CN111474263A - 一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒及检测方法，属于药物分析技术领域。为解决利巴韦林检测前处理过程复杂、耗时长的问题，本发明提供了一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒，包括含有磷酸酶的试剂A和蛋白沉淀剂配制的试剂B。本发明还提供了一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，包括确定高效液相检测条件、检测各浓度梯度标准液试样并绘制标准曲线；人红细胞样本前处理以及待测样本高效液相检测与数据处理。本发明前处理试剂盒样品前处理过程简单，将多种磷酸化利巴韦林去磷酸化，能够实现红细胞中利巴韦林总量的准确测定；利巴韦林快速检测方法灵敏度高、精确度高、准确度高，适用于大批量样品的定性、定量检测。

Description

一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒及检测方法。

背景技术

利巴韦林是一种人工合成的核苷类抗病毒药物，通过阻断病毒的再复制和扩散发挥广谱抗病毒作用，对于DNA病毒和RNA病毒均有效。临床上常用于治疗上呼吸道感染、肝炎、手足口病、水痘等由病毒感染引发的疾病。血液系统毒性是利巴韦林常见的不良反应，其中最主要的是溶血性贫血。人体内的利巴韦林会被平衡型核苷转运体(ENT)结合至细胞中，在细胞内磷酸化为多种磷酸盐，其中单磷酸利巴韦林和三磷酸利巴韦林被认为仍具备抗病毒活性。在有核细胞中，磷酸化利巴韦林会被去磷酸化酶去磷酸化，然后由ENT从细胞中消除。但红细胞作为无核细胞，缺乏去磷酸化酶，磷酸化利巴韦林会大量蓄积于红细胞内并消耗ATP，导致红细胞结构特征改变并溶血，这是利巴韦林诱发溶血性贫血的主要原因。研究表明，利巴韦林诱发溶血性贫血的风险与药物浓度密切相关，可通过调整利巴韦林用量降低该不良反应发生的风险，但调整给药剂量可能会影响利巴韦林的抗病毒效果，因此剂量的调整应以利巴韦林的治疗药物浓度监测结果为基准。

利巴韦林以磷酸盐的形式大量蓄积于红细胞中，浓度高于血浆几十倍，因此测定红细胞中的总利巴韦林对于评价人体内的利巴韦林水平更有价值。但现有检测方法存在利巴韦林与内源性物质难以分离、紫外响应值不高、灵敏度低的检测难点。红细胞内的利巴韦林以多种磷酸盐的形式存在，测定前需用磷酸酶进行孵育去磷酸化。现有文献中去磷酸化孵育方法需借助固相萃取(SPE)技术和氮吹技术对样本进行浓集除杂，方法复杂、成本高，且耗时较长。

发明内容

为解决利巴韦林检测前处理过程复杂、成本高、耗时长的问题，本发明提供了一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒及检测方法。

本发明的技术方案：

一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒，包括试剂A和试剂B，所述试剂A为磷酸酶含量不少于3.6Units/mL的磷酸酶孵育液；所述试剂B为蛋白沉淀剂。

进一步的，所述试剂A包括质量体积比为5mg:150μL:10μL:50μL的P864642磷酸酶、pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和去离子水；所述试剂B为质量浓度为20％的高氯酸。

进一步的，由5mg P864642磷酸酶、150μL pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、10μL pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和50μL去离子水组成的一份试剂A用于孵育50μL以内的人红细胞。

一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，步骤如下：

步骤一、配制利巴韦林浓度梯度标准液，取各浓度标准液按一定体积比分别与空白红细胞混匀，所得混悬液分别加入磷酸酶含量不少于3.6Units/mL的前处理试剂A于一定温度下进行孵育，然后加入由蛋白沉淀剂配制的试剂B终止孵育，离心所得上清液即为各浓度梯度标准液试样，确定高效液相检测条件并对各浓度梯度标准液试样进行检测，绘制利巴韦林高效液相检测标准曲线；

步骤二、人红细胞样本前处理：将由待测外周血分离得到的红细胞加入所述前处理试剂A中，一定孵育温度下对红细胞进行孵育；然后加入所述试剂B，利用试剂B中的蛋白沉淀剂终止孵育并沉淀蛋白，离心所得上清液即为待测样本；

步骤三、待测样本高效液相检测与数据处理。

进一步的，步骤一和步骤二所述前处理试剂A均包括质量体积比为5mg:150μL:10μL:50μL的P864642磷酸酶、pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和去离子水；所述试剂B均为质量浓度为20％的高氯酸。

进一步的，步骤一所述利巴韦林浓度梯度标准液的浓度依次为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1200μg/mL和2000μg/mL；所述浓度梯度标准液与空白红细胞的体积比为1:9；所述孵育温度为37℃，孵育时间为1h，所述离心条件为13000rpm，离心3～5min。

所述空白红细胞是由不含利巴韦林的外周血经4000rpm离心3～5min所得。

进一步的，步骤一所述高效液相检测条件为：色谱柱：Atlantis C18色谱柱(150mm×4.6mm，Waters)；水相：KH₂PO₄缓冲液，pH4.2；有机相：乙腈；梯度洗脱：水相:有机相＝100:0→95:5→100:0；柱温：35℃；检测波长：207nm；流速：0.9mL/min；进样量：40μL。

进一步的，步骤一所述绘制利巴韦林高效液相检测标准曲线是以利巴韦林的色谱峰面积为纵坐标，以红细胞中利巴韦林浓度为横坐标进行绘制，所得标准曲线为y＝0.8192x+17.785，R²＝0.9991，线性范围10.0-200μg/mL。

进一步的，步骤二所述前处理试剂A的用量为：由5mg P864642磷酸酶、150μL pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、10μL pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和50μL去离子水组成的一份试剂A用于孵育50μL以内的人红细胞。

进一步的，步骤二所述孵育温度为37℃，孵育时间为1h，所述离心条件为13000rpm，离心3～5min。

本发明的有益效果：

本发明提供的人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒，能够将人红细胞中多种磷酸化利巴韦林去磷酸化为利巴韦林，能够实现红细胞中利巴韦林总量的准确测定。本发明前处理试剂盒样品前处理过程简单，省略了固相萃取和氮吹等除杂浓集步骤，能同时快速处理大批量样品，主要试剂以工作液的形式提供，简化流程、节约成本并进一步缩短了前处理时间。

本发明建立的人红细胞中利巴韦林快速检测方法，解决了利巴韦林与内源性干扰物质在高效液相检测过程中难以分离、紫外响应值不高、检测灵敏度低等技术难点，实现了临床红细胞样本中利巴韦林的快速检测，为临床调整给药剂量，降低不良反应发生风险提供了重要参考。本发明方法简便、灵敏度高、精确度高、准确度高、可实行度高、价格低廉，适用于大批量样品的定性、定量检测。

附图说明

图1为实施例4待测红细胞样本的高效液相色谱图；

图2为对比例1待测红细胞样本的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1

本实施例提供了一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒，包括试剂A和试剂B，其中试剂A为磷酸酶含量不少于3.6Units/mL的磷酸酶孵育液，具体组分为质量体积比为5mg:150μL:10μL:50μL的P864642磷酸酶、pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和去离子水；试剂B为蛋白沉淀剂，具体组分为质量浓度为20％的高氯酸。

为方便使用、提高检测效率，将5mg P864642磷酸酶、150μL pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、10μL pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和50μL去离子水组成的一份试剂A置于2mL圆底独立试剂管中，每个试剂管中的试剂A可用于孵育50μL以内的人红细胞。试剂A置于圆底独立试剂管中需冻存于-20℃，使用前取出在室温融化并涡旋混匀。

试剂A用于孵育红细胞，将红细胞内磷酸利巴韦林的去磷酸化，以便实现红细胞中利巴韦林总量的准确测定。试剂B用于孵育结束后终止孵育反应并沉淀蛋白。本实施例提供的前处理试剂盒对红细胞样品的前处理仅包括孵育去磷酸化和终止孵育两个步骤，省略了固相萃取和氮吹等除杂浓集步骤，简化了处理流程，可实现人红细胞中利巴韦林的快速检测。试剂盒中主要试剂以工作液的形式提供，试剂A分装后能够同时快速处理大批量样品，节约成本，并进一步缩短了前处理时间。

实施例2

本实施例建立了一种人红细胞中利巴韦林高效液相检测方法，包括如下步骤：

(1)配制利巴韦林浓度梯度标准液：

精密称取利巴韦林，加入去离子水配制成2000μg/mL的利巴韦林储备液，再用去离子水进行梯度稀释，获得浓度依次为100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，800μg/mL，1200μg/mL和2000μg/mL的利巴韦林浓度梯度标准液，4℃储存。

(2)制备利巴韦林浓度梯度标准液试样：

采用EDTA管采集不含利巴韦林的空白外周血2-3mL，4000rpm离心3～5min，分离血浆与红细胞，得到不含利巴韦林的空白红细胞。

取利巴韦林浓度梯度标准液各5μL，分别加入45μL所得空白红细胞并混匀；将所得各混悬液分别加入实施例1提供的装有1份试剂A的试剂管中，充分涡旋1min。涡旋后的试剂管置于预热至37℃的水浴箱中孵育1h，向孵育后的试剂管中加入50μL实施例1提供的试剂B终止反应并沉蛋白，涡旋1min后13000rpm离心3～5min，分离上清液即为利巴韦林各浓度梯度标准液试样；

(3)确定高效液相检测条件：

仪器：赛默飞Thermo Ultimate 3000；

色谱柱：Atlantis C18色谱柱(150mm×4.6mm，Waters)；

水相：KH₂PO₄缓冲液，pH4.2；

有机相：乙腈；

梯度洗脱：水相:有机相＝100:0→95:5→100:0；

柱温：35℃；

检测波长：207nm；

流速：0.9mL/min；

进样量：40μL。

(4)绘制标准曲线：

按所确定的高效液相检测条件对所得利巴韦林各浓度梯度标准液试样进行高效液相检测，以利巴韦林的色谱峰面积为纵坐标，以红细胞中利巴韦林浓度为横坐标绘制标准曲线，所得利巴韦林高效液相检测标准曲线为：y＝0.8192x+17.785，R²＝0.9991，线性范围10.0-200μg/mL。

本试剂盒内磷酸酶含量有限，当利巴韦林测定结果超过200μg/g时，应考虑A组分去磷酸能力达到饱和，需将样本稀释后再使用本试剂盒进行孵育。

本实施例采用Atlantis C18色谱柱，增强对极性物质的保留，以确保实现利巴韦林与内源性物质的分离，解决了利巴韦林与内源性干扰物质在高效液相检测过程中难以分离、紫外响应值不高、检测灵敏度低等技术难点。

实施例3

本实施例提供了一种利用实施例1前处理试剂盒处理人红细胞样本的方法，步骤如下：

(1)采用EDTA管采集待测患者外周血2-3mL，4000rpm离心3～5min，分离血浆与红细胞；

(2)取出-20℃储存的内含试剂A的独立试剂管，室温融化后充分涡旋，加入待测红细胞50μL后，再次涡旋1min。

(3)将涡旋后试剂管置于预热至37℃的水浴箱中孵育1h；

(4)孵育结束后，向试剂管中加入50μL试剂B终止孵育反应并沉淀蛋白，涡旋1min后13000rpm离心3～5min，离心所得上清液即为待测样本。

实施例4

将实施例3经前处理获得的待测样本按实施例2确定的高效液相检测条件进行高效液相检测，得到图1所示的高效液相色谱图。由保留时间定性，图中RBV表示利巴韦林色谱峰；由峰面积定量，将利巴韦林色谱峰面积代入实施例3绘制的标准曲线方程，外标法定量，计算得出该红细胞样本中的利巴韦林含量为83.19μg/mL。

对比例1

本对比例为待测红细胞不经过磷酸酶孵育直接进行高效液相检测的方法，步骤如下：

(1)配制利巴韦林浓度梯度标准液：

精密称取利巴韦林，加入去离子水配制成2000μg/mL的利巴韦林储备液，再用去离子水进行梯度稀释，获得浓度依次为20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL的利巴韦林浓度梯度标准液，4℃储存。

(2)制备利巴韦林浓度梯度标准液试样：

采用EDTA管采集不含利巴韦林的空白外周血2-3mL，4000rpm离心3～5min，分离血浆与红细胞，得到不含利巴韦林的空白红细胞。

取利巴韦林浓度梯度标准液各5μL，分别加入45μL所得空白红细胞并混匀；将所得各混悬液分别加入50μL去离子水，涡旋1min，静置15min，涡旋30s，加入20μL 72％高氯酸，13000rpm离心2～3min，离心两次，分离上清液即为利巴韦林各浓度梯度标准液试样；

(3)确定高效液相检测条件：

仪器：赛默飞Thermo Ultimate 3000；

色谱柱：Atlantis C18色谱柱(150mm×4.6mm，Waters)；

水相：KH₂PO₄缓冲液，pH4.2；

有机相：乙腈；

梯度洗脱：水相:有机相＝100:0→95:5→100:0；

柱温：35℃；

检测波长：207nm；

流速：0.9mL/min；

进样量：40μL。

(4)绘制标准曲线：

按所确定的高效液相检测条件对所得利巴韦林各浓度梯度标准液试样进行高效液相检测，以利巴韦林的色谱峰面积为纵坐标，以红细胞中利巴韦林浓度为横坐标绘制标准曲线，所得利巴韦林高效液相检测标准曲线为：y＝0.8908x+26.691，R²＝0.9996，线性范围2.0-80μg/mL。

(5)待测红细胞样本的处理：

采用EDTA管采集来此实施例3同一位待测患者同一批次的外周血2-3mL，4000rpm离心3～5min，分离血浆与红细胞；

取50μL红细胞加入50μL去离子水，涡旋1min，静置15min，涡旋30s，加入20μL 72％高氯酸，13000rpm离心2～3min，离心两次，取上清液进样。

(6)高效液相检测及数据处理

按本对比例确定的高效液相检测条件进行高效液相检测，得到图2所示的高效液相色谱图，图中RBV表示利巴韦林色谱峰，将利巴韦林色谱峰面积代入本实施例绘制的标准曲线方程，经换算得到该红细胞样本中的利巴韦林含量为9.56μg/mL。

观察图1和图2中利巴韦林色谱峰的峰型可以发现，本发明建立的人红细胞中利巴韦林高效液相检测方法能够实现利巴韦林与内源性干扰物质的分离，符合检测方法的专属性要求，能够用于人红细胞中利巴韦林的精准测定。

但图2中的样本因未进行孵育等前处理，大量利巴韦林以磷酸盐形式存在，无法检测，导致利巴韦林峰面积较小，检测难度增加，并且不能反映人红细胞中利巴韦林的真实水平，不利于临床判断。

图1所示，经过本发明中前处理试剂盒孵育处理后，样本中利巴韦林含量明显增加，易于测定，且能反应患者红细胞中总利巴韦林的真实浓度。

经测定，同一红细胞样本，未孵育的红细胞中利巴韦林浓度为9.56μg/mL，经本发明中的试剂盒孵育后利巴韦林含量为83.19μg/mL，表明本发明中的试剂盒能够将红细胞中的磷酸利巴韦林去磷酸化，转化为利巴韦林后进行测定能够保证红细胞中利巴韦林总量的准确测定。本发明提供的前处理试剂盒和相配套的高效液相检测方法可用于评估人红细胞中的总利巴韦林水平，对于临床调整给药方案，规避不良反应有重大参考价值。

实施例6

本实施例验证了本发明提供的前处理试剂盒和相配套的高效液相检测方法的线性和灵敏度，具体方法为：

实施例2得到的利用本发明前处理试剂盒孵育过的红细胞样本中利巴韦林检测标准曲线：y＝0.8192x+17.785，R²＝0.9991，线性范围10.0-200μg/mL，定量下限为10.0μg/mL；

而对比例1得到的未经孵育的红细胞样本中利巴韦林检测标准曲线：y＝0.8908x+26.691，R²＝0.9996，线性范围2.0-80μg/mL，定量下限为2.0μg/mL。

实施例2和对比例1标准曲线的R²均大于0.9981，符合生物样本的测定要求。

实施例7

本实施例验证了本发明提供的前处理试剂盒和相配套的高效液相检测方法的精密度与回收率。精密度、回收率通过测定向空白人红细胞中加入已知量利巴韦林标准液制备的质控标准品而得出，具体方法为：

(1)配制含利巴韦林2μg/mL、20μg/mL、80μg/mL的红细胞样本，按照对比例1中非孵育前处理方法进行样本处理，每个浓度样本5份平行，在一天内按对比例1检测方法测定，代入标准曲线方程，所得的结果用于计算回收率和日内精密度；连续测定5天，所得的结果用于计算日间精密度。用相对标准偏差来表示精密度。

(2)配制含利巴韦林10μg/mL、80μg/mL、200μg/mL的红细胞样本，按照实施例3中试剂盒孵育前处理方法进行处理，每个浓度样本5份平行，在一天内按实施例2检测方法测定，代入标准曲线方程，所得的结果用于计算回收率和日内精密度；连续测定5天，所得的结果用于计算日间精密度。用相对标准偏差来表示精密度。

空白红细胞中添加三个浓度质控溶液的回收率和精密度见表1。

表1

由表1数据可知，本发明提供的前处理试剂盒和相配套的高效液相检测方法具有较好的精密度和回收率，可用于精确的定量分析。

实施例8

本实施例验证了本发明提供的前处理试剂盒和相配套的高效液相检测方法的稳定性，通过测定向空白红细胞中加入已知量的标准液制备而得的质控标准样品得出，具体方法为：

(1)配制含利巴韦林2μg/mL、20μg/mL、80μg/mL的红细胞样本，按照对比例1中非孵育前处理方法进行样本处理，每个浓度样本分成三组，分别置于三种处置条件下：(a)进样室中室温放置8h；(b)反复冻融3次；(c)-80℃保存30天。按对比例1检测方法对上述三种样本进行高效液相检测，代入标准曲线方程，所得的结果用于计算红细胞样品加标的稳定性RSD％，结果见表2。

(2)配制含利巴韦林10μg/mL、80μg/mL、200μg/mL的红细胞样本，按照实施例3中试剂盒孵育前处理方法进行处理，每个浓度样本分成三组，分别置于三种处置条件下：(a)进样室中室温放置8h；(b)反复冻融3次；(c)-80℃保存30天。按实施例2检测方法上述三种样本进行高效液相检测，代入标准曲线方程，所得的结果用于计算红细胞样品加标的稳定性RSD％，结果见表2。

表2

当红细胞样品加标的稳定性所得结果的RSD小于15％时，可认为样品稳定。由表2数据可知，本发明提供的前处理试剂盒和相配套的高效液相检测方法的稳定性符合标准，能够实现临床人红细胞样本中利巴韦林的快速准确检测，为临床调整给药剂量，降低不良反应发生风险提供了重要参考。

Claims (10)

1.一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒，其特征在于，包括试剂A和试剂B，所述试剂A为磷酸酶含量不少于3.6Units/mL的磷酸酶孵育液；所述试剂B为蛋白沉淀剂。

2.根据权利要求1所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒，其特征在于，所述试剂A包括质量体积比为5mg:150μL:10μL:50μL的P864642磷酸酶、pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和去离子水；所述试剂B为质量浓度为20％的高氯酸。

3.根据权利要求1或2所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测前处理试剂盒，其特征在于，由5mg P864642磷酸酶、150μL pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、10μL pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和50μL去离子水组成的一份试剂A用于孵育50μL以内的人红细胞。

4.一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一、配制利巴韦林浓度梯度标准液，取各浓度标准液按一定体积比分别与空白红细胞混匀，所得混悬液分别加入磷酸酶含量不少于3.6Units/mL的前处理试剂A于一定温度下进行孵育，然后加入由蛋白沉淀剂配制的试剂B终止孵育，离心所得上清液即为各浓度梯度标准液试样，确定高效液相检测条件并对各浓度梯度标准液试样进行检测，绘制利巴韦林高效液相检测标准曲线：

步骤二、人红细胞样本前处理：将由待测外周血分离得到的红细胞加入所述前处理试剂A中，一定孵育温度下对红细胞进行孵育；然后加入所述试剂B，利用试剂B中的蛋白沉淀剂终止孵育并沉淀蛋白，离心所得上清液即为待测样本；

步骤三、待测样本高效液相检测与数据处理。

5.根据权利要求4所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，其特征在于，步骤一和步骤二所述前处理试剂A均包括质量体积比为5mg:150μL:10μL:50μL的P864642磷酸酶、pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和去离子水；所述试剂B均为质量浓度为20％的高氯酸。

6.根据权利要求4或5所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，其特征在于，步骤一所述利巴韦林浓度梯度标准液的浓度依次为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1200μg/mL和2000μg/mL；所述浓度梯度标准液与空白红细胞的体积比为1:9；所述孵育温度为37℃，孵育时间为1h，所述离心条件为13000rpm，离心3～5min。

7.根据权利要求6所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，其特征在于，步骤一所述高效液相检测条件为：色谱柱：Atlantis C18色谱柱(150mm×4.6mm，Waters)；水相：KH₂PO₄缓冲液，pH4.2；有机相：乙腈；梯度洗脱：水相:有机相＝100:0→95:5→100:0；柱温：35℃；检测波长：207nm；流速：0.9mL/min；进样量：40μL。

8.根据权利要求7所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，其特征在于，步骤一所述绘制利巴韦林高效液相检测标准曲线是以利巴韦林的色谱峰面积为纵坐标，以红细胞中利巴韦林浓度为横坐标进行绘制，所得标准曲线为y＝0.8192x+17.785，R²＝0.9991，线性范围10.0-200μg/mL。

9.根据权利要求8所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，其特征在于，步骤二所述前处理试剂A的用量为：由5mg P864642磷酸酶、150μL pH值为7.9的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液、10μL pH值为4.0的1.0mol/L醋酸缓冲液和50μL去离子水组成的一份试剂A用于孵育50μL以内的人红细胞。

10.根据权利要求9所述一种人红细胞中利巴韦林快速检测方法，其特征在于，步骤二所述孵育温度为37℃，孵育时间为1h，所述离心条件为13000rpm，离心3～5min。

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