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CN111521817B - 一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法 - Google Patents

一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法 Download PDF

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CN111521817B
CN111521817B CN202010335300.0A CN202010335300A CN111521817B CN 111521817 B CN111521817 B CN 111521817B CN 202010335300 A CN202010335300 A CN 202010335300A CN 111521817 B CN111521817 B CN 111521817B
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Beijing Chest Hospital
Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
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Abstract

本发明公开了一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，涉及分子生物技术领域，具体地，该用于识别蛋白质磷酸化位点的方法包括将表达载体1表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行免疫印迹实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体1含具有待测位点的氨基酸序列片段，其在没有针对单个蛋白位点的磷酸化抗体的条件下，也能够有效准确地检测蛋白单个位点的磷酸化修饰情况，节省了针对特定位点的磷酸化抗体的制备成本，加快蛋白质磷酸化位点的研究进程。

Description

一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法。
背景技术
蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细胞代谢、细胞分化和细胞生长等重要的生命活动过程，是细胞生理活动的分子开关。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点，其增加了磷酸化蛋白质研究的复杂性，使磷酸化蛋白质成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。
用32P选择性标记磷酸化蛋白是一种经典的技术，其通过纯化的激酶及32P进行体外标记，或利用32P-ATP或32PO4 3-(正磷酸盐)进行体内标记，然后通过SDS-PAGE、2D-GE或薄层层析对蛋白质进行分离，再经放射自显影或光学成像检测标记的磷酸化蛋白。
体外检测到的磷酸化蛋白是否具有生物学意义，必须对它在体内的磷酸化情况进行验证。因为在体外情况下，激酶可能会与许多在生理条件下因处于不同的细胞或亚细胞结构而根本无法接触到的蛋白质发生作用，从而得出假阳性结沦。
而体内磷酸化标记研究也取决于机体本身磷酸化的效率，及靶蛋白磷酸化与非磷酸化形态之间的平衡关系。如果某一蛋白已经被磷酸基团所饱和，那么无论激酶的活性如何，也不会有放射件标记的磷酸基团插人，因此也检测不到磷酸化蛋白。
到了20世纪90年代。磷酸化位点分析的标准途径是用32P标记纯化的磷酸化蛋白，通过一维的薄层电泳和二维的薄层层析(称为二维肽谱)对所得到的肽段进行分离，放射自显影检测磷酸化肽段，进行埃德曼降解测序；或使用荧光标记磷酸肽.然后通过磷酸化残基特定的滞留时间、荧光标记或放射性标记的氨基酸的释放最终定位磷酸化位点释放的氨基酸进行鉴定，而该方法进行大规模应用时，工作量显然太大。
随着蛋白质组学技术的不断发展，蛋白质组学研究已经进入定量分析及功能蛋白质组阶段，磷酸化修饰成为众多学者关注的重点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法。
本发明是这样实现的：
实施例提供一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其包括以下步骤：将表达载体1表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行免疫印迹实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体1含具有待测位点的氨基酸序列片段1；
氨基酸序列片段1为待测蛋白的片段上除待测位点外大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其在没有针对单个蛋白位点的磷酸化抗体的条件下，也能够有效准确地检测蛋白单个位点的磷酸化修饰情况，节省了针对特定位点的磷酸化抗体的制备成本，加快蛋白质磷酸化位点的研究进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中的ATGL载体图谱；
图2为本发明实施例2中的ATGL-Ser47位点表达载体1、2、3的表达图；
图3为本发明实施例3中的ATGL蛋白的10个磷酸化位点对应的表达载体1的银染结果和免疫印记实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
名词定义
本文中涉及的“蛋白质磷酸化”是指由蛋白质激酶催化，把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)上的过程，或者在信号作用下结合GTP。现有技术存在蛋白质磷酸化位点的分析困难的原因在于，蛋白质磷酸化在体内是一种不稳定的动态过程，磷酸化蛋白质在细胞内丰度较低，且磷酸化蛋白质的磷酸基团很容易在分离过程中丢失，且因其负电性而难于质子化。
本文中涉及的“磷酸化抗体”是指针对一个底物磷酸化状态下的磷酸化位点而生产的抗体，免疫原经过磷酸化，用其制备的抗体被称之为磷酸化抗体。然而，现有技术中，针对特定蛋白的单个位点的特异性磷酸化抗体的制备是很困难的，存在制备成本高，时间长，且还可能制备不成功的缺点。
本文中涉及的“可逆磷酸化位点”是指蛋白质上有可能进行磷酸化的位点，其磷酸化的过程是由蛋白激酶催化的，把ATP或GTP的磷酸化基因转移到蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆向过程为由蛋白磷酸(酯)酶催化的蛋白质脱(去)磷酸化，其磷酸化和非磷酸化的过程是可逆的。
本文中涉及的“大部分可能的可逆磷酸化位点”是指：将该“大部分可能的可逆磷酸化位点”全部进行永久非磷酸化位点突变后，包含该大部分可能的可逆磷酸化位点的片段的载体，能够作为阴性对照的程度，即载体不会与磷酸化抗体发生反应的程度。
本文中涉及的“永久非磷酸化位点突变”和“永久磷酸化位点突变”是指将可逆磷酸化为位点的氨基酸突变为永久非磷酸化和永久磷酸化的氨基酸。
本发明实施例提供了一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其能够在没有特异性针对蛋白单个位点的磷酸化抗体的情况下，检测蛋白单个位点的磷酸化位点修饰情况。
具体的，该方法具体包括以下步骤：将表达载体1表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行免疫印迹实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体1含具有待测位点的氨基酸序列片段1。
氨基酸序列片段1为待测蛋白的片段上除待测位点外大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段。
具体地，表达载体1中，将除待测位点外的其他大部分可能的可逆磷酸化位点进行永久非磷酸化位点突变的目的在于：消除其他可逆的磷酸化位点进行磷酸化的可能，使非特异性针对单个位点的磷酸化抗体检测的对象只针对待测位点，即在此条件下，不适用特异性针对某蛋白单个位点的磷酸化抗体也能够检测到待测位点上磷酸化的情况。
在可选实施方式中，所述方法还包括将表达载体2表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行Western Blot实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体2含具有待测位点的氨基酸序列片段2。
氨基酸序列片段2为待测蛋白的片段上大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段。作为所述方法的阴性对照。
在可选实施方式中，所述方法还包括将表达载体3表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行Western Blot实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体3含具有所述待测位点的氨基酸序列片段3。
氨基酸序列片段3，为将待测蛋白的片段上的待测位点进行永久磷酸化位点突变，除待测位点外的其他大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段。作为所述方法的阳性对照。
需要说明的是，在具有表达载体1～3的时候，所述方法包括将表达载体1～3表达的蛋白分离后，分别使用磷酸化抗体进行Western Blot实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况。且本申请说明书的“氨基酸序列片段1、氨基酸序列片段2和氨基酸序列片段3”均为待测蛋白的氨基酸序列片段，区别仅在于对于该序列片段上的磷酸化位点的处理方式不同。
表达载体1表达的蛋白作为待测位点检测的野生型样本，表达载体2表达的蛋白作为待测位点检测的阴性对照，表达载体3表达的蛋白作为待测位点检测的阳性对照。在同时具有表达载体1～3的实施方式中，还可以根据检测的结果进行对比，比较磷酸化位点修饰程度的差异。
在可选实施方式中，所述磷酸化抗体为非特异性针对单个位点的磷酸化抗体。
优选地，所述磷酸化抗体包括：对以下任意一种或多种氨基酸的磷酸化具有抗性的抗体：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
进一步地，上述“对任意一种氨基酸的磷酸化具有抗性的抗体”比如：丝氨酸磷酸化抗体、苏氨酸磷酸化抗体、酪氨酸磷酸化抗体；再比如多种氨基酸磷酸化具有抗性的抗体：丝氨酸/苏氨酸磷酸化抗体，丝氨酸/酪氨酸磷酸化抗体、酪氨酸/苏氨酸磷酸化抗体以及酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸化抗体。
在可选实施方式中，筛选待测蛋白序列上的可逆磷酸化位点的方式为磷酸化蛋白质组学分析。需要说明的是，也可以通过其他方式，如查找现有文献的方式，筛选确认可能的可逆磷酸化位点。
在可选实施方式中，所述永久非磷酸化位点突变为将丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸突变为丙氨酸或苯丙氨酸。
具体地，“将丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸突变为丙氨酸或苯丙氨酸”可以理解为2种情况，针对单个可逆磷酸化位点的永久非磷酸化位点突变时，将丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸中的任意一种突变为丙氨酸或苯丙氨酸；针对一段序列上多个磷酸化位点做永久非磷酸化位点突变时，将序列上大部分可能的可逆磷酸化位点的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸突变为丙氨酸或苯丙氨酸。
所述永久磷酸化位点突变为将丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸突变为天冬氨酸或者谷氨酸。需要说明的是，永久磷酸化位点突变的理解根据永久非磷酸化位点突变的理解类推。
在可选实施方式中，所述方法用于识别甘油三酯脂肪酶的磷酸化位点。
负责甘油三酯代谢的酶包括甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)和甘油单酯脂肪酶(MGL)。其中，关于HSL和MGL的研究已有40多年的历史，而ATGL只是在最近几年才被发现，并且其研究正在逐步深入。
ATGL最初是在脂肪组织中发现的，研究发现ATGL广泛存在于许多组织中(包括肝脏、心肌和骨骼肌)。ATGL是参与甘油三酸酯水解第一步的限速酶。在ATGL的作用下，甘油三酯水解为甘油二酯(DAG)，然后通过HSL将甘油二酯水解为甘油一酯，然后通过甘油单酯脂肪酶MGL完全水解为甘油和脂肪酸。尽管ATGL的磷酸化在甘油三酯的合成和分解中起着重要的作用，但是针对ATGL单位点磷酸化抗体的缺乏限制了ATGL磷酸化修饰与其功能关系的研究。采用本申请实施例提供的方法能够快速且有效分析ATGL的磷酸化位点。
在可选实施方式中，所述甘油三酯脂肪酶的磷酸化位点选自：Ser47、Ser87、Thr101、Thr210、Thr372、Tyr378、Ser393、Ser396、Ser406和Ser430中的任意一种。
在可选实施方式中，所述甘油三酯脂肪酶的磷酸化位点为Ser47。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其包括以下步骤。
(1)确定待测样本的磷酸化位点
通过文献查找的方式或磷酸化蛋白质组学分析，筛选其可能存在的大部分可能的可逆磷酸化位点。
(2)构建表达载体1～3
表达载体1～3为分别含有氨基酸序列片段1～3的质粒，氨基酸序列片段1～3均为含待测蛋白的待测位点的序列片段，序列长度相同。
其中，氨基酸序列片段1为待测蛋白的片段上除待测位点外大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段；
氨基酸序列片段2为待测蛋白的片段上大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段；
氨基酸序列片段3，为将待测蛋白的片段上的待测位点进行永久磷酸化位点突变，除待测位点外的其他大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段。
(3)检测磷酸化位点
将步骤(2)中的表达载体1～3分别进行转染实验，培养宿主细胞，并获取宿主细胞表达的蛋白。将表达载体1～3表达的蛋白分别通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行免疫印迹实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况。
实施例2
本实施例提供ATGL单位点磷酸化检测的方法，本实施例以Ser47的磷酸化位点为研究对象。
(1)筛选ATGL可能的磷酸化位点
通过文献报道，小鼠ATGL有10个磷酸化位点发生修饰，包括Ser47、Ser87、Thr101、Thr210、Thr372、Tyr378、Ser393、Ser396、Ser406和Ser430。
(2)构建表达载体
本实施例以Ser47的磷酸化位点为研究对象，设计一个由CMV启动子(FLAG-FLAG双标签，p9-ATGL-FLAG)控制的10个位点永久性非磷酸化突变质粒，作为阴性对照，阴性对照也就是表达载体2，ATGL载体图谱请参照附图1。其氨基酸序列片段碱基序列如SEQ ID No.2所示。
该质粒上含有的氨基酸序列片段的10个永久非磷酸化突变位点：S47A、S87A、T101A、T210A、T372A、Y378F、S393A、S396A、S406A和S430A(A为丙氨酸的缩写，F为苯丙氨酸缩写，需要说明的是，在其他实施例中，阴性对照也可以将Y378突变为丙氨酸，另外9个磷酸化位点均突变为苯丙氨酸)。
然后，在阴性对照基础上构建了Ser47永久磷酸化质粒(p10-ATGL-S47D-FLAG)和Ser47野生型质粒(p10-ATGL-S47-FLAG)。
具体地，Ser47永久磷酸化质粒为表达载体3，其氨基酸序列片段3的碱基序列如SEQ ID No.3所示；Ser47野生型质粒为表达载体1，其氨基酸序列片段3的碱基序列如SEQID No.1所示。
需要说明的是，在其实施例中，针对其他位点，如Ser87为研究位点时，方法的操作过程与Ser47一样，除了质粒构建中，阳性对照为p10-ATGL-S87D-FLAG，野生型质粒为p10-ATGL-S87-FLAG，其他位点依次类推。
(3)检测磷酸化位点
3.1细胞培养和质粒转染
采用步骤(2)中获得的阴性质粒(表达载体2)、阳性质粒(表达载体3)和野生型质粒(表达载体1)分别转染小鼠来源的心肌细胞系HL-1细胞，细胞在Claycomb培养基(Sigma)中生长，并补充有10％FBS，1％青霉素和链霉素，细胞在37℃和5％CO2的条件下培养。
3.2收获细胞
质粒转染24～48h蛋白表达后，弃掉培养基，用4℃预冷的PBS洗培养皿1到2次，吸干液体。在4℃或者冰上，加入适量4℃预冷的细胞IP裂解缓冲液(添加10mM NaF，10mMNa3VO4和蛋白酶抑制剂)，用细胞刮子收取细胞，4℃或者冰上裂解30分钟，离心机12000g离心30min后取上清。
取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加入50μL FLAG磁珠(Sigma–Aldrich M8823)，4℃缓慢摇晃孵育4h。孵育后，用磁力架分离磁珠，吸取上清。磁珠用1mL裂解缓冲液洗1到2次。最后加入15μL的2×SDS上样缓冲液，沸水煮10min热变性。10％SDS-PAGE分离总蛋白，转移到PVDF膜上，在0.1％Tween 20和5％牛白蛋白的TBS缓冲液中，于4℃封闭8h，4℃一抗孵育8h。用辣根-过氧化物酶偶联的二抗孵育8h，并用ECL系统检测。
FLAG磁珠免疫沉淀反应分离ATGL蛋白，银染结果和免疫印记结果请参照附图2。图2中，Input为转染细胞裂解液；output为转染细胞裂解液免疫沉淀反应后上清；wash为免疫沉淀反应后FLAG磁珠洗涤下的蛋白；beads为FLAG磁珠结合蛋白。Heavy chain指磁珠上FLAG抗体的重链，Light chain指磁珠上FLAG抗体的轻链；ATGL-FLAG指表达载体表达的带FLAG标签的ATGL蛋白。
银染结果显示，FLAG磁珠结合蛋白主要是表达载体表达的带FLAG标签的ATGL蛋白。免疫印迹结果显示载体3磷酸化修饰阳性，载体2磷酸化修饰阴性，载体1磷酸化修饰很弱。
实施例3
本实施例提供ATGL单位点磷酸化检测的方法，具体方法同实施例2，分别以Ser47、Ser87、Thr101、Thr210、Thr372、Tyr378、Ser393、Ser396、Ser406和Ser430的磷酸化位点为研究对象。
其针对上述10个磷酸化位点分别制备了对应10个待测位点的表达载体1，序列信息请参照表1。
表1 序列信息
Figure BDA0002466347500000061
ATGL10个磷酸化位点质粒载体1转染HL-1细胞48小时收取蛋白，FLAG磁珠免疫沉淀反应分离ATGL蛋白。银染结果和免疫印迹结果请参照附图3。
银染结果显示FLAG磁珠结合蛋白主要是表达载体表达的带FLAG标签的ATGL蛋白。免疫印迹结果显示ATGL十个磷酸化位点载体1磷酸化修饰。
由图3可知，ATGL蛋白10个磷酸化位点分别对应的表达载体1表达的蛋白磷酸化修饰情况都可以由此反应体系检测到。综上表明，实施例1提供的方法可以有效检测目标位点被磷酸化的状态。ATGL是甘油三酯代谢的关键酶，磷酸化是调节ATGL活性的主要途径。我们的方法可以有效代替ATGL单位点磷酸化抗体，便于对ATGL进行各种功能研究。相同的原理可以应用于其他蛋白质，为蛋白质磷酸化修饰的研究提供了强有力的工具。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院
北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> 一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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gccctgcctg ctgattgcca tgagcgcgcc aatggacgcc tgggcatctc cctgactcgt 360
gtttcagacg gagagaacgt catcatatcc cactttagct ccaaggatga gctcatccag 420
gccaatgtct gcagcacatt tatcccggtg tactgtggcc tcattcctcc taccctccaa 480
ggggtgcgct atgtggatgg cggcatttca gacaacttgc cactttatga gctgaagaat 540
accatcacag tgtccccatt ctcaggcgag agtgacatct gccctcagga cagctccacc 600
aacatccacg agcttcgcgt caccaacgcc agcatccagt tcaaccttcg caatctctac 660
cgcctctcga aggctctctt cccgccagag cccatggtcc tccgagagat gtgcaaacag 720
ggctacagag atggacttcg attccttagg aggaatggcc tactgaacca acccaaccct 780
ttgctggcac tgcccccagt tgtcccccag gaagaggatg cagaggaagc tgctgtggtg 840
gaggagaggg ctggagagga ggatcaattg cagccttata gaaaagatcg aattctagag 900
cacctgcctg ccagactcaa tgaggccctg ctggaggcct gtgtggaacc aaaggacctg 960
atgaccaccc tttccaacat gctaccagtg cgcctggcaa cggccatgat ggtgccctat 1020
actctgccgc tggagagtgc agtgtccttc accatccgct tgttggagtg gctgcctgat 1080
gtccctgaag atatccggtg gatgaaagag caggccggta gcatctgcca gttcctggtg 1140
atgagggcca agaggaaatt gggtgaccat ctgcctgcca gactggccga gcaggtggaa 1200
ctgcgacgtg cccaggccct gccctctgtg ccactgtctt gcgccaccta cagtgaggcc 1260
ctacccaact gggtacgaaa caacctcgac ctgggggacg cgctggccaa gtgggaagaa 1320
tgccagcgtc agctactgct gggtctcttc tgcaccaatg tggccttccc gccggatgcc 1380
ttgcgcatgc gcgcacctgc cagccccact gccgcagatc ctgccacccc acaggatcca 1440
cctggcctcc cgccttgctg a 1461

Claims (8)

1.一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，其包括以下步骤：将表达载体1、表达载体2和表达载体3表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行Western Blot实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体1、表达载体2和表达载体3依次为含具有待测位点的氨基酸序列片段1、氨基酸序列片段2和氨基酸序列片段3；
氨基酸序列片段1为待测蛋白的片段上除待测位点外大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段；
氨基酸序列片段2为待测蛋白的片段上大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段；
氨基酸序列片段3，为将待测蛋白的片段上的待测位点进行永久磷酸化位点突变，除待测位点外的其他大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段；
所述磷酸化抗体为非特异性针对单个位点的磷酸化抗体。
2.根据权利要求1所述的用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，所述磷酸化抗体包括：对以下任意一种或多种氨基酸磷酸化具有抗性的抗体：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
3.根据权利要求1所述的用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，在将表达载体1~3表达的蛋白分别通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行Western Blot实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况前，所述方法还包括筛选待测蛋白序列上的可逆磷酸化位点。
4.根据权利要求3所述的用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，筛选待测蛋白序列上的可逆磷酸化位点的方式为：磷酸化蛋白质组学分析。
5.根据权利要求1所述的用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，所述永久非磷酸化位点突变为将丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸突变为丙氨酸或苯丙氨酸；
所述永久磷酸化位点突变为将丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸突变为天冬氨酸或者谷氨酸。
6.根据权利要求1所述的用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，所述方法用于识别甘油三酯脂肪酶的磷酸化位点。
7.根据权利要求6所述的用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，所述甘油三酯脂肪酶的磷酸化位点选自：Ser47、Ser87、Thr101、Thr210、Thr372、Tyr378、Ser393、Ser396、Ser406和Ser430中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其特征在于，所述甘油三酯脂肪酶的磷酸化位点为Ser47。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101233228A (zh) * 2005-06-10 2008-07-30 马德里自治大学 丝裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位点、经修饰的蛋白和用途
CN101506226A (zh) * 2005-11-14 2009-08-12 维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司 改良的色素上皮衍生因子变体及其用途
WO2011053565A2 (en) * 2009-10-29 2011-05-05 Biomedical Sciences Research Centre "Alexander Fleming" Compositions and methods for detecting a tauopathy
CN103163010A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 天津市国际生物医药联合研究院 相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法
CN109342592A (zh) * 2018-10-31 2019-02-15 华中科技大学 一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030215899A1 (en) * 2002-02-13 2003-11-20 Ceptyr, Inc. Reversible oxidation of protein tyrosine phosphatases

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101233228A (zh) * 2005-06-10 2008-07-30 马德里自治大学 丝裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位点、经修饰的蛋白和用途
CN101506226A (zh) * 2005-11-14 2009-08-12 维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司 改良的色素上皮衍生因子变体及其用途
WO2011053565A2 (en) * 2009-10-29 2011-05-05 Biomedical Sciences Research Centre "Alexander Fleming" Compositions and methods for detecting a tauopathy
CN103163010A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 天津市国际生物医药联合研究院 相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法
CN109342592A (zh) * 2018-10-31 2019-02-15 华中科技大学 一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
大麦条纹花叶病毒γb蛋白的磷酸化及其与寄主激酶STY46互作的功能分析;张璇;《中国优秀博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20190115;第2018年卷(第12期);D046-20 *

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