.6(C-10),18.5(C-11),32.8(C-12),39.9(C-13),36.9(C-14),82.3(C-15),157.9(C-16),105.2(C-17),45.8(C-19),15.9(C-20)；ESIMS m/z327.2[M+Na]⁺,631.4[2M+Na]⁺；HRESIMS m/z 305.2114[M+H]⁺(calcd for C₁₉H₂₉O₃,305.2111,Δ＝+1.0ppm).。

实施例2：体外抗肿瘤活性测定

实验方法：采用对数生长期细胞，按5000个/孔接种于96孔板中，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24小时后弃上清，按以下方法给药：样品溶于DMSO中配成100mM的溶液，再用培养基稀释至100μM，进一步用培养基按2倍浓度梯度稀释，共设置8个浓度梯度，每个浓度三个复孔，每孔加100微升含化合物的培养基，紫杉醇(Taxol)为阳性对照。继续培养48小时后弃去上清，每孔加入150微升含0.5mg/ml MTT的空白培养基，培养4小时后弃去含MTT的空白培养基，每孔加入150微升DMSO，室温震荡5分钟，在570nm处测其紫外吸光度，GraphPadPrism 6.0处理数据得到化合物的IC₅₀值。

化合物amentotanol A和amentotanol B抗肿瘤活性数据如表1所示，测试结果表明上述两个化合物对能显著抑制人宫颈癌细胞HeLa，人肺癌细胞A549，人肝癌细胞Huh-7，人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人卵巢癌细胞SKOV3及人结肠癌细胞HCT-116等6种肿瘤细胞的增殖，可用于肿瘤疾病的治疗或者作为开发抗肿瘤药物的先导化合物。

表1.化合物抑制肿瘤细胞增殖活性数据

Claims

1.结构式如下所示的降碳贝壳杉烷型二萜类化合物amentotanol A和amentotanol B，其特征在于，C-18位降碳且C-4与C-19位形成三元氧环，

2.如权利要求1所述的降碳贝壳杉烷型二萜类化合物，其特征在于通过下述方法制备：

采用穗花杉干燥枝叶，粉碎后用90％甲醇提取，提取液浓缩后加水悬浮，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩后得浸膏，该浸膏经硅胶柱色谱、MCI微孔树脂柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及反相半制备HPLC色谱分离制备，可得到化合物amentotanolA和amentotanol B。

3.如权利要求1所述的降碳贝壳杉烷型二萜类化合物amentotanol A和amentotanol B在制备治疗宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或结肠癌药物中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，amentotanol A和amentotanol B可单独应用或者合用。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，amentotanol A和amentotanol B可分别与赋形剂结合制成片剂、胶囊、颗粒或针剂。