CN111471802A

CN111471802A - 一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111471802A
Application number: CN202010471895.2A
Authority: CN
Inventors: 贺东生; 陈一波; 陈湘; 司广斌; 蔡蔚游
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-07-31

Abstract

本发明提供一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用。本发明通过引入双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide，DPO)设计技术，根据猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的高度保守的特异性序列设计DPO引物，并通过反应体系优化，建立一种针对PDCoV的检测方法以及相应的检测试剂盒。该试剂盒具备快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，可实现对PDCoV的精准检测，助力PDCoV的防控诊治，具有很好的应用前景。

Description

一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV)于2012年通过流行病学调查发现，随后在LLC-PK细胞上分离并鉴定了PDCoV。PDCoV是一种新型猪冠状病毒，可引起新生仔猪急性肠炎。截止目前，美国、加拿大、中国、韩国、泰国及日本等国相继报道了PDCoV的存在，对养猪业造成明显的经济损失。

PDCoV属于冠状病毒科(Coronavirinae)冠状病毒属(Coronavirus)，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，是现今已知最小的冠状病毒，基因组全长约25.4kb，由一个5′非翻译区(UTR)、6个开放阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2至5)和一个3′UTR组成。本病毒与其他猪源性冠状病毒在临床上均可引起猪的呕吐、腹泻等症状，且难以从临床特征和病原形态加以区分。

目前国内实验室诊断方法包括病理学检查、血清学检测和RT-PCR检测等，然而现存检测方法存在局限性，易受到检测条件、周期、准确性等因素的限制，难以实现高效快捷的病原确诊，如病毒分离、血清学检测方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。近年来PDCoV的检测研究的侧重点主要是PCR法，这种方法实用性强、高效、快速、准确而被广泛应用，但常规PCR引物设计过程复杂，需要对引物参数进行反复优化，而且特异性较差，有时即使优化反应条件也避免不了非特异性扩增的出现。

DPO双启动寡核苷酸引物(DualPrimingOligonucleotide，DPO)是一种新颖的引物设计方法，该引物特异性强于常规引物，DPO引物与模板DNA发生3个以上碱基错配，扩增效率会极大降低或终止反应，同时DPO引物有效退火温度范围宽，且设计过程简单，避免了传统方法中反复优化反应的繁琐操作，极大地简化了常规引物设计的繁琐步骤。

有鉴于此，本发明期望通过引入双启动寡核苷酸引物(DualPrimingOligonucleotide，DPO)设计技术，建立一种基于DPO技术的检测PDCoV的PCR方法，以提高检测的敏感性及特异性，实现对PDCoV的精准检测。

发明内容

本发明提供一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用，通过引入双启动寡核苷酸引物(DualPrimingOligonucleotide，DPO)设计技术，对PDCoV的基因序列进行比对，选取其高特异性序列进行DPO引物设计，建立一种针对PDCoV的高灵敏高特异检测方法，实现对PDCoV的精准检测，助力PDCoV的防控诊治。

为此，本发明第一方面提供猪德尔塔冠状病毒快速检测引物，所述引物包括：

上游引物：5'-TCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGIIIIITGGAAGTG-3'(SEQ ID NO.1)，

下游引物：5'-CATGATGCGAGGATCAGCCATAIIIIICTTCTCAG-3'(SEQ ID NO.2)，

其中，I表示次黄嘌呤核苷。

本发明第二方面提供猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，包括SEQ ID NO.1、SEQID NO.2所示的上下游引物，还包括阳性质控品、阴性质控品。

在本发明一实施例中，所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，反应体系中上下游引物反应终浓度为0.05～0.6μM。

在本发明一优选实施例中，所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，反应体系中上下游引物反应终浓度为0.1～0.6μM。

在本发明一实施例中，所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，反应条件包括：

在本发明一优选实施例中，所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，反应条件包括：

在本发明一实施例中，所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒检测敏感性可达7.47×10³copies/μL。

在本发明一实施例中，所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒可在样品中特异性鉴定出猪德尔塔冠状病毒，其中，所述样品包含有猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪轮状病毒、猪呼吸道冠状病毒病和猪塞内加谷病毒中的一种或多种。

本发明第三方面提供猪德尔塔冠状病毒快速检测试方法，包括以下步骤：

1)从待检样品中提取核酸；

2)以步骤1)所得核酸为模板，进行逆转录反应，得到以cDNA；

3)以步骤2)所得cDNA为扩增模板，利用本发明第一方面所述的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

4)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

在本发明一实施例中，步骤2)逆转录反应的反应条件如下：

在本发明一实施例中，步骤4)所述琼脂糖凝胶为1％琼脂糖凝胶。

本发明第四方面提供如本发明第一方面所述猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、如本发明第二方面所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒或如本发明第三方面所述猪德尔塔冠状病毒快速检测方法在检测猪德尔塔冠状病毒中的应用。

本发明提供的试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，且检测成本低廉，对检测仪器以及操作人员的水平要求不高，同时具备较高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪德尔塔冠状病毒的微量潜伏感染，因此，适用于对猪德尔塔冠状病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警，具有很好的应用价值，利于在养殖企业中得到应用和推广。

附图说明

图1为本发明实施例提供的猪德尔塔冠状病毒快速检测方法的引物退火温度优化结果，其中M为DNAMarker1000，1～6分别为：42℃、46℃、50℃、54℃、58℃和62℃；

图2为本发明实施例提供的猪德尔塔冠状病毒快速检测方法的引物浓度优化结果，其中M为DNAMarker1000，1～6分别为：0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM；

图3为本发明实施例提供的猪德尔塔冠状病毒快速检测方法的特异性试验结果，其中M为DNAMarker1000，1为阳性对照，2～7分别为：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪呼吸道冠状病毒病(PRCV)和猪塞内加谷病毒(SVV)样品，8为阴性对照；

图4为本发明实施例提供的猪德尔塔冠状病毒快速检测方法的敏感性试验结果，其中M为DNAMarker1000，1～8分别为的10倍梯度稀释的样品，其稀释度依次为：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8；

图5为本发明实施例提供的猪德尔塔冠状病毒快速检测方法对临床样品的检测结果，其中M为DNAMarker1000，1为阴性对照，2为阳性对照，3～22为临床样品。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

实施例1PCR快速检测方法构建

1、引物设计：

根据GenBank中登录的基因序列，使用Oligo6.0引物设计软件选择N基因作为引物设计区域，引物序列如下：

上游引物PDCoV-DPO-F：

5'-TCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGIIIIITGGAAGTG-3'(SEQ ID NO.1)，

下游引物PDCoV-DPO-R：

5'-CATGATGCGAGGATCAGCCATAIIIIICTTCTCAG-3'(SEQIDNO.2)，

其中，I表示次黄嘌呤核苷。

2、样本RNA的提取：

使用康宁生命科学(吴江)有限公司的体液病毒DNA/RNA制备试剂盒(货号:PID0320425)，按照说明书提取模板RNA，-70℃保存备用。

3、RNA反转录：

将步骤2提取制得的RNA为模板反转录制得cDNA，步骤与试剂如下：

4、PCR反应：

以步骤3制得的cDNA作为模板，使用湖南艾科瑞生物工程有限公司的2×AccurateTaq预混液(货号:AG11010)进行PCR扩增，反应体系如下：

反应条件如下：

5、检测结果的判定：取PCR产物5μL与loading Buffer 1μL混合。加入到琼脂糖凝胶电泳点样孔中。同时在样品孔旁加入5μL DL1000DNA Marker作对照，用100V-130V电压50mA进行电泳。15min-30min后于紫外光下观察结果。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，若能扩增出大小为263bp的单一目的条带，则判定该样本为猪德尔塔冠状病毒阳性。

6、基因克隆、含有目的基因质粒构建

提取猪德尔塔冠状病毒RNA，逆转录得cDNA，并进行PCR扩增靶目的基因，将扩增得到的靶基因PCR产物回收纯化与PMD-19T载体过夜连接后转化大肠杆菌DH5α。用质粒提取试剂盒提取转化长出的菌落质粒，作为检测方法的标准品阳性质粒。

7、测序鉴定

对获得质粒经PCR和双酶切鉴定，对含有目的基因的质粒送至广东温氏大华农生物科技有限公司测序，经过比对确认，得到阳性质粒。

8、PCR条件优化

对不同退火温度(42℃，46℃，50℃，54℃，58℃和62℃)和引物浓度(0.025μM，0.05μM，0.1μM，0.2μM，0.3μM，0.4μM，0.5μM和0.6μM)在梯度PCR仪上进行PCR扩增，摸索PCR的最佳反应条件。退火温度优化结果如图1所示，结果显示所用退火温度均能扩增出目的条带，表明DPO引物有效退火温度范围宽。引物浓度优化结果如图2所示，DPO引物有效浓度为：0.05～0.6μM，当DPO引物浓度0.1-0.6μM时，PCR扩增效果更优。

9、猪德尔塔冠状病毒快速检测方的特异性

按照步骤3、步骤4所述的逆转录及PCR反应进行检测，将样本模板RNA分别换成TGEV、PEDV、SADS-CoV和PoRV，PRCV、SVV样品，以本实验室检测阳性并经测序鉴定过的猪德尔塔冠状病毒样本为阳性对照，进行PCR检测，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图3所示，结果显示仅阳性对照泳道263bp处出现单一条带，说明该方法特异性好。

10、猪德尔塔冠状病毒快速检测方的敏感性

按照步骤3、步骤4所述的逆转录及PCR反应进行检测，以步骤9中的阳性样品RNA(7.47×10⁹copies/μL)按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8进行10倍梯度稀释，以去离子水为阴性对照，进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图4所示，结果显示稀释度为10^-5条带仍较明显，稀释度为10^-6条带仍有不明显但肉眼可见的条带，表明10^-6为为最低检测限，本发明提供的猪德尔塔冠状病毒快速检测方法最低检测到7.47×10³copies/μL。

11、临床样本检测

按照步骤3、步骤4所述的逆转录及PCR反应进行检测，以步骤9中的阳性对照RNA作为阳性对照，以去离子水为阴性对照，对22个疑似发生猪德尔塔冠状病毒的临床样品进行检测，模板RNA的提取及PCR反应参考步骤2和3，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图5所示。结果显示阴阳性对照成立，6个样品为PDCoV阳性。

综上所述，本发明提供的猪德尔塔冠状病毒快速检测的试剂盒具备较高的检测敏感性以及特异性，同时本发明提供的检测试剂盒对设备和人员技能要求较低，适用于对猪德尔塔冠状病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警，利于在养殖企业中得到应用和推广，可大幅增加猪德尔塔冠状病毒微量感染情况下的病原检出率，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，有利于对症下药实施正确的治疗方案，具有很好的应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaacgctag aggaagacct cagtggaagt g 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgatgcga ggatcagcca tacttctcag 30

Claims

1.一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物，其特征在于，所述引物包括：

上游引物：5'-TCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGIIIIITGGAAGTG-3'(SEQ ID NO.1)，

下游引物：5'-CATGATGCGAGGATCAGCCATAIIIIICTTCTCAG-3'(SEQ ID NO.2)，

其中，I表示次黄嘌呤核苷。

2.一种猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的上下游引物，还包括阳性质控品、阴性质控品。

3.如权利要求2所述的猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系中上下游引物反应终浓度为0.05～0.6μM。

4.如权利要求2所述的猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应条件包括：

5.如权利要求2所述的猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测敏感性可达7.47×10³copies/μL。

6.如权利要求2所述的猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可在样品中特异性鉴定出猪德尔塔冠状病毒，其中，所述样品包含有猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪轮状病毒、猪呼吸道冠状病毒病和猪塞内加谷病毒中的一种或多种。

7.一种猪德尔塔冠状病毒快速检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品中提取核酸；

2)以步骤1)所得核酸为模板，进行逆转录反应，得cDNA；

4)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

8.如权利要求1所述猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、如权利要求2所述猪德尔塔冠状病毒快速检测试剂盒或如权利要求7所述猪德尔塔冠状病毒快速检测方法在检测猪德尔塔冠状病毒中的应用。