[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN111448216B - 新的抗hla-a2抗体及其用途 - Google Patents

新的抗hla-a2抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111448216B
CN111448216B CN201880074978.9A CN201880074978A CN111448216B CN 111448216 B CN111448216 B CN 111448216B CN 201880074978 A CN201880074978 A CN 201880074978A CN 111448216 B CN111448216 B CN 111448216B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hla
seq
antibody
domain
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880074978.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111448216A (zh
Inventor
周丽
T·亚伯
F·迈耶
M·利文斯
N·道森
C·拉马切
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sangamo Biotherapy France
University of British Columbia
Original Assignee
Sangamo Biotherapy France
University of British Columbia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangamo Biotherapy France, University of British Columbia filed Critical Sangamo Biotherapy France
Publication of CN111448216A publication Critical patent/CN111448216A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111448216B publication Critical patent/CN111448216B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的抗HLA‑A2抗体，以及包含所述HLA‑A2抗体的嵌合抗原受体。本发明还涉及表达所述嵌合受体抗原的免疫细胞，以及其治疗用途，特别是用于治疗或预防移植排斥或GVHD。

Description

新的抗HLA-A2抗体及其用途
技术领域
本发明涉及HLA-A2结合分子，特别是人源化抗HLA-A2抗体。本发明进一步涉及包含所述HLA-A2结合分子的重组分子，例如，如嵌合抗原受体(CAR)。本发明的另一个目的是包含所述CAR的工程化免疫细胞，例如调节性T细胞，及其在治疗方法中的用途。
发明背景
I类HLA抗原是在所有有核细胞上表达的多态性蛋白，并且是移植环境下免疫识别的关键靶标。事实上，I类HLA特异性T细胞和/或抗体的形成是同种异体移植物的急性和慢性排斥的主要风险因素，并且预形成的抗供体I类HLA抗体的存在可导致超急性排斥。因此，寻找对HLA I类蛋白的免疫应答的控制方法将是移植中的重大突破。
典型的HLA I类分子是多态性的，并由许多不同的等位基因编码，这些等位基因响应于感染的进化压力而进化。有三个基因座编码经典的I类HLA蛋白，命名为A、B和C基因座。在HLA-A基因座内，等位基因的HLA-A2家族是最大且最多变化的家族，已知人类中存在至少有31种不同的HLA-A2等位基因。有趣的是，与许多其它HLA等位基因家族相反，HLA-A2在所有人种群中都是常见的，并且发现于50％的高加索人和35％的非裔美国人中。许多HLA-A2等位基因仅有1-9个氨基酸不同，大多数多态性集中在肽结合槽周围。HLA-A2等位基因被进一步分组为两个主要分支：通过等位基因间转换事件衍生自A*0201或A*0205的那些。
利用调节性T(Treg)细胞的过继性(adoptive)免疫疗法作为控制对HLA蛋白和驱动移植排斥的其它抗原的不利免疫的方式是用于同种异体移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)的有希望的疗法。已有报道在同种异体造血干细胞移植(HSCT)后使用多克隆Treg细胞转移预防了移植物抗宿主病(GVHD)。还有报道使用Treg细胞转移维持了1型糖尿病中的c-肽水平。然而，值得注意的是，已经报道了可能存在与使用多克隆Treg细胞用于这种细胞疗法相关的全身免疫抑制的短暂风险。
来自动物研究的数据表明，使用Treg细胞的细胞疗法的效力和特异性可以通过使用抗原特异性细胞而显著增强。例如，在自身免疫模型中，抗原特异性Treg细胞在减少疾病方面优于多克隆Treg细胞：从胰腺淋巴结分离的或用胰岛抗原脉冲的Treg细胞在预防或治疗1型糖尿病方面明显优于多克隆Treg细胞，并且在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中，表达自身抗原特异性转基因T细胞受体(TCR)的Treg细胞在抑制中枢神经系统炎症方面优于多克隆Treg细胞。类似地，通过同种异体抗原刺激的体外扩增富集的或工程化以表达TCR转基因的同种异体抗原特异性Treg细胞在预防器官和组织移植物排斥方面比多克隆Treg细胞更有效。有一些证据表明，用同种异体抗原扩增的Treg细胞有效地预防GVHD，并且抗原特异性Treg细胞的体内诱导促进了对造血同种异体移植物的接受而没有GVHD。人源化小鼠模型显示了相似的结果：同种异体抗原扩增的人Treg细胞是比多克隆Treg细胞更有效的皮肤移植排斥的抑制剂。
过表达转基因TCR或抗原刺激的扩增以富集抗原特异性T细胞的替代方法是使用嵌合抗原受体(CAR)。在基于细胞的过继免疫疗法中，可以修饰从患者分离的免疫细胞以表达合成蛋白，所述合成蛋白使得细胞能够在随后转移回患者体内之后执行新的治疗功能。这种合成蛋白的一个实例是CAR。目前使用的CAR的实例是胞外识别结构域(例如，抗原结合结构域)、跨膜结构域和一个或多个胞内信号传导结构域的融合。在抗原接合时，CAR的胞内信号传导部分可以在免疫细胞中启动活化相关的应答。
本发明涉及表达特异性结合HLA-A2的CAR的免疫细胞，特别是免疫调节细胞，及其治疗用途。
发明概述
本发明涉及一种人源化抗HLA-A2抗体，其与BB7.2抗体或包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34及其任意组合的组，优选地选自包含A25、A29、A30及其任意组合的组的HLA-A亚型的反应性较低，其中
-重链可变区包含至少一个下列CDR：
VH-CDR1:SYHIQ(SEQ ID NO:1)或GYTFTSY(SEQ ID NO:4)
VH-CDR2:WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:2)或YPGDGS(SEQ ID NO:5)
VH-CDR3:EGTYYAMDY(SEQ ID NO:3)
或具有与SEQ ID NO：1-5有至少60％同一性的氨基酸序列的任何CDR，和/或
-轻链可变区包含至少一个下列CDR：
VL-CDR1:RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:6)
VL-CDR2:KVSNRFS(SEQ ID NO:7)
VL-CDR3:FQGSHVPRT(SEQ ID NO:8)
或具有与SEQ ID NO：6-8有至少60％同一性的氨基酸序列的任何CDR。
在一个实施方案中，重链可变区包含至少一个权利要求1中定义的CDR，并且轻链可变区包含至少一个权利要求1中定义的CDR。
在一个实施方案中，
-重链可变区包含以下CDR：SYHIQ(SEQ ID NO：1)、WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ IDNO：2)和EGTYYAMDY(SEQ ID NO：3)；或GYTFTSY(SEQ ID NO：4)、YPGDGS(SEQ ID NO：5)和EGTYYAMDY(SEQ ID NO：3)或具有与所述SEQ ID NO：1-5有至少60％同一性的氨基酸序列的任何CDR，并且
-轻链可变区包含以下CDR：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：6)、KVSNRFS(SEQ IDNO：7)和FQGSHVPRT(SEQ ID NO：8)或任何具有与所述SEQ ID NO：6-8有至少60％同一性的氨基酸序列的CDR。
在一个实施方案中，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：9，或与所述SEQ IDNO：9具有至少60％同一性的任何氨基酸序列。
在一个实施方案中，轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：10，或与所述SEQ IDNO：10具有至少60％同一性的任何氨基酸序列，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A。
在一个实施方案中，轻链可变区的氨基酸序列选自包含SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12和SEQ ID NO：13的组或与所述SEQ ID NO：11-13有至少60％同一性的任何氨基酸序列。
在一个实施方案中，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：9或与所述SEQ IDNO：9具有至少60％同一性的任何氨基酸序列，并且轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：10，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，优选地，轻链可变区的氨基酸序列选自包含SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的组或与所述SEQ ID NO：10-13具有至少60％同一性的任何氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗体是完整抗体、单链抗体、二聚体单链抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab)'2、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)，选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段，或选自由亲合体(affibody)、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、抗运载蛋白、avimer、fynomer、versabody或duocalin组成的组的抗体模拟物。
在另一个实施方案中，所述抗体是完整抗体、单链抗体、二聚体单链抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab)'2、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体，选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段，或选自由亲合体、alphabody、基于armadillo重复蛋白的支架、knottin、kunitz结构域肽、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、抗运载蛋白、avimer、fynomer、versabody或duocalin组成的组的抗体模拟物。
在一个实施方案中，所述抗体是scFv，优选具有序列SEQ ID NO：70-72或74-76的scFv。
本发明还涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
-包含如上文所述的人源化抗HLA-A2抗体的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-包含胞内信号传导结构域的胞质结构域。
本发明的另一个目的是编码如上文所述的CAR的核酸序列。
本发明的另一个目的是包含如上文所述的CAR或如上文所述的核酸序列的免疫细胞，其中所述免疫细胞优选是调节性T细胞。
本发明还涉及包含如上文所述的免疫细胞的组合物，其中优选地，所述组合物是药物组合物，并且还包含药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及如上文所述的免疫细胞，其用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受，其中优选地，所述耐受是对移植的器官或组织的耐受。
本发明还涉及如上所述的免疫细胞，其用于治疗器官或组织移植排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。
在一个实施方案中，受试者还接受免疫抑制剂。
本发明还涉及如本发明中所述的免疫细胞与至少一种免疫抑制剂的组合，用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受，或用于在有需要的受试者中治疗器官或组织移植排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。
本发明还涉及一种部件的试剂盒，该试剂盒在第一部件中包括如在本发明中描述的免疫细胞和/或用于制备此类免疫细胞的试剂(例如，编码本公开的抗HLA-A抗体或CAR的核酸或载体)，并且在第二部件中包括至少一种免疫抑制剂。
本发明还涉及用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的免疫细胞，其中优选地所述耐受是对移植的器官或组织的耐受。
本发明还涉及在有需要的受试者中治疗器官或组织移植排斥或移植物抗宿主病(GVHD)的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本发明中所述的免疫细胞。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括向受试者施用至少一种免疫抑制剂。
定义
在本发明中，下列术语具有下列含义：
在本发明的上下文中，使用下列常见核酸碱基的缩写。"A"指腺嘌呤，"C"指胞嘧啶，"G"指鸟嘌呤，"T"指胸腺嘧啶，"U"指尿嘧啶。
术语“一”("a")和“一个”("an")是指一个或多于一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如，"一个元件"是指一个元件或多于一个元件。
术语"约"在提及可测量值例如量、持续时间等时，意指包含指定值的±20％或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％的变化，只要这样的变化适于进行所公开的方法。
本文所用的术语"活化"是指T细胞(例如调节性T细胞)的状态，其已被充分刺激以诱导可检测的细胞应答。活化也可以与可检测的效应子功能(例如细胞因子产生或抑制活性)相关。术语"活化的"调节性T细胞尤其是指能够抑制免疫应答的调节性T细胞。
"Adnectin"，也称为monobody，是本领域公知的，是指设计用于以高亲和力和特异性结合抗原的蛋白。它们属于统称为"抗体模拟物"的分子类型。
如本文所用，"Alphabody"，也可以称为细胞穿透性Alphabody，是指由经工程化以结合多种抗原的10kDa小蛋白组成的一类抗体模拟物。alphabody能够到达并结合胞内蛋白靶标。
"亲合体"是本领域熟知的，并且指基于58个氨基酸残基的蛋白结构域的亲和蛋白，其衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一。
如本文所用，术语"亲和力"是指两种试剂可逆结合的平衡常数，并表示为解离常数(Kd)。亲和力可以是抗体对不相关氨基酸序列的亲和力的至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍大或更大。抗体对靶蛋白的亲和力可以是例如从约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、从约100nM至约1皮摩尔(pM)、或从约100nM至约1飞摩尔(fM)或更大。
"Affilin"是本领域公知的，并且指设计用于选择性结合抗原的人工蛋白。它们在其对抗原的亲和力和特异性方面类似于抗体，但在结构上不类似，这使得它们成为一类抗体模拟物。
术语"同种异体的"是指源自与引入材料的个体具有相同物种的不同个体的任何材料。当在一个或多个基因座的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可能在遗传上充分不同从而抗原性地相互作用。
术语"抗体"和"免疫球蛋白"(Ig)可互换使用，并且是指来源于与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆的、多链或单链的、或完整的免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或重组来源。术语"抗体"还包含多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。抗体还可以是免疫球蛋白分子的多聚体，例如免疫球蛋白分子的四聚体。
基本的四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。来自任何脊椎动物物种的L链可以根据它们的恒定结构域(CL)的氨基酸序列被归类至两种明显不同的类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。根据免疫球蛋白重链恒定区(CH)的氨基酸序列，可以将其分为不同的种类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别被命名为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的重链。基于CH序列和功能的相对较小差异，将γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N末端具有可变结构域(VH)，随后对于α链和γ链中的每一条是三个恒定结构域(CH)，对于μ同种型和ε同种型则为四个CH结构域。每条L链在N末端具有可变结构域(VL)，随后在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一个恒定区(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。IgM抗体由五个基本的异四聚体单元以及另外的称为J链的多肽组成，并且因此含有十个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可聚合形成多价装配物，其包含2-5个基本的4链单元和J链。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。对于不同类型抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology，第8版，DanielP.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页,第6章。
术语"抗体片段"是指完整抗体的至少一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，其保留与抗原表位特异性相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链抗体分子，特别是scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CHI结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体，例如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体，例如包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，以及抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可掺入到单结构域抗体、巨抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、纳米抗体、胞内抗体(intrabody)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136，2005)。抗原结合片段也可以移植到基于例如III型纤维连接蛋白的多肽的支架中(参见美国专利号：6,703,199，其描述了纤维连接蛋白多肽的微抗体)。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，和残留的"Fc"片段，其名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab')2片段，其大致相当于两个二硫键连接的Fab片段，具有二价抗原结合活性，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有额外的几个残基，包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是指恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab'。F(ab')2抗体片段最初是作为中间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
如本文所用，"抗体的功能片段或类似物"是具有与全长抗体相同的定性生物活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能片段或类似物是能以抑制或基本上降低这种分子结合高亲和力受体FcεRI的能力的方式结合IgE免疫球蛋白的片段或类似物。
术语"抗体重链"是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较大的一种，并且其通常决定抗体所属的类别。
术语"抗体轻链"是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是两种主要的抗体轻链同种型。
"抗运载蛋白(anticalin)"是本领域熟知的，指抗体模拟技术，其中结合特异性来自脂质运载蛋白。抗运载蛋白也可为双靶向蛋白的形式，称为Duocalin。
术语"抗原"或"Ag"是指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以作为抗原。此外，抗原可衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码本文所用的术语"抗原"。此外，本领域技术人员将理解，抗原不一定必然仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫应答的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不必由"基因"编码。显而易见的是，抗原可以是合成的，或者可以源自生物样品，或者可以是多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、细胞或具有其它生物组分的液体。
术语"抗原呈递细胞"或"APC"是指在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHCs)复合的外源抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞等)。T细胞可以利用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用，"基于armadillo重复蛋白的支架"是指对应于基于armadillo重复蛋白的人工肽结合支架的一类抗体模拟物。armadillo重复蛋白的特征在于由约42个氨基酸的串联armadillo重复组成的armadillo结构域，其介导与肽或蛋白的相互作用。
"Atrimer"是本领域熟知的，并且指靶蛋白的结合分子，其三聚化为其生物活性的先决条件。与其它抗体模拟物支架相比，它们相对较大。
术语"自体的"是指源自相同个体的任何材料，所述材料随后将被再引入所述相同个体。
"Avimer"是本领域公知的，并且指抗体模拟技术。
"DARPin"(设计的锚蛋白重复蛋白)是本领域公知的，并且指开发用于利用非抗体多肽的结合能力的抗体模拟DRP(设计的重复蛋白)技术。
本文所用的术语"BB7.2"是指鉴定为ATCC保藏号HB-82的鼠杂交瘤。BB7.2杂交瘤细胞分泌IgG2bκ同种型的鼠单克隆抗体(例如BB7.2抗体)，其表征在Parham，P.等人和Hilton等人(Parham，P.等人，1981；Hilton等人，2013)。BB7.2抗体是可商购的，例如购自Abcam(目录参考号：ab74674)、Thermo Fisher Scientific(目录参考号：17-9876-42)或Santa Cruz Biotechnology(目录参考号：sc-32236)。BB7.2抗体的六个互补决定区(CDR)的氨基酸序列如下：
-重链CDR1(HCDR1)：SYHIQ(SEQ ID NO：62)；
-重链CDR2(HCDR2)：WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO：63)；
-重链CDR3(HCDR3)：EGTYYAMDY(SEQ ID NO：64)；
-轻链CDR1(LCDR1)：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：65)
-轻链CDR2(LCDR2)：KVSNRFS(SEQ ID NO：66)；
-轻链CDR3(LCDR3)：FQGSHVPRT(SEQ ID NO：67)。
如本文所用，"BB7.2抗体"是具有BB7.2分泌的单克隆抗体的VH(SEQ ID NO：9)和VL(SEQ ID NO：10)的抗体。BB7.2抗体可以是具有BB7.2分泌的单克隆抗体的VH和VL的完整抗体或其片段，例如具有BB7.2分泌的单克隆抗体的VH和VL的scFv。
术语"结合"是指两个分子之间的直接缔合，例如由于共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用，包括相互作用如盐桥和水桥。非特异性结合是指亲和力小于10-7M的结合，例如亲和力为10-6M、10-5M、10-4M等。
如本文所用，"5'帽"(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久被添加到真核信使RNA的"前"端或5'末端。5'帽由与第一个转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于核糖体的识别和对抗RNase的保护至关重要。Cap添加与转录偶联，并且在转录上共同发生，使得彼此相互影响。转录开始后不久，正在合成的mRNA的5'末端被与RNA聚合酶相连的帽合成复合物结合。该酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成以多步生化反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能性，例如其稳定性或翻译效率。
"嵌合抗体"是一种抗体分子，其中(A)恒定区(即重链和/或轻链)或其部分被改变、替代或交换，使得抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)连接；或(b)用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、置换或交换可变区或其部分。嵌合抗体还包括灵长类化的抗体，特别是人源化的抗体。此外，嵌合抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。进一步的细节，参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992).(see U.S.Pat.No.4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。
术语"嵌合受体"或"嵌合抗原受体"或"CAR"指一种多肽或一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两种，当在免疫细胞中时，其为细胞提供对靶配体的特异性并提供胞内信号产生。在一些实施方案中，所述一组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，嵌合受体是包含该组多肽的嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子存在时可以将多肽彼此偶联，例如可以将配体结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，嵌合受体在嵌合受体融合蛋白的氨基末端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个实施方案中，嵌合受体还包含在胞外配体结合结构域的N-末端的前导序列，其中在嵌合受体的细胞加工和定位到细胞膜的过程中，前导序列任选地从配体结合结构域切割。
术语"保守序列修饰"指不显著影响或改变含有氨基酸序列的蛋白的生物学功能的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入蛋白。"保守取代"是其中一个氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸取代，从而肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性本质基本上不变。因此，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性替代是本领域技术人员公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。氨基酸取代可进一步基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守性改变的其它氨基酸组包括：(1)Ala，Pro，Gly，Glu，Asp，Gln，Asn，Ser，Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；(3)Val，Ile，Leu，Met，Ala，Phe；(4)Lys、Arg、His；和(5)Phe，Tyr，Trp，His。具有相似侧链的其它氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的抗体或嵌合受体中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基取代，并且可以测试改变的抗体或嵌合受体与HLA-A2的结合。
术语"组成型启动子"是指当与编码基因产物或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下，在细胞中引起基因产物产生的核苷酸序列。
术语"共刺激分子"指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以由下列蛋白家族代表：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化NK细胞受体。
"细胞毒性细胞"包括细胞毒性CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
如本文所用的术语"衍生自"表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并且不意味着或包括对衍生自第二分子的第一分子的方法或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的胞内信号传导结构域的情况下，胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，从而具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它不意味着或包括对产生胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它不意味着，为了提供胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并缺失不需要的序列，或施加突变以到达胞内信号传导结构域。
术语"双抗体"指通过构建在VH和VL结构域之间具有短连接子(约5-10个残基)的scFv片段，从而实现V结构域的链间而非链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段，而制备的小抗体片段。双特异性双抗体是两个"交叉"scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更充分地描述于例如EP0404097；Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)。
"结构域抗体"是本领域公知的，并且指抗体的最小功能性结合单位，对应于抗体重链或轻链的可变区。
术语"编码"是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的在生物过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质，所述多核苷酸具有确定的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。因此，如果对应于所述基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白，则该基因、cDNA或RNA编码蛋白。当编码基因或cDNA的蛋白或其它产物时，可以指编码链(与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列)和非编码链(用作基因转录或cDNA的模板)两者。除非另有说明，"编码氨基酸序列的核苷酸序列"包括彼此是简并形式的并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语"编码蛋白或RNA的核苷酸序列"也可以包括内含子，其程度为编码蛋白的核苷酸序列在某些形式中可以含有内含子。
术语"内源的"是指来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
术语"工程化的"或"修饰的"可互换使用，并且是指已经转染、转化或转导的细胞。
"Evasin"是本领域公知的，并且指一类趋化因子结合蛋白。
术语"外源的"是指引入生物体、细胞、组织或系统中的或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何材料。
术语"表达"是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语"表达载体"指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其它元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括但不限于粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其引入重组多核苷酸。
抗体的"Fc"片段包含通过二硫键连接在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
"框架"或"FR"残基是除本文定义的高变区残基以外的可变区残基。
"Fv"是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密的非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中产生六个高变环(H和L链各三个环)，其为抗原结合贡献氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整的结合位点。
"Fynomer"是本领域公知的，并且指属于抗体模拟物类别的蛋白。由于它们的高热稳定性和降低的免疫原性，它们是有吸引力的结合分子。
本文所用的术语"移植物抗宿主病"或"GVHD"指接受来自遗传学上不同的人的移植组织后的医学并发症。捐献组织(移植物)中的免疫细胞将受体(宿主)识别为外来物。然后，移植的免疫细胞攻击宿主的体细胞。GVHD通常与干细胞移植相关；然而，该术语包括由其它形式的组织移植物产生的GVHD。GVHD也可在输血后发生。
如本文所用的"HLA-A亚型"指由HLA-A基因的等位基因编码的蛋白。本文所用的术语"HLA-A*25:01"是指根据由WHO HLA系统因子委员会(WHO Committee for Factors ofthe HLA System)于2010年形成的HLA命名体系，以"HLA-A*25:01"命名的HLA蛋白。术语"HLA-A*29:02"和"HLA-A*30:01"分别指名称为"HLA-A*29:02"和"HLA-A*30:01"的HLA蛋白。
本文所用的术语"HLA-A2"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座的HLA-A*02等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的人白细胞抗原(HLA)蛋白。术语"HLA-A2"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*02抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*02抗原类型的其他名称包括"HLA-A2"、HLA-A02"、"HLA-A*2"。已经形成了鉴定由该等位基因家族编码的HLA蛋白的不同的命名系统，包括WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统。术语"HLA-A2"是指由具有根据该命名体系名称以"HLA-A*02"开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以"HLA-A*02:01"、"HLA-A*02:02"、"HLA-A*02:03"、"HLA-A*02:04"、"HLA-A*02:05"、"HLA-A*02:06"、"HLA-A*02:07"、"HLA-A*02:08"、"HLA-A*02:09"、"HLA-A*02:10"和"HLA-A*02:11"开头的名称。等位基因名称可以是斜体的。以"HLA-A*02"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。术语"HLA-A2"也指根据该命名体系以"HLA-A*02"开头的命名所鉴定的HLA蛋白，包括但不限于命名"HLA-A*02:01"、"HLA-A*02:02"、"HLA-A*02:03"、"HLA-A*02:04"、"HLA-A*02:05"、"HLA-A*02:06"、"HLA-A*02:07"、"HLA-A*02:08"、"HLA-A*02:09"、"HLA-A*02:10"和"HLA-A*02:11"。
本文使用的术语"抗HLA-A2抗体"指优先或特异性地结合HLA-A2的抗体。
本文中使用的术语"HLA-A*03"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*03等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*03"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*03抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*03抗原类型的其他名称包括"HLA-A03"和"HLA-A3"。术语"HLA-A*03"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*03："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*11"、"HLA-A11"和"A11"均是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*11等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*11"、"HLA-A11"和"A11"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*11抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*11抗原类型的其他名称包括"HLA-A11"。术语"HLA-A*11"、"HLA-A11"和"A11"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*11："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*23"、"HLA-A23"和"A23"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*23等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*23"、"HLA-A23"和"A23"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*23抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*23抗原类型的其他名称包括"HLA-A23"。术语"HLA-A*23"、"HLA-A23"和"A23"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*23："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*25"、"HLA-A25"和"A25"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*25等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*25"、"HLA-A25"和"A25"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*25抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*25抗原类型的其他名称包括"HLA-A25"。术语"HLA-A*25"、"HLA-A25"和"A25"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*25："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*26"、"HLA-A26"和"A26"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*26等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*26"、"HLA-A26"和"A26"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*26抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*26抗原类型的其他名称包括"HLA-A26"。术语"HLA-A*26"、"HLA-A26"和"A26"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*26："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*29"、"HLA-A29"和"A29"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*29等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*29"、"HLA-A29"和"A29"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*29抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*29抗原类型的其他名称包括"HLA-A29"。术语"HLA-A*29"、"HLA-A29"和"A29"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*29："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*30"、"HLA-A30"和"A30"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*30等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*30"、"HLA-A30"和"A30"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*30抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*30抗原类型的其他名称包括"HLA-A30"。术语"HLA-A*30"、"HLA-A30"和"A30"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*30："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*31"、"HLA-A31"和"A31"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*31等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*31"、"HLA-A31"和"A31"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*31抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*31抗原类型的其他名称包括"HLA-A31"。术语"HLA-A*31"、"HLA-A31"和"A31"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*31："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*33"、"HLA-A33"和"A33"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*33等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*33"、"HLA-A33"和"A33"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*33抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*33抗原类型的其他名称包括"HLA-A33"。术语"HLA-A*33"、"HLA-A33"和"A33"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*33："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*34"、"HLA-A34"和"A34"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*34等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*34"、"HLA-A34"和"A34"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型被识别为属于HLA-A*34抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*34抗原类型的其他名称包括"HLA-A34"。术语"HLA-A*34"、"HLA-A34"和"A34"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*34："开头的等位基因编码的HLA蛋白。
非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、scFv、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体及其抗体片段大部分是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中受体互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基所取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既未在受体抗体中发现也未在引入的CDR或框架序列中发现的残基。设计这样的抗体以维持衍生结合区的非人抗体的结合特异性，但避免针对非人抗体的免疫反应。这些修饰可以进一步细化和优化抗体或抗体片段的性能。一般而言，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上全部的至少一个且通常为两个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且FR区的全部或重要部分是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体或抗体片段也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节，参见Jones等人，Nature，321:522-525，1986；Reichmann等人，Nature，332:323-329，1988；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593-596，1992。
"全人"指免疫球蛋白，例如抗体或抗体片段的整个分子是人源的或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。这种抗体可以从已经被工程化以产生应答抗原激发的特异性人抗体的转基因小鼠或其它动物中获得(参见，例如Green等人，(1994)Nature Genet 7:13；Lonberg等人，(1994)Nature 368:856；Taylor等人，(1994)Int Immun6:579，其全部内容通过引用并入本文)。全人抗体可以通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建，这些均是本领域熟知的(参见，例如McCafferty等人，(1990)Nature348:552-553)。人抗体还可以通过体外活化的B细胞产生(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，其通过引用整体并入本文)。
术语"高变区"当在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如，当根据Kabat编号系统编号时，VL中的大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及VH中的大约31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))；和/或来自"高变环"的那些残基(例如，当根据Chothia编号系统编号时，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中的残基26-32(H1)、52-56(H2)和95-15101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自"高变环"/CDR的那些残基(例如，当根据IMGT编号系统编号时，VL中的残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3)，和VH中的残基27-38(H1)、56-65(H2)和105-120(H3)；Lefranc，M.P.等人，Nucl.AcidsRes.27:209-212(1999)，Ruiz，M.等人，Nucl.Acids Res.28:219-221(2000))。任选地，当根据AHo编号时，抗体在以下点中的一个或多个点上具有对称插入：VL中的28、36(L1)、63、74-75(L2)和123(L3)和VH中的28、36(H1)、63、74-75(H2)和123(H3)(Honneger，A.和Plunkthun，A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001))。
当用于两个或更多个多肽或核酸序列的序列之间的关系时，术语"同一性"或"同源性"是指多肽或核酸序列之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基或核苷酸残基的序列段之间的匹配数目所确定。"同一性"测量由特定数学模型或计算机程序(即"算法")处理的具有缺口比对(如果有的话)的两个或更多个序列的较小者之间的相同匹配的百分比。当两个分子中的亚单位位置均被相同的单体亚单位占据时，例如，如果两个DNA分子中的位置均被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的正函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，在长度为十个亚单位的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。相关多肽或核酸序列的同一性可以容易地通过已知方法计算。这些方法包括但不限于以下所描述：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part1，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New 10Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M.Stockton Press，New York，1991；和Carillo等人，SIAM J.Applied Math.48，1073(1988)。设计用于确定同一性的优选方法以在测试的序列之间给出最大匹配。确定同一性的方法在公众可获得的计算机程序中描述。用于确定两个序列之间同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.\2，387(1984)；Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，Wis.)，BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.MoI.Biol.215，403-410(1990))。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLASTManual，Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等人，见上)公开获得。也可使用熟知的Smith Waterman算法来确定同一性。
如本文所用，术语"免疫细胞"通常包括源自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)。免疫细胞的实例包括但不限于淋巴细胞(T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)和衍生自骨髓的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)。
如本文所用，术语"免疫效应细胞"是指处于能够发动特异性免疫应答的形式的免疫系统的细胞。
如本文所用，术语"免疫应答"包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性的免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括间接受T细胞活化影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答性细胞例如巨噬细胞的活化。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞，例如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Thl和Th2细胞)；抗原呈递细胞(例如，专职性抗原呈递细胞，如树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞，和非专职性抗原呈递细胞，如角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
本文所用术语"免疫适应(immune accommodation)"是指移植受体的一种状况，其中尽管受体中存在对器官或组织移植物特异的抗体，但器官或组织移植物仍正常发挥功能。
如本文所用，术语"免疫学耐受"或"免疫耐受"是指对一定比例的受治疗受试者进行的方法，其中与未受治疗的受试者相比，a)特异性免疫应答水平降低(认为至少部分由抗原特异性效应T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗体或其等价物介导)；b)特异性免疫应答的发作或进展延迟；或c)特异性免疫应答的发作或进展的风险降低。当与其它抗原相比相对于某些抗原优先引起免疫学或免疫耐受时，发生"特异性"免疫学或免疫耐受。
术语"诱导型启动子"是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才引起细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
如本文所用，"指导材料"包括出版物、记录、图表或任何其它表达介质，其可用于传达本发明的组合物和方法的使用。本发明的试剂盒的指导材料可以例如附着于含有本发明的抗体、细胞和/或组合物的容器，或与含有本发明的抗体、细胞和/或组合物的容器一起运送。或者，指导材料可以与容器分开运输，目的是指导材料和抗体、细胞和/或组合物由接受者合作使用。
"完整"抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
如本文所用，术语"胞内信号传导结构域"是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含有嵌合受体的细胞的免疫功能的信号。嵌合受体-T细胞中的免疫功能的实例可包括细胞溶解活性、抑制活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。
如本文所用，"体外转录的RNA"是指已经在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
术语"分离的"是指改变或去除天然状态。例如，在活的动物中天然存在的核酸或肽不是分离的，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是分离的。分离的核酸或肽可以以基本纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。通常，分离的核酸或肽的制剂含有至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、大于95％纯、大于96％纯、大于97％纯、大于98％纯或大于99％纯的核酸或肽。
"分离的抗体"是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分是可能干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白成分。在优选的实施方案中，抗体是纯化的：(1)达到通过Lowry方法测定的大于95％(重量)的抗体，最优选大于99％(重量)；(2)达到足以通过使用转杯测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)达到通过使用考马斯蓝或优选银染在还原或非还原条件下的SDS-PAGE的均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位的抗体，因为抗体天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
"分离的核酸"或"分离的核酸序列"是基本上与其他基因组DNA序列以及天然序列天然地伴随的蛋白或复合物如核糖体和聚合酶分离的核酸。该术语包括从其天然存在的环境中移出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指最初分离的核酸，并且不排除后来人工加入到分离的核酸中的基因或序列。
"分离的多肽"是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。在优选的实施方案中，分离的多肽将被纯化(1)达到通过Lowry方法所测定的大于95％(重量)的多肽，最优选大于99％(重量)，(2)达到足以通过使用转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)达到通过使用考马斯蓝或优选银染在还原或非还原条件下的SDS-PAGE的均质。分离的多肽包括重组细胞内原位的多肽，因为多肽天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
如本文所用，"knottin"(其也可称为胱氨酸-knot抑制剂)是指包含含有三个二硫键的蛋白结构基序的抗体模拟物。
如本文所用，"Kunitz结构域肽"是指一种类型的抗体模拟物，并且是基于抑制蛋白酶功能的蛋白的活性结构域。
术语"慢病毒"指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。慢病毒的实例包括但不限于HIV、SIV和FIV。
术语"慢病毒载体"指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其它实例包括但不限于来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。
术语"配体"是指配体/受体对的成员，并与该对的另一成员结合。
如本文所用，术语"单克隆抗体"指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，群体中包含的各个抗体是相同的，除了可能以微量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以在不被其它抗体污染的情况下合成。修饰语"单克隆"不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，Nature，256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。"单克隆抗体"也可以使用例如，Clackson等人，Nature，352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。本文的单克隆抗体包括"嵌合"抗体。
术语"核酸"或"多核苷酸"是指单链或双链形式的通过磷酸二酯键共价连接的核苷酸的聚合物，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合性质，并且代谢方式与天然存在的核苷酸相似。除非另有说明，特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
"纳米抗体"是本领域熟知的，并且指衍生自抗体的治疗性蛋白，其含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。
"天然序列"多核苷酸是具有与源自自然的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。"天然序列"多肽是与天然来源(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列的多核苷酸和多肽可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成手段产生。
术语"有效地连接"或"转录控制"是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列有效地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效地连接。有效地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如，在需要连接两个蛋白编码区的情况下，位于相同的阅读框中。
如本文所用，术语"手术耐受性"是指在能够对包括感染在内的其它攻击做出应答的免疫活性宿主中，在至少1年内没有任何免疫抑制药物治疗的情况下，存在稳定的移植功能且缺乏组织学排斥(包括急性或慢性排斥)现象的临床情况。
术语"肽"、"多肽"和"蛋白"可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。多肽不限于特定长度：它必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含多肽序列的氨基酸最大数目没有限制。肽、寡肽和蛋白包括在多肽的定义内，并且除非另外特别指出，否则这些术语在本文中可互换使用。如本文所用，该术语指短链(其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体)和长链(其在本领域中通常被称为蛋白，其存在许多类型)。在一个实施方案中，如本文所用，术语"肽"是指通过肽键连接在一起的氨基酸的线性聚合物，优选具有小于约50个氨基酸残基的链长；"多肽"是指通过肽键连接在一起的至少50个氨基酸的线性聚合物；蛋白具体指由一种或多种任选糖基化的肽或多肽形成的且任选由非多肽辅因子形成的功能实体。该术语也不是指或排除多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其它修饰，包括天然存在的和非天然存在的。多肽可以是完整的蛋白或其子序列。"多肽"包括例如生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。本发明中的目的特定多肽是包含CDR并能够结合抗原的氨基酸亚序列。
术语"药学上可接受的赋形剂"或"药学上可接受的载体"是指当施用于动物、优选人时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人类给药，制剂应满足管理机构例如FDA局或EMA所要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用，"poly(A)"是与mRNA连接的一系列单磷酸腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一个优选实施方案中，polyA是50至5000个单磷酸腺苷，优选大于或等于64个，更优选大于或等于100个，最优选大于或等于300或400个单磷酸腺苷。poly(A)序列可以化学或酶促修饰，以调节mRNA的功能性，例如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，"聚腺苷酸化"是指聚腺苷酰部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端聚腺苷酸化。3'聚腺苷酸尾是通过聚腺苷酸聚合酶的作用加到pre-mRNA上的腺嘌呤核苷酸的长序列(通常为几百)。在高等真核生物中，将poly(A)尾加到含有特定序列即聚腺苷酸化信号的转录物上。poly(A)尾和与其结合的蛋白有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核输出和翻译也是重要的。多聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即发生在细胞核中，但另外也可以稍后发生在细胞质中。转录终止后，mRNA链通过与RNA聚合酶相关的内切核酸酶复合物的作用而被切割。切割位点的特征通常在于切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，将腺苷残基加到切割位点的游离3'端。
术语"启动子/调控序列"是指由细胞的合成机制或导入的合成机制识别的核酸序列(例如DNA序列)，其是启动多核苷酸序列的特异性转录从而允许表达与启动子/调控序列有效地连接的基因产物所需要的。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其它情况下，该序列也可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其它调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
如本文所用，术语"反应性"是指抗体与分子(例如，特异性结合分子)反应(即结合)的能力。当第一抗体与第二抗体相比对分子(例如HLA分子)表现出降低的结合性时，第一抗体与第二抗体相比对分子具有"较低的反应性"。用于容易地比较第一和第二抗体对一种或多种特定HLA分子的反应性的方法是已知的。本文实施例部分提供了一种示例性方法，其中使用单抗原珠(/>Single Antigen beads，One Lambda)来确定抗体与特定HLA分子反应(或结合)的能力。这种流式细胞术方法可用于高通量抗体反应性分析。
术语"重组蛋白或肽"指使用重组DNA技术产生的蛋白或肽(例如抗体或CAR)，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的蛋白或肽(例如抗体或CAR)。该术语还应该解释为意指通过合成编码蛋白或肽(例如抗体或CAR)的DNA分子而产生的蛋白或肽(例如抗体或CAR)，并且该DNA分子表达蛋白或肽(例如抗体或CAR)，或指定蛋白或肽(例如抗体或CAR)的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可获得的公知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文所用，术语"调节性免疫细胞"是指以"调节性"方式起作用以抑制免疫系统的活化并由此维持免疫系统稳态和对自身抗原的耐受性的免疫细胞。"调节性免疫细胞"也可对非免疫细胞具有作用，其导致改善的临床状态，例如促进组织修复或再生。调节性免疫细胞可以包括但不限于调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞和调节性树突细胞。
本发明中使用的"调节性T淋巴细胞"、"调节性T细胞"、"T调节性细胞"、"Treg细胞"或"Treg"是同义的，并且意在具有其在本领域中使用的标准定义。Treg细胞是一种特化的T细胞亚群，其以"调节"方式起作用以抑制免疫系统的激活，从而维持免疫系统的稳态和对自身抗原的耐受性。Treg有时被称为抑制性T细胞。Treg细胞通常但不总是表征为叉头(forkhead)家族转录因子Foxp3(叉头盒p3)的表达。它们还可以表达CD4或CD8表面蛋白。它们也可表达CD25。如本发明中所用，除非另有说明，Treg包括在胸腺中发育的"天然"Treg，通过在胸腺外发生的分化过程(例如，在组织或次级淋巴器官中，或在实验室环境中在确定的培养条件下)产生的诱导的/适应性/外周Treg，和使用重组DNA技术产生的Treg。天然存在的Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)的出现与胸腺中所有其它T细胞相似。相比之下，诱导的/适应性/外周Treg细胞(其包括CD4+CD25+Foxp3+Treg、Tr1细胞、Th3细胞和其它)在胸腺外产生。诱导Treg的一种方式是通过将效应T细胞暴露于IL-10或TGF-β。还可以通过将Foxp3基因转染或转导到混合的T细胞群体中，使T细胞转化为Treg细胞。引起Foxp3表达的T细胞采用Treg表型，并且这样的重组Treg在本文中也被定义为"Treg"。
术语"排斥"是指移植的器官或组织不被受体的身体接受的状态。排斥是由于受体免疫系统攻击移植器官或组织而引起的。排斥可以在移植后数天至数周(急性)或在移植后数月至数年(慢性)发生。
术语"单链Fv"或"scFv"指包含至少一个包含轻链可变区(VL)的抗体片段和至少一个包含重链可变区(VH)的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区连续地连接成单个多肽链。在一个实施方案中，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽连接子，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构，例如合成连接子，例如短的柔性多肽连接子。因此，scFv能够作为单链多肽表达，并保留了其来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，如本文所用，scFv可以具有任一顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可以包含VL-连接子-VH或可以包含VH-连接子-VL。
如本文所用，如果抗体或CAR以可检测水平与抗原反应，亲和常数Ka优选大于或等于约104M-1，或大于或等于约105M-1，大于或等于约106M-1，大于或等于约107M-1，或大于或等于108M-1，或大于或等于109M-1，或大于或等于1010M-1，则其被称为对抗原是"免疫特异性的"、对抗原是"特异性的"或"特异性结合"抗原。抗体对其同源抗原的亲和力通常也表示为解离常数Kd，并且在某些实施方案中，如果抗体结合抗原的Kd小于或等于10-4M、小于或等于约10-5M、小于或等于约10-6M、小于或等于10-7M、或小于或等于10-8M、或小于或等于5.10-9M、或小于或等于10-9M、或小于或等于5.10-10M、或小于或等于10-10M，则抗体特异性结合抗原。抗体或CAR的亲和力可以使用常规技术容易地测定，例如Scatchard等人，(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949))所述的技术。抗体与抗原、细胞或其组织的结合特性通常可以使用免疫检测方法来测定和评估，所述免疫检测方法包括例如基于免疫荧光的测定，例如免疫组织化学(IHC)和/或荧光激活细胞分选(FACS)。在一个实施方案中，术语"特异性结合"指抗体、CAR或配体，其识别样品中存在的结合伴侣并与之结合，但该抗体或CAR或配体基本上不识别或结合样品中的其它分子。
术语"信号转导途径"是指在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。
术语"信号传导结构域"是指蛋白的功能部分，其通过在细胞内传递信息来起作用，以通过产生第二信使经由限定的信号传导途径调节细胞活性，或通过响应于此类信使而起效应物的作用。
如本文所用，术语"干细胞"通常包括亚全能(pluripotent)或多能(multipotent)干细胞。"干细胞"包括但不限于胚胎干细胞(ES)；间充质干细胞(MSC)；诱导亚全能干细胞(iPS)；和定向祖细胞(造血干细胞(HSC)；骨髓衍生细胞等)。
术语"刺激"是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物或嵌合受体)与其同源配体结合诱导的基本反应，从而介导信号转导事件，例如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过嵌合受体的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语"刺激分子"是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或B细胞)表达的分子，其提供细胞质信号传导序列，所述序列以刺激方式调节免疫细胞的活化，用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面。一方面，该信号是由例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子结合而起始的主要信号，并且其导致T细胞应答的介导，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初级(primary)胞质信号传导序列(也称为"初级信号传导结构域")可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
术语"受试者"旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体。在一个实施方案中，所述受试者是温血动物，优选哺乳动物(包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等…)，更优选人。在一个实施方案中，受试者可以是"患者"，即温血动物，更优选人，其等待接受或正在接受医疗护理或曾经/将成为医疗程序的对象，或被监测目标疾病或病症的发展。在一个实施方案中，受试者是成年的受试者(例如年龄大于18岁的受试者)。在另一个实施方案中，所述受试者是年幼的受试者(例如年龄低于18岁的受试者)。在一个实施方案中，所述受试者是雄性。在另一个实施方案中，所述受试者是雌性。
术语"基本上纯化的细胞"是指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本纯化的细胞也指已经与其它细胞类型分离的细胞，所述细胞通常以其天然存在的状态与所述其它细胞类型相关联。在一个实施方案中，基本上纯化的细胞是指这样的细胞，其至少约75％不含、80％不含或85％不含，并且优选约90％、95％、96％、97％、98％或99％不含在其天然存在状态下通常与其相关的其他细胞类型。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质细胞群。在一个实施方案中，基本上纯化的细胞群是指至少约75％同质、80％同质或85％同质，并且优选约90％、95％、96％、97％、98％或99％同质的细胞群。在其它情况下，该术语简单地指已经与在其天然状态下与其天然关联的细胞分离的细胞。在一些方面，体外培养细胞。在其它方面，细胞不在体外培养。
术语"T细胞"包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性CD8+T细胞、调节性CD8+T细胞)、调节性T细胞(Treg)、γ-δT细胞和双阴性T细胞。
术语"治疗有效量"是指有效实现特定生物学结果的如本文所述的免疫细胞或组合物的量。因此，术语"有效量"或"治疗有效量"是指目的在于以下而不对靶标引起显著的负面或不良副作用的细胞或组合物的水平或量：(1)延迟或预防目标疾病或病症的发作；(2)减缓或停止目标疾病或病症的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)改善目标疾病或病症的症状；(4)降低目标疾病或病症的严重性或发病率；或(5)治疗目标疾病或病症。为了预防或防止作用，可以在目标疾病或病症发作之前施用治疗有效量。或者或另外，治疗有效量可在目标疾病或病状开始之后施用以用于治疗作用。
术语"转染"或"转化"或"转导"是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。"转染"或"转化"或"转导"的细胞是已经转染、转化或转导有外源核酸的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
术语"转移载体"指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相连的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语"转移载体"包括自主复制质粒或病毒。该术语还应解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
如本文所用，"瞬时"是指非整合转基因表达数小时、数天或数周的时间，其中表达时间小于基因整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内时表达的时间。
如本文所用，"移植物"指被引入个体的细胞、组织或器官。移植材料的来源可以是培养的细胞、来自另一个体的细胞或来自同一个体的细胞(例如，细胞在体外培养之后)。示例性的器官移植是肾、肝、心脏、肺和胰腺。示例性组织移植物是胰岛。示例性的细胞移植是同种异体造血干细胞移植。
"治疗"指治疗性处理和预防性或阻止性措施；其中目的是预防或减缓(减轻)目标病理状况或病症。因此，在一个实施方案中，这些术语指由于给予一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂如本发明的Treg细胞)而导致的目标疾病或病症的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善，或目标疾病或病症的一种或多种症状(优选一种或多种可辨别的症状)的改善。在具体实施方案中，术语"治疗"是指改善目标疾病或病症的至少一种可测量的物理(physical)参数。在其它实施方案中，术语"治疗"是指抑制目标疾病或病症的进展，无论是在物理上通过例如稳定可辨别的症状，还是在生理上通过例如稳定物理参数，或两者。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及倾向于患有病症的那些或其中病症待预防的那些。如果在接受治疗量的本发明的细胞或组合物后，受试者显示可观察和/或可测量到的致病细胞数量的减少；致病总细胞百分比的降低；在一定程度上缓解与特定疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率，和/或改善生活质量，则受试者被成功地"治疗"。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可通过医生熟悉的常规程序容易地测量。
"unibody"是本领域公知的，并且指缺少IgG4抗体铰链区的抗体片段。铰链区的缺失产生的分子基本上是传统IgG4抗体一半大小，并且具有IgG4抗体的单价结合区而不是二价结合区。
术语"可变"指V结构域的某些区段在抗体之间序列差异非常大的事实。V结构域介导抗原结合，并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性在可变区的110至130个氨基酸跨度上不是均匀分布的。实际上，V区由相对不变的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的区段以及分割所述区段的被称为"高变区"的极端可变且均为9-12个氨基酸长的较短区域组成。天然重链和轻链的可变区均包含主要采取β-折叠构型的、通过三个高变区连接的四个FR，其形成环连接并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR保持紧密靠近在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
抗体的"可变区"或"可变结构域"是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可以称为"VH"或"VH"。轻链的可变结构域可以称为"VL"或"VL"。这些结构域通常是抗体的最可变部分，并且含有抗原结合位点。
本文所用术语多核苷酸"变体"是通常与本文具体公开的多核苷酸区别在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的多核苷酸。此类变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过修饰本发明的一个或多个多核苷酸序列，并评估如本文所述的编码多肽的一种或多种生物活性，和/或使用本领域熟知的多种技术中的任一种。本文所用术语多肽"变体"是通常与本文具体公开的多肽区别在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的多肽。此类变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如通过修饰一种或多种上述多肽序列并评估本文所述多肽的一种或多种生物活性和/或使用本领域熟知的多种技术中的任一种。可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍然获得编码具有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。当需要改变多肽的氨基酸序列以产生本发明多肽的等价物或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的一个或多个密码子。例如，某些氨基酸可以取代蛋白结构中的其它氨基酸，而其结合其它多肽(例如抗原)或细胞的能力没有明显损失。由于正是蛋白的结合能力和性质限定了蛋白的生物功能活性，所以可以在蛋白序列中进行某些氨基酸序列取代，当然也可以在其基本DNA编码序列中进行取代，并且仍然获得具有相似特性的蛋白。因此，可以预期，可以对本发明的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行各种改变，而不会明显损失它们的生物学效用或活性。在许多情况下，多肽变体将含有一个或多个保守取代。变体还可以或可选地含有非保守性改变。在优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的区别在于取代、缺失或添加五个或更少氨基酸。变体还可以(或可选地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性具有最小影响的氨基酸来修饰。
"Versabodies"是本领域公知的，并且指另一种抗体模拟技术。它们是3-5kDa的小蛋白，具有＞15％的半胱氨酸，其形成高二硫键密度支架，替代传统蛋白所具有的疏水性核心。
术语"异种的"是指衍生自不同物种的个体的任何材料。术语"异种移植物"是指衍生自不同物种的个体的移植物。
术语"ζ"或"ζ链"、"CD3-ζ"或"TCR-ζ"定义为GenBank登录号BAG36664.1的蛋白，或来自非人类物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基，并且"ζ刺激结构域"或"CD3-ζ刺激结构域"或"TCR-ζ刺激结构域"定义为来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基，或其功能衍生物，其功能上足以传递T细胞活化所需的起始信号。在一个实施方案中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等价残基，它们是其功能直系同源物。
发明详述
本发明的第一个目的是针对HLA-A2的抗体，优选针对HLA-A2的人源化抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQID NO：62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
在一个实施方案中，本发明的抗体与包含以下的抗体结合相同的HLA-A2表位：具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体与BB7.2抗体竞争结合HLA-A2和/或结合相同的HLA-A2表位。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34及其任意组合的组的HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01、A34:01及其任何组合的组的HLA-A亚型的反应性较低。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的三种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的三种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的四种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的四种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中五种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中五种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中六种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中六种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中七种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中七种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的八种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的八种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中九种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中九种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25、A29、A30及其任意组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25:01、A29:02、A30:01及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25、A29和A30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25:01、A29:02和A30:01中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25、A29和A30中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25:01、A29:02和A30:01中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包括BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25、A29和A30的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25:01、A29:02和A30:01的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A25具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A29具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A30具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A3具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A11具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A26具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A31具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A32具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A33具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，或者与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A34具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A25:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A29:02具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A30:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A03:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A11:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A26:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A31:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A33:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，优选与BB7.2scFv相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A34:01具有较低的反应性。
用于测量HLA-A2抗体对HLA-A亚型的反应性的方法是技术人员公知的，并且包括但不限于单抗原测定，例如由ONE LAMBDA提供的FlowPRA单抗原抗体。
在一个实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与抗体BB7.2或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34及其任意组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与抗体BB7.2或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25、A29、A30及其任意组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
测试A：
将表达包含抗HLA-A2抗体或BB7.2抗体或BB7.2抗体的VH和VL的CAR(mA2CAR)的0.25.106个T细胞与FlowPRA单抗原抗体珠板(FL1HD01、FL1HD02、FL1HD03、FL1HD04、FL1HD06和FL1HD08，One Lambda)和可固定的活性染料(FVD，ThermoFisher，65-0865-14，eBioscience)在室温下孵育30分钟。洗涤样品，用0.5％甲醛固定，并通过流式细胞术分析。每个样品获得两百个阴性对照珠。单独的珠子用作阴性对照。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物(doublet)后门控单个抗原珠。然后，通过它们各自的PE强度峰确定每HLA的珠数量。通过将每个HLA峰中目的珠的数量乘以200，除以样品中阴性珠的数量，将数据标准化。对于每个HLA峰，通过对照样品中的珠数量减去CAR-Treg中的珠数量，然后除以非CAR表达对照中的平均珠数量，乘以100，确定与对照(非CAR表达细胞)相比时CAR Treg的相对结合百分比。
在一个实施方案中，当在测试B的条件下测量时，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2的VH和VL的抗体相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34及其任意组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，当在测试B的条件下测量时，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2的VH和VL的抗体相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25、A29、A30及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
测试B：
将在细胞表面表达抗HLA-A2抗体或BB7.2抗体或BB7.2抗体的VH和VL或截短的NGFR转导标记(NGFR)(例如作为本文所述嵌合抗原受体的一部分)的0.25.106个T细胞与FlowPRA单抗原抗体珠(FL1HD，One lambda)和可固定的活性染料(FVD，65-0865-14，eBioscience)一起孵育，然后用0.5％甲醛固定并通过流式细胞术分析。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物后对单珠进行门控。然后，通过它们各自的PE强度确定每HLA的珠的数量。通过将样品中的阴性珠子的数量除以Treg-NGFR样品中的阴性珠子的数量，乘以Treg-NGFR样品中的阴性珠子的数量，对数据进行标准化。相对结合百分比是NGFR样品中针对特定HLA的珠数量减去样品中针对该HLA的标准化珠数量，除以NGFR样品中的珠数量，乘以100。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34的组的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于抗体BB7.2的反应性或在统计学上劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体的反应性，优选地当在测试A或测试B的条件下测量时。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对至少一种选自包含A25、A29、A30的组的HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于抗体BB7.2的反应性或在统计学上劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体的反应性，优选当在试验A或试验B的条件下测量时。
在一个实施方案中，术语"统计学上劣"是指对本发明的抗HLA-A2抗体所测定的反应性(即，例如，在测试A或测试B的条件下的相对结合)劣于对BB7.2抗体或包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体所测定的反应性，p值至多约0.05，优选至多约0.01，更优选至多约0.005，甚至更优选至多约0.001，特别是当通过双向ANOVA、Dunnett后检验分析时。
在一个实施方案中，在测试A或测试B条件下测量时，本发明的抗HLA-A2抗体对至少一种选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34的组的HLA-A亚型的反应性劣于BB7.2抗体的反应性或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体的反应性，优选地，本发明的抗HLA-A2抗体对至少一种选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34的组的HLA-A亚型的相对结合劣于BB7.2抗体的相对结合或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体的相对结合，更优选地，对本发明的抗HLA-A2抗体测量的相对结合是对BB7.2抗体或包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体测量的相对结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在一个实施方案中，当在测试A或测试B的条件下测量时，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25、A29、A30的组的至少一种HLA-A亚型的反应性劣于BB7.2抗体的反应性或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体的反应性，优选地，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25、A29、A30的组的至少一种HLA-A亚型的相对结合劣于BB7.2抗体的相对结合或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体的相对结合，更优选地，对本发明的抗HLA-A2抗体测量的相对结合是对BB7.2抗体或对包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体测量的相对结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。
在一个实施方案中，重链可变区包含至少一个下列CDR：
VH-CDR1:SYHIQ(SEQ ID NO:1)
VH-CDR2:WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:2)
VH-CDR3:EGTYYAMDY(SEQ ID NO:3)
CDR的编号和定义根据Kabat定义。
在一个实施方案中，重链可变区包含至少一个下列CDR：
VH-CDR1:GYTFTSY(SEQ ID NO:4)
VH-CDR2:YPGDGS(SEQ ID NO:5)
VH-CDR3:EGTYYAMDY(SEQ ID NO:3)
CDR的编号和定义根据Chothia的定义。
在一个实施方案中，轻链可变区包含至少一个下列CDR：
VL-CDR1:RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:6)
VL-CDR2:KVSNRFS(SEQ ID NO:7)
VL-CDR3:FQGSHVPRT(SEQ ID NO:8)
CDR的编号和定义根据Kabat或Chothia的定义。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体在其重链中包含一个VH-CDR1(SYHIQ(SEQ ID NO:1))，一个VH-CDR2(WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:2))和/或一个VH-CDR3(EGTYYAMDY(SEQ ID NO:3))。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体在其重链中包含3个CDR：VH-CDR1(SYHIQ(SEQ ID NO:1))，VH-CDR2(WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:2))和VH-CDR3(EGTYYAMDY(SEQ ID NO:3))。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体在其重链中包含一个VH-CDR1(GYTFTSY(SEQ ID NO:4))，一个VH-CDR2(YPGDGS(SEQ ID NO:5))和/或一个VH-CDR3(EGTYYAMDY(SEQ ID NO:3))。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体在其重链中包含3个CDR：VH-CDR1(GYTFTSY(SEQ ID NO:4))，VH-CDR2(YPGDGS(SEQ ID NO:5))和VH-CDR3(EGTYYAMDY(SEQ IDNO:3))。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体在其轻链中包含一个VL-CDR1(RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:6))，一个VL-CDR2(KVSNRFS(SEQ ID NO:7))和/或一个VL-CDR3(FQGSHVPRT(SEQ ID NO:8))。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体在其轻链中包含3个CDR：VL-CDR1(RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:6))，VL-CDR2(KVSNRFS(SEQ ID NO:7))和VL-CDR3(FQGSHVPRT(SEQ ID NO:8))。
在本发明的一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含：
-在其重链中的3个CDR SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；以及
-在其轻链中的3个CDR SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
在本发明的一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含：
-在其重链中的3个CDR SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：3；以及
-在其轻链中的3个CDR SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
根据本发明，重链和轻链的CDR1、2和3中的任何一个都可表征为具有与相应SEQID NO：1-8中所列的特定CDR或CDR组具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体包含序列SEQ ID NO：9的重链可变区。
(SEQ ID NO:9)
QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSS
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体的重链可变区具有与SEQ ID NO：9具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体包含序列SEQ ID NO：10的轻链可变区。
(SEQ ID NO:10)
DX1VMTQX2PX3X4LX5VX6X7GX8X9X10X11ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYX12QKPGQX13PRLLIYKVSNRFSGX14PDRFSGSGSGTDFTLX15ISRX16EX17EDX18X19VYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A。
在本发明的一个实施方案中，抗HLA-A2抗体的轻链可变区具有与SEQ ID NO：10具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
在一个实施方案中，轻链区具有序列SEQ ID NO：11，或与SEQ ID NO：11具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的任何序列。
(SEQ ID NO:11)
DVVMTQTPLSLPVTLGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
在一个实施方案中，轻链区具有序列SEQ ID NO：12，或与SEQ ID NO：12具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的任何序列。
(SEQ ID NO:12)
DVVMTQSPSSLSVTLGDRVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
在一个实施方案中，轻链区具有序列SEQ ID NO：13，或与SEQ ID NO：13具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的任何序列。
(SEQ ID NO:13)
DIVMTQSPATLSVSPGERATISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKVSNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
在一个实施方案中，本发明的HLA-A2抗体包含具有序列SEQ ID NO：9的重链可变区和具有序列SEQ ID NO：10的轻链可变区，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，或与SEQ IDNO：9和10具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的任何序列。
在一个实施方案中，本发明的HLA-A2抗体包含具有序列SEQ ID NO：9的重链可变区和具有序列SEQ ID NO：11的轻链可变区，或与SEQ ID NO：9和11具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的任何序列。
在一个实施方案中，本发明的HLA-A2抗体包含具有序列SEQ ID NO：9的重链可变区和具有序列SEQ ID NO：12的轻链可变区，或与SEQ ID NO：9和12具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的任何序列。
在一个实施方案中，本发明的HLA-A2抗体包含具有序列SEQ ID NO：9的重链可变区和具有序列SEQ ID NO：13的轻链可变区，或与SEQ ID NO：9和13具有至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的任何序列。
根据本发明，重链可变区或轻链可变区的一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。
在一个实施方案中，在本发明的抗体中，特定的可变区和CDR序列可以包含保守序列修饰。保守序列修饰是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入本发明的抗体。
本发明的另一个目的是编码SEQ ID NO：9的重链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID NO：86。
(SEQ ID NO:86)
CAGGTCCAGCTAGTACAAAGCGGCCCTGAAGTAAAGAAACCTGGTGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACCACATCCAGTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAGGGACTAGAGTGGATCGGCTGGATCTATCCTGGCGACGGCAGCACCCAGTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTTACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACACAGCTGTTTACTATTGTGCCAGAGAGGGCACCTACTACGCAATGGATTATTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTTTCTTCT
本发明的另一个目的是编码SEQ ID NO：11的轻链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID NO：87。
(SEQ ID NO:87)
GATGTTGTAATGACCCAGACACCTCTGAGCCTGCCTGTGACCCTGGGAGAACCAGCATCCATCAGCTGTCGGAGCAGCCAGAGCATCGTTCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAATGGTATCTACAGAAGCCCGGACAGAGCCCCAGGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGCTTCAGTGGTGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAAGGCAGCCATGTGCCAAGAACCTTTGGTGGAGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
本发明的另一个目的是编码SEQ ID NO：12的轻链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID NO：88。
(SEQ ID NO:88)
GATGTTGTAATGACCCAGAGCCCTAGTAGCCTGTCTGTGACCCTGGGAGATCGAGTATCCATCAGCTGTCGGAGCAGCCAGAGCATCGTTCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAATGGTATCAACAGAAGCCCGGACAGAGCCCCAGGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGCTTCAGTGGTGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACGATCTCCAGAGTGGAACCAGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAAGGCAGCCATGTGCCAAGAACCTTTGGTGGAGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
本发明的另一个目的是编码SEQ ID NO：13的轻链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID NO：89。
(SEQ ID NO:89)
GATATTGTAATGACCCAGAGCCCTGCAACACTGTCTGTGTCCCCTGGAGAACGAGCAACAATCAGCTGTCGGAGCAGCCAGAGCATCGTTCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAATGGTATCAACAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGCTTCAGTGGAATACCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACGATCTCCAGATTAGAACCAGAGGACTTTGCAGTGTACTACTGCTTCCAAGGCAGCCATGTGCCAAGAACCTTTGGTGGAGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
本发明的另一个目的是一种表达载体，其包含编码本发明的抗HLA-A2抗体的核酸序列。
本发明的另一个目的是包含所述载体的分离的宿主细胞。所述宿主细胞可以用于本发明抗体的重组生产。
在一个实施方案中，所述抗体是选自由完整抗体、人源化抗体、单链抗体、二聚体单链抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab)'2、脱岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体组成的组的抗体分子。
在另一个实施方案中，所述抗体是选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段。
在另一个实施方案中，所述抗体是选自由亲合体、Alphabody、基于armadillo重复蛋白的支架、knottin、Kunitz结构域肽、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、抗运载蛋白、avimer、fynomer、versabody和duocalin的组的抗体模拟物。
本发明抗体的片段和衍生物(除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则其被本申请中所用的术语"抗体"所涵盖)可以通过本领域已知的技术来产生。"片段"包含完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；任何抗体片段，其是具有由一条连续氨基酸残基的不间断序列组成的初级结构的多肽(本文称为"单链抗体片段"或"单链多肽")，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或其含有轻链可变结构域的三个CDR而没有相关重链部分的片段，和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或其含有重链可变区的三个CDR而没有相关轻链部分的片段；和由抗体片段形成的多特异性抗体。本发明抗体的片段可以使用标准方法获得。
例如，Fab或F(ab')2片段可根据常规技术通过蛋白酶消化分离的抗体来产生。应当理解，免疫反应性片段可以使用已知方法修饰，例如以减慢体内清除并获得更理想的药代动力学特性，所述片段可以用聚乙二醇(PEG)修饰。偶联和位点特异性地缀合PEG至Fab'片段的方法描述于例如Leong等人，Cytokines 16(3):106-119(2001)和Delgado等人，Br.J.Cancer 5 73(2):175-182(1996)，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，本发明的抗体是scFv或scFab，优选scFv。
在一个实施方案中，本发明的抗体是scFv，其包含SEQ ID NO:9的序列和SEQ IDNO:10的序列，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，顺序为至scFv的N-末端和C-末端中任一者。优选地，本发明的抗体是scFv，其包含SEQ ID NO:9的序列和SEQ ID NO:11、12或13的序列，顺序为至scFv的N-末端和C-末端中任一者。
在一个实施方案中，序列SEQ ID NO:9是N-末端，序列SEQ ID NO:10、11、12或13是C-末端。
在一个实施方案中，本发明的scFv，从N-末端至C-末端包含：SEQ ID NO:9、任选的连接子和SEQ ID NO:10，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A(优选SEQ ID NO:11-13中的一者)。
在一个实施方案中，本发明的scFv，从N-末端至C-末端包含：SEQ ID NO:10(其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A(优选SEQ ID NO:11-13中的一者))，任选的连接子，SEQ IDNO:9。
在一个实施方案中，scFv包含连接子。连接子的实例包括但不限于如本文所述的GS连接子。在一个实施方案中，连接子包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18)或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的scFv包含序列SEQ ID NO：69，或与SEQ ID NO：69具有至少约95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:69)
QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDX1VMTQX2PX3X4LX5VX6X7GX8X9X10X11ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYX12QKPGQX13PRLLIYKVSNRFSGX14PDRFSGSGSGTDFTLX15ISRX16EX17EDX18X19VYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
其中，X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A。SEQ ID NO:69从N-末端至C-末端由SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:10组成。
在一个实施方案中，本发明的scFv包含序列SEQ ID NO：70、71或72，或与SEQ IDNO：70、71或72具有至少约95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。SEQ ID NO：70-72从N-末端到C-末端分别由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：11-13组成。
(SEQ ID NO:70)
QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
(SEQ ID NO:71)
QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSVTLGDRVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
(SEQ ID NO:72)
QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPATLSVSPGERATISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKVSNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
在一个实施方案中，本发明的scFv还在N末端包含S残基，以促进任选前导序列的切割。
因此，在一个实施方案中，本发明的scFv具有序列73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A。
在一个实施方案中，本发明的scFv包含序列SEQ ID NO：74、75或76，或由其组成。
(SEQ ID NO:74)
SQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSVTLGDRVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
(SEQ ID NO:75)
SQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSVTLGDRVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
(SEQ ID NO:76)
SQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPATLSVSPGERATISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKVSNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKR
本发明的另一个目的是一种组合物，该组合物包含至少一种本发明的抗HLA-A2抗体，基本上由其组成或由其组成。
如本文所用，关于组合物的"基本上由……组成"是指如上所述的本发明的至少一种抗HLA-A2抗体是所述组合物中唯一的一种治疗剂或具有生物活性的试剂。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含至少一种本发明的抗HLA-A2抗体和药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体的实例包括但不限于介质、溶剂、包被材料、等渗剂和吸收延迟剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、抑制酶降解的物质、醇、pH控制剂、抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；防腐剂和推进剂。
药学上可接受的介质的实例包括但不限于水、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、生理盐水或其它生理缓冲盐水，或其它溶剂如乙二醇、甘油，和油如橄榄油或可注射有机酯。药学上可接受的介质也可以含有脂质体或胶束。
包被材料的实例包括但不限于卵磷脂。
等渗剂的实例包括但不限于糖、氯化钠等。
延迟吸收的试剂的实例包括但不限于单硬脂酸铝和明胶。
添加剂的实例包括但不限于甘露醇、葡聚糖、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)；甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它添加剂，例如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或适于体内给药的重组蛋白(例如人血清白蛋白)。
合适的稳定剂的实例包括但不限于蔗糖、明胶、蛋白胨、消化的蛋白提取物如NZ-胺或NZ-胺AS。
可用于这些组合物的药学上可接受的载体进一步包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的另一个目的是一种药物，包含至少一种如上文所述的本发明的抗HLA-A2抗体，由其或基本上由其组成。
本发明的另一个目的是至少一种本发明的抗HLA-A2抗体用于在体外或体内检测样品中，优选生物样品中的HLA-A2的用途。
可使用本发明抗HLA-A2抗体的测定实例包括但不限于ELISA、夹心ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、Western-blot和免疫沉淀。
本发明的另一个目的是提供一种检测样品中HLA-A2的方法，包括将样品与本发明的抗HLA-A2抗体接触，并检测与HLA-A2结合的抗HLA-A2抗体，从而指示样品中HLA-A2的存在。
在本发明的一个实施方案中，样品是生物样品。生物样品的实例包括但不限于体液，优选血液，更优选血清、血浆、滑液、支气管肺泡灌洗液、痰、淋巴液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脑脊液、胸膜液、心包液和肺泡巨噬细胞、组织裂解物和从患病组织或从移植物制备的提取物。
在本发明的一个实施方案中，术语"样品"意指在任何分析之前从个体采集的样品。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体直接用可检测标记物标记，并可直接检测。在另一个实施方案中，本发明的蛋白是未标记的(被称为第一/初级抗体)，而第二抗体或其它能结合抗HLA-A2抗体的分子被标记。如本领域所熟知的，选择第二抗体以能够特异性结合特定种类和类型的第一抗体。
通过检测标记的第二抗体的存在，可以检测和测量样品中抗HLA-A2抗体/HLA-A2复合物的存在。例如，在从包含第一抗体/抗原复合物的孔或从包含复合物的膜(例如硝化纤维或尼龙膜)洗去未结合的第二抗体之后，可以基于例如针对样品的标记物的化学发光来显现和检测结合的第二抗体。
抗HLA-A2抗体或第二抗体的标记包括但不限于各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射活性材料。这些酶的实例包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物的实例包括但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质的实例包括但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、dansyne chloride或藻红蛋白；发光材料的实例包括但不限于，鲁米诺；磁性试剂的实例包括钆；合适的放射活性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
本发明的另一目的是一种试剂盒，其包含至少一种本发明的抗HLA-A2抗体，优选单克隆抗HLA-A2抗体。
"试剂盒"是指任何包含至少一种试剂，优选抗体的制品(例如，包装或容器)，用于特异性检测HLA-A2的表达。
试剂盒可以作为实施本发明方法的单元进行推广、分销或销售。此外，任何或所有试剂盒试剂都可以提供在保护它们不受外部环境影响的容器内，例如在密封容器中。
试剂盒也可以包含描述试剂盒及其使用方法的包装插页。
进行夹心ELISA的试剂盒通常包括捕获抗体，任选固定在固体支持物(例如微量滴定板)上，和与可检测物质偶联的显示抗体，所述可检测物质例如HRP、荧光标记、放射性同位素、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
在另一个实施方案中，可检测物质被固定在固体支持物(例如微量滴定板)上。
本发明还涉及特异于HLA-A2的嵌合抗原受体(CAR)。CAR是嵌合蛋白分子，其将对靶抗原的基于抗体的特异性与免疫细胞受体活化胞内结构域组合。
根据本发明，CAR在一种或多种多肽中包含(i)胞外HLA-A2结合结构域，其中所述胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体(优选抗HLA-A2scFv)，或由组成，(ii)任选的胞外铰链结构域，(iii)任选的跨膜结构域，和(iv)胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，嵌合受体还包含标签和/或前导序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQ IDNO：62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
在一个实施方案中，本发明的CAR与包含以下的抗体结合相同的HLA-A2表位：具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
在一个实施方案中，本发明的CAR与BB7.2抗体竞争结合HLA-A2和/或结合与BB7.2抗体相同的HLA-A2表位。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的CAR对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的CAR对选自包含A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01、A34:01及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的三种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的三种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的四种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的四种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中五种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中五种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中六种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中六种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中七种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中七种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中的八种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中的八种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34中九种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01中九种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33和A34的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A03:01、A11:01、A23:01、A25:01、A26:01、A29:02、A30:01、A31:01、A33:01和A34:01的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，优选与BB7.2scFv相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，本发明的CAR对选自包含A25、A29、A30及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与抗体BB7.2相比，优选与BB7.2scFv相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，本发明的CAR对选自包含A25:01、A29:02、A30:01及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25、A29和A30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25:01、A29:02和A30:01中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25、A29和A30中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自A25:01、A29:02和A30:01中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25、A29和A30的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包含A25:01、A29:02和A30:01的组的每种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A25具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A29具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A30具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A3具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A11具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A26具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A31具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A32具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A33具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A34具有较低的反应性。
在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A25:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A29:02具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A30：具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A03:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A11:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A26:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A31:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A33:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2的CAR或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的抗HLA-A2抗体对HLA-A34:01具有较低的反应性。
用于测量CAR对HLA-A亚型的反应性的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于单抗原测定，例如由ONE LAMBDA提供的FlowPRA单抗原抗体。
在一个实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与包含抗体BB7.2的CAR相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的CAR对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与抗体BB7.2相比或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，本发明的CAR对选自包含A25、A29、A30及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
测试A：
将表达包含抗HLA-A2抗体或BB7.2抗体或BB7.2抗体的VH和VL的CAR(mA2CAR))的0.25.106个T细胞与FlowPRA单抗原抗体珠板(FL1HD01、FL1HD02、FL1HD03、FL1HD04、FL1HD06和FL1HD08，One Lambda)和可固定的活性染料(FVD，ThermoFisher，65-0865-14，eBioscience)在室温下孵育30分钟。洗涤样品，用0.5％甲醛固定，并通过流式细胞术分析。每个样品获得两百个阴性对照珠。单独的珠子用作阴性对照。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物后门控单个抗原珠。然后，通过它们各自的PE强度峰确定每HLA的珠数量。通过将每个HLA峰中目的珠的数量乘以200，除以样品中阴性珠的数量，将数据标准化。对于每个HLA峰，通过从对照样品中的珠数量减去CAR-Treg中的珠数量，然后除以非CAR表达对照中的平均珠数量，乘以100，确定与对照(非CAR表达细胞)相比时CAR Treg的相对结合百分比。
在一个实施方案中，当在测试B的条件下测量时，与包含抗体BB7.2的CAR相比，或与包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR相比，本发明的CAR对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
在一个实施方案中，当在测试B的条件下测量时，与抗体BB7.2相比，或与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体相比，本发明的CAR对选自包含A25、A29、A30及其任何组合的组的HLA-A亚型具有较低的反应性。
测试B：
将在细胞表面表达抗HLA-A2抗体或BB7.2抗体或BB7.2抗体的VH和VL或截短的NGFR转导标记(NGFR)(例如作为本文所述嵌合抗原受体的一部分)的0.25.106个T细胞与FlowPRA单抗原抗体珠(FL1HD，One lambda)和可固定的活性染料(FVD，65-0865-14，eBioscience)一起孵育，然后用0.5％甲醛固定并通过流式细胞术分析。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物后对单珠进行门控。然后，通过它们各自的PE强度确定每HLA的珠的数量。通过将样品中的阴性珠子的数量除以Treg-NGFR样品中的阴性珠子的数量，乘以Treg-NGFR样品中的阴性珠子的数量，对数据进行标准化。相对结合百分比是NGFR样品中针对特定HLA的珠数量减去样品中该HLA的标准化珠数量，除以NGFR样品中的珠数量，乘以100。
在一个实施方案中，本发明的CAR对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34的组的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于包含抗体BB7.2的CAR的反应性或在统计学上劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR的反应性，优选地当在测试A或测试B的条件下测量时。
在一个实施方案中，本发明的CAR对选自包含A25、A29、A30的组的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于抗体BB7.2的反应性或在统计学上劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体的反应性，优选地当在测试A或测试B的条件下测量时。
在一个实施方案中，术语"统计学劣"是指对本发明CAR所测量的反应性(即，例如，在测试A或测试B的条件下的相对结合)劣于对BB7.2抗体或包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体所测定的反应性，p值至多约0.05，优选至多约0.01，更优选至多约0.005，并且更优选至多约0.001，特别是当通过双向ANOVA、Dunnett后检验分析时。
在一个实施方案中，本发明的CAR对至少一种选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34的组的HLA-A亚型的反应性劣于包含BB7.2抗体的CAR的反应性或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR的反应性，优选地，在测试A或测试B的条件下测量时，本发明的CAR对选自包含A03、A11、A23、A25、A26、A29、A30、A31、A33、A34的组的至少一种HLA-A亚型的相对结合劣于包含BB7.2抗体的CAR的相对结合或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR的相对结合，更优选地，对本发明的抗HLA-A2抗体测量的相对结合是对BB7.2的抗体或包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体测量的相对结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在一个实施方案中，当在测试A或测试B的条件下测量时，本发明的CAR对选自包含A25、A29、A30的组的至少一种HLA-A亚型的反应性劣于包含BB7.2抗体的CAR的反应性或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR的反应性，优选地，本发明的CAR对选自包含A25、A29、A30的组的至少一种HLA-A亚型的相对结合劣于于包含BB7.2抗体的CAR的相对结合或劣于包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR的相对结合，更优选地，对本发明的抗HLA-A2抗体测量的相对结合是对BB7.2抗体或对包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体测量的相对结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
本发明还涉及编码如上文所述的CAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含i)HLA-A2结合结构域的核酸序列(优选地，其中所述HLA-A2结合结构域是抗HLA-A2抗体，优选地，如上文所述的抗HLA-A2scFv)，(ii)任选地，胞外铰链结构域的核酸序列，(iii)任选地，跨膜结构域的核酸序列，(iv)胞内信号传导结构域的一个或多个核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列还包含编码标签和/或前导序列的序列。
在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域是scFv，包含序列SEQ ID NO：9和序列SEQ ID NO：10，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，顺序为至scFv的N-末端和C-末端中任一者。优选地，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域是scFv，其包含序列SEQ ID NO：9和序列SEQ ID NO：11、12或13，顺序为至scFv的N-末端和C-末端中任一者。
在一个实施方案中，序列SEQ ID NO：9是N-末端，并且SEQ ID NO：10、11、12或13是C-末端。
在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域，从N-末端至C-末端包含：SEQ ID NO：9，任选的连接子，SEQ ID NO：10，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A(优选SEQ ID NO：11-13中的一者)。
在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域，从N-末端至C-末端包含：SEQ ID NO：10(其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A(优选SEQ ID NO：11-13中的一者))，任选的连接子，SEQ ID NO：9。
在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域包含连接子。连接子的实例包括但不限于如本文所述的GS连接子。在一个实施方案中，所述连接子包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：18)或由其组成。
在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域包含序列SEQ IDNO：69或由其组成，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A。SEQ ID NO：69从N-末端到C-末端由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：10组成。
在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域包含序列SEQ IDNO：70、71或72或由其组成。SEQ ID NO：70-72从N-末端到C-末端分别由SEQ ID NO：9、SEQID NO：18和SEQ ID NO：11-13组成。
在一个实施方案中，包含在本发明CAR中的HLA-A2结合结构域在N末端进一步包含S残基，以促进任选前导序列的切割。
因此，在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域具有序列73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A。
在一个实施方案中，包含在本发明的CAR中的HLA-A2结合结构域包含序列SEQ IDNO：74、75或76或由其组成。
在一个实施方案中，HLA-A2结合结构域可以通过铰链结构域连接到跨膜结构域。
在一个实施方案中，短的寡肽连接子或多肽连接子，优选具有2至10个氨基酸长度的短的寡肽连接子或多肽连接子，可以形成铰链结构域。在一个实施方案中，术语"连接子"是指柔性多肽连接子。
例如，甘氨酸-丝氨酸成对物提供了特别合适的铰链结构域(GS连接子)。在一个实施方案中，铰链结构域是Gly/Ser连接子。Gly/Ser连接子的实例包括但不限于GS连接子、G2S连接子、G3S连接子、G4S连接子。
G2S连接子的实例包括，但不限于，GGS。
G3S连接子包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，也称为(GGGS)n或(SEQ ID NO：14)n，其中n是等于或大于1的正整数(例如，n＝l，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9或n＝10)。G3S连接子的实例包括但不限于GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：15)。
G4S连接子的实例包括但不限于对应于GGGGS(SEQ ID NO：16)的(Gly4Ser)；对应于GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)的(Gly4Ser)2；对应于GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：18)的(Gly4Ser)3；和对应于GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：19)的(Gly4Ser)4。
WO2012/138475中描述的铰链结构域也包括在本发明的范围内，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，铰链结构域包含氨基酸序列AGSSSSGGSTTGGSTT(SEQ ID NO：20)、氨基酸序列GTTAASGSSGGSSSGA(SEQ ID NO：21)、氨基酸序列SSATATAGTGSSTGST(SEQID NO：22)，和/或氨基酸序列TSGSTGTAASSTSTST(SEQ ID NO：23)。
在一个实施方案中，铰链结构域由核苷酸序列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO：24)编码。
在另一实施方案中，铰链结构域是对应于KIRRDSS(SEQ ID NO：25)的KIR2DS2铰链。
在一个实施方案中，铰链结构域包含CD8铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)或与SEQ ID NO：26具有95-99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列SEQ ID NO：27或与SEQ ID NO：27具有95-99％同一性的核酸序列编码的CD8铰链。
(SEQ ID NO：26)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
(SEQ ID NO：27)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
在另一个实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)或与SEQ ID NO：28具有95-99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列SEQ ID NO：29或与SEQ ID NO：29具有95-99％同一性的核酸序列编码的IgG4铰链。
(SEQ ID NO:28)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
(SEQ ID NO:29)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
在另一个实施方案中，铰链结构域包含IgD铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)或与SEQ ID NO：30具有95-99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列SEQ ID NO：31，或与SEQ ID NO：31具有95-99％同一性的核酸序列编码的IgD铰链。
(SEQ ID NO:30)
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH
(SEQ ID NO:31)
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT
在另一个实施方案中，铰链区包含CD28铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)或与SEQ ID NO：32具有95-99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸SEQ ID NO：33或与SEQ ID NO：33具有95-99％同一性的核酸序列编码的CD28铰链。
(SEQ ID NO:32)
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
(SEQ ID NO:33)
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC
可用于本发明嵌合受体的跨膜结构域的实例包括但不限于以下的的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD3ζ，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD1la，CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，PD1，ITGAX，CDl1c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D，和/或NKG2C。
在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)或与SEQ ID NO：34具有95-99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列或与SEQ ID NO：34具有95-99％同一性的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:34)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
在另一个实施方案中，跨膜结构域由CD8跨膜结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)或与SEQ ID NO：35具有95-99％同一性的核苷酸序列编码。
(SEQ ID NO:35)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
在另一个实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO：36)或与SEQ ID NO：36具有95-99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，跨膜结构域是由核酸序列SEQ ID NO：37或与SEQ ID NO：37具有95-99％同一性的核酸序列编码的CD28跨膜结构域。
(SEQ ID NO:36)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
(SEQ ID NO:37)
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
在一个实施方案中，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，它将主要包含疏水性氨基酸，例如缬氨酸或亮氨酸。
包括CAR的胞内信号传导结构域的胞质结构域负责激活已将CAR置于其中的免疫细胞(例如，调节性T细胞)的至少一种效应子功能。术语"效应子功能"是指免疫细胞的特定功能。例如，调节性T细胞的效应子功能可以包括抑制或下调其他免疫细胞的诱导和/或增殖。此外，Treg的效应子功能可以包括对非免疫细胞的导致临床状态改善的作用，例如促进组织修复或再生。因此，术语"胞内信号传导结构域"是指转导效应子功能信号并且指导免疫细胞执行其专门功能的蛋白的部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要此类截短部分转导了效应子功能信号，就可以使用其代替完整链。因此，术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含其所来源的分子的整个胞内部分或整个天然胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。
根据一个实施方案，胞内信号传导结构域包含至少一个(例如，一个)T细胞初级(primary)信号传导结构域(或源自其的序列)和任选地T细胞共刺激分子的一个或多个胞内结构域(或源自其的序列)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域由至少一个(例如，一个)初级信号传导结构域组成。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包括T细胞共刺激分子的一个或多个胞内结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域由T细胞共刺激分子的一个或多个胞内结构域组成。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含至少一个共刺激结构域和至少一个(例如，一个)初级信号传导结构域。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含至少两个共刺激结构域和至少一个(例如，一个)初级信号传导结构域。
在本发明的一个实施方案中，T细胞初级信号传导结构域包含选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、普通FcR导(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12及其衍生序列的组的蛋白的信号传导结构域。
在一个实施方案中，T细胞初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域或由其组成。
在一个实施方案中，T细胞初级信号传导结构域包含SEQ ID NO：38、39、40或41或与SEQ ID NO：38-41具有95-99％同一性的氨基酸序列的CD3-ζ结构域的氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:38)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:39)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:40)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:41)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在另一实施方案中，CD3ζ初级信号传导结构域包含具有SEQ ID NO：38-41的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38-41具有95-99％同一性的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
因此，在一个实施方案中，编码T细胞初级信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43或包含与SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43具有95-99％同一性的核苷酸序列的CD3-ζ结构域的核酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:42)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
(SEQ ID NO:43)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
以刺激方式起作用的T细胞初级信号传导结构域可以包含称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的信号传导基序。
在本发明中特别有用的含有ITAM的T细胞初级胞内信号传导结构域的实例包括但不限于CD3ζ、普通FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD66b、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些(或衍生自它们)。
在一个实施方案中，T细胞初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，突变的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或降低的)活性。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含含有经修饰的ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如含有经优化和/或截短的ITAM的初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含与一个或多个共刺激信号传导结构域组合的T细胞初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导结构域)。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的至少一个胞内结构域的嵌合受体的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。
T细胞共刺激分子的胞内结构域的实例包括但不限于选自以下的组的蛋白的信号传导结构域：CD27，CD28，4-1BB(CD137)，MHC I类分子，BTLA，toll配体受体，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS(CD278)，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特异结合CD83的配体，CDS，ICAM-1，GITR，ARHR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD160(BY55)，CD19，CD19a，CD4，CD8α，CD8β，IL2Ra，IL6Ra，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，IL-13RA1/RA2，IL-33R(IL1RL1)，IL-10RA/RB，IL-4R，IL-5R(CSF2RB)，IL-21R，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a/CD18，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，ITGB7，NKG2D，NKG2C，CTLA-4(CD152)，CD95，TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)，TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)，TGFbR1/2/3，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，通用γ链，特异结合CD83的配体，NKp44，NKp30，NKp46，或者NKG2D，及其任意组合。
在本发明的一个实施方案中，嵌合受体包含选自包含4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、CTLA4和PD-1及其任意组合的组的T细胞共刺激分子的至少一个胞内结构域。
在一个实施方案中，T细胞共刺激信号传导结构域包含4-1BB胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)或与SEQ ID NO：44具有95-99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一个实施方案中，T细胞共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:44)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
在一个实施方案中，T细胞共刺激信号传导结构域包含CD27胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)或与SEQ ID NO：45具有95-99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，T细胞共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列或由其组成。
(SEQ ID NO:45)
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
在一个实施方案中，T细胞共刺激信号传导结构域包含CD28胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)或与SEQ ID NO：46具有95-99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，T细胞共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列或由其组成。
(SEQ ID NO:46)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
在本发明的一个实施方案中，嵌合受体包含T细胞共刺激分子的至少两个胞内结构域的组合，优选选自CD28的胞内结构域、CD27的胞内结构域和4-1BB的胞内结构域。
在一个实施方案中，嵌合受体包含4-1BB胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)或与SEQ ID NO：44具有95-99％同一性的氨基酸序列和CD27胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)或与SEQ ID NO：45具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，嵌合受体包含4-1BB胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)或与SEQ ID NO：44具有95-99％同一性的氨基酸序列，以及CD28胞内结构域的氨基酸序列(S EQ ID NO：46)或与SEQ ID NO：46具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，嵌合受体包含CD27胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)或与SEQ ID NO：45具有95-99％同一性的氨基酸序列，以及CD28胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)或与SEQ ID NO：46具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，嵌合受体包含4-1BB胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)或与SEQ ID NO：44具有95-99％同一性的氨基酸序列和CD27胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)或与SEQ ID NO：45具有95-99％同一性的氨基酸序列和CD28胞内结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)或与SEQ ID NO：46具有95-99％同一性的氨基酸序列。
因此，在一个实施方案中，编码T细胞共刺激信号传导结构域的核酸序列包含4-1BB胞内结构域的核酸序列(SEQ ID NO：47)或与SEQ ID NO：47具有95-99％同一性的核酸序列，和/或CD27胞内结构域的核酸序列(SEQ ID NO：48)或与SEQ ID NO：48具有95-99％同一性的核酸序列，和/或CD28胞内结构域的核酸序列(SEQ ID NO：49)，或与SEQ ID NO：49具有95-99％同一性的核酸序列。
(SEQ ID NO:47)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
(SEQ ID NO:48)
CAACGAAGGAAATATAGATCAAACAAAGGAGAAAGTCCTGTGGAGCCTGCAGAGCCTTGTCGTTACAGCTGCCCCAGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGATTACCGAAAACCGGAGCCTGCCTGCTCCCCC
(SEQ ID NO:49)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含：
-SEQ ID NO：44的4-1BB胞内结构域的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44具有95-99％同一性的氨基酸序列，和/或SEQ ID NO：45的CD27胞内结构域的氨基酸序列或与SEQ IDNO：45具有95-99％同一性的氨基酸序列，和/或SEQ ID NO：46的CD28胞内结构域的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46具有95-99％同一性的氨基酸序列；以及
-SEQ ID NO：38-41的CD3-ζ胞内结构域的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：38-41具有95-99％同一性的氨基酸序列；
其中包含在胞内结构域中的序列在相同的框中作为单多肽链表达。
因此，在一个实施方案中，编码本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域的核酸序列包含：
-SEQ ID NO：47的4-1BB胞内结构域的核酸序列或与SEQ ID NO：47具有95-99％同一性的核酸序列，和/或SEQ ID NO：48的CD27胞内结构域的核酸序列或与SEQ ID NO：48具有95-99％同一性的核酸序列，和/或SEQ ID NO：49的CD28胞内结构域的核酸序列或与SEQID NO：49具有95-99％同一性的核酸序列；以及
-SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43的CD3-ζ胞内结构域的核酸序列，或与SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含可以以随机或特定顺序彼此连接的至少两个不同结构域(例如初级信号传导结构域和T细胞共刺激分子的至少一个胞内结构域)。
任选地，长度例如在2至10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短寡肽连接子或多肽连接子可以形成不同信号传导结构域之间的连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸成对物(GS)用作合适的连接子。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如丙氨酸(A)、甘氨酸(G)，被用作合适的连接子。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含两个或更多个，例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域。
在另一个实施方案中，两个或更多个，例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域被连接子分子，例如上文所述的连接子分子分开。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含CD3-ζ的初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)和CD28的共刺激信号传导结构域(优选SEQ ID NO：46)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含CD3-ζ的初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)和4-1BB的共刺激信号传导结构域(优选SEQ ID NO：44)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体的胞内信号传导结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)和CD27的信号传导结构域(优选SEQ ID NO：45)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体进一步包括位于自HLA-A2结合结构域而言N末端的前导序列。前导序列的非限制性实例是CD8的前导序列，其可以包含序列SEQ IDNO：50或由其组成。
(SEQ ID NO:50)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
在一个实施方案中，嵌合受体还包含标签，例如用于质量控制、富集、体内追踪等的标签。所述标签可以位于N末端、C末端和/或内部。可用于本发明的嵌合受体的标签的实例是技术人员熟知的。例如，但不限于，本发明中使用的标签可以是选自包含或由血凝素标签、聚精氨酸标签、聚组氨酸标签、Myc标签、Strep标签、S-标签、HAT标签、3x Flag标签、钙调蛋白结合肽标签、SBP标签、壳多糖结合结构域标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白标签、荧光蛋白标签(例如，eGFP，具有序列SEQ ID NO：68)、T7标签、V5标签和Xpress标签组成的组的标签。标签的其它实例包括但不限于NWSHPQFEK(SEQ ID NO：51)或SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：52)。
(SEQ ID NO:51)
NWSHPQFEK
(SEQ ID NO:52)
SAWSHPQFEK
(SEQ ID NO:68)
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体进一步包含位于胞内信号传导结构域C末端的核糖体切割位点。核糖体切割位点的非限制性实例是P2A核糖体切割位点序列ASGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:61)。
根据第一个实施方案，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域(优选SEQ IDNO：69或73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)、任选地胞外铰链结构域、跨膜结构域和T细胞初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2标记结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2标记结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2标记结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD28的跨膜结构域(优选SEQID NO：36)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ IDNO：36)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ IDNO：36)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
根据第二个实施方案，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域(优选SEQ IDNO：69或73，其中其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)、任选地胞外铰链结构域、跨膜结构域、T细胞共刺激分子的单胞内结构域和T细胞初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ IDNO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ IDNO：28)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ IDNO：28)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ IDNO：32)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ IDNO：32)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
根据第三个实施方案，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域(优选SEQ IDNO：69或73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)、任选地胞外铰链结构域、跨膜结构域、T细胞共刺激分子的两个胞内结构域和T细胞原代信号传导结构域。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ IDNO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ IDNO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO：26)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ IDNO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO：28)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域，优选包含氨基酸序列SEQ ID NO：30；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ IDNO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO：30)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ IDNO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：34)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO：44)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO：32)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO：36)；CD27的胞内结构域(优选SEQ ID NO：45)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO：46)；和CD3-ζ初级信号传导结构域(优选SEQ ID NO：38、39、40或41)。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含(i)HLA-A2结合结构域(优选SEQ IDNO：69或73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)，(ii)人CD28的铰链区，(iii)人CD28的跨膜结构域，(iv)人CD28的胞内结构域和(v)人CD3ζ链的胞内结构域。
在一个实施方案中，包含人CD28的铰链区、人CD28的跨膜结构域、人CD28的胞内结构域和人CD3ζ链的胞内结构域的嵌合受体的部分对应于SEQ ID NO：53或54的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53或54有95-99％同一性的氨基酸序列。
(SEQ ID NO:53)
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:54)
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域(优选SEQ ID NO：69或73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)，该结合结构域与SEQ ID NO：53或54的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53或54具有95-99％同一性的序列或氨基酸序列连接。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含(i)HLA-A2结合结构域(优选SEQ IDNO：69或73，其中其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)，(ii)人CD8的铰链区，(iii)人CD8的跨膜结构域，(iv)人4-1BB的胞内结构域和(v)人CD3ζ的胞内结构域。在一个实施方案中，包含人CD8的铰链区、人CD8的跨膜结构域、人4-1BB的胞内结构域和人CD3ζ的胞内结构域的嵌合受体的部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：55、56、57或58，或与SEQ ID NO：55-58具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:55)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:56)
NWSHPQFEKMHTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELTRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:57)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:58)
NWSHPQFEKMHTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELTRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域(优选SEQ ID NO：69或73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)，所述结合结构域连接到SEQ ID NO：55-58的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55-58具有95-99％同一性的序列或氨基酸序列上。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含SEQ ID NO：77中所示的序列，或与SEQID NO：77具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:77)
SQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDX1VMTQX2PX3X4LX5VX6X7GX8X9X10X11ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYX12QKPGQX13PRLLIYKVSNRFSGX14PDRFSGSGSGTDFTLX15ISRX16EX17EDX18X19VYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体还包含N-末端中的前导序列(优选具有序列SEQ ID NO：50)，并且包含SEQ ID NO：81(其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A)或与SEQ IDNO：81具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:81)
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDX1VMTQX2PX3X4LX5VX6X7GX8X9X10X11ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYX12QKPGQX13PRLLIYKVSNRFSGX14PDRFSGSGSGTDFTLX15ISRX16EX17EDX18X19VYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含SEQ ID NO：78中所示的序列，或与SEQID NO：78具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:78)
SQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体还包含N末端中的前导序列(优选具有序列SEQ ID NO：50)，并且包含序列SEQ ID NO：82或与SEQ ID NO：82具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:82)
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含SEQ ID NO：79中所示的序列，或与SEQID NO：79具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:79)
SQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSVTLGDRVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体还包含N末端中的前导序列(优选具有序列SEQ ID NO：50)，并且包含序列SEQ ID NO：83或与SEQ ID NO：83具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:83)
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSVTLGDRVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含SEQ ID NO：80中所示的序列，或与SEQID NO：80具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:80)
SQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPATLSVSPGERATISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKVSNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体还包含N末端中的前导序列(优选具有序列SEQ ID NO：50)，并且包含序列SEQ ID NO：84或与SEQ ID NO：84具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:84)
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPATLSVSPGERATISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKVSNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKRRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含(i)HLA-A2结合结构域(优选SEQ IDNO：69或73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)，(ii)人CD8的铰链区，(iii)人CD8的跨膜结构域，(iv)人CD28的胞内结构域和(v)人CD3ζ的胞内结构域。在一个实施方案中，包含人CD8的铰链区、人CD8的跨膜结构域、人CD28的胞内结构域和人CD3ζ的胞内结构域的嵌合受体的部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：59或60，或与SEQ ID NO：59或60具有95-99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
(SEQ ID NO:59)
MHTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSTRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:60)
MHTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSTRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含HLA-A2结合结构域(优选SEQ ID NO：69或73，其中X1是V或I，X2是T或S，X3是L或S或A，X4是S或T，X5是P或S，X6是T或S，X7是L或P，X8是E或D，X9是P或R，X10是A或V，X11是S或T，X12是L或Q，X13是S或A，X14是V或I，X15是K或T，X16是V或L，X17是A或P，X18是L或F，并且X19是G或A，更优选SEQ ID NO：70-72或74-76之一)，所述结合结构域连接到SEQ ID NO：59-60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：59-60具有95-99％同一性的序列或氨基酸序列上。
本发明还涉及表达如上文所述的CAR的免疫细胞，和此类免疫细胞的群。
在一个实施方案中，将编码本发明的CAR的核酸引入免疫细胞，从而产生在细胞表面上表达本发明的CAR的工程化细胞。
根据本发明，本发明的免疫细胞被遗传修饰以表达识别HLA-A2的嵌合受体。因此，本发明的免疫细胞可以被定义为重定向(redirected)的免疫细胞。
如本文所用，术语"重定向"是指携带本文所述嵌合受体的免疫细胞，所述受体赋予免疫细胞结合配体(即HLA-A2)并被配体激活的能力，所述配体不同于免疫细胞所具有或将具有特异性或被其激活的配体。在一个实施方案中，嵌合受体能够在免疫细胞中表达，使得免疫细胞被HLA-A2激活。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞是哺乳动物免疫细胞，优选人免疫细胞。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞已经被冷冻和解冻。
在一个实施方案中，免疫细胞选自包括淋巴细胞、骨髓来源的细胞及其任何组合的组。
在一个实施方案中，免疫细胞是选自包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞及其任何组合的组的淋巴细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞选自由CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、双阴性(DN)T细胞及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，免疫细胞是CD4+T细胞，例如，T辅助细胞、调节性T细胞及其任何组合。
在一个实施方案中，免疫细胞是CD4+调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，Treg是胸腺来源的Treg或适应性或诱导的Treg。在一个实施方案中，Treg是CD4+FOXP3+调节性T细胞或CD4+FOXP3-调节性T细胞(Tr1细胞)，优选CD4+FOXP3+调节性T细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是CD8+T细胞，例如细胞毒性CD8+T细胞或CD8+调节性T细胞。
优选地，免疫细胞是CD8+调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，CD8+调节性T细胞选自由CD8+CD28-调节性T细胞、CD8+CD103+调节性T细胞、CD8+FoxP3+调节性T细胞、CD8+CD122+调节性T细胞及其任何组合的组。
在一个实施方案中，免疫细胞是INFγ+IL10+IL34+CD8+CD45RC低调节性T细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是γδT细胞，优选调节性γδT细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是DN T细胞，优选调节性DN T细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是B细胞，优选调节性B细胞。在一个实施方案中，调节性B细胞是CD19+CD24hiCD38hi B细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是NK细胞，优选调节性NK细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是骨髓衍生的细胞，优选选自包含嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合的组。
在一个实施方案中，免疫细胞是巨噬细胞，优选调节性巨噬细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是树突细胞，优选调节性树突细胞。
优选地，免疫细胞是调节性免疫细胞，例如，适合用于细胞疗法的任何调节性免疫细胞。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是CD8+调节性T细胞。CD8+调节性T细胞的实例包括但不限于CD8+CD28-调节性T细胞、CD8+CD103+调节性T细胞、CD8+FoxP3+调节性T细胞、CD8+CD122+调节性T细胞及其任何组合。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性γδT细胞。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性DN T细胞。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性B细胞。调节性B细胞的实例包括但不限于CD19+CD24hiCD38hi B细胞。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性NK细胞。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性巨噬细胞。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性树突细胞。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性T细胞，特别是胸腺来源的Treg或适应性或诱导的Treg。Treg的例子包括但不限于CD4+FOXP3+调节性T细胞或CD4+FOXP3-调节性T细胞(Tr1细胞)。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞具有以下表型：CD4+CD25+，例如CD4+CD25+CD127-，例如CD4+CD25+CD127-CD45RA+。优选地，调节性免疫细胞具有以下表型：FoxP3+CD4+CD25+，例如FoxP3+CD4+CD25+CD127-，例如FoxP3+CD4+CD25+CD127-CD45RA+。
在一个实施方案中，免疫调节细胞呈现至少一种以下表型：CD4+CD25+、FoxP3+、CD127lo/-、CTLA-4+、CD39+、Helios+、CD62L+/hi、VLA4+、LFA1+、CD49bint、ITGb7int、PSGL-1+、ICOS+、GITR+、PD-1int、Perflo/-、CCR7+。在一个实施方案中，免疫调节细胞不表达粒酶A和/或粒酶B。
在一个实施方案中，通过流式细胞术、免疫荧光或图像分析，例如高含量分析，进行分子表达水平的测定。优选地，通过流式细胞术进行分子表达水平的测定。在一个实施方案中，在进行流式细胞术分析之前，将细胞固定并透化，从而允许检测胞内蛋白。
在一个实施方案中，测定细胞群中分子的表达水平包括测定细胞群中表达分子的细胞(即，细胞对于分子"+")的百分比。优选地，表达所述分子的细胞的百分比通过FACS测量。
术语"表达(或+)"和"不表达(或-)"是本领域熟知的，并且是指目的细胞标记的表达水平，其中对应于"+"的细胞标记的表达水平是高的或中等的，也称为"+/-"，并且对应于"-"的细胞标记的表达水平是没有的。
术语"低"或"lo"或"lo/-"是本领域公知的，指目的细胞标记的表达水平，其中与作为整体分析的细胞群中该细胞标记的表达水平相比，该细胞标记的表达水平低。更特别地，术语"lo"是指以比一种或多种其他不同细胞群低的水平表达细胞标志物的不同细胞群。
术语"高"或"hi"或"鲜明(bright)"是本领域公知的，并且是指目的细胞标记的表达水平，其中与作为整体分析的细胞群中该细胞标记的表达水平相比，该细胞标记的表达水平高。
通常，染色强度的前2、3、4或5％的细胞被归为"hi"，而落入群体的前半部分的那些被归类为"+"。将落入荧光强度后50％的那些细胞归为"lo"细胞，后5％的细胞归为"-"细胞。
通过比较用对目的细胞标记物特异的荧光标记的抗体染色的细胞群的细胞的中值荧光强度(MFI)和用具有不相关特异性但具有相同同种型、相同荧光探针且来源于相同物种的荧光标记的抗体(称为同种型对照)染色的相同细胞群的细胞的荧光强度(FI)，确定该标记物的表达水平。用对该标记物特异的荧光标记的抗体染色的细胞群中的，显示与用同种型对照染色的细胞相当的MFI或更低的MFI的细胞不表达该标记物，然后被归为(-)或阴性。用对该标记物特异的荧光标记的抗体染色的群体中的，MFI值优于用同种型对照染色的细胞的细胞表达该标记物，然后归为(+)或阳性。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞在其细胞表面表达本发明的CAR，和结合至除HLA-A2之外的另一配体的另一受体(本文称为"第二受体")。根据本发明，该第二受体包含胞外配体结合结构域、任选的铰链、任选的跨膜结构域和胞内信号传导结构域，如前所述。
在一个实施方案中，所述第二受体是内源性的(例如，内源性TCR)。在另一个实施方案中，第二受体是外源的，并且其表达通过转化或转导编码它的核酸在本发明的免疫细胞中诱导。所述外源受体可以是外源TCR或嵌合抗原受体。因此，在一个实施方案中，本发明的免疫细胞表达两种嵌合抗原受体，其中第一种识别HLA-A2，第二种识别不同的配体。
在另一个实施方案中，本发明的免疫细胞在其细胞表面表达本发明的CAR，和结合HLA-A2中的另一个表位的另一个受体(本文称为"第二受体")。根据本发明，该第二受体包含胞外配体结合结构域、任选的铰链、任选的跨膜结构域和胞内信号传导结构域，如前所述。
在另一个实施方案中，本发明的免疫细胞表达两种CAR，其中第一种识别HLA-A2的第一表位，第二种识别HLA-A2上的不同表位。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含第一胞内信号传导结构域，并且第二受体包含不同的第二胞内信号传导结构域。在第一个实施方案中，本发明的CAR包含T细胞初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)，并且第二受体包含共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB的共刺激信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域或4-1BB和CD28的共刺激信号传导结构域的组合)。在第二个实施方案中，本发明的CAR包含共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB的共刺激信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域或4-1BB和CD28的共刺激信号传导结构域的组合)，并且第二受体包含T细胞初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)。
因此，根据这些实施方案，本发明的免疫细胞的完全激活需要本发明的CAR与HLA-A2的结合，以及第二受体与其所针对的配体的结合两者。
在一个实施方案中，由第二受体识别的配体在患病组织或器官中或在自身免疫应答的位点表达或存在。
可被第二受体识别的配体的实例包括但不限于来自普通人饮食的食物抗原、自身抗原、吸入的变应原、摄入的变应原或接触变应原。
术语"来自普通人类饮食的食物抗原"是指免疫原性肽，其来自人类普通的食物，例如以下非限制性列表的食物抗原：牛抗原例如脂质运载蛋白、Ca结合S100、α-乳白蛋白、乳球蛋白例如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鲑鱼抗原，例如小清蛋白；鸡抗原，例如卵类粘蛋白、卵清蛋白、Ag22、伴清蛋白、溶菌酶或鸡血清白蛋白；花生抗原；虾抗原，例如原肌球蛋白；小麦抗原，例如凝集素或醇溶蛋白；芹菜抗原，例如芹菜前纤维蛋白；胡萝卜抗原，如胡萝卜前纤维蛋白；苹果抗原，例如索马甜、苹果脂质转移蛋白或苹果前纤维蛋白；梨抗原，如梨前纤维蛋白或异黄酮还原酶；鳄梨抗原，如内切壳多糖酶；杏抗原，例如杏脂质转移蛋白；桃抗原，如桃脂质转移蛋白或桃前纤维蛋白；大豆抗原，例如HPS、大豆前纤维蛋白或(SAM22)PR-I0prot；其片段、变体和混合物。
在一个实施方案中，所述自身抗原是多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人HSP抗原、皮肤相关抗原或涉及移植物排斥或GVHD的抗原。
术语"多发性硬化相关抗原"是指髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白(OMGP)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudinl 1)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNPase)、其片段、变体和混合物。
术语"关节相关抗原"是指瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白肽、II型胶原蛋白肽、人软骨糖蛋白39(HCgp39)肽、HSP、异质核内核糖核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP B1、hnRNPD、Ro60/52、HSP60、HSP65、HSP70和HSP90、BiP、角蛋白、波形蛋白、纤维蛋白原、I型-、III型-、IV-型和V型-胶原蛋白肽、膜联蛋白V、葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)、乙酰钙蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脱氢酶(PDH)、醛缩酶、拓扑异构酶I、snRNP、PARP、Scl-70、Scl-100、磷脂抗原包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸、电荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱、基质金属蛋白酶、原纤维蛋白、聚集蛋白聚糖(aggreccan)、其片段、变体和混合物。
术语"眼睛相关抗原"是指II型胶原、视网膜抑制蛋白(arrestin)、S-抑制蛋白、光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP1)、β-晶体蛋白B1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段、变体和混合物。
术语"人HSP抗原"指人HSP60、HSP70、HSP90、其片段、变体和混合物。
皮肤相关抗原的实例包括但不限于角质形成细胞抗原、存在于真皮或表皮中的抗原、黑素细胞抗原(例如黑色素或酪氨酸酶)、桥粒芯蛋白(例如桥粒芯蛋白1或3，也可称为Dsg1/3)、BP180、BP230、网蛋白、整联蛋白(例如整联蛋白α4β6)、胶原蛋白(例如胶原蛋白VII型)、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白332或层粘连蛋白γ1)、斑蛋白(Plakin)(例如包斑蛋白(envoplakin)、周斑蛋白(periplakin)或桥斑蛋白(desmoplakin))、角蛋白(例如KRT5、KRT8、KRT15、KRT17和KRT31)、角蛋白纤丝相关蛋白、丝聚蛋白、角膜锁链蛋白(corneodesmosin)和弹性蛋白。
在一个实施方案中，配体是参与移植排斥或GVHD的抗原。此类抗原的实例包括但不限于对移植组织或宿主特异的MHC、β2-微球蛋白、来自ABO系统的抗原、来自恒河猴血型系统的抗原(特别是来自C、c、E和e和D系统的抗原)和异血凝素。可能涉及移植排斥或GVHD的抗原的其它实例包括但不限于HLA-DR(特别是在移植后的前六个月期间)、HLA-B(特别是在移植后的前两年期间)、次要组织相容性抗原(miHA，例如HLA-E、HLA-F和HLA-G)、对应于MHC I类(B和C)的HLA、对应于MHC II类(DP、DM、DOA、DOB、DQ和DR)的HLA和对应于MHC III类(例如补体系统的组分)的HLA。
自身抗原的其它例子包括但不限于水通道蛋白水通道(例如，水通道蛋白-4水通道(AQP4))、Hu、Ma2、脑衰反应调节蛋白5(CRMP5)和两载蛋白(amphiphysin)、电压门控钾通道(VGKC)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPAR)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗-N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)、Rh血型抗原、I抗原、桥粒芯蛋白1或3(Dsg1/3)、BP180、BP230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、GpIIb:IIIa，胶原(例如胶原α-3(IV)链)、类风湿因子、钙蛋白酶抑制蛋白、瓜氨酸化蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽、α-β-晶体蛋白、DNA、组蛋白、核糖体、RNP、组织转谷氨酰胺酶(TG2)、内因子、65-kDa抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗嗜中性粒细胞胞质抗体、Scl-70、U1-RNP、ANA、SSA、抗-SSB、抗核抗体(ANA)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)、Jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、sp100、抗磷脂抗体、U1-70kd snRNP、GQ1b神经节苷脂、GM1、去唾液酸GM1、GD1b、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗肝肾微粒体-1抗体(ALKM-1)、抗肝细胞溶胶抗体-1(ALC-1)、IgA抗肌内膜抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁胞内因子、胰岛素(IAA)、谷氨酸脱羧酶(GAA或GAD)和蛋白酪氨酸磷酸酶(如IA2或ICA512)、PLA2R1和THSD7A1。
在一个实施方案中，所述配体选自包括卵清蛋白、MOG、II型胶原蛋白片段、其变体和混合物的组。
在一个实施方案中，所述配体是卵清蛋白、其片段、变体和混合物。
在另一个实施方案中，所述配体是MOG、其片段、变体和混合物。
在另一个实施方案中，所述配体是II型胶原、其片段、变体和混合物。
在另一个实施方案中，所述配体是IL23R、其片段、变体和混合物。
在一个实施方案中，本发明的CAR进一步包含识别与HLA-A2不同的配体的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明的CAR的配体结合结构域是识别HLA-A2上的多个不同表位的多功能抗体。在一个实施方案中，本发明的CAR的配体结合结构域是识别HLA-A2上的两个不同表位的双功能抗体。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞外配体结合结构域，其包含HLA-A2结合结构域和识别与HLA-A2不同的配体的另一配体结合结构域。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是识别HLA-A2和不同配体两者的双功能抗体。
可被本发明的CAR识别的不同于HLA-A2的配体的实例在上文中列出。
本发明还涉及分离的和/或基本上纯化的如上文所定义的免疫细胞群。
因此，本发明的一个目的是分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群，其中该群的细胞包含CAR，其中所述CAR识别HLA-A2。
如本文所用，"分离的群"是指从其天然环境(如外周血)中移出并分离、纯化或分开的细胞群体，其至少约75％、80％、85％不含，并且优选约90％、95％、96％、97％、98％、99％不含缺乏分离细胞所基于的细胞表面标记的天然存在的其它细胞。
本发明还涉及如上文定义的免疫细胞的富集群体。
在一个实施方案中，本发明的分离的、纯化的和/或富集的免疫细胞群已经冷冻和解冻。
本发明的另一个目的是包含编码如上文所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的载体。
可用于本发明的载体的实例包括但不限于DNA载体、RNA载体、质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。
病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记(例如，如WO01/96584；WO01/29058；和US6,326,193中所述，其通过引用并入本文)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并将其体内或离体递送到受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统都是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体都是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的转录活性元件，例如启动子和增强子，可以调节转录起始的频率。通常，关于核心启动子，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件，并且增强子元件通常位于起始位点上游500-2000bp。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，以便当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保持。在胸苷激酶(TK)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到50bp。根据启动子，似乎单个元件可以协同或独立地发挥作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个例子是延伸生长因子-la(EF-la)。合适启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要表达时，该开关能够开启与其有效地连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时，关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。此外，允许两个或多个基因有效地协同表达的双向启动子也是本发明感兴趣的。双向启动子的实例包括但不限于US2006200869中描述的启动子，该文献通过引用并入本文，其公开了一种双向启动子，其包含i)源自巨细胞病毒(CMV)或小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)基因组的第一最小启动子序列和ii)源自动物基因的完整的有效启动子序列。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入免疫细胞的表达载体还可以含有选择标记基因，例如CD34或报告基因或两者，以促进从旨在通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染方法中。选择标记和报告基因的侧翼都可以有合适的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
在本发明的一些实施方案中，可以使用自杀基因技术。根据其作用机制，本领域描述了不同的自杀基因技术(Jones等人Frontiers in Pharmacology,2014(5):254)。将无毒药物转化为有毒药物的基因指导的酶前体药物疗法(GDEPT)的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨酶(CD)。其它实例是由与细胞凋亡成分连接的药物结合结构域组成的嵌合蛋白，例如可诱导的Fas(iFas)或可诱导的Caspase 9(iCasp9)系统。其他实例包括由治疗性抗体介导的系统，例如通过施用抗c-myc抗体诱导工程化细胞表面c-myc的过表达以诱导其缺失。与c-myc系统相比，EGFR的使用被描述为类似系统。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于或表达于受体生物体或组织中的基因，并且其所编码多肽的表达通过一些容易检测的性质例如酶活性来显示。报道基因的表达在DNA导入受体细胞后的合适时间来测定。合适的报道基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如Ui-Tei等人，2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，可以使用已知技术制备或商业获得。通常，将具有最小5'侧翼区且显示报告基因表达最高水平的构建体鉴定为启动子。这类启动子区可与报道基因连接，并用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因导入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可通过本领域的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物方法将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔、膜破裂等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸导入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
将目的多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。其它病毒载体可衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见例如US5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶态分散系统，例如大分子复合物、纳米颗粒(纳米球、纳米胶囊)、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸都结合的连接分子附着于脂质体，包裹在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含或复合有胶束，或者以其它方式与脂质结合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束形式存在，或具有"坍塌"结构。它们也可以简单地分散在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱("DMPC")可以从Sigma,St.Louis,MO获得；双十六烷基磷酸酯("DCP")可以从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇("Choi")可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油("DMPG")和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。"脂质体"是包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质媒介物的通称。脂质体的特征在于具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量的水性溶液中时自发形成。脂质成分在形成闭合结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物也包括在其中。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
不管用于将外源核酸导入宿主细胞的方法如何，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这些测定包括例如本领域技术人员熟知的"分子生物学"测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；"生物化学"测定，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定。
在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞通过引入RNA来修饰。在一个实施方案中，体外转录的RNA CAR可以以瞬时转染的形式引入细胞中。RNA可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)产生的模板的体外转录来产生。使用合适的引物和RNA聚合酶，通过PCR可将来自任何来源的目的DNA直接转化为体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合适的DNA来源。体外转录的所需模板是本发明的CAR。
在一个实施方案中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，DNA是全长的目的基因或基因的一部分。该基因可以包括一些或全部5'和/或3'非翻译区(UTR)。基因可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方案中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人基因。DNA或者可以是在天然存在的生物体中正常不表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列是含有连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个生物体。
PCR可用于产生用于mRNA体外转录的模板用于转染。进行PCR的方法是本领域公知的。用于PCR的引物被设计成具有与用作PCR模板的DNA区域基本互补的区域。如本文所用，"基本互补"是指其中引物序列中的大多数或所有碱基互补，或一个或多个碱基非互补或错配的核苷酸序列。基本互补的序列能够在PCR的退火条件下与预期的DNA靶退火或杂交。引物可设计成与DNA模板的任何部分基本互补。例如，引物可设计成扩增在细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。引物也可设计成扩增基因的编码特定目的结构域的一部分。在一个实施方案中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。用于PCR的引物通过本领域熟知的合成方法产生。
"正向引物"是含有与待扩增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本互补的核苷酸区域的引物。"上游"在此用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。"反向引物"是含有与双链DNA模板基本互补的核苷酸区域的引物，所述双链DNA模板位于待扩增的DNA序列的下游。"下游"在此用于指相对于编码链而言待扩增DNA序列的3'位置。
任何用于PCR的DNA聚合酶都可以用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度在零与3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该方法，本领域普通技术人员可以修饰在转染转录的RNA后实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。5'和3'UTR可以是天然存在的、目的基因的内源5'和3'UTR。或者，可通过将UTR序列引入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰来添加非目的基因内源的UTR序列。使用对于目的基因不是内源的UTR序列可以改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的UTR的性质选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5'UTR可以包含内源基因的Kozak序列。或者，当通过如上所述的PCR添加不是目的基因内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录本的翻译效率，但似乎不是所有RNA都需要Kozak序列才能进行有效翻译。本领域已知许多mRNA对Kozak序列的要求。在其他实施方案中，5'UTR可源自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方案中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，应该在待转录序列上游的DNA模板上连接转录启动子。当起RNA聚合酶启动子作用的序列加到正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子被引入到待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选的实施方案中，mRNA在5'端具有帽结构并具有3'poly(a)尾，其决定了核糖体结合、翻译的起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长串联产物。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中无效，即使其在转录后被聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将polyA/T延伸片段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的polyA/T序列可引起质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其它畸变高度污染的原因。这使得克隆过程不仅费力费时，而且通常不可靠。这就是为什么非常需要一种不进行克隆就可以用polyA/T3'延伸片段构建DNA模板的方法。
转录DNA模板的polyA/T片段可通过使用含有polyT尾如100T尾(大小可以为50-5000T)的反向引物在PCR过程中产生，或在PCR之后通过任何其它方法，包括但不限于DNA连接或体外重组而产生。poly(A)尾还提供RNA稳定性并减少其降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，poly(A)尾是100-5000个腺苷。
RNA的poly(A)尾可在体外转录后用poly(A)聚合酶如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP)进行进一步延伸。在一个实施方案中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300-400个核苷酸导致RNA翻译效率增加约两倍。另外，3'末端连接不同化学基团可以增加mRNA稳定性。这种连接可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP类似物掺入poly(A)尾。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
RNA上的5'帽还为RNA分子提供稳定性。在一个优选的实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。5'帽使用本领域已知的和本文描述的技术提供(Cougot,等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其起始核糖体与mRNA的非帽依赖性结合，并促进翻译起始。可以包括任何适于细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和存活力的因素，例如糖、肽、脂质、蛋白、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任何一种将RNA导入靶细胞，例如，商业上可获得的方法包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，Germany))、(ECM830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Massachusets))或Gene PulserII(BioRad，Denver，Colo)、Multiporator(Eppendert，Hamburg Germany)、使用lipofection的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染、或生物射弹颗粒递送系统如"基因枪"(参见，例如Nishikawa等，Hum Gene Ther，12(8)：861-70(2001)。
在一个实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将CAR序列递送至细胞中。使用转导的细胞作为载体或包封的、结合的或裸的载体的无细胞局部或全身递送，可以将表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体递送到不同类型的真核细胞中，以及组织和完整生物体中。所用方法可以用于需要稳定表达或稳定表达足以的任何目的。
在另一个实施方案中，使用体外转录的mRNA将CAR序列递送至细胞中。使用转染的细胞作为载体或包封的、结合的或裸mRNA的无细胞局部或全身递送，可以将体外转录的mRNA CAR递送到不同类型的真核细胞中，以及组织和完整生物体中。所用方法可以用于需要瞬时表达或瞬时表达足以的任何目的。
在另一个实施方案中，所需CAR可以通过转座子在细胞中表达。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞是T细胞。在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何技术从收集自受试者的血液单位中获得，例如FicollTM分离或Sepax分离系统。在一个优选的实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它具核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个替代实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含有或不含缓冲液的盐水溶液。或者，可以除去单采术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一个实施方案中，通过裂解红血细胞和消耗单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞的特定亚群，例如CD4+CD25+，特别是CD4+CD25+CD127lo，例如CD4+CD25+CD127loCD45RA+，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3x28)-缀合的珠，例如M-450CD3/CD28T孵育足以阳性选择所需T细胞的时间段，来分离T细胞。在一个实施方案中，所述时间段为约30分钟。在另一个实施方案中，所述时间段的范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，所述时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的实施方案中，所述时间段为10至24小时。在一个优选的实施方案中，温育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间，例如24小时，可以增加细胞产量。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，例如从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用较长的孵育时间来分离T细胞。因此，通过简单地缩短或延长所述时间，可以允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或降低珠与T细胞的比例(如本文进一步所述)，可以在培养开始时或在该过程的其它时间点优先选择出或者排除T细胞亚群。另外，通过增加或减少珠或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以在培养开始时或在其它所需时间点优先选择出或排除T细胞亚群。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。
在另一个实施方案中，在激活和扩增过程中可能需要进行选择程序并使用"未选择的"细胞。"未选择的"细胞也可进行更多轮的选择。通过阴性选择富集T细胞群可以用针对负选择细胞特有的表面标记的抗体组合来完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术，其使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物，进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正选择通常具有表型CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，调节性T细胞通过抗CD25缀合的珠或其它类似的选择方法来消耗。
为了通过正选择或负选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著减小珠子和细胞在其中混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万细胞/ml或1亿细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或捕获来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且将是期望获得的。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群中的粒细胞和某种程度上除去单核细胞提供了更均一的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在此背景下是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适细胞冷冻介质，然后以1℃/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃并且储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中的不受控即冻法。
在某些实施方案中，将冷冻保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并允许在活化之前在室温下静置一小时。
本发明还涉及在可能需要本文所述的扩增细胞之前的时间或在可能需要本文所述的扩增细胞时，从受试者收集血样或单采术产物。如此，待扩增的细胞来源可以在任何必要的时间点收集，并且可以分离和冷冻所需的细胞，例如T细胞，以便随后用于将受益于T细胞治疗的任何数量的疾病或病症(例如本文所述的那些)的T细胞治疗中。在一个实施方案中，从整体上健康的受试者采集血液样品或单采术产物。在某些实施方案中，从处于发展疾病的风险中但尚未发展疾病的整体健康受试者采集血液样品或单采术产物，并且分离和冷冻目的细胞以供后续使用。在某些实施方案中，T细胞可以被扩增、冷冻并在以后使用。
无论在遗传修饰T细胞(优选Treg细胞)以表达所需CAR之前或之后，T细胞都可以通常使用如下中所述的方法活化和扩增：US6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和US20060121005，在通过引用并入本文。
通常，本发明的T细胞(优选Treg细胞)群通过与表面接触而扩增，所述表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T(优选Treg)细胞群细胞表面上的共刺激分子的配体。具体而言，T(优选Treg)细胞群可以如本文所述进行刺激，例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)连同钙离子载体(calcium ionophore)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞群可以与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括但不限于9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)。可以使用本领域公知的其它扩增方法(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(l-2):53-63,1999)。
在某些实施方案中，T(优选Treg)细胞群的细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当偶联至表面时，所述试剂可以偶联至相同的表面(即，以"顺式"形式)或单独的表面(即，以"反式"形式)。或者，一种试剂可以偶联到表面上，而另一种试剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种试剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，所述试剂可以是可溶形式，然后交联到表面，例如表达Fc受体的细胞或将与所述试剂结合的抗体或其它结合剂。在这方面，参见例如US20040101519和20060034810，其通过引用并入本文，用于人工抗原呈递细胞(aAPC)，该细胞被考虑用于在本发明中激活和扩增T细胞。
在一个实施方案中，两种试剂固定在珠子上，在相同的珠子上，即"顺式"，或固定至单独的珠子上，即"反式"。例如，提供初级活化信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子量共同固定到相同的珠上。在一个实施方案中，使用以1:1比例结合至珠上的各抗体用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与珠子结合的抗CD3：CD28抗体的比例，其使得与使用1:1的比例观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定的实施方案中，与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠结合的CD3：CD28抗体比例的范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3：CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个具体实施方案中，使用了1:100的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用了1:75的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在进一步的实施方案中，使用了1:50的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用了1:30的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在一个优选的实施方案中，使用了1:10的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用了1:3的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在又一个实施方案中，使用了3:1的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。
1:500至500:1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比例都可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠仅能结合少数细胞，而较大的珠能结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比例范围为1:100至100:1以及其间为任何整数值，并且在进一步的实施方案中，比例包括1:9至9:1以及其间的任何整数值，也可以用于刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3-和抗CD28-偶联颗粒与T细胞的比例可以如上所述变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比例是每个T细胞至少1:1颗粒。在一个实施方案中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比例。在一个特定实施方案中，优选的颗粒：细胞比例为1:5。在进一步的实施方案中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，在第一天，颗粒与细胞的比例为1:1至10:1，并且在最多10天内，每天或每隔一天将另外的颗粒加入细胞中，最终比例为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特定的实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为1:1，在刺激的第三天和第五天，调节至1:5。在另一个实施方案中，颗粒以每天或每隔一天的方式加入，在刺激的第一天最终比例为1:1，在刺激的第三天和第五天为1:5。在另一个实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为2:1，在刺激的第三天和第五天，调节至1:10。在另一个实施方案中，颗粒以每天或每隔一天的方式加入，在刺激的第一天最终比例为1:1，在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员将理解，多种其它比例可适用于本发明。特别地，比例将根据颗粒尺寸以及细胞尺寸和类型而变化。
在本发明的进一步实施方案中，将T细胞(优选Treg细胞)与试剂包被的珠子混合，随后将珠子和细胞分离，然后培养细胞。在一个替代实施方案中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是将它们一起培养。在另一个实施方案中，首先通过施加力如磁力来浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28珠)接触Treg细胞群体的细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如，104至109T细胞)和珠(例如，比例为1:1的M-450CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液中合并，优选PBS(不含二价阳离子如钙和镁)。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常稀少，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品都是目的靶细胞(即100％)。因此，任何细胞数量都在本发明的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著减小颗粒和细胞在其中混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万细胞/ml或1亿细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些实施方案中是期望获得的。
在本发明的一个实施方案中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，混合物可以培养21天。在本发明的一个实施方案中，将珠子和T细胞一起培养大约8天。在另一个实施方案中，将珠子和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个循环的刺激，以使T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-Vivo 15(Lonza))，其可以含有增殖和存活必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、Plasmanate和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-vivo 15和X-vivo20、优化因子(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，是无血清的或补充有适量的血清(或血浆)或确定的激素组，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采外周血单核细胞产品具有的辅助T细胞群(Th，CD4+)大于细胞毒性或抑制性T细胞群(Tc，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体进行T细胞的离体扩增产生了T细胞群，该T细胞群在约8-9天之前主要由Th细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群则包含越来越多的Tc细胞群。因此，根据治疗目的，给受试者输注主要包含Th细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离了Tc细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩增至更大程度可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标记以外，其它表型标记也有显著变化，但在细胞扩增过程中大部分是可重现的。因此，这种再现性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产品。
在本发明的一个实施方案中，T细胞可以在雷帕霉素存在下培养以获得调节性T细胞，如例如在WO2007110785中所述，该文献通过引用并入本文中。US2016024470中描述了另一种产生调节性T细胞的方法，其通过引用并入本文，其中将T细胞与T细胞受体(TCR)/CD3激活剂例如TCR/CD3抗体、TCR共刺激激活剂例如CD28、CD137(4-1BB)、GITR、B7-1/2、CD5、ICOS、OX40、CD40或CD137抗体和雷帕霉素一起培养。
在本发明的一个实施方案中，通过CAR的表达而遗传修饰的T细胞也可以通过至少一种胞内因子如ROR-C、Foxo1、T-bet或Gata 3、C-Maf、AhR的表达而遗传修饰。在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达Foxo1。
在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的细胞可以是同种异体免疫细胞，例如，同种异体T或Treg细胞。例如，同种异体免疫细胞可以是缺乏功能性人白细胞抗原(HLA)例如I类HLA和/或II类HLA的表达或缺乏功能性T细胞受体(TCR)的表达的免疫细胞。
在一个实施方案中，可将缺乏功能性TCR的T细胞工程化，以使其在其表面不表达任何功能性TCR，工程化以使其不表达一个或多个包含功能性TCR的亚基，或工程化以使其在其表面产生非常少的功能性TCR。或者，该T细胞可表达实质上受损的TCR，例如通过表达该TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式。术语"实质上受损的TCR"是指该TCR不会在宿主中引起不利的免疫反应。
在另一个实施方案中，可以工程化改造本文所述的遗传修饰的细胞，使得它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的免疫细胞可被工程化，使得细胞表面HLA表达，例如I类HLA和/或II类HLA或非经典HLA分子表达被下调。
在另一实施方案中，该T细胞可缺乏功能性TCR及功能性HLA，诸如I类HLA及/或II类HLA。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的免疫细胞(例如，修饰的T或Treg细胞)可通过任何合适的方法获得，包括敲除或敲低TCR和/或HLA的一个或多个亚基。例如，免疫细胞可包括使用siRNA、shRNA、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指内切核酸酶(ZFN)、大型核酸酶(meganuclease或mn，也称为归巢内切核酸酶)或megaTAL(将TAL效应物与mn切割结构域组合)敲减TCR和/或HLA(Osborn等人,“Evaluation of TCR Gene Editing Achieved by TALENs,CRISPR/Cas9,and megaTALNucleases”Mol Ther.2016Mar；24(3):570-81)。
在一个实施方案中，TCR表达和/或HLA表达可以使用靶向T细胞中编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA抑制。T细胞中siRNA和shRNA的表达可以使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。下调I类HLA和/或II类HLA基因表达的示例性siRNA和shRNA描述于例如US2007/0036773中。下调TCR组分表达的示例性shRNA描述于例如US2012/0321667中。
本文中使用的"CRISPR"或"针对TCR和/或HLA的CRISPR"或"抑制TCR和/或HLA的CRISPR"是指一组成簇的规律间隔的短回文重复序列，或包含重复序列组的系统。如本文所用，"Cas"是指CRISPR相关蛋白。"CRISPR/Cas"系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可以用于沉默或突变TCR和/或HLA基因。
在大约40％的经测序真细菌基因组和90％的经测序古细菌中发现了天然存在的CRISPR/Cas系统。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8:172。该系统是一种原核免疫系统，其赋予对诸如质粒和噬菌体的外源遗传元件的抗性，并提供获得性免疫的形式。Barrangou等人(2007)Science 315:1709-1712；Marragini等人(2008)Science 322:1843-1845。CRISPR/Cas系统已经被修饰用于真核生物(例如小鼠或灵长类)中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature 482：331-8。这通过将含有特别设计的CRISPR和一种或多种合适的Cas的质粒引入真核细胞中来实现。CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替的重复序列和间隔区。在天然存在的CRISPR中，间隔区通常包含对于细菌而言外源的序列，例如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLA CRISPR/Cas系统中，间隔区源自TCR或HLA基因序列。来自CRISPR基因座的RNA被组成型表达，并由Cas蛋白加工成小RNA。这些序列包含侧翼为重复序列的间隔区。RNA引导其它Cas蛋白以在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。Horvath等人(2010)Science 327:167-170；Makarova等人(2006)BiologyDirect 1:7。因此，间隔区作为RNA分子的模板，类似于siRNA。Penisis(2013)Science 341：833-836。因此CRISPR/Cas系统可以用于编辑TCR和/或HLA基因(添加或缺失碱基对)，或引入提前终止，从而减少TCR和/或HLA的表达。备选地，CRISPR/Cas系统可以像RNA干扰一样使用，以可逆的方式关闭HLA基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至TCR和/或HLA启动子，空间阻断RNA聚合酶。
可以使用本领域已知的技术，例如US20140068797和Cong(2013)Science 339：819-823中所述的技术，产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统。也可产生本领域已知的抑制TCR和/或HLA的其它人工CRISPR/Cas系统，例如以下中所述：Tsai(2014)NatureBiotechnol 32:6 569-576，US8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359。
"TALEN"或"针对TCR和/或HLA的TALEN"或"抑制TCR和/或HLA的TALEN"是指转录激活子样效应核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA的人工核酸酶。TALEN通过将TAL效应DNA结合结构域融合至DNA切割结构域人工产生。转录激活子样效应物(TALE)可经工程化以结合任何所需DNA序列，包括TCR和/或HLA基因的一部分。通过将工程化TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何期望的DNA序列(包括TCR和/或HLA序列)特异的限制酶。然后可将这些导入细胞，其中它们可用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6；和Boch等人(2009)Science 326:1509-12；Moscou等人(2009)Science 326:3501。
TALE是由黄单胞菌分泌的蛋白。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸的序列，除了第12和第13个氨基酸。这两个位置是高度可变的，显示与特异核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以被工程化以结合到所需的DNA序列。为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，所述核酸酶是野生型或突变的Fokl内切核酸酶。已经对Fokl进行了几种突变以用于TALEN；例如，这些提高了切割特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.39:e82；Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.29:731-734；Wood等人(2011)Science 333:307；Doyon等人(2010)Nature Methods 8:74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.25:786-793；和Guo等人(2010)/.Mol.Biol.200:96。Fokl结构域作为二聚体起作用，这需要两个构建体，所述构建体具有针对目标基因组中的位点的具有适当方向和间隔的独特DNA结合结构域。TALE DNA结合结构域和Fokl切割结构域之间的氨基酸残基的数量和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数量似乎是实现高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8。TCR和/或HLA TALEN可以在细胞内用于产生双链断裂(DSB)。如果修复机制通过非同源末端接合不正确地修复断裂，则可以在断裂位点引入突变。例如，不正确的修复可能引入移码突变。或者，外源DNA可以与TALEN一起导入细胞；根据外源DNA的序列和染色体序列，该方法可用于纠正TCR和/或HLA基因中的缺陷或将这样的缺陷引入wt TCR和/或HLA基因中，从而降低TCR和/或HLA的表达。TCR和/或HLA中序列特异性的TALEN可以使用本领域已知的任何方法构建，包括使用模块组件的各种方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6:el9509。
"ZFN"或"锌指核酸酶"或"针对TCR和/或HLA的ZFN"或"抑制TCR和/或HLA的ZFN"是指锌指核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA基因的人工核酸酶。与TALEN一样，ZFN包含融合到DNA结合结构域的Fokl核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。Carroll等人(2011)Genetics Society of America 188:773-782；和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160。锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可包含例如Cys2His2，并可识别约3-bp序列。可以组合已知特异性的各种锌指来产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
与TALEN一样，ZFN必须二聚化才能切割DNA。因此，需要ZFN对来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相对链，从而它们的核酸酶被正确地间隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5。还像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果被不正确地修复，则其可以产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和数量降低。ZFN也可以与同源重组一起用以在TCR和/或HLA基因中产生突变。TCR和/或HLA中序列特异性的ZFN可以使用本领域已知的任何方法构建。参见，例如，Provasi(2011)Nature Med.18:807-815；Torikai(2013)Blood 122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7；Quo等人(2010)/.Mol.Biol.400:96；US2011/0158957；和US2012/0060230。
"大型核酸酶"或"针对TCR和/或HLA的大型核酸酶"或"抑制TCR和/或HLA的大型核酸酶"是指具有大的(＞14个碱基对)识别位点的单体内切核酸酶，其可用于编辑TCR和/或HLA基因。大型核酸酶(MN)是具有固有核酸酶活性的单体蛋白，其源自细菌归巢核酸内切酶并且针对独特的靶位点进行了工程化。归巢内切核酸酶是DNA切割酶，其可以在它们的宿主基因组中的单独基因座处产生双链断裂，从而驱动位点特异性基因转化事件。(Stoddard，Structure.2011Jan 12；19(1)：7-15)。尽管归巢核酸内切酶的大小较小，但它们能识别长的DNA序列(通常为20-30个碱基对)。归巢核酸内切酶非常广泛，并且在微生物以及噬菌体和病毒中发现。LAGLIDADG和His-Cys盒酶(其是这些酶的最特异性的序列)依赖于对接到它们的DNA靶位点的大沟中的反平行β-片(Flick等人,1998；Jurica等人,1998)。在那里它们建立了在多个连续碱基对上不均匀分布的序列特异性和非特异性的接触的集合(Chevalier等人,2003；Scalley-Kim等人,2007)。
LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)家族是用于基因靶向应用的工程酶的主要来源。LHE家族主要在古细菌内以及在藻类和真菌的叶绿体和线粒体基因组中编码(Chevalier等人,2005；Dalgaard等人,1997；Sethuraman等人,2009)。每个蛋白链具有单个保守LAGLIDADG基序(SEQ ID NO：85)的大型核酸酶形成切割回文和几乎回文的DNA靶序列的同型二聚体蛋白，而每个蛋白链含有两个此基序的那些形成可靶向完全不对称DNA序列的更大的假对称单体。
大型核酸酶可以被工程化以靶向TCR和/或HLA，并因此在DNA中产生双链断裂，如果被不正确地修复，其可以产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和量的降低。
"MegaTAL"或"针对TCR和/或HLA的MegaTAL"或"抑制TCR和/或HLA的MegaTAL"是指人工核酸酶，其可用于编辑TCR和/或HLA基因。MegaTAL是通过将最小TAL(转录激活子样)效应结构域融合到来源于LAGLIDADG归巢核酸内切酶家族的大型核酸酶的N-末端而获得的杂合单体核酸酶(Nucleic Acids Res.2014Feb；42(4):2591-601；Takeuchi等人,MethodsMol Biol.2015；1239:105-32.doi:10.1007/978-1-4939-1862-1_6)。因此，MegaTAL由位点特异性大型核酸酶切割头部组成，所述切割头部具有TAL效应子DNA结合结构域提供的额外亲和力和特异性。可将MegaTAL工程化以靶向TCR和/或HLA，从而在DNA中产生双链断裂，如果不正确地修复，则其可产生移码突变，导致细胞中HLA的表达和量的降低。使用I-OnuI大型核酸酶(mn)的变体设计TCRα-MegaTAL以敲除T细胞受体α(TCRα)基因。将TCRαmn融合到10.5重复的TALE阵列上，所述阵列设计用于结合TCRαmn结合位点上游的DNA序列。发现靶向TCRα的megaTAL在人原代T细胞中实现了极高的基因破坏，没有可检测的脱靶切割(Boissel等人,Nucleic Acids Res.2014Feb；42(4):2591-601)。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施方案中，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性，这是由于T细胞中的端粒缩短；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善T细胞在患者体内的持久性。参见Carl June,"Adoptive T cell therapy forcancer in the clinic",Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本公开提供了产生表达CAR的免疫细胞的方法，包括使免疫细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后使细胞与核酸接触。
本发明的另一个目的是包含至少一种本发明的免疫细胞或群、由其组成或基本上由其组成的组合物。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种分离的和/或基本上纯化的本发明的免疫细胞群，由其组成或基本上由其组成。
在一个实施方案中，所述组合物已经冷冻和解冻。
本发明的另一个目的是药物组合物，其包含至少一种如上文所述的免疫细胞或免疫细胞群和至少一种药学上可接受的赋形剂，或由或基本上由其组成。
本发明的另一个目的是包含、由或基本上由至少一种如上文所述的免疫细胞群组成的药物。
在一个实施方案中，药物组合物或药物包含本发明的分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群。
如本文所用，针对药物组合物或药物的术语"基本上由……组成"是指本发明的至少一种免疫细胞或免疫细胞群是所述药物组合物或药物内唯一的一种治疗剂或具有生物活性的试剂。
这样的组合物和药物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在一个方面，本发明的免疫细胞组合物通过皮内或皮下注射施用给患者。
在一个实施方案中，本发明的至少一种免疫细胞或免疫细胞群通过静脉内注射施用。
因此，在一个实施方案中，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
在一个实施方案中，本发明的工程化的免疫细胞可用作将所述免疫细胞募集至特异性免疫或炎性应答的位点，并活化免疫细胞以抑制免疫效应细胞在这些位点处的免疫活性的手段。因此CAR介导的免疫细胞的募集和激活可以提供预防或治疗许多得益于此类免疫抑制活性的免疫疾病或病症的方法。
在一个实施方案中，免疫细胞是如上文所述的调节性免疫细胞，优选选自包含以下的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。
在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞。尽管调节性T细胞的激活是抗原依赖性的，但是这些细胞的抑制作用是抗原-、TCR-和MHC-非依赖性的。因此，CAR在调节性T细胞中的表达将这些细胞及其激活重新导向合适的靶组织，以便它们以抗原特异性方式激活；然而，它们的抑制作用的发生不需要进一步识别疾病相关抗原。因此，只要调节性T细胞位于免疫效应细胞所在的正确的附近位置并介导它们的不期望的效应，则重定向的调节性T细胞就可以在该位置被触发或激活以产生它们的抑制效应。
在一个实施方案中，HLA-A2靶抗原可以在由免疫效应细胞介导的不期望的免疫或炎症反应的部位或靶组织处存在或表达。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可用于治疗一种或多种与器官或组织移植相关的疾病、病症、症状或状况(例如，器官或组织排斥/功能障碍、GVHD和/或与其相关的状况)。移植排斥涉及供体的移植组织通过免疫应答被受体的免疫细胞破坏。GVHD中也涉及免疫应答；然而，在这种情况下，受体的组织通过移植物被转移到受体的供体的免疫细胞破坏。因此，CAR介导的免疫细胞的重定向和激活提供了在GVHD的情况下抑制免疫效应细胞对错配细胞和/或组织的排斥或抑制移植的免疫活性细胞的致病作用的方法。在一个实施方案中，错配的细胞和/或组织包括HLA-A2错配的细胞和/或组织。
因此，本发明的另一个目的是用于治疗受试者中与器官或组织移植相关的一种或多种疾病、病症、症状或病况(例如，器官或组织排斥/功能障碍、GVHD和/或与其相关的病况)的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所述的CAR工程化的免疫细胞或组合物。
在一个实施方案中，所述方法是细胞治疗方法。在一个实施方案中，细胞治疗是自体的。在一个实施方案中，细胞治疗是异源的。在一个实施方案中，细胞治疗是同种异体的。在一个实施方案中，所述方法是基因治疗方法。
因此，本发明的另一个目的是如本文所述的CAR工程化的免疫细胞或组合物，其用于治疗受试者中与器官或组织移植相关的一种或多种疾病、病症、症状或病况(例如，器官或组织排斥/功能障碍、GVHD和/或与其相关的病况)。
本发明的CAR修饰的免疫细胞可进一步用于促进受试者中的免疫耐受、手术耐受和/或免疫调节，特别是在器官或组织移植之后。
因此，本发明的另一个目的是促进受试者中的免疫耐受、手术耐受和/或免疫调节的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的CAR工程化免疫细胞或药物组合物。在一个实施方案中，所述方法可以用于促进对受试者中移植的器官或组织的免疫耐受、手术耐受和/或免疫适应。
在一个实施方案中，在移植器官或组织的同时、之前或之后施用本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)可用于预防或治疗对移植器官或组织的排斥。对移植器官或组织的排斥的实例包括但不限于对移植器官或组织的超急性排斥，以及对移植器官或组织的抗体介导的排斥。
在一个实施方案中，本发明的方法包括将本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)施用至暴露于移植器官或组织的受试者。
在一个实施方案中，移植的器官或组织可以包括骨髓移植、器官移植、输血或有目的地引入到受试者中的任何其它外来组织或细胞。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)可用作治疗以抑制移植后的移植排斥，包括但不限于同种异体移植排斥或异种移植排斥。
本发明的另一个目的是预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥的方法，该方法包括向受试者施用本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)，或包含所述免疫细胞的药物组合物。
因此，本发明的另一个目的是本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)，或包含所述免疫细胞的药物组合物，其用于在受试者中预防或治疗器官或组织移植排斥。
本发明的另一个目的是增加受试者中移植物存活的时间的方法，该方法包括向受试者施用本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)，或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，所述方法产生的移植物存活时间段为1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年，或受试者的终生。
在一个实施方案中，所述受试者没有经历任何免疫抑制剂治疗。
在一个实施方案中，施用本发明的免疫细胞或组合物允许减少由受试者接受的免疫抑制剂治疗的量。
在一个实施方案中，移植物是同种异体移植物。在一个实施方案中，在将移植物移植到受体中的同时、之前或之后，可将移植物暴露于本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)。在一个实施方案中，器官或组织移植物可以是心脏、心脏瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞。然而，本发明不限于特定类型的移植。
在一个实施方案中，供体移植物可以在移植到受体中之前通过用本发明的CAR工程化的免疫细胞处理器官或组织移植物来"预处理"或"预先准备"，以降低移植物对抗受体的免疫原性，从而降低或预防移植物排斥。
在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对选自由HLA-A03、HLA-A11、HLA-A23、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A33和HLA-A34组成的组的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对选自HLA-A25、HLA-A29和HLA-A30组成的组的HLA-A亚型是阳性的。
在一个实施方案中，移植物为HLA-A2阳性。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)可用于预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。在一个实施方案中，该方法包括将本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)施用于暴露于移植器官或组织的受试者。在一个实施方案中，移植的器官或组织可以包括骨髓移植、器官移植、输血或有目的地引入受试者的任何其它外来组织或细胞。例如，GVHD可发生在心脏、心脏瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞移植之后。然而，本发明不限于特定类型的移植。
在一个实施方案中，GVHD可在造血干细胞移植后发生。
因此，本发明的另一个目的是预防或治疗受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的CAR-工程化免疫细胞(优选CAR-工程化Treg细胞)或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了在将移植物移植到受体中的同时、之前或之后，使供体移植物(例如，生物相容性格架或供体组织、器官或细胞)与本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)接触的方法。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)可用于改善、抑制或减少供体移植物对抗受体的不利反应，从而预防或治疗GVHD。
因此，本发明的另一个目的是在受试者中预防或延迟GVHD发作的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)或药物组合物。
在一个实施方案中，GVHD的发作延迟1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年或受试者的终生。
在一个实施方案中，所述受试者没有经历任何免疫抑制剂治疗。
在一个实施方案中，所述受试者正在经历免疫抑制疗法。在一个实施方案中，将本发明的免疫细胞施用于受试者，目的是降低所述免疫抑制疗法的治疗有效量。
在一个实施方案中，GVHD可以是急性GVHD或慢性GVHD。
在一个实施方案中，供体移植物可以通过在移植到受体中之前用本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)处理移植物来"预处理"或"预先准备"，以便降低移植物对抗受体的免疫原性，从而降低或预防GVHD。在一个实施方案中，移植前可将移植物与受体的细胞或组织接触以活化与移植物相关的T细胞。在用来自受体的细胞或组织处理移植物后，可从移植物取出细胞或组织。然后，可以使经处理的移植物进一步与本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)接触，以降低、抑制或消除通过处理来自受体的细胞或组织而活化的免疫效应细胞的活性。在用本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)处理移植物之后，CAR修饰的免疫细胞可以在移植到受体中之前从移植物中去除。然而，一些CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可以贴附至移植物，并且因此可以随移植物引入至受体。在这种情况下，引入到受体中的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可以抑制由与移植相关的细胞引起的针对受体的免疫应答。
在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对选自由HLA-A03、HLA-A11、HLA-A23、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A33和HLA-A34组成的组的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对选自由HLA-A25、HLA-A29和HLA-A30组成的组的HLA-A亚型是阳性的。
在一个实施方案中，移植物为HLA-A2阳性。
本发明的另一个目的是在受试者中扩增免疫细胞群的方法，其中免疫细胞被修饰以表达本发明的嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方描述的工程化的免疫细胞，其中施用的工程化的免疫细胞在受试者中产生子代免疫细胞群。
在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞，优选选自包含调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合的组，更优选调节性T细胞。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的Treg细胞能够在体内复制，从而导致长期持久性，这可以产生对靶细胞的免疫应答的持续抑制和免疫耐受。
因此，本发明的另一个目的是在受试者中产生调节性T细胞的持久群的方法，其中所述调节性T细胞被修饰以表达本发明的嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括向所述受试者施用如本文任何地方所述的调节性T细胞，其中所述修饰的调节性T细胞的持久群在施用后在所述受试者中持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、200天、300天、400天、500天、600天、700天、800天、900天或1000天。
在一个实施方案中，本发明的CAR-Treg细胞可能能够在体内自我更新并且被再活化以抑制靶细胞的免疫应答。在一个实施方案中，CAR-Treg细胞可以是记忆CAR-Treg细胞，其可被再活化以抑制靶细胞的免疫应答。
免疫细胞可以从任何来源获得。例如，在一个实施方案中，免疫细胞可以从组织供体、移植受体或其他无关来源(完全不同的个体或物种)获得，用于产生本发明的CAR修饰的免疫细胞。因此，本发明的CAR修饰的免疫细胞对于移植受体可以是自体的、同种异体的或异种的，或者是其它不相关的来源。在一个实施方案中，本发明的CAR-Treg细胞对于移植受体可以是自体的、同种异体的或异种的。在一个实施方案中，本发明的CAR-Treg细胞对于移植受体可以是自体的。
在一个实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物。在一个实施方案中，所述受试者可以是人。
在一个实施方案中，可能需要给受试者施用活化的T细胞，然后再抽血(或进行单采术)，根据本发明活化其中的T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再输注到受试者体内。该过程可以每几个星期进行多次。在某些实施方案中，T细胞可以从10cc至400cc的抽血中活化。在某些实施方案中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中活化。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可以用于选出某些T细胞群。
本发明的CAR工程化的免疫细胞可单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分组合施用，所述其他组分包括但不限于IL-2或其他细胞因子或细胞群。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文任何地方描述的CAR工程化的免疫细胞或细胞群。这样的组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以任何合适的方式施用于受试者，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文任何地方描述的药物组合物可以通过肠胃外施用施用于受试者。本文任何地方描述的药物组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、胸骨内注射、静脉内注射、输注技术或腹膜内施用于受试者。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过皮内或皮下注射施用给受试者。在另一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过静脉内注射施用。在一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞的组合物可以直接注射到淋巴结、感染部位、炎症部位或组织或器官排斥部位。
本发明的药物组合物可以以适合于待预防或治疗的疾病的方式施用。施用的量和频率将由诸如受试者的状况、受试者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可通过临床试验来确定。
当指示"有效量"或"治疗量"时，待施用的本发明组合物的准确量可考虑受试者的年龄、体重、抗体滴度和状况的个体差异来确定。通常可以说，包含如本文任何地方所述的CAR工程化的免疫细胞的药物组合物可以以1x104至1x109个细胞/kg体重或1x105至100x105个细胞/kg体重的剂量施用，包括那些范围内的所有整数值。CAR工程化的免疫细胞组合物也可以以这些剂量施用多次。CAR工程化的免疫细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用。通过监测受试者的疾病征象并相应地调整治疗，可以容易地确定特定受试者的最佳剂量和治疗方案。
在一个实施方案中，将本发明的至少一种CAR工程化的免疫细胞与另一种活性剂组合施用至有需要的受试者。根据一个实施方案，所述至少一种免疫细胞群在施用另一种活性剂之前、同时或之后施用。
在一个实施方案中，本发明的CAR-工程化的免疫细胞可与任何数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)施用给受试者，所述治疗方式包括但不限于用试剂如抗病毒疗法、化学疗法、放射、免疫抑制剂、抗体、免疫清除剂、细胞因子和辐射治疗。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可与免疫抑制剂联合施用。可以使用本领域已知的任何免疫抑制剂。
免疫抑制剂的实例包括但不限于钙调磷酸酶抑制剂例如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林(methoxsalen)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、霉酚酸、霉酚酸钠、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、利妥昔单抗、mTOR抑制剂如西罗莫司、依维莫司、巴利昔单抗、达克珠单抗、贝洛西普、阿仑单抗、莫罗单抗-CD3、抗胸腺细胞球蛋白、糖皮质类固醇或肾上腺皮质类固醇例如泼尼松和泼尼松龙，或其任意组合。
本发明的CAR工程化的免疫细胞可在免疫抑制剂之前、之后或与免疫抑制剂同时施用给受试者。
本发明的CAR工程化的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植后施用于受试者。可选地，或另外，本发明的CAR工程化的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植之前施用于受试者。本发明的CAR工程化的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植手术期间施用于受试者。
在一个实施方案中，一旦免疫抑制疗法已经开始，就进行本发明的将CAR工程化的免疫细胞施用至受试者的方法。
在一些实施方案中，所述方法进行多于一次，例如，以随时间监测移植受体，并且如果适用，用在不同的免疫抑制治疗方案中。
在一些实施方案中，如果预测移植物受体对移植物耐受，则减少免疫抑制疗法。在一些实施方案中，如果预测移植物受体对移植物耐受，则不开具免疫抑制疗法，例如停止免疫抑制疗法。
因此，本发明还涉及部件的试剂盒，其在第一部件中包括本发明的免疫细胞或免疫细胞群，并在第二部件中包括另一种活性剂，包括但不限于抗病毒疗法、化学疗法、放射、免疫抑制剂、抗体、免疫清除剂、细胞因子和辐射。优选地，本发明的部件的试剂盒在第一部件中包括本发明的免疫细胞或免疫细胞群，并且在第二部件中包括一种或多种免疫抑制剂。
在一个实施方案中，该部件的试剂盒包含用于制备本发明的细胞的一种或多种试剂(例如，编码本公开的抗HLA-A抗体或CAR的核酸或表达载体)。
可存在于本发明的试剂盒中的免疫抑制剂的实例包括但不限于钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素、他克莫司、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林、雷帕霉素、霉酚酸酯、霉酚酸、霉酚酸钠、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、利妥昔单抗、mTOR抑制剂例如西罗莫司、依维莫司、巴利昔单抗、达克珠单抗、贝拉西普、阿仑单抗、莫罗单抗-CD3、抗胸腺球蛋白细胞、糖皮质类固醇或肾上腺皮质类固醇例如泼尼松和泼尼松龙，或其任意组合。
本发明的另一个目的是预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥的方法，该方法包括向受试者施用(i)至少一种免疫抑制剂和(ii)本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)，或包含所述免疫细胞的药物组合物。
因此，本发明的另一个目的是本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化Treg细胞)或包含所述免疫细胞的药物组合物与至少一种免疫抑制剂的组合，其用于预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥。
本发明的另一个目的是增加受试者中的移植物存活时间段的方法，该方法包括向受试者施用至少一种免疫抑制剂和本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)，或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，至少一种免疫抑制剂与本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)的组合用于预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
在一个实施方案中，GVHD可在造血干细胞移植后发生。
因此，本发明的另一个目的是预防或治疗受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的至少一种免疫抑制剂和CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化Treg细胞)或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了在将移植物移植到受体中的同时、之前或之后，使供体移植物(例如，生物相容的格架或供体组织、器官或细胞)与至少一种免疫抑制剂和本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)接触的方法。
在一个实施方案中，至少一种免疫抑制剂与本发明的CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)的组合可用于改善、抑制或减少供体移植物对抗针对受体的不利反应，从而预防或治疗GVHD。
因此，本发明的另一个目的是在受试者中预防或延迟GVHD发作的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的至少一种免疫抑制剂和CAR工程化的免疫细胞(优选CAR工程化的Treg细胞)或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞和至少一种免疫抑制剂同时或顺序施用。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞和任选的至少一种其他活性剂，优选免疫抑制剂，与移植物联合施用(例如，在移植之前、同时或之后)。
本发明的CAR工程化的免疫细胞可以在诊断移植器官或组织排斥之后施用，随后施用本发明的CAR工程化的免疫细胞和免疫抑制剂两者，直到器官或组织排斥的症状消退。
在另一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞组合物可以与骨髓移植联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者。
在另一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗)后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可经历高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者可以接受本发明的扩增的CAR工程化的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，可以在手术之前或之后施用扩增的CAR工程化的免疫细胞。
在一个实施方案中，受试者(例如人)接受本发明的至少一种免疫细胞或免疫细胞群的初始施用，和一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用是在前次施用后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。
在一个实施方案中，将治疗有效量的本发明的免疫细胞施用或将要施用给受试者。
在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种免疫细胞群的免疫细胞的量是至少102、103、104、105、106、107、108或109个细胞。
在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量在约102至约109、约103至约108、约104至约107或约105至约106个细胞的范围内。
在另一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量在约106至约109、约106至107、约106至108、约107至109、约107至108、约108至109的范围内。在另一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量为约106、约107、约108或约109。
在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种免疫细胞群的免疫细胞的量为至少102、103、104、105、106、107、108或109个细胞/kg身体。
在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量在约104至109个细胞/kg体重或105至108个细胞/kg体重的范围内，包括在那些范围内的所有整数值。
在一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用本发明的至少一种免疫细胞或免疫细胞群多于一次，例如每周施用本发明的遗传修饰的免疫细胞或免疫细胞群2、3或4次。
本发明的另一个目的是含有可用于预防和/或治疗移植排斥或GVHD的材料的制品。
所述制品可包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器装有能有效预防和/或治疗免疫疾病如移植排斥或GVHD的组合物，并可具有无菌入口(例如该容器可以是静脉注射液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的CAR工程化的免疫细胞，优选CAR工程化的Treg。
标签或包装插页可指示该组合物用于预防或治疗移植排斥或GVHD。
制品、标签或包装插页还可以包括用于向患者施用CAR工程化的免疫细胞组合物的指导材料。另外，制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户观点来看所希望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
还提供了用于各种目的(例如，用于预防或治疗移植排斥或GVHD)的试剂盒。可以提供含有CAR工程化的免疫细胞的试剂盒。与制品一样，试剂盒可以包括容器和在容器上或与容器关联的标签或包装插页。容器容纳包含至少一种CAR工程化的免疫细胞，优选本发明的CAR工程化的Treg的组合物。可以包括另外的容器，其包含例如稀释剂和缓冲剂。标签或包装插页可以提供组合物的说明以及预期用途的说明书。
附图简要说明
图1是显示本发明的抗HLA-A2CAR构建体与常见HLA-A和HLA-B等位基因变体的交叉反应性的图的组合。将表达本发明的CAR构建体(或鼠抗HLA-A2CAR构建体)的GFP+Treg细胞与Flow Panel反应性单抗原珠和可固定的活性染料在室温下孵育30分钟。然后洗涤样品，固定并通过流式细胞术分析。如方法中所述分析数据。A和B中的数据显示相对于仅表达GFP的对照Treg细胞的结合百分比，其针对通过细胞仪收集的HLA阴性珠的数量进行了标准化。线上的数据点代表自仅有珠子的对照的平均值的两个以上标准偏差的值，因此是统计学显著的(p＜0.05)。数据是两次独立实验的平均值。平均值±SEM。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例1：
材料和方法
人源化HLA-A2特异性scFv的产生。HLA-A2特异性scFv的序列来源于专利申请US2013/0078243A1中公开的序列。编码人源化scFv的密码子优化的基因序列由GeneArt，Life Technologies(Regensburg)作为"串"(strings)合成，使用供应商提供的密码子优化算法。ScFv的N-末端侧翼是Kozak序列和CD8信号序列。构建体进一步侧接BamHI和MfeI限制性位点，其允许框内克隆至自失活的慢病毒CAR表达质粒的CD8铰链区。PGK启动子驱动的CAR表达质粒含有人CD8铰链和CD8跨膜结构域，其后是与人CD3ζ融合的胞内人41BB共刺激结构域。在CAR序列之后，通过可自切割的2A位点在框内连接EGFP报告蛋白，用于检测细胞中的基因转移。
HLA-A2-CAR的产生。使用第3代包装质粒(Trono Lab，EPFL(école polytechniquefédérale de Lausanne))，通过在HEK 293T细胞中基于聚乙烯亚胺的瞬时转染产生病毒载体。
Jurkat NFAT。将Jurkat-Lucia NFAT报道细胞系培养在补充有10％胎牛血清的RPMI(Gibco，Life Technologies)中。使用在不同浓度的病毒载体下的孵育来转导细胞，以实现30-50％的转导，从而避免多个载体整合。通过与结合APC的HLA-A2多聚体(Dextramer，WB2666，Immudex；Copenhagen，丹麦)结合，证实了正确折叠CAR的表达和展示。通过HLA-A2特异性CAR与HLA-A2阳性或HLA-A2阴性细胞系的共培养，实现经由CAR的活化。在发光计(Glowmax，Promega)上使用QUANTI-Luc底物(Invivogen)分析培养基中NFAT活化依赖性萤光素酶的分泌。
Treg分选、转导和扩增。通过RosetteSep(Stemcell)从HLA-A2-供体分离CD4+T细胞，富集CD25+细胞(Miltenyi)，然后使用FACSAria II(BD Biosciences)分选活的CD4+CD127loCD25hi Treg。分选的Treg用L细胞和在1000U/mL IL-2中的αCD3mAb(OKT3；200ng/mL)刺激。一天后，用慢病毒以10个病毒颗粒：1个细胞的感染复数转导细胞。在第7天，如上所述用L细胞再刺激细胞并扩增5天。为了测试HLA-A2介导的刺激的效果，将Treg与限制性IL-2(100U/mL)一起培养过夜，随后用辐照的anti-CD3/anti-CD28负载的K562.64细胞或K562.64.HLA-A2细胞以1:2(K562：T细胞)的比例再刺激24小时。
流式细胞术。对于表型分析，用可固定的活性染料(FVD，65-0865-14，eBioscience；423102，Biolegend)针对表面标记对细胞染色，然后用FOXP3/转录因子染色缓冲液组(Transcription Factor Staining Buffer Set)(eBioscience)固定/透化处理并针对胞内蛋白染色。样品在Cytoflex(Beckman-Coulter)上读取，并使用FlowJo软件版本9.9.4和10.3(Tree Star)分析结果。对CD3(564465，BD Biosciences)、CD4(317410，Biolegend)、CD25(130-091-024，Miltenyi)、LAP(25-9829-42，eBioScience)、CD69(310946，Biolegend)、CD154(555702，BD Biosciences)和CD127(48-1278-42，eBiosciences)进行表面染色。四聚体染色是通过用链霉亲和素-别藻蓝蛋白(PJ27S，Prozyme)将HLA-A*02:01单体制成的四聚体进行的。对CTLA-4(369606，Biolegen)进行细胞内染色。
HLA等位基因交叉反应性测定。将表达根据本发明的CAR或包含BB7.2抗体的VH和VL的CAR(mA2CAR)的0.25×106个Treg与单抗原抗体珠组(FL1HD01、FL1HD02、FL1HD03、FL1HD04、FL1HD06和FL1HD08，One Lambda)和可固定的活性染料(FVD，ThermoFisher，65-0865-14，eBioscience)在室温下孵育30分钟。洗涤样品，用0.5％甲醛固定，并通过流式细胞术分析。每个样品获得两百个阴性对照珠。单独的珠子用作阴性对照。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物后门控单个抗原珠。然后，通过它们各自的PE强度峰确定每种HLA抗原的珠数量。通过将每个HLA峰中目的珠的数量乘以200，除以样品中阴性珠的数量，将数据标准化。对于每个HLA峰，通过从对照样品中的珠数量减去CAR-Treg中的珠数量，然后除以非CAR表达对照中的平均珠数量，乘以100，确定与对照(非CAR表达细胞)相比的CAR Treg的相对结合百分比。
结果：
人源化HLA-A2特异性CAR的构建
产生1个人源化重链和3个不同的人源化轻链，并且通过组合人源化重链和轻链产生总共3个不同的嵌合抗原受体。
使用Jurkat NFAT报告细胞系验证CAR的表达和正确折叠。
HLA-A2-CAR构建体对其他I类HLA等位基因的交叉反应性
HLA有许多不同的等位基因，其随着时间的推移由少数祖先等位基因进化而来的。因此，存在仅有几个氨基酸不同的等位基因家族，并且单个抗HLA抗体可识别进化关联家族内的多个等位基因。已知小鼠单克隆抗体(BB7.2)对其它HLA-A等位基因具有交叉反应性(Hilton&Parham，2013)。具体地，在固相测定中进行检测时，发现BB7.2识别HLA-A2的五种亚型(*02:01、*02:02、*02:03、*02:05、*02:06)，并与HLA-A69:01交叉反应，并且在高浓度下进行检测时，也与HLA-A*23:01、A*24:02、A*24:03、A*68:01、A*68:02交叉反应(Hilton&Parham，2013)。为了评估本发明的人源化抗HLA-A2抗体的交叉反应性并与包含BB7.2抗体的VH和VL的抗体进行比较，我们采用了设计用于测量血清中的抗HLA抗体的ONE Lambda固相测定法，以测量HLA包被的珠与目的人源化CAR的结合。表达所示人源化CAR的GFP+Treg与Flow Panel反应性单抗原珠一起孵育，将与单一类型的珠的结合定量为正向/侧向散点图中珠门中的信号损失。将数据相对于样品中阴性对照珠的数量标准化，并且相对于GFP+-对照Treg的结合量，通过GFP样本中阴性珠的数量，乘以GFP样本中阴性珠的数量，计算与表达hCAR的Treg的相对结合量。
图1显示了包含具有序列SEQ ID NO：72的scFv的构建体的结果。该HLA-A2-CAR构建物显著地结合HLA-A*02:01(图1A)。令人惊讶地，对于本发明的CAR构建体，除了A*02:01之外，我们没有观察到与任何测试的HLA-A或B等位基因的任何统计学显著的结合。(图1A-B)。
序列表
<110> 英属哥伦比亚大学（THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA）
TXCELL
<120> 新的抗HLA-A2抗体及其用途
<130> P1526PC00
<140> 尚未指定
<141> 2018-09-20
<150> US 62/560,841
<151> 2017-09-20
<150> US 62/691,027
<151> 2018-06-28
<160> 89
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR1
<400> 1
Ser Tyr His Ile Gln
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 2
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR3
<400> 3
Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR1
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 5
Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR1
<400> 6
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 7
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 8
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<220>
<221> SITE
<222> 2
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 7
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 9
<223> X是L或S或A
<220>
<221> SITE
<222> 10
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 12
<223> X是P或S
<220>
<221> SITE
<222> 14
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 15
<223> X是L或P
<220>
<221> SITE
<222> 17
<223> X是E或D
<220>
<221> SITE
<222> 18
<223> X是P或R
<220>
<221> SITE
<222> 19
<223> X是A或V
<220>
<221> SITE
<222> 20
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 42
<223> X是L或Q
<220>
<221> SITE
<222> 48
<223> X是S或A
<220>
<221> SITE
<222> 63
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 79
<223> X是K或T
<220>
<221> SITE
<222> 83
<223> X是V或L
<220>
<221> SITE
<222> 85
<223> X是A或P
<220>
<221> SITE
<222> 88
<223> X是L或F
<220>
<221> SITE
<222> 89
<223> X是G或A
<400> 10
Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Xaa Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Xaa Gln Lys Pro Gly Gln Xaa
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Xaa Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile
65 70 75 80
Ser Arg Xaa Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 11
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G3S连接子
<400> 14
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G3S连接子
<400> 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G4S连接子
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G4S连接子
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G4S连接子
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G4S连接子
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区
<400> 20
Ala Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Gly Gly Ser Thr Thr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区
<400> 21
Gly Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区
<400> 22
Ser Ser Ala Thr Ala Thr Ala Gly Thr Gly Ser Ser Thr Gly Ser Thr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区
<400> 23
Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ala Ala Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区
<400> 24
ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区
<400> 25
Lys Ile Arg Arg Asp Ser Ser
1 5
<210> 26
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8铰链区
<400> 26
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 27
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8铰链区
<400> 27
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 28
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG4铰链区
<400> 28
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225 230
<210> 29
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG4铰链区
<400> 29
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690
<210> 30
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgD铰链区
<400> 30
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 31
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgD铰链区
<400> 31
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60
gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840
gaccatt 847
<210> 32
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28铰链区
<400> 32
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 33
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28铰链区
<400> 33
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 34
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8跨膜结构域
<400> 34
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 35
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8跨膜结构域
<400> 35
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 36
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 36
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 37
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 37
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 38
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 39
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 40
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 41
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 41
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 42
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 42
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 43
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 43
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 44
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB胞内结构域
<400> 44
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 45
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD27胞内结构域
<400> 45
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 46
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28胞内结构域
<400> 46
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 47
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB胞内结构域
<400> 47
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 48
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD27胞内结构域
<400> 48
caacgaagga aatatagatc aaacaaagga gaaagtcctg tggagcctgc agagccttgt 60
cgttacagct gccccaggga ggaggagggc agcaccatcc ccatccagga ggattaccga 120
aaaccggagc ctgcctgctc cccc 144
<210> 49
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28胞内结构域
<400> 49
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 50
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8前导序列
<400> 50
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 标签
<400> 51
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 标签
<400> 52
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 53
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 53
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
35 40 45
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
50 55 60
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
65 70 75 80
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
85 90 95
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
100 105 110
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
115 120 125
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
130 135 140
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
145 150 155 160
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
165 170 175
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
180 185 190
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
195 200 205
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220
<210> 54
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 54
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
35 40 45
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
50 55 60
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
65 70 75 80
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
85 90 95
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
100 105 110
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
115 120 125
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
130 135 140
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln
145 150 155 160
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
165 170 175
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
180 185 190
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
195 200 205
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220
<210> 55
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 55
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
65 70 75 80
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
85 90 95
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
100 105 110
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
130 135 140
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
145 150 155 160
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
165 170 175
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
180 185 190
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
195 200 205
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220
<210> 56
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 56
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Met His Thr Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
35 40 45
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
50 55 60
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
65 70 75 80
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
85 90 95
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
100 105 110
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Thr Arg Arg Val Lys Phe
115 120 125
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
130 135 140
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
145 150 155 160
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
165 170 175
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
180 185 190
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
195 200 205
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
210 215 220
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
225 230 235
<210> 57
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 57
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
65 70 75 80
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
85 90 95
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
100 105 110
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
130 135 140
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
145 150 155 160
Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
165 170 175
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
180 185 190
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
195 200 205
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220
<210> 58
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 58
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Met His Thr Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
35 40 45
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
50 55 60
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
65 70 75 80
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
85 90 95
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
100 105 110
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Thr Arg Arg Val Lys Phe
115 120 125
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
130 135 140
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
145 150 155 160
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
165 170 175
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
180 185 190
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
210 215 220
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
225 230 235
<210> 59
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 59
Met His Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
85 90 95
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
115 120 125
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
130 135 140
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
145 150 155 160
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
165 170 175
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
180 185 190
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
210 215 220
Pro Arg
225
<210> 60
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 60
Met His Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
85 90 95
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
115 120 125
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
130 135 140
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
145 150 155 160
Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
165 170 175
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
180 185 190
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
195 200 205
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
210 215 220
Pro Pro Arg
225
<210> 61
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P2A核糖体切割位点
<400> 61
Ala Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BB7.2的重链CDR1
<400> 62
Ser Tyr His Ile Gln
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BB7.2的重链CDR2
<400> 63
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BB7.2的重链CDR3
<400> 64
Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BB7.2的轻链CDR1
<400> 65
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BB7.2的轻链CDR2
<400> 66
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BB7.2的轻链CDR3
<400> 67
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 68
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> eGFP
<400> 68
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 69
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<220>
<221> SITE
<222> 135
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 140
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 142
<223> X是L或S或A
<220>
<221> SITE
<222> 143
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 145
<223> X是P或S
<220>
<221> SITE
<222> 147
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 148
<223> X是L或P
<220>
<221> SITE
<222> 150
<223> X是E或D
<220>
<221> SITE
<222> 151
<223> X是P或R
<220>
<221> SITE
<222> 152
<223> X是A或V
<220>
<221> SITE
<222> 153
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 175
<223> X是L或Q
<220>
<221> SITE
<222> 181
<223> X是S或A
<220>
<221> SITE
<222> 196
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 212
<223> X是K或T
<220>
<221> SITE
<222> 216
<223> X是V或L
<220>
<221> SITE
<222> 218
<223> X是A或P
<220>
<221> SITE
<222> 221
<223> X是L或F
<220>
<221> SITE
<222> 222
<223> X是G或A
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Xaa Xaa Leu
130 135 140
Xaa Val Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Xaa Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Xaa Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Xaa Ile Ser Arg Xaa Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 70
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
130 135 140
Pro Val Thr Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 71
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Val Thr Leu Gly Asp Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 72
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 73
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<220>
<221> SITE
<222> 136
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 141
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 143
<223> X是L或S或A
<220>
<221> SITE
<222> 144
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 146
<223> X是P或S
<220>
<221> SITE
<222> 148
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 149
<223> X是L或P
<220>
<221> SITE
<222> 151
<223> X是E或D
<220>
<221> SITE
<222> 152
<223> X是P或R
<220>
<221> SITE
<222> 153
<223> X是A或V
<220>
<221> SITE
<222> 154
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 176
<223> X是L或Q
<220>
<221> SITE
<222> 182
<223> X是S或A
<220>
<221> SITE
<222> 197
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 213
<223> X是K或T
<220>
<221> SITE
<222> 217
<223> X是V或L
<220>
<221> SITE
<222> 219
<223> X是A或P
<220>
<221> SITE
<222> 222
<223> X是L或F
<220>
<221> SITE
<222> 223
<223> X是G或A
<400> 73
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Xaa Xaa
130 135 140
Leu Xaa Val Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Xaa
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Xaa Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Xaa Ile Ser Arg Xaa Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 74
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<400> 74
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Pro Val Thr Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 75
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<400> 75
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Val Thr Leu Gly Asp Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 76
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv
<400> 76
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 77
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<220>
<221> SITE
<222> 136
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 141
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 143
<223> X是L或S或A
<220>
<221> SITE
<222> 144
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 146
<223> X是P或S
<220>
<221> SITE
<222> 148
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 149
<223> X是L或P
<220>
<221> SITE
<222> 151
<223> X是E或D
<220>
<221> SITE
<222> 152
<223> X是P或R
<220>
<221> SITE
<222> 153
<223> X是A或V
<220>
<221> SITE
<222> 154
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 176
<223> X是L或Q
<220>
<221> SITE
<222> 182
<223> X是S或A
<220>
<221> SITE
<222> 197
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 213
<223> X是K或T
<220>
<221> SITE
<222> 217
<223> X是V或L
<220>
<221> SITE
<222> 219
<223> X是A或P
<220>
<221> SITE
<222> 222
<223> X是L或F
<220>
<221> SITE
<222> 223
<223> X是G或A
<400> 77
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Xaa Xaa
130 135 140
Leu Xaa Val Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Xaa
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Xaa Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Xaa Ile Ser Arg Xaa Glu Xaa Glu Asp Xaa Xaa Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 78
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 78
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Pro Val Thr Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 79
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 79
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Val Thr Leu Gly Asp Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 80
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 80
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 81
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<220>
<221> SITE
<222> 157
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 162
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 164
<223> X是L或S或A
<220>
<221> SITE
<222> 165
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 167
<223> X是P或S
<220>
<221> SITE
<222> 169
<223> X是T或S
<220>
<221> SITE
<222> 170
<223> X是L或P
<220>
<221> SITE
<222> 172
<223> X是E或D
<220>
<221> SITE
<222> 173
<223> X是P或R
<220>
<221> SITE
<222> 174
<223> X是A或V
<220>
<221> SITE
<222> 175
<223> X是S或T
<220>
<221> SITE
<222> 197
<223> X是L或Q
<220>
<221> SITE
<222> 203
<223> X是S或A
<220>
<221> SITE
<222> 218
<223> X是V或I
<220>
<221> SITE
<222> 234
<223> X是Kor T
<220>
<221> SITE
<222> 238
<223> X是V或L
<220>
<221> SITE
<222> 240
<223> X是A或P
<220>
<221> SITE
<222> 243
<223> X是L或F
<220>
<221> SITE
<222> 244
<223> X是G或A
<400> 81
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Xaa Val Met Thr
145 150 155 160
Gln Xaa Pro Xaa Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
180 185 190
Leu Glu Trp Tyr Xaa Gln Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Arg Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Xaa Pro Asp Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile Ser Arg Xaa Glu Xaa
225 230 235 240
Glu Asp Xaa Xaa Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 82
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 82
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr
145 150 155 160
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
180 185 190
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 83
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 83
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly Asp Arg Val Ser Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
180 185 190
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 84
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR
<400> 84
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
180 185 190
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
225 230 235 240
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LAGLIDADG基序
<400> 85
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
<210> 86
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 86
caggtccagc tagtacaaag cggccctgaa gtaaagaaac ctggtgcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctaccaca tccagtgggt tcgacaggcc 120
cctggacagg gactagagtg gatcggctgg atctatcctg gcgacggcag cacccagtac 180
aacgagaagt tcaagggcag agttaccatc accgccgaca agagcaccag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgac cagcgaggac acagctgttt actattgtgc cagagagggc 300
acctactacg caatggatta ttggggccag gggaccagcg tgaccgtttc ttct 354
<210> 87
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 87
gatgttgtaa tgacccagac acctctgagc ctgcctgtga ccctgggaga accagcatcc 60
atcagctgtc ggagcagcca gagcatcgtt cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctacaga agcccggaca gagccccagg ctgctgatct acaaggtgtc caaccgcttc 180
agtggtgtgc ccgatagatt ttctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagagtgg aagccgagga cctgggcgtg tactactgct tccaaggcag ccatgtgcca 300
agaacctttg gtggaggcac aaagctggaa atcaagcgg 339
<210> 88
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 88
gatgttgtaa tgacccagag ccctagtagc ctgtctgtga ccctgggaga tcgagtatcc 60
atcagctgtc ggagcagcca gagcatcgtt cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatcaacaga agcccggaca gagccccagg ctgctgatct acaaggtgtc caaccgcttc 180
agtggtgtgc ccgatagatt ttctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgacgatc 240
tccagagtgg aaccagagga cctgggcgtg tactactgct tccaaggcag ccatgtgcca 300
agaacctttg gtggaggcac aaagctggaa atcaagcgg 339
<210> 89
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 89
gatattgtaa tgacccagag ccctgcaaca ctgtctgtgt cccctggaga acgagcaaca 60
atcagctgtc ggagcagcca gagcatcgtt cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatcaacaga agcccggaca ggcccccagg ctgctgatct acaaggtgtc caaccgcttc 180
agtggaatac ccgatagatt ttctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgacgatc 240
tccagattag aaccagagga ctttgcagtg tactactgct tccaaggcag ccatgtgcca 300
agaacctttg gtggaggcac aaagctggaa atcaagcgg 339

Claims (15)

1.一种人源化的能够结合HLA-A2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区的氨基酸序列由序列SEQ IDNO：9组成，并且其中所述轻链可变区的氨基酸序列由序列SEQ ID NO：13组成。
2.如权利要求1所述的人源化的能够结合HLA-A2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是完整抗体，Fv，scFv，Fab，F(ab)'2，双特异性抗体，或unibody。
3.如权利要求1所述的人源化的能够结合HLA-A2的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
4.如权利要求1至3任一项所述的人源化的能够结合HLA-A2的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是由序列SEQ ID NO：72组成的scFv。
5.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)胞外结构域，其包含如权利要求1至4任一项所述的人源化的能够结合HLA-A2的抗体或其抗原结合片段，
b)跨膜结构域，和
c)胞质结构域，其包含胞内信号传导结构域。
6.如权利要求5所述的CAR，其中所述的人源化的能够结合HLA-A2的抗体或其抗原结合片段是由SEQ ID NO：72的氨基酸序列组成的scFV。
7.如权利要求5所述的CAR，其中所述CAR特异性结合HLA-A*02:01。
8.如权利要求5至7任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域并且所述胞内信号传导结构域包含4-1BB共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
9.一种核酸分子，其编码权利要求5至8任一项所述的CAR。
10.一种免疫细胞，其包含权利要求5至8任一项所述的CAR或权利要求9所述的核酸分子。
11.如权利要求10所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是调节性T细胞。
12.一种包含权利要求10或11所述的免疫细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
13.如权利要求10或11所述的免疫细胞在制备用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受和/或治疗器官或组织移植排斥或移植物抗宿主病的药物中的用途。
14.如权利要求10或11所述的免疫细胞与至少一种免疫抑制剂的组合在制备用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受和/或治疗器官或组织移植排斥或移植物抗宿主病的药物中的用途。
15.一种部件的试剂盒，其在第一部件中包括权利要求10或11所述的免疫细胞或权利要求12所述的药物组合物，并且在第二部件中包括至少一种免疫抑制剂。
CN201880074978.9A 2017-09-20 2018-09-20 新的抗hla-a2抗体及其用途 Active CN111448216B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762560841P 2017-09-20 2017-09-20
US62/560,841 2017-09-20
US201862691027P 2018-06-28 2018-06-28
US62/691,027 2018-06-28
PCT/CA2018/051174 WO2019056106A1 (en) 2017-09-20 2018-09-20 NOVEL ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND USES THEREOF

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111448216A CN111448216A (zh) 2020-07-24
CN111448216B true CN111448216B (zh) 2023-11-07

Family

ID=65810548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880074978.9A Active CN111448216B (zh) 2017-09-20 2018-09-20 新的抗hla-a2抗体及其用途

Country Status (12)

Country Link
US (2) US11814432B2 (zh)
EP (1) EP3684822A4 (zh)
JP (1) JP7317023B2 (zh)
KR (1) KR20200090151A (zh)
CN (1) CN111448216B (zh)
AU (1) AU2018338423A1 (zh)
BR (1) BR112020005519A2 (zh)
CA (1) CA3076547A1 (zh)
IL (1) IL273401A (zh)
MX (1) MX2020003047A (zh)
SG (1) SG11202002532XA (zh)
WO (1) WO2019056106A1 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110678190A (zh) 2017-03-28 2020-01-10 宾夕法尼亚大学董事会 保护移植的组织免受排斥的方法
JP7281774B2 (ja) 2017-09-19 2023-05-26 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 抗ｈｌａ－ａ２抗体及びその使用方法
CA3146013A1 (en) * 2019-07-09 2021-01-14 The Children's Mercy Hospital Engineered regulatory t cells
CA3147837A1 (en) * 2019-08-16 2021-02-25 Marco Davila Anti-cd83 chimeric antigen receptor expressing t regulatory cells
CN111440246B (zh) * 2020-04-16 2022-03-18 成都仕康美生物科技有限公司 靶向HLA-B的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途
CN111393533B (zh) * 2020-04-16 2021-05-11 成都仕康美生物科技有限公司 靶向HLA-A的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途
WO2023156587A1 (en) * 2022-02-18 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
CN114316056A (zh) * 2022-03-02 2022-04-12 天津一瑞生物科技股份有限公司 一种鼠抗ndm型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
AU2023229697A1 (en) * 2022-03-08 2024-09-19 Vaxcell-Bio Co., Ltd. Pd-l1-specific chimeric antigen receptor and immune cell comprising same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011058321A1 (en) * 2009-11-11 2011-05-19 King's College Hospital Nhs Foundation Trust Conjugate molecule
CN103739667A (zh) * 2013-09-24 2014-04-23 上海宇研生物技术有限公司 卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
DK0617706T3 (da) 1991-11-25 2001-11-12 Enzon Inc Multivalente antigenbindende proteiner
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
WO1998056915A2 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
EP1235842A4 (en) 1999-10-15 2003-04-23 Univ Massachusetts GENESIS OF THE RNA INTERFERENCE PATH AS AID OF TARGETED GENTIAN INTERFERENCE
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
KR20030032922A (ko) 2000-02-24 2003-04-26 싸이트 테라피스 인코포레이티드 세포의 동시 자극 및 농축
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
JP2006524051A (ja) 2003-04-24 2006-10-26 フォンダッチォーネ・セントロ・サン・ラファエル・デル・モンテ・タボール 両方向性合成プロモーターを備えたレンチウイルスベクターおよびその使用
EP1765988B1 (en) 2004-05-27 2017-09-20 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1795599A1 (en) 2005-12-09 2007-06-13 Schuler, Gerold, Prof. Dr. Methods for generating antigen-specific effector T cells
GB0603081D0 (en) 2006-02-15 2006-03-29 Dynal Biotech Asa Oslo Method
TWI507204B (zh) 2009-05-26 2015-11-11 Oncotherapy Science Inc Ｃｄｃ４５ｌ胜肽與含此胜肽之疫苗
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US8945868B2 (en) 2010-07-21 2015-02-03 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a HLA locus
MX347078B (es) 2010-12-09 2017-04-10 Univ Pennsylvania Uso de celulas t modificadas por receptor de antigeno quimerico para tratar cancer.
TR201815488T4 (tr) 2011-04-08 2018-11-21 Health Anti-epidermal büyüme faktör reseptörü varyant III kimerik antijen reseptörleri ve kanser tedavisi için kullanımı.
RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2023-10-31 Univ California Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
JP2015180607A (ja) 2012-08-01 2015-10-15 国立大学法人 東京大学 移植片対宿主病などの造血幹細胞移植に伴う疾患を治療することのできる抗体およびその機能断片並びにこれらを含んでなる医薬組成物
US20140186919A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
EP4286403A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3263595A1 (en) 2016-06-30 2018-01-03 Medizinische Hochschule Hannover Fusion protein for use in the treatment of hvg disease
CN110678190A (zh) 2017-03-28 2020-01-10 宾夕法尼亚大学董事会 保护移植的组织免受排斥的方法
JP7281774B2 (ja) 2017-09-19 2023-05-26 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 抗ｈｌａ－ａ２抗体及びその使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011058321A1 (en) * 2009-11-11 2011-05-19 King's College Hospital Nhs Foundation Trust Conjugate molecule
CN103739667A (zh) * 2013-09-24 2014-04-23 上海宇研生物技术有限公司 卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A rapid and efficient strategy to generate allele specific anti HLA monoclonal antibodies;Yamazaki S等;《Journal of Immunological Methods》;20090331;第343卷(第1期);全文 *
Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor.;Macdonald,K.G.等;《J Clin Invest》;20160321;第126卷(第4期);全文 *
Direct binding to antigen-coated beads refines the specificity and cross reactivity of four monoclonal antibodies that recognize polymorphic epitopes of HLA class I molecules.;Hilton,H.G.等;《Tissue Antigen》;20130430;第81卷(第4期);全文 *
Effective treatment against severe graftversus-host disease with allele-specific anti-HLA monoclonal antibody in a humanized mouse model.;Nakauchi Yusuke等;《Experimental hematalogy》;20141030;第43卷(第2期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020535843A (ja) 2020-12-10
MX2020003047A (es) 2020-10-22
EP3684822A4 (en) 2021-06-16
WO2019056106A1 (en) 2019-03-28
EP3684822A1 (en) 2020-07-29
US20240067732A1 (en) 2024-02-29
RU2020112262A (ru) 2021-10-25
BR112020005519A2 (pt) 2020-10-27
US20200283530A1 (en) 2020-09-10
CN111448216A (zh) 2020-07-24
RU2020112262A3 (zh) 2022-02-22
SG11202002532XA (en) 2020-04-29
JP7317023B2 (ja) 2023-07-28
KR20200090151A (ko) 2020-07-28
CA3076547A1 (en) 2019-03-28
IL273401A (en) 2020-05-31
US11814432B2 (en) 2023-11-14
AU2018338423A1 (en) 2020-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111448216B (zh) 新的抗hla-a2抗体及其用途
CN111448215B (zh) 抗-hla-a2抗体及其使用方法
CN109072194B (zh) 免疫细胞组合物及其使用方法
JP2023062132A (ja) 移植された組織を拒絶反応から保護するための方法
WO2018127585A1 (en) Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
CN112888481A (zh) 包含tnfr2结构域的新型car构建体
KR20210018833A (ko) 근육 특이적 키나제 키메라 자가항체 수용체 세포의 조성물 및 방법
CN112292400A (zh) 对白介素-23受体特异的嵌合抗原受体
WO2018127584A1 (en) Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
JP2022533092A (ja) アセチルコリン受容体キメラ自己抗体受容体細胞の組成物および方法
RU2805674C2 (ru) Новые анти-hla-а2 антитела и их применение
RU2782276C2 (ru) Анти-hla-a2 антитела и способы их применения
RU2808254C2 (ru) Новые конструкции химерного антигенного рецептора, содержащие домены tnfr2

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant