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CN111432828A - 用以调节免疫耐受的多功能抗体-配体捕获剂 - Google Patents

用以调节免疫耐受的多功能抗体-配体捕获剂 Download PDF

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CN111432828A
CN111432828A CN201880049751.9A CN201880049751A CN111432828A CN 111432828 A CN111432828 A CN 111432828A CN 201880049751 A CN201880049751 A CN 201880049751A CN 111432828 A CN111432828 A CN 111432828A
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CN
China
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receptor
molecule
ligand
cell
antibody
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CN201880049751.9A
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阿图尔·贝迪
拉贾尼·拉维拉
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Johns Hopkins University
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Abstract

本发明提供了多种多功能抗体‑配体捕获剂以及多种使用它们来消解免疫耐受及/或免疫功能障碍的方法。本发明的多功能抗体‑配体捕获剂以及融合蛋白可以消解免疫功能障碍，以恢复以及释出抗肿瘤或针对病原体的免疫反应。本文提供了有前景的免疫治疗剂，用于治疗以及预防癌症、传染病以及免疫炎性疾病。

Description

用以调节免疫耐受的多功能抗体-配体捕获剂
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)主张于2017年5月26日申请的美国申请案第62/511,911号以及2017年11月29日申请的第62/592,341号的优先权。先前申请的公开内容被认为是其一部分，并且通过引用将其整体并入本文。
序列表纳入
所附序列表中的材料通过引用并入本文。随附的序列表文本文件JHU4100_2WO_Sequence_Listing.txt创建于2018年5月25日，大小为1,145kb。可以在使用Windows操作系统的计算机上使用Microsoft Word来评估文件。
本发明的背景技术
本发明的技术领域
本发明总体上涉及靶向免疫调节分子以及融合蛋白的领域，更具体地涉及用于靶向免疫刺激或免疫抑制分子以及融合蛋白的组合物及方法，以消解或诱导细胞中免疫耐受。
背景技术资讯
免疫系统为人体提供识别以及防御自身被识别为外来或潜在有害的微生物以及物质的手段。尽管使用单克隆抗体对癌症进行被动免疫疗法以及T细胞被动转移攻击肿瘤细胞已显示出临床疗效，然而，主动免疫疗法诱导这些免疫效应子并建立针对肿瘤细胞的免疫记忆的目标仍然具有挑战性。已经鉴定了几种肿瘤特异性以及与肿瘤相关的抗原，然而这些抗原通常是弱免疫原性的，并且肿瘤采用多种机制来创建致耐受性环境，从而使其能够逃避免疫攻击。克服这种免疫耐受以及激活抗体及/或T细胞应答的稳定水平的策略是有效的癌症免疫疗法的关键。
发明内容
本发明基于开创性的发现，靶向的免疫调节抗体以及融合蛋白可以消解或逆转在癌症、炎性疾病以及慢性传染病中的免疫耐受、T细胞分化异常以及T细胞功能障碍或耗竭。
在一个实施方案中，本发明提供一种分子，包含一靶向部分以及一个或多个免疫调节部分，其中所述靶向部分包含一多肽，所述多肽特异性地结合一肿瘤细胞、肿瘤微环境、肿瘤相关生长因子或受体、肿瘤相关细胞因子或受体、肿瘤相关T淋巴细胞、T细胞共刺激分子、T细胞共抑制分子、免疫细胞、病原体或病原体相关细胞的一组成部分、以及所述免疫调节部分包含一T淋巴细胞免疫受体、T细胞抑制受体、T细胞共抑制分子、T细胞共刺激分子、B淋巴细胞受体、树突细胞受体、自然杀伤细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体、趋化因子受体或肿瘤细胞受体的一细胞外结构域(extracellular domain,ECD)序列或其配体结合片段。
在一方面中，所述靶向部分的多肽包含一免疫球蛋白、一抗体、一双特异性抗体、一多特异性抗体、一抗体片段、一单链可变片段、一二价单链可变片段、一多价单链可变片段或一含有可结晶片段多肽的一抗原结合结构域。在另一方面，所述靶向部分包含来自一受体的所述细胞外结构域的一配体结合序列。在某些方面，所述靶向部分的多肽是特异性地结合一T细胞抑制受体(T cell inhibitory receptor,TCIR)、一T细胞抑制受体配体(Tcell inhibitory receptor ligand,TCIR ligand)、一T细胞共抑制分子、或一T细胞共刺激分子的一抗体。在另一方面，所述抗体是一TCIR，TCIR配体或共抑制分子的一拮抗剂。在另一方面，所述抗体是一T细胞共刺激分子的一激动剂。另一方面，所述靶向部分的多肽特异性地结合于以下的一个或多个：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic Tlymphocyte associated antigen-4,CTLA-4、分化簇(CD)152)、程序性死亡受体-1蛋白(Programmed Death-1protein,PD-1)、程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1,PD-L1)、程序性死亡配体-2(Programmed death ligand,PD-L2)、B7-H3(CD 276)、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,TIM-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子-1(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesionmolecule 1,CEACAM-1)、癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂(V domain Ig suppressor of T cell activation,VISTA)、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8(V-set and immunoglobulin domain containing 8,VSIG8)、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)、疱疹病毒进入介体(Herpesvirus Entry Mediator,HVEM)、CD160、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(T cell Ig and ITM domain,TIGIT)、CD226、CD96、淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3,LAG-3)、转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)、转化生长因子β受体(transforming growth factorβreceptor,TGFβR)、核因子κB受体致活剂(Receptor Activator of Nuclear FactorκB,RANK)、核因子κB受体致活剂配体(RANK ligand,RANKL)、4-1BB(CD137)、诱导性T细胞共刺激分子(Inducible T-CellCostimulator,ICOS)、OX-40(CD134)、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(glucocorticoid-induced TNFR-related protein,GITR)、CD27、介白素-6受体(interleukin 6receptor,IL6R)、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD40、CD40L、CD47、CD73、CC趋化因子受体4(C-C chemokine receptor type 4,CCR4)、CC趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type5,CCR5)、趋化因子受体CXCR 4(C-X-C chemokinereceptor type 4,CXCR-4)、IL12R、CD4、IL-2R、CD25、CD3。在某些方面，所述靶向部分的多肽特异性地结合以下的一个或多个：表皮生长因子受体/人类表皮生长因子受体-1(epidermal growth factor receptor,EGFR/EGFR1/ErbB-1/HER1)、表皮生长因子受体-2/人类表皮生长因子受体-2(ErbB-2/HER2/neu)、表皮生长因子受体-3/人类表皮生长因子受体-3(ErbB-3/HER3)、表皮生长因子受体-4/人类表皮生长因子受体-4(ErbB-4/HER4)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子α(Transforming growthfactorα,TGFα)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管内皮生长因子受体-1(Vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR-1)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)或血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)。在某些方面，所述靶向部分的多肽特异性地结合人类免疫缺陷病毒糖蛋白120(human immunodeficiencyvirus gp120 protein,HIV gp120)。
在各个方面，所述免疫调节部分包含转化生长因子β受体II(transforminggrowth factorβreceptor II,TGFβRII)、PD-1、TIM-3、BTLA、CD160、CD226、TIGIT、CD96、CD44、群落刺激因子1受体(Colony stimulating factor 1receptor,CSF1R)、CCR4、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)、血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、RANK、VSIG8、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(Leukocyte-associatedimmunoglobulin-like receptor 1,LAIR1)或VISTA的细胞外配体结合序列或其配体结合片段。
在一些方面，所述分子包含一连接体，并且所述连接体可以具有SEQ ID NO：3所示的序列。在另一方面，所述连接体融接所述靶向部分以及所述免疫调节部分。
在一些方面，所述免疫调节部分与包含一抗体的一靶向部分的重链融接。在其他方面，所述免疫调节部分与包含一抗体的一靶向部分的轻链融接。在另一方面，一个免疫调节部分与包含一抗体的一靶向部分的重链融接，而一第二免疫调节部分与所述相同的靶向抗体的轻链融接。
在一方面，所述靶向部分与包含TIM-3的所述ECD或其一配体结合片段的一免疫调节部分融接。在一特定方面，所述配体结合片段包含TIM-3的所述CEACAM-1结合片段。在一特定方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：2所示的TIM-3的细胞外结构域(TIM-3细胞外结构域(TIM-3ectodomain,TIM-3ecd)的一配体结合序列。
在一个方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽与PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、VISTA、TIGIT、BTLA、CCR4、41BB、OX40、GITR、VEGF、RANKL、TGF-β、IL6R、EGFR、HER2/neu或gp120结合，并且所述免疫调节部分是TIM-3的ECD或其一配体结合片段。在一具体方面，所述免疫调节部分包含TIM-3的CEACAM-1结合片段。在一具体方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：2所示的TIM-3ecd的一配体结合序列。
在某些方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于PD-1或PD-L1，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在特定方面，所述分子包含SEQ IDNO：51、52、53或192所示的序列。在特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：282、288、274、278所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：185所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：52以及SEQ ID NO：186所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：53以及SEQ ID NO：187所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：192以及SEQ ID NO：193所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分包含结合CTLA-4的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：50所示的序列。在特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：204所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：184所示的序列。
在另一方面，所述靶向部分包含结合LAG-3的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：26所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：161所示的序列。
在一方面，所述靶向部分包含结合VISTA的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述分子包含SEQ ID NO：12的序列。在特定方面，所述分子包含对应与SEQ ID NO：12以及SEQ ID NO：147所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分包含结合TIGIT的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：17所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：17以及SEQ ID NO：152所示的序列。
在另一方面，所述靶向部分包含结合BTLA的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述分子包含SEQ ID NO：22所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：22以及SEQ ID NO：157所示的序列。
在某些方面，所述靶向部分包含结合CCR-4的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：31所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：31以及SEQ ID NO：166所示的序列。
在另一方面，所述靶向部分包含结合4-1BB的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：116所示的序列。在特定的方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：116以及SEQ ID NO：117所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分包含结合VEGF的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：88所示的序列。在特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：252所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：88以及SEQ ID NO：89所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分包含结合RANKL的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。
在一个方面，所述靶向部分包含结合IL6-R的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：219所示的序列。在特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：216所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：219以及61所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分包含结合EGFR的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：231所示的序列。在特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：228所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：231以及SEQ ID NO：75所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分包括结合HER2/Neu的一多肽，并且所述免疫调节部分包括TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：102所示的序列。在特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：240所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：102以及SEQ ID NO：103所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分包含结合HIV gp120的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：267所示的序列。在特定方面，所述分子包含SEQ ID NO：264所示的序列。在特定方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：267以及gp120抗体的轻链的序列。
在另一方面，所述靶向部分包含融接于一免疫调节部分，所述免疫调节部分具有PD-1的所述ECD或其一配体结合片段。在某些方面，所述配体结合片段包含一PD-L1或PD-L2结合片段。在一特定的方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：194所示的PD-1细胞外结构域(PD-1ecd)的一配体结合序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合TIM-3、CEACAM-1，BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β或VEGF的一多肽，并且所述免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其一配体结合片段。
另一方面，所述靶向部分包含融接于一免疫调节部分，所述免疫调节部分包含TGFβ受体的所述ECD或其一配体结合片段。在某些方面，所述配体结合片段包含TGFβRII的一TGFβ结合片段。在一特定方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：6所示的TGFβRII细胞外结构域(TGFβRII extracellular domain，TGFβRII ecd)的一配体结合序列。在某些方面，所述靶向部分包含与TIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL或VEGF结合的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其一配体结合片段。
在一另一方面，所述靶向部分包含融接于一免疫调节部分，所述免疫调节部分包含BTLA、CD160或LIGHT的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述配体结合片段包含HVEM(CD 270)结合片段。在一特定方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：8所示的BTLA细胞外结构域(BTLA ecd)的一配体结合序列。在一特定方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：302所示的LIGHT细胞外结构域(LIGHT ecd)的一配体结合序列。在某些方面，所述靶向部分包含与TIM-3、CEACAM-1、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL或VEGF结合的一多肽，并且所述免疫调节部分包含BTLA、CD160或LIGHT的所述ECD或其一配体结合片段。
在另一方面，所述靶向部分与包含TIGIT或CD96的所述ECD或其配体结合片段的一免疫调节部分融接。在一个方面，所述配体结合片段包含一CD155或CD112结合片段。在某些方面，所述免疫调节部分包含TIGIT的所述ECD或其一配体结合片段。在一特定方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：289所示的TIGIT细胞外结构域(TIGIT ECD)的一配体结合序列。在一特定方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：301所示的CD96细胞外结构域(CD96 ECD)的一配体结合序列。在另一方面，所述靶向部分包含与TIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β或VEGF结合的一多肽，并且所述免疫调节部分包含TIGIT的所述ECD或其配体结合片段。
在另一方面，所述靶向部分与包含CD226的ECD或其一配体结合片段的一免疫调节部分融接。在某些方面，所述配体结合片段包含一CD155或CD112结合片段。在一具体方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：9所示的CD226细胞外结构域(CD226 ECD)的一配体结合序列。在另一方面，所述靶向部分包含与TIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β或VEGF结合的一多肽，并且所述免疫调节部分包含CD226的所述ECD或其一配体结合片段。
在另一方面，所述靶向部分与包含VSIG8的所述ECD或其一配体结合片段的一免疫调节部分融接。在某些方面，所述配体结合片段包含一VISTA结合片段。在一特定方面，所述免疫调节部分包含对应于SEQ ID NO：55所示的VSIG8细胞外结构域(VSIG8 ecd)的一配体结合序列。在另一方面，所述靶向部分包含与TIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β或VEGF结合的一多肽，并且所述免疫调节部分包含VSIG8的所述ECD或其一配体结合片段。
在一另一方面，所述靶向部分包含与TIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β或VEGF结合的一多肽，并且所述免疫调节部分包含CD44的所述ECD或其一配体结合片段。在一特定方面，所述免疫调节部分是对应于SEQ ID NO：36所示的CD44细胞外结构域(CD44 ecd)的一配体结合序列。
在一另一方面，所述免疫调节部分包含CCR4的所述ECD或其配体结合片段，并且所述配体结合片段包括一CCL22结合片段。
在一方面，所述分子包含SEQ ID NOs：10及145、11及146、12及147、13及148、14及149、15及150、16及151、17及152、18及153、19及154、20及155、21及156、22及157、23及158、24及159、25及160、26及161、27及162、28及163、29及164、30及165、31及166、32及167、33及168、34及169、35及170、37及171、38及172、39及173、40及174、41及175、42及176、43及177、44及178、45及179、46及180、47及181、48及182、49及183、50及184、51及185、52及186、53及187、58及188、59及189、60及61、62及63、64及65、66及67、68及69、70及71、72及73、74及75、76及77、78及79、80及81、82及83、84及85、86及87、88及89、90及91、92及93、94及95、96及97、98及99、100及101、102及103、104及105、106及107、108及109、110及111、112及113、114及115、116及117、118及119、120及121、122及123、124及125、126及127、128及129、130及131、132及133、134及135、136及137、138及139、140及141、142及143、192及193、209及210、211及212、221及222、223及224、233及234、235及236、245及246、247及248、257及258、259及260、269及270、271及272、275及276、279及280、283及284、287及288、290及291、292及293、294及295、296及297、或298及299所示的序列。
在一另一实施方案中，本发明提供了一分子，所述分子包含一靶向部分、一第一免疫调节部分以及一第二免疫调节部分，其中所述靶向部分包含一多肽，所述多肽特异性地结合于CTLA-4(CD152)、PD-1、PD-L1、VISTA、BTLA、TIGIT、LAG-3、4-1BB配体(CD137)、OX-40(CD134)、GITR、TGF-β、CD27、CD47、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD73、CD122、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、RANKL、RANK、EGFR、HER2、VEGF、所述第一免疫调节部分包含TGFβRII、PD-1、TIM-3、BTLA、CD226、TIGIT、CD44、CSF1R、CCR4、KIR、VEGFR、RANK、VSIG8、LIGHT(TNFSF14)或VISTA的所述细胞外配体结合序列或其配体结合片段、所述第二免疫调节部分包括TGFβRII、PD-1、TIM-3、BTLA、CD226、TIGIT、CD44、CSF1R、CCR4、KIR、VEGFR、RANK、VSIG8、LIGHT(TNFSF14)、或VISTA的所述细胞外配体结合序列或其配体结合片段。
在一些方面，所述分子包含SEQ ID NO：201及202、203及204、205及206、207及208、213及214、215及216、217及218、219及220、225及226、227及228、229及230、231及232、237及238、239及240、241及242、243及244、249及250、251及252、253及254、255及256、261及262、263及264、265及266、267及268、273及274、277及278、281及282、或285及286所示的序列。
在一个方面，所述靶向部分的多肽包含一免疫球蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单链可变片段、二价单链可变片段、多价单链可变片段、自一受体的所述细胞外结构域的一配体结合序列或含有可结晶片段多肽的一抗原结合结构域。在某些方面，所述多肽是一抗体。
在一个方面，所述第一免疫调节部分连接至所述抗体的重链，所述第二免疫调节部分连接至所述抗体的轻链。在一另一方面，所述第一免疫调节部分连接至所述抗体的一重链或一轻链的C端，所述第二免疫调节部分连接至所述抗体的一重链或一轻链的C端、及/或所述第二免疫调节部分连接至所述第一免疫调节部分。
在一另一方面，所述第一及第二免疫调节部分通过一连接体连接至所述抗体的重链或轻链，及/或所述第二免疫调节部分通过一连接体连接至所述第一免疫调节部分。在某些方面，所述连接体具有(GGGGS)n的序列(SEQ ID NO：3)，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些方面，所述连接体具有SEQ ID NO 3所示的序列。在某些方面，所述第一免疫调节部分包含TIM3的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段、所述第一免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段、所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段、及/或所述第一免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段。
在另一方面，所述靶向部分特异性地结合IL6R、CTLA-4、PD-1、PD-L1、EGFR、HER2、VEGF或gp120。
在一个方面，所述靶向部分包含结合CTLA-4的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：201以及SEQ ID NO：202所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合CTLA-4的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，并且所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一方面中，所述分子包含SEQ ID NO：205以及SEQ ID NO：206所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：207以及SEQ ID NO：208所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合CTLA-4的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段，并且所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一方面，所述分子包含SEQ ID NO：203以及SEQ ID NO：204所示的序列。在另一方面，所述靶向部分多肽包括伊匹(ipilimumab)。在另一方面，所述抗体是曲美木单抗(tremelimumab)。
在一个方面，所述靶向部分包括结合PD-1或PD-L1的一多肽，所述第一免疫调节部分包括TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包括TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：273以及SEQ ID NO：274所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：277以及SEQ ID NO：278所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：285以及SEQ ID NO：286所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：281以及SEQ ID NO：282所示的序列。在另一方面，所述靶向部分的多肽包括纳武单抗(Nivolumab)或帕博利珠单抗(pembrolizumab)。在另一方面，所述抗体是阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)或杜鲁伐单抗(durvalumab)。
在一个方面，所述靶向部分包含结合IL-6R的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：213以及SEQ ID NO：214所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合IL-6R的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：217以及SEQ ID NO：218所示的序列。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：219以及SEQ ID NO：220所示的序列。在另一个方面中，所述靶向部分包含结合IL-6R的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：215以及SEQ ID NO：216所示的序列。在一另一方面，所述靶向部分多肽包含结合IL-6R的一抗体。在另一方面，所述抗体包含托珠单抗(tocilizumab)。
在一个方面中，所述靶向部分包含结合VEGF的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：249以及SEQ ID NO：250所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合VEGF的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：253以及SEQ ID NO：254所示的序列。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：255以及SEQ ID NO：256所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合VEGF的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段，并且所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：251以及SEQ ID NO：252所示的序列。在一另一方面，所述靶向部分的多肽包含贝伐单抗(Bevacizumab)。在一另一方面，所述靶向部分包含VEGFR的一配体结合细胞外结构域。在另一方面，靶向部分包含阿柏西普(aflibercept)。
在一个方面中，所述靶向部分包含结合EGFR的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：225以及SEQ ID NO：226所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合EGFR的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：229以及SEQ ID NO：230所示的序列。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：231以及SEQ ID NO：232所示的序列。在另一个方面中，所述靶向部分包含结合EGFR的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：227以及SEQ ID NO：228所示的序列。在一另一方面，所述靶向部分多肽包括西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)或耐昔妥珠单抗(Necitumumab)。
在一个方面中，所述靶向部分包含结合HER2/Neu的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：237以及SEQ ID NO：238所示的序列。在另一个方面中，所述靶向部分包含结合HER2的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：243以及SEQ ID NO：244所示的序列。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：241以及SEQ ID NO：242所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合HER2的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，并且所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：239以及SEQ ID NO：240所示的序列。在一另一方面，所述靶向部分多肽包括曲妥珠单抗(Trastuzumab)或帕妥珠单抗(Pertuzumab)。
在一个方面中，所述靶向部分包含结合HIV gp120的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：261以及SEQ ID NO：262所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合gp120的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：265以及SEQ ID NO：266所示的序列。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：267以及SEQ ID NO：268所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合gp120的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述分子包含SEQ ID NO：263以及SEQ ID NO：264所示的序列。在一另一方面，所述靶向部分的多肽包括曲妥珠单抗(Trastuzumab)或帕妥珠单抗(Pertuzumab)。
在一另一实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，包含TIM-3的细胞外结合结构域(extracellular binding domain,ECD)或其配体结合片段，以及TGFRβII、PD-1、BTLA、LIGHT、CD226或VSIG8的所述ECD或其配体结合片段。在一个方面中，所述融合蛋白包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段以及TGFβRII的所述ECD或其配体结合片段。在某些方面中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：190所示的序列。在另一方面，所述融合蛋白包含TIM-3的所述ECD或其配体结合片段以及PD-1的所述ECD或其配体结合片段。在特定方面中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：195、196或197所示的序列。在一另一方面，所述融合蛋白包含一Fc。在一另一方面，所述TIM-3的ECD与另一ECD通过一连接体连接。在某些方面中，所述连接体具有SEQ ID NO 3、4或5所示的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了多个包含前述分子或融合蛋白以及一药物载体的组合物。
在一另一实施方案中，本发明提供了一种治疗患有癌症或一传染病的一受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用先前描述的分子、融合蛋白或组合物。在一个方面中，所述分子、融合蛋白或组合物通过皮内、皮下、静脉内、腹腔内、动脉内、鞘内、包膜内、眼窝内、心内、真皮内、经皮、经气管、表皮层下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊椎内、胸骨内、口腔、舌下颊、直肠、阴道、鼻腔或眼部给予而被施用、通过输注、吸入或雾化而被施用，或通过肠胃外给予而被施用。
在另一方面，所述癌症是肺癌、乳癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、子宫颈癌、食道癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、肾脏癌、子宫内膜癌、头颈癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、卵巢癌、黑素瘤、胆囊癌、喉癌、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌或卡波西肉瘤。
在一另一方面，所述传染病原体或疾病是人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征、单纯疱疹病毒/疱疹、人类乳头瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒/肝炎、人类疱疹病毒第四型(Epstein-Barr virus,EBV)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)/莱姆病、流行性感冒、结核分枝杆菌/结核病、麻风杆菌/麻风病、疟疾、梅毒、淋病或克雷伯氏肺炎菌(Epstein-Barr virus,EBV)/肺炎。
在另一个实施方案中，在所述分子、融合蛋白或组合物施用的同时、之前或之后，同时施用一化学治疗剂、免疫治疗剂或抗生素。
附图说明
图1：抑制T细胞活化并诱导免疫耐受以及T细胞耗竭的自分泌/旁分泌受体-配体相互作用的示意图。自分泌/旁分泌TGFβ诱导FOXP3的表达，FOXP3是Treg谱系的标志性转录因子。FOXP3诱导CTLA-4的表达，CTLA-4是一种T细胞抑制性受体，通过干扰B7-CD28相互作用来抑制T细胞共刺激。Tregs表达Galectin-9，它是一种与TIM-3结合并通过TIM-3/CEACAM-1共抑制轴触发效应T细胞的耗尽或细胞凋亡的配体。PD-L1与PD-1的结合可促进TGFβ诱导的FOXP3表达，以诱导以及维持Tregs，并与TIM-3/CEACAM-1信号传导共同诱导T细胞的耗竭及死亡。
图2A-C：a-PDL1-TIM3 ecd以及a-PD1-TIM3 ecd通过同时中断PD-L1/PD-1信号传导以及TIM-3/CEACAM-1共同抑制轴来消解免疫耐受以及T细胞耗竭。(A)a-PDL1-TIM3 ecd以及a-PD1-TIM3 ecd的结构以及靶向的示意图。a-PD1-TIM3 ecd包括：(i)人a-PD-1抗体的重链，通过一柔性连接肽在C端与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列融接，(GGGGS)3，(SEQ ID NO：53)、以及人a-PD-1抗体的轻链(SEQ ID NO：187)。a-PDL1-TIM3ecd包含：(i)人a-PD-L1抗体的重链，通过一柔性连接肽在C端与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列融接，(GGGGS)3，(SEQ ID NO：51)以及(ii)人α-PD-L1抗体的轻链(SEQ ID NO：185)。(B)a-PDL1-TIM3 ecd以及a-PD1-TIM3 ecd破坏抑制T细胞活化并诱导T细胞耗竭的自分泌/旁分泌受体-配体相互作用的靶向及机制的示意图。自分泌/旁分泌的TGFβ诱导FOXP3的表达，FOXP3是Treg谱系的标志性转录因子。FOXP3诱导CTLA-4的表达，CTLA-4是一种T细胞抑制性受体，通过干扰B7-CD28相互作用来抑制T细胞共刺激。Tregs表达Galectin-9，它是一种与TIM-3结合并通过TIM-3/CEACAM-1共同抑制轴触发效应T细胞的耗尽或细胞凋亡的配体。PD-1与PD-1的结合可促进TGFβ诱导的FOXP3表达，以诱导及维持Tregs，并与TIM-3/CEACAM-1信号传导共同诱导T细胞的耗竭及死亡。a-PDL1-TIM3 ecd以及a-PD1-TIM3 ecd禁用PD-1/PD-L1信号传导，同时破坏涉及TIM-3及CEACAM-1共抑制途径的顺式/反式相互作用。(C)通过PD-L1/PD-1及TIM-3/CEACAM-1共抑制轴，a-PDL1-TIM3 ecd及a-PD1-TIM3 ecd同时消解T细胞多管抑制的机制的示意图。a-PDL1-TIM3 ecd及a-PD1-TIM3 ecd中断PD-L1/PD-1相互作用并同时破坏：(i)嗜异性TIM-3/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1/TIM-3异二聚化、以TIM-3反式CEACAM1异二聚化)、(ii)同源CEACAM-1/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1二聚化、反式CEACAM1诱导的顺式CEACAM-1二聚化)。
图3A-D：a-PDL1-TIM3ecd及a-PD1-TIM3ecd的表征及目标结合能力。(A)使用SDS-PAGE在还原(R)和非还原(NR)条件下比较a-PD1-TIM3ecd和a-PD1抗体(纳武单抗)的全长(FL)、重链(HC)和轻链(LC)。与a-PD1抗体的重链相比，SDS-PAGE证实了a-PD1-TIM3ecd的重链预期具有更高的分子量(上图)。使用还原(R)及非还原(NR)条件下的SDS-PAGE比较a-PDL1-TIM3ecd及a-PDL1(纳武单抗)抗体的全长(FL)、重链(HC)及轻链(LC)。SDS-PAGE证实了与a-PDL1抗体的重链相比，a-PDL1-TIM3ecd的重链具有更高的预期分子量(下图)。(B)显示a-PD1-TIM3与rhPD-1结合的ELISA(上图)：将生物素化的rhPD-1(0-250ng/ml)添加到涂有a-PD1-TIM3ecd(1μg/ml)的盘上。ELISA显示a-PDL1-TIM3与rhPD-L1结合(下图)：将生物素化的rhPD-L1(0-250ng/ml)加入涂有a-PDL1-TIM3(1μg/ml)或a-PDL1抗体(阿特珠单抗)(阳性对照)。(C)a-PD1-TIM3ecd以及a-PDL1-TIM3ecd在体外结合重组人(rh)CEACAM-1。在存在或不存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-gp120-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)(各10μg)的情况下孵育rhCEACAM-1(5μg)(过夜，在4℃下)，然后与A-琼脂糖蛋白珠(10μl)孵育6h，然后与A-琼脂糖蛋白免疫沉淀。沉淀的复合物用免疫沉淀缓冲液洗涤，重悬于含还原剂的NuPAGE样品缓冲液中，煮沸，在Bis-Tris CriterionXT凝胶系统上溶解，并转移到PVDF膜上。将膜使用一抗[CEACAM1(D1P4T)；TIM3(D5D5RTM)]免疫印迹过夜、洗涤，与二抗一起孵育，并通过Amersham ECL Western Blotting检测试剂进行显像。免疫印迹分析检测到a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd及a-gp120-TIM3ecd蛋白A提取的免疫沉淀物中的rhCEACAM-1，但未在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)的免疫沉淀物中检测到。(D)α-PD1-TIM3ecd和α-PDL1-TIM3ecd结合CEACAM-1在共刺激的人T细胞上。在存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd，a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1mAb(纳武单抗)的情况下，将人PBMC与抗CD3/抗CD28磁珠共同刺激6天。细胞裂解物用蛋白A–琼脂糖珠(10μl)免疫沉淀6小时。沉淀的复合物用免疫沉淀缓冲液洗涤，重悬于含还原剂的NuPAGE样品缓冲液中、煮沸，在Bis-Tris Criterion XT凝胶系统上溶解，并转移到PVDF膜上。将膜使用一抗(CEACAM1(D1P4T)；TIM3(D5D5RTM))免疫印迹过夜、洗涤，与二抗一起孵育，并通过Amersham ECL Western Blotting检测试剂进行显像。用CEACAM-1抗体进行的免疫印迹分析在处理过的a-PD1-TIM3ecd及a-PDL1-TIM3ecd处理的细胞裂解物中的蛋白A免疫沉淀物中检测到CEACAM-1，但在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)的处理的细胞裂解液的免疫沉淀物中未检测到CEACAM-1。用TIM-3ecd抗体进行的免疫印迹分析在a-PD1-TIM3ecd及a-PDL1-TIM3ecd处理的细胞裂解液的蛋白A免疫沉淀物中检测到a-PD1-TIM3ecd或a-PDL1-TIM3ecd的重链，但未在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)处理的细胞裂解液的免疫沉淀物中检测到。
图4A-C：a-PD1-TIM3ecd和a-PDL1-TIM3ecd在促进IFNγ表达和抵消共同刺激的T细胞耗竭方面比a-PD-1mAb或a-PD-L1 mAb有效得多。
(A)在存在或不存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(atezolizumab)、a-PD1 mAb(纳武单抗)、a-human TIM3 Ab(F38-2E2)或a-PD1 mAb and a-TIM3 Ab的组合(5μl/ml)的情况下，用抗CD3/抗CD28磁珠及rhIL-2刺激人PBMC持续3-9天。在每个指示的时间(3d，6d和9d)，细胞上清中的干扰素-γ(IFN-γ)通过ELISA进行定量(数据代表每组3次体外复制的平均值±SEM)。ELISA证明，与a-PDL1(阿特珠单抗)、a-PD-1(pembrolizumab)、a-TIM3 Ab或甚至a-PD1 mAb及a-TIM3 Ab的组合相比，a-PDL1-TIM3ecd和a-PD1-TIM3ecd在体外促进IFNγ表达和抵消共同刺激的T细胞耗竭方面更有效。(B)在存在或不存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)、a-PD1 mAb(纳武单抗)、a-人TIM3Ab(F38-2E2)或a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab的组合(各5μg/ml)的情况下，用抗CD3/抗CD28珠(5μl/ml)和rhIL-2刺激人PBMC，持续16h或40h，以及通过ELISA对细胞上清液中的IFN-γ进行定量(每组3个体外重复试验的平均值±SEM)。与a-PDL1(阿特珠单抗)、a-PD-1(帕博利珠单抗)、a-TIM3Ab或甚至a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab的组合相比，a-PDL1-TIM3ecd在体外通过共刺激的T细胞在促进IFNγ表达明显更有效。(数据代表与没有抗体的共同刺激相比，每个抗体治疗组的IFNγ表达的倍数变化)。(C)α-PD1-TIM3ecd抵消了TGFβ介导的共同刺激的T细胞中IFNγ表达的抑制。在存在或不存在rhTGF 1(5ng/ml)或不存在a-PDL1-TIM3(5μg/ml)的情况下，用抗CD3/抗CD28和rhIL-2刺激人PBMC 16h或40h，并通过ELISA对细胞上清液中的干扰素-γ(IFN-γ)进行定量分析(数据代表每组3次体外重复的平均值±SEM)。
图5A-B：a-PD1-TIM3ecd比a-PD-1、a-TIM-3或a-TIM-3与a-PD1(A)的组合更有效地抑制肿瘤生长。NSG小鼠(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8周)在以下指定处理条件下，通过过继转移3x106人外周血单个核细胞(PBMC)[与抗CD3/抗CD28磁珠(5μl/ml)共刺激]与rhIL-2进行重组，持续8天(各5μg/ml)：a-PD1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(纳武单抗)、a-人TIM3Ab(F38-2E2)、a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab的组合，或安慰剂。重组小鼠皮下注射2x106个D-MUT1人结肠直肠癌细胞，每组均进行体内治疗(每5天，5mg/kg，ip)，与用于过继转移的PBMC的体外治疗相同，如所示：a-PD1-TIM3ecd、a-PD1(纳武单抗)、a-TIM-3(F38-2E2)、a-PD1与a-TIM-3的组合、单独的安慰剂(未治疗的对照)[≥5只小鼠/组]。测量对治疗组不知情的肿瘤大小，并使用公式(长×宽×高)计算肿瘤体积。显示了体内肿瘤生长曲线(平均值+SEM)。使用不成对的双向t检验得出p值。p值(p<0.02，学生未配对t检验)表示a-PD1-TIM3ecd与其他治疗组之间存在显着差异。(B)以200cGy照射免疫缺陷的NSG小鼠(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8周)，并通过过继转移HLA A2匹配的人CD34+造血细胞重建免疫。重组的人源化小鼠皮下注射人类三阴性乳腺癌(TNBC)HLA A2+肿瘤细胞(MDA-MB-231-Luc)(基质胶中1x106；乳腺脂肪垫)。肿瘤接种后第3天，将小鼠随机分组，并单独用赋形剂(未治疗的对照)或以下抗体(每周ip 5mg/kg)治疗：a-PD1-TIM3ecd，a-PD1 mAb(纳武单抗)，a-人TIM3 Ab(F38-2E2)，a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab的组合[≥5只小鼠/组]。测量对治疗组不知情的肿瘤大小，并使用公式(长×宽×高)计算肿瘤体积。显示了体内肿瘤生长曲线(平均值+SEM)。使用不成对的双向t检验得出p值。p值(p<0.02，学生未配对t检验)表示a-PD1-TIM3ecd与其他治疗组之间存在显着差异。
图6A-C：a-PDL1-TIM3ecd比a-PD-L1、a-PD-1、a-TIM-3或a-PD-L1和a-TIM-3的组合更有效地抑制肿瘤生长。免疫缺陷的NSG小鼠(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8周)接受200cGy辐射，并通过过继转移HLA A2人CD34+造血细胞来重建免疫。重组的人源化小鼠皮下注射人类三阴性乳腺癌(TNBC)HLA A2+肿瘤细胞(MDA-MB-231-Luc)(基质胶中1x106；乳腺脂肪垫)。肿瘤接种后第3天，将小鼠随机分组并单独用赋形剂(未治疗的对照)或以下抗体(每周ip 5mg/kg)治疗：a-PDL1-TIM3ecd，a-PD1 mAb(阿托珠单抗)，a-PD1 mAb(派姆单抗)，α-人TIM3 Ab(F38-2E2)，α-PD-L1mAb和α-TIM3Ab的组合[≥5只小鼠/组]。(A)测量对治疗组不知情的肿瘤大小，并使用公式(长×宽×高)计算肿瘤体积。显示了体内肿瘤生长曲线(平均值+SEM)。使用不成对的双向t检验得出p值。p值(p<0.02，学生未配对t检验)表示a-PDL1-TIM3ecd与其他治疗组之间存在显着差异。(B)在肿瘤细胞接种后7和27天，未治疗的对照或指定的治疗组中的原发性肿瘤的生物发光测定。(C)肿瘤中T细胞密度的定量：肿瘤体积和流式细胞仪用于评估每mm3肿瘤CD4+和CD8+T细胞的绝对数量。
图7A-B：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意图设计，其包含与靶表位结合的靶向抗体，TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd)和PD-1的配体结合胞外域序列(PD-1ecd)。多功能抗体-配体捕获剂可以结合目标表位(通过抗原结合CDR)，结合PD-1配体，PD-L1和PD-L2(通过PD-1ecd)和TIM-3配体(CEACAM-1)(通过TIM-3ecd)。(A)本发明的包含靶向抗体的多功能抗体-配体捕获剂的示意图设计，其中抗体的重链在C端与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列融合(TIM-3ecd：SEQ ID NO：2)通过接头连接，并且抗体的轻链在C端通过接头与PD-1的配体结合胞外域序列(PD-1ecd：SEQ ID NO：7)融合。一方面，接头是肽(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)。(B)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意图，其包含靶向抗体，其中抗体的重链是融合的在C端通过连接肽与PD-1的配体结合胞外域序列(PD-1ecd：SEQ ID NO：7)结合，抗体的轻链在C端与配体-经由连接肽的TIM-3的结合胞外域序列(TIM-3ecd：SEQID NO：2)。一方面，接头是肽(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)。在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂的靶向抗体结合以下分子之一：CTLA-4(CD152)、B7-H3(CD276)、VISTA、VSIG8、BTLA、HVEM、CD160、TIGIT、CD226、CD96、LAG-3、TGF-β、TGFβR、4-1BB(CD137)、ICOS、OX-40(CD134)、GITR、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD73、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、EGFR(EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3(HER3)、ErbB-4(HER4)、EGFR配体、VEGF、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2)、RANKL、RANK、gp120。
图8A-B：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，其包含结合CTLA-4、TIM-3的配体结合IgV胞外域序列以及PD-1的配体结合胞外域序列。多功能抗体-配体捕获剂可以结合CTLA-4(通过抗原结合CDR)，结合PD-1配体、PD-L1和PD-L2(通过PD-1ecd)以及TIM-3配体(CEACAM-1)(通过TIM-3ecd)。(A)包含结合CTLA-4的靶向抗体的本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意图设计，其中所述抗体的重链通过连接肽在C端与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列融接(SEQ ID NO：207)，抗体的轻链通过连接肽在C端与PD-1的配体结合胞外域序列融接(SEQ ID NO：208)。在一方面，连接体是肽(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)。(B)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意图设计，其包含结合CTLA-4的靶向抗体，其中重链抗体的轻链通过连接肽在C端融接至PD-1的配体结合胞外域序列(SEQ ID NO：205)，并且抗体的轻链在C端融合至配体。经由连接肽的TIM-3的结合外域结构域序列(SEQ ID NO：206)。在一方面，连接体是肽(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)。
图9：本发明的多功能抗体-配体捕获物的示意图，其包含与靶表位结合的靶向抗体，TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd)和其的配体结合胞外域序列TGFβRII(TGFRIIecd)。多功能抗体-配体陷阱可以结合靶表位(通过抗原结合CDR)，结合TGFβ(通过TGFβRIIecd)和TIM-3配体(CEACAM-1)(通过TIM-3ecd)。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获物包括靶向抗体，其中所述抗体的重链在C-末端通过TGFβRII的配体结合胞外域序列(TGFβRIIecd)融合。连接肽(SEQ ID NO：6)，并且抗体的轻链在C端通过接头与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd：SEQ ID NO：2)融合。肽。一方面，接头是肽(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)。在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获物的靶向抗体结合以下分子之一：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4，CD152)，程序性死亡1蛋白(PD-1)，程序性死亡配体(PD-L1)，程序性死亡配体(PD-L2)，B7-H3(CD276)，V结构域Ig T细胞活化抑制因子(VISTA)，VSIG8，B和T淋巴细胞减毒剂(BTLA)，疱疹病毒进入介体(HVEM)，CD160，T细胞Ig和ITM结构域(TIGIT)，CD226，CD96，淋巴细胞活化基因3(LAG)-3)，4-1BB(CD137)，诱导性T细胞共刺激物(ICOS)，OX-40(CD134)，糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)，IL6R，IL23R，IL17R，IL-6，IL-23，IL-17，CD39，CD73，CCR4，CCR5，CXCR4，IL12R，CD4，CD25，CD3，表皮生长因子受体(EGFR，EGFR1，ErbB-1，HER1)，ErbB-2(HER2/neu)，ErbB-3/HER3，ErbB-4/HER4，EGFR配体，血管内皮生长因子(VEGF)，VEGFR(VE GFR1，VEGFR2)，RANK配体(RANKL)，RANK。
图10A-C。本发明的多功能抗体-配体捕获器的示意图设计，其包含与T细胞抑制受体或配体结合的靶向抗体，TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd)和TGFβRII的配体结合胞外域序列((A)本发明的多功能抗体-配体陷阱的示意图设计，其包含与PD-1结合的靶向抗体，TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd)和与之结合的配体结合胞外域序列。TGFβRII(TGFβRIIecd)。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获物包含结合PD-1的靶向抗体，其中抗体的重链在C末端与TGFβRII(TGFβRIIecd)的配体结合胞外域序列融合(SEQ ID NO：6)经由接头肽，并且抗体的轻链在C末端通过cDNA与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd：SEQ ID NO：2)融合。接头肽。一方面，接头是肽(GGGGS)n(SEQ IDNO：3)。在一实例中，多功能抗体-配体捕获物包含对应于SEQ ID NO：273的重链和对应于SEQ ID NO：274的轻链。在另一个实例中，多功能抗体-配体捕集器包含对应于SEQ ID NO：277的重链和对应于SEQ ID NO：278的轻链。(B)本发明的包含靶向抗体的多功能抗体-配体捕集器的示意图设计结合PD-L1，TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd)和TGFβRII的配体结合胞外域序列(TGFβRIIecd)。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获物包含结合PD-L1的靶向抗体，其中该抗体的重链在C末端与TGFβRII(TGFβRIIecd)的配体结合胞外域序列融合(SEQ ID NO：6)经由接头肽，并且抗体的轻链在C端通过cDNA与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列(TIM-3ecd：SEQ ID NO：2)融合。接头肽。一方面，接头是肽(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)。在一实例中，多功能抗体-配体捕获物包含对应于SEQ ID NO：285的重链和对应于SEQ ID NO：285的轻链。在另一个实例中，多功能抗体-配体捕获器包含对应于SEQID NO：281的重链和对应于SEQ ID NO：282的轻链。(C)本发明的多功能抗体-配体捕获器的示意图，其包含靶向抗体结合CTLA-4，TIM-3(TIM-3ecd)的配体结合IgV胞外域序列和TGFβRII(TGFβRIIecd)的配体结合胞外域序列。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获物包含结合CTLA-4的靶向抗体，其中该抗体的重链在C-末端与TGFβRII的配体结合胞外域序列(TGF RIIecd(SEQ ID NO：6)通过接头肽，抗体的轻链在C末端与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列融合(TIM-3ecd：SEQ ID NO：2)通过接头肽。一方面，接头是肽(GGGGS)n(SEQID NO：3)。在一实例中，多功能抗体-配体捕获物包含对应于SEQ ID NO：203的重链和对应于SEQ ID NO：204的轻链。
图11：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意图设计，其包含一靶向抗体，所述靶向抗体与一靶向表位、PD-1的配体结合细胞外结构域序列(PD-1ecd)以及TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列(TGFβRII ecd)结合。所述多功能抗体-配体捕获剂可以结合一靶向表位(通过抗原结合CDR)，结合TGFβ(通过TGFβRII ecd)以及PD-1配体、PD-L1及PD-L2(通过PD-1ecd)。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包括一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端融接于TGFβRII的一配体结合细胞外结构域序列(TGFβRII ecd)(SEQ ID NO：6)，并且所述抗体的轻链通过一连接肽在C端融接于PD-1的配体结合细胞外结构域序列(PD1 ecd：SEQ ID NO：7)。在一个方面，所述连接肽是一肽(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂的靶向抗体结合以下分子之一：CTLA-4(CD152)、TIM-3、CEACAM-1、CEA、VISTA、VSIG8、BTLA、HVEM、CD160、TIGIT、CD226、CD96、LAG-3、4-1BB(CD137)、ICOS、OX-40(CD134)、GITR、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD73、CD122、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、EGFR(EGFR1/ErbB-1/HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3(HER3)、ErbB-4(HER4)、EGFR配体、VEGF、VEGFR、RANKL、RANK。
图12：在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于一T细胞抑制性受体或配体、PD-1的配体结合细胞外结构域序列(PD-1ecd)以及TGFβRII的配体-结合细胞外结构域序列。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于CTLA-4，其中所述抗体的重链在C端通过一连接肽融接于TGFβRII的一配体结合细胞外结构域序列(TGFβRIIecd)(SEQ ID NO：203)，并且所述抗体的轻链在C端通过一连接肽融接于PD-1的一配体结合细胞外结构域序列(PD-1ecd：SEQ ID NO：202)。在一个方面，所述连接肽是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在一示例中，多功能抗体-配体捕获剂包含对应于SEQ ID NO：202的一重链以及对应于SEQID NO：203的一轻链。
图13A至图13B是多肽序列。图13A：人TIM-3/HAVCR2蛋白序列，SEQ ID NO：1。图13B：人TIM-3/HAVCR2细胞外结构域(Extracellular Domain,ECD)蛋白，序列SEQ ID NO：2。
图14A至图14D是多肽序列。图14A：连接体序列SEQ ID NO：3。图14B：连接体序列SEQ ID NO：144。图14C：连接体序列SEQ ID NO：4。图14D：连接体序列SEQ ID NO：5。
图15A至图15D是多肽序列。图15A：TGFβ受体II细胞外结构域蛋白序列，SEQ IDNO：6。图15B：PD-1细胞外结构域蛋白序列，SEQ ID NO：7。图15C：BTLA细胞外结构域蛋白序列，SEQ ID NO：8。图15D：CD226细胞外结构域蛋白序列，SEQ ID NO：9。
图16A至图16B是多肽序列。图16A：抗VISTA重链+TGFβRII ECD融合序列，SEQ IDNO：10。图16B：抗VISTA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：145。
图17A至是多肽序列。图17A：抗VISTA重链+PD-1ECD融合序列，SEQ ID NO：11。图17B：抗VISTA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：146。
图18A至图18B是多肽序列。图18A：抗VISTA重链+TIM-3ECD融合序列，SEQ ID NO：12。图18B：抗VISTA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：147。
图19A至图19B是多肽序列。图19A：抗VISTA重链+BTLA ECD融合序列，SEQ ID NO：13。图19B：抗VISTA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：148。
图20A至是多肽序列。图20A：抗VISTA重链+CD226 ECD融合序列，SEQ ID NO：14。图20B：抗VISTA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：149。
图21A至图21B是多肽序列。图21A：抗TIGIT重链+TGFβRII ECD融合序列，SEQ IDNO：15。图21B：抗TIGIT轻链蛋白序列，SEQ ID NO：150。
图22A至图22B是多肽序列。图22A：抗TIGIT重链+PD-1ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：16。图22B：抗TIGIT轻链蛋白序列，SEQ ID NO：151。
图23A至图23B是多肽序列。图23A：抗TIGIT重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：17。图23B：抗TIGIT轻链蛋白序列，SEQ ID NO：152。
图24A至图24B是多肽序列。图24A：抗TIGIT重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：18。图24B：抗TIGIT轻链蛋白序列，SEQ ID NO：153。
图25A至图25B是多肽序列。图25A：抗TIGIT重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：19。图25B：抗TIGIT轻链蛋白序列，SEQ ID NO：154。
图26A至图26B是多肽序列。图26A：抗BTLA重链+TGFβRII ECD融合蛋白序列，SEQID NO：20。图26B：抗BTLA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：155。
图27A至图27B是多肽序列。图27A：抗BTLA重链+PD-1ECD融合蛋白序列，SEQ IDNOSEQ ID NO：21。图27B：抗BTLA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：156。
图28A至图28B是多肽序列。图28A：抗BTLA重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：22。图28B：抗BTLA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：157。
图29A至是多肽序列。图29A：抗BTLA重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ ID NO：23。图29B：抗BTLA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：158。
图30A至图30B是多肽序列。图30A：抗LAG-3重链+TGFβRII ECD融合蛋白序列，SEQID NO：24。图30B：抗LAG-3轻链蛋白序列，SEQ ID NO：159。
图31A至图31B是多肽序列。图31A：抗LAG-3重链+PD-1ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：25。图31B：抗LAG-3轻链蛋白序列，SEQ ID NO：160。
图32A至图32B是多肽序列。图32A：抗LAG-3重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：26。图32B：抗LAG-3轻链蛋白序列，SEQ ID NO：161。
图33A至图33B是多肽序列。图33A：抗LAG-3重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：27。图33B：抗LAG-3轻链蛋白序列，SEQ ID NO：162。
图34A至图34B是多肽序列。图34A：抗LAG-3重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：28。图34B：抗LAG-3轻链蛋白序列，SEQ ID NO：163。
图35A至图35B是多肽序列。图35A：抗CCR4重链+TGFβRII ECD融合蛋白序列，SEQID NO：29。图35B：抗CCR4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：164。
图36A至图36B是多肽序列。图36A：抗CCR4重链+PD-1ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：30。图36B：抗CCR4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：165。
图37A至图37B是多肽序列。图37A：抗CCR4重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：31。图37B：抗CCR4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：166。
图38A至图38B是多肽序列。图38A：抗CCR4重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：32。图38B：抗CCR4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：167。
图39A至图39B是多肽序列。图39A：抗CCR4重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：33。图39B：抗CCR4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：168。
图40A至图40B是多肽序列。图40A：抗PD1重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：34。图40B：抗PD-1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：169。
图41A至图41B是多肽序列。图41A：抗PD1重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：35。图41B：抗PD-1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：170。
图42A至图42C是多肽序列。图42A：CD44蛋白序列的细胞外结构域，SEQ ID NO：36。图42B：抗PD1重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ ID NO：37。图42C：抗PD-1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：171。
图43A至图43B是多肽序列。图43A：抗CTLA-4重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：38。图43B：抗CTLA-4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：172。
图44A至图44B是多肽序列。图44A：抗LAG-3重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：39。图44B：抗LAG-3轻链蛋白序列，SEQ ID NO：173。
图45A至图45B是多肽序列。图45A：抗TIGIT重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：40。图45B：抗TIGIT轻链蛋白序列，SEQ ID NO：174。
图46A至图46B是多肽序列。图46A：抗BTLA重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：41。图46B：抗BTLA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：175。
图47A至图47B是多肽序列。图47A：抗VISTA重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：42。图47B：抗VISTA轻链蛋白序列，SEQ ID NO：176。
图48A至图48B是多肽序列。图48A：抗CCR4重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：43。图48B：抗CCR4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：177。
图49A至图49B是多肽序列。图49A：抗CTLA-4重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：44。图49B：抗CTLA-4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：178。
图50A至图50B是多肽序列。图50A：抗PD-1重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：45。图50B：抗PD-1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：179。
图51A至图51B是多肽序列。图51A：抗PD-L1重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：46。图51B：抗PD-L1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：180。
图52A至图52B是多肽序列。图52A：抗CTLA-4重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQID NO：47。图52B：抗CTLA-4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：181。
图53A至图53B是多肽序列。图53A：抗PD-1重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：48。图53B：抗PD-1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：182。
图54A至图54B是多肽序列。图54A：抗PD-L1重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：49。图54B：抗PD-L1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：183。
图55A至图55B是多肽序列。图55A：抗CTLA-4重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：50。图55B：抗CTLA-4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：184。
图56A至图56B是多肽序列。图56A：抗PD-L1重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：51。图56B：抗PD-L1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：185。
图57A至图57B是多肽序列。图57A抗PD-1重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：52。图57B：抗PD-1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：186。
图58A至图58B是多肽序列。图58A：抗PD-1重链+TIM-3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：53。图58B：抗PD-1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：187。
图59A至图59D是多肽序列。图59B：人VSIG8 ECD蛋白序列，SEQ ID NO：55。图59C：人VISTA蛋白序列，SEQ ID NO：56。图59B：人VISTA ECD蛋白序列，SEQ ID NO：57。
图60A至图60B是多肽序列。图60A：抗CTLA-4重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQID NO：58。图60B：抗CTLA-4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：188。
图61A至图61B是多肽序列。图61A：抗CTLA-4重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQID NO：59。图61B：抗CTLA-4轻链蛋白序列，SEQ ID NO：189。
图62A至图62B是多肽序列。图62A：抗IL6R重链+TIM3ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：60。图62B：抗IL6R轻链蛋白序列，SEQ ID NO：61。
图63A-是多肽序列。图63A：抗IL6R重链+VISTA ECD融合蛋白序列，SEQ ID NO：62。图63B：抗IL6R轻链蛋白序列，SEQ ID NO：63。
图64A至图64B是多肽序列。图64A：抗IL6R重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：64。图64B：抗IL6R轻链蛋白序列，SEQ ID NO：65。
图65A至图65B是多肽序列。图65A：抗IL6R重链+CD44ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：66。图65B：抗IL6R轻链蛋白序列，SEQ ID NO：67。
图66A至图66B是多肽序列。图66A：抗IL6R重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：68。图66B：抗IL6R轻链蛋白序列，SEQ ID NO：69。
图67A至图67B是多肽序列。图67A：抗IL6R重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：70。图67B：抗IL6R轻链蛋白序列，SEQ ID NO：71。
图68A至图68B是多肽序列。图68A：抗IL6R重链+LIGHT ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：72。图68B：抗IL6R轻链蛋白序列，SEQ ID NO：73。
图69A至图69B是多肽序列。图69A：抗EGFR重链+TIM3 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：74。图69B：抗EGFR轻链蛋白序列，SEQ ID NO：75。
图70A至图70B是多肽序列。图70A：抗EGFR重链+VISTA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：76。图70B：抗EGFR轻链蛋白序列，SEQ ID NO：77。
图71A至图71B是多肽序列。图71A：抗EGFR重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：78。图71B：抗EGFR轻链蛋白序列，SEQ ID NO：79。
图72A至图72B是多肽序列。图72A：抗EGFR重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：80。图72B：抗EGFR轻链蛋白序列，SEQ ID NO：81。
图73A至图73B是多肽序列。图73A：抗EGFR重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：82。图73B：抗EGFR轻链蛋白序列，SEQ ID NO：83。
图74A至图74B是多肽序列。图74A：抗EGFR重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：84。图74B：抗EGFR轻链蛋白序列，SEQ ID NO：85。
图75A至图75B是多肽序列。图75A：抗EGFR轻链+LIGHT ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：86。图75B：抗EGFR轻链蛋白序列，SEQ ID NO：87。
图76A至图76B是多肽序列。图76A：抗VEGF重链+TIM3 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：88。图76B：抗VEGF轻链蛋白序列，SEQ ID NO：89。
图77A至图77B是多肽序列。图77A：抗VEGF重链+VISTA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：90。图77B：抗VEGF轻链蛋白序列，SEQ ID NO：91。
图78A至图78B是多肽序列。图78A：抗VEGF重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：92。图78B：抗VEGF轻链蛋白序列，SEQ ID NO：93。
图79A至图79B是多肽序列5。图79A：抗VEGF重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：94。图79B：抗VEGF轻链蛋白序列，SEQ ID NO：95。
图80A至图80B是多肽序列。图80A：抗VEGF重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：96。图80B：抗VEGF轻链蛋白序列，SEQ ID NO：97。
图81A至图81B是多肽序列。图81A：抗VEGF重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：98。图81B：抗VEGF轻链蛋白序列，SEQ ID NO：99。
图82A至图82B是多肽序列。图82A：抗VEGF轻链+LIGHT ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：100。图82B：抗VEGF轻链蛋白序列，SEQ ID NO：101。
图83A至图83B是多肽序列。图83A：抗HER2重链+TIM3 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：102。图83B：抗HER2轻链蛋白序列，SEQ ID NO：103。
图84A至图84B是多肽序列。图84A：抗HER2重链+VISTA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：104。图84B：抗HER2轻链蛋白序列，SEQ ID NO：105。
图85A至图85B是多肽序列。图85A：抗HER2重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：106。图85B：抗HER2轻链蛋白序列，SEQ ID NO：107。
图86A至图86B是多肽序列。图86A：抗HER2重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：108。图86B：抗HER2轻链蛋白序列，SEQ ID NO：109。
图87A至图87B是多肽序列。图87A：抗HER2重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：110。图87B：抗HER2轻链蛋白序列，SEQ ID NO：111。
图88A至图88B是多肽序列。图88A：抗HER2重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：112。图88B：抗HER2轻链蛋白序列，SEQ ID NO：113。
图89A至图89B是多肽序列。图89A：抗HER2重链+LIGHT ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：114。图89B：抗HER2轻链蛋白序列，SEQ ID NO：115。
图90A至图90B是多肽序列。图90A：抗41BB重链+TIM3 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：116。图90B：抗41BB轻链蛋白序列，SEQ ID NO：117。
图91A至图91B是多肽序列。图91A：抗41BB重链+VISTA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：118。图91B：抗41BB轻链蛋白序列，SEQ ID NO：119。
图92A至图92B是多肽序列。图92A：抗41BB重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：120。图92B：抗41BB轻链蛋白序列，SEQ ID NO：121。
图93A至图93B是多肽序列。图93A：抗41BB重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：122。图93B：抗41BB轻链蛋白序列，SEQ ID NO：123。
图94A至图94B是多肽序列41BB轻链蛋白序列，SEQ ID NO：125。
图95A至图95B是多肽序列。图95A：抗41BB重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：126。图95B：抗41BB轻链蛋白序列，SEQ ID NO：127。
图96A至图96B是多肽序列。图96A：抗41BB重链+LIGHT ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：128。图96B：抗41BB轻链蛋白序列，SEQ ID NO：129。
图97A至图97B是多肽序列。图97A：抗IL23重链+TIM3 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：130。图97B：抗IL23轻链蛋白序列，SEQ ID NO：131。
图98A至图98B是多肽序列。图98A：抗IL23重链+VISTA ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：132。图98B：抗IL23轻链蛋白序列，SEQ ID NO：133。
图99A至图99B是多肽序列。图99A：抗IL23重链+VSIG8 ECD融合蛋白序列，SEQ IDNO：134。图99B：抗IL23轻链蛋白序列，SEQ ID NO：135。
图100A至图100B是多肽序列。图100A：抗IL23重链+CD44 ECD融合蛋白序列，SEQID NO：136。图100B：抗IL23轻链蛋白序列，SEQ ID NO：137。
图101A至图101B是多肽序列。图101A：抗IL23重链+BTLA ECD融合蛋白序列，SEQID NO：138。图101B：抗IL23轻链蛋白序列，SEQ ID NO：139。
图102A至图102B是多肽序列。图102A：抗IL23重链+CD226 ECD融合蛋白序列，SEQID NO：140。图102B：抗IL23轻链蛋白序列，SEQ ID NO：141。
图103A至图103B是多肽序列。图103A：抗IL23重链+LIGHT ECD融合蛋白序列，SEQID NO：142。图103B：抗IL23轻链蛋白序列，SEQ ID NO：143。
图104A至图104B是多肽序列。TIM3 ecd-Fc-TGFβRII ecd融合蛋白序列，SEQ IDNO：190。图104B：TIM3 ecd-Fc-TGFβRII ecd融合蛋白序列，SEQ ID NO：191。
图105A至图105B是多肽序列。图105A：抗PD-L1重链+TIM3 ECD融合蛋白序列，SEQID NO：192。图105B：抗PD-L1轻链蛋白序列，SEQ ID NO：193。
图106A至图106D是多肽序列。图106A：PD-1ecd蛋白序列的一配体结合序列，SEQID NO：194。图106B：TIM3 ecd+PD-1ecd融合蛋白序列，SEQ ID NO：195。图106C：TIM3 ecd+PD-1ecd融合蛋白序列。图106D：TIM3 ecd+PD-1ecd融合蛋白序列，SEQ ID NO：197。
图107是PD-1细胞外结构域蛋白序列，SEQ ID NO：198。
图108是IgG Fc蛋白序列，SEQ ID NO：199。
图109是TIM-3细胞外结构域蛋白序列，SEQ ID NO：200。
图110A至图110B是多肽序列。图110A：SEQ ID NO：201：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)重链+TGFbRII ECD。图110B：SEQ ID NO：202：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)轻链+PD-1ECD。
图111A至图111B是多肽序列。图111A：SEQ ID NO：203：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)重链+TGFbRII ECD。图111B：SEQ ID NO：204：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)轻链+TIM3 ECD。
图112A至图112B是多肽序列。图112A：SEQ ID NO：205：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)重链+PD-1ECD。图112B：SEQ ID NO：206：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)轻链+TIM3 ECD。
图113A至图113B是多肽序列。图113A：SEQ ID NO：207：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)重链+TIM3 ECD。图113B：SEQ ID NO：208：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)轻链+PD-1ECD。
图114A至图114B是多肽序列。图114A：SEQ ID NO：209：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)重链。图114B：SEQ ID NO：210：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)轻链+PD-1ECD。
图115A至图115B是多肽序列。图115A：SEQ ID NO：211：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)重链。图115B：SEQ ID NO：212：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)轻链+TIM3 ECD。
图116A至图116B是多肽序列。图116A：SEQ ID NO：213：抗IL6R抗体(托珠单抗)重链+TGFbRII ECD。图116B：SEQ ID NO：214：抗IL6R抗体(托珠单抗)轻链+PD-1ECD。
图117A至图117B是多肽序列。图117A：SEQ ID NO：215：抗IL6R抗体(托珠单抗)重链+TGFbRII ECD。图117B：SEQ ID NO：216：抗IL6R抗体(托珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图118A至图118B是多肽序列。图118A：SEQ ID NO：217：抗IL6R抗体(托珠单抗)重链+PD-1ECD。图118B：SEQ ID NO：218：抗IL6R抗体(托珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图119A至图119B是多肽序列。图119A：SEQ ID NO：219：抗IL6R抗体(托珠单抗)重链+TIM3 ECD。图119B：SEQ ID NO：220：抗IL6R抗体(托珠单抗)轻链+PD-1ECD。
图120A至图120B是多肽序列。图120A：SEQ ID NO：221：抗IL6R抗体(托珠单抗)重链。图120B：SEQ ID NO：222：抗IL6R抗体(托珠单抗)轻链+PD-1ECD。
图121A至图121B是多肽序列。图121A：SEQ ID NO：223：抗IL6R抗体(托珠单抗)重链。图121B：SEQ ID NO：224：抗IL6R抗体(托珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图122A至图122B是多肽序列。图122A：SEQ ID NO：225：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)重链+TGFbRII ECD。图122B：SEQ ID NO：226：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)轻链+PD-1ECD。
图123A至图123B是多肽序列。图123A：SEQ ID NO：227：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)重链+TGFbRII ECD。图123B：SEQ ID NO：228：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)轻链+TIM3 ECD。
图124A至图124B是多肽序列。图124A：SEQ ID NO：229：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)重链+PD-1ECD。图124B：SEQ ID NO：230：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)轻链+TIM3 ECD。
图125A至图125B是多肽序列。图125A：SEQ ID NO：231：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)重链+TIM3 ECD。图125B：SEQ ID NO：232：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)轻链+PD-1ECD。
图126A至图126B是多肽序列。图126A：SEQ ID NO：233：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)重链。图126B：SEQ ID NO：234：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)轻链+PD-1ECD。
图127A至图127B是多肽序列。图127A：SEQ ID NO：235：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)重链。图127B：SEQ ID NO：236：抗EGFR抗体(西妥昔单抗)轻链+TIM3 ECD。
图128A至图128B是多肽序列。图128A：SEQ ID NO：237：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)重链+TGFbRII ECD。图128B：SEQ ID NO：238：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)轻链+PD-1ECD。
图129A至图129B是多肽序列。图129A：SEQ ID NO：239：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)重链+TGFbRII ECD。图129B：SEQ ID NO：240：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图130A至图130B是多肽序列。图130A：SEQ ID NO：241：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)重链+PD-1ECD。图130B：SEQ ID NO：242：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图131A至图131B是多肽序列。图131A：SEQ ID NO：243：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)重链+TIM3 ECD。图131B：SEQ ID NO：244：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)轻链+PD-1ECD。
图132A至图132B是多肽序列。图132A：SEQ ID NO：245：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)重链。图132B：SEQ ID NO：246：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)轻链+PD-1ECD。
图133A至图133B是多肽序列。图133A：SEQ ID NO：247：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)重链。图133B：SEQ ID NO：248：抗HER2抗体(曲妥珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图134A至图134B是多肽序列。图134A：SEQ ID NO：249：抗VEGF抗体(贝伐单抗)重链+TGFbRII ECD。图134B：SEQ ID NO：250：抗VEGF抗体(贝伐单抗)轻链+PD-1ECD。
图135A至图135B是多肽序列。图135A：SEQ ID NO：251：抗VEGF抗体(贝伐单抗)重链+TGFbRII ECD。图135B：SEQ ID NO：252：抗VEGF抗体(贝伐单抗)轻链+TIM3 ECD。
图136A至图136B是多肽序列。图136A：SEQ ID NO：253：抗VEGF抗体(贝伐单抗)重链+PD-1ECD。图136B：SEQ ID NO：254：抗VEGF抗体(贝伐单抗)轻链+TIM3 ECD。
图137A至图137B是多肽序列。图137A：SEQ ID NO：255：抗VEGF抗体(贝伐单抗)重链+TIM3 ECD。图137B：SEQ ID NO：256：抗VEGF抗体(贝伐单抗)轻链+PD-1ECD。
图138A至图138B是多肽序列。图138A：SEQ ID NO：257：抗VEGF抗体(贝伐单抗)重链。图138B：SEQ ID NO：258：抗VEGF抗体(贝伐单抗)轻链+PD-1ECD。
图139A至图139B是多肽序列。图139A：SEQ ID NO：259：抗VEGF抗体(贝伐单抗)重链。图139B：SEQ ID NO：260：抗VEGF抗体(贝伐单抗)轻链+TIM3 ECD。
图140A至图140B是多肽序列。图140A：SEQ ID NO：261：抗gp120抗体(B12)重链+TGFbRII ECD。图140B：SEQ ID NO：262：抗gp120抗体(B12)轻链+PD-1ECD。
图141A至图141B是多肽序列。图141A：SEQ ID NO：263：抗gp120抗体(B12)重链+TGFbRII ECD。图141B：SEQ ID NO：264：抗gp120抗体(B12)轻链+TIM3 ECD。
图142A至图142B是多肽序列。图142A：SEQ ID NO：265：抗gp120抗体(B12)重链+PD-1ECD。图142B：SEQ ID NO：266：抗gp120抗体(B12)轻链+TIM3 ECD。
图143A至图143B是多肽序列。图143A：SEQ ID NO：267：抗gp120抗体(B12)重链+TIM3 ECD。图143B：SEQ ID NO：268：抗gp120抗体(B12)轻链+PD-1ECD。
图144A至图144B是多肽序列。图144A：SEQ ID NO：269：抗gp120抗体(B12)重链。图144B：SEQ ID NO：270：抗gp120抗体(B12)轻链+PD-1ECD。
图145A至图145B是多肽序列。图145A：SEQ ID NO：271：抗gp120抗体(B12)重链。图145B：SEQ ID NO：272：抗gp120抗体(B12)轻链+TIM3 ECD。
图146A至图146B是多肽序列。图146A：SEQ ID NO：273：抗PD1抗体(纳武单抗)重链+TGFbRII ECD。图146B：SEQ ID NO：274：抗PD1抗体(纳武单抗)轻链+TIM3 ECD。
图147A至图147B是多肽序列。图147ASEQ ID NO：275：抗PD1抗体(纳武单抗)重链。图147B：SEQ ID NO：276：抗PD1抗体(纳武单抗)轻链+TIM3 ECD。
图148A至图148B是多肽序列。图148A：SEQ ID NO：277：抗PD1抗体(帕博利珠单抗)重链+TGFbRII ECD。图148B：SEQ ID NO：278：抗PD1抗体(帕博利珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图149A至图149B是多肽序列。图149A：SEQ ID NO：279：抗PD1抗体(帕博利珠单抗)重链。图149B：SEQ ID NO：280：抗PD1抗体(帕博利珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图150A至图150B是多肽序列。图150A：SEQ ID NO：281：抗PDL1抗体(阿特珠单抗)重链+TGFbRII ECD。图150B：SEQ ID NO：282：抗PDL1抗体(阿特珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图151A至图151B是多肽序列。图151A：SEQ ID NO：283：抗PDL1抗体(阿特珠单抗)重链。图151B：SEQ ID NO：284：抗PDL1抗体(阿特珠单抗)轻链+TIM3 ECD。
图152A至图152B是多肽序列。图152A：SEQ ID NO：285：抗PDL1抗体(阿维单抗)重链+TGFbRII ECD。图152B：SEQ ID NO：286：抗PDL1抗体(阿维单抗)轻链+TIM3 ECD。
图153A至图153B是多肽序列。图153A：SEQ ID NO：287：抗PDL1抗体(阿维单抗)重链。图153B：SEQ ID NO：288：抗PDL1抗体(阿维单抗)轻链+TIM3 ECD。
图154是TIGIT的细胞外结构域的多肽序列，SEQ ID NO：289。
图155A至图155B是多肽序列。图155A：SEQ ID NO：290：抗PD1抗体(纳武单抗)重链+TIGIT ECD。图155B：SEQ ID NO：291：抗PD1抗体(纳武单抗)轻链。
图156A至图156B是多肽序列。图156A：SEQ ID NO：292：抗PD1抗体(帕博利珠单抗)重链+TIGIT ECD。图156B：SEQ ID NO：293：抗PD1抗体(帕博利珠单抗)轻链。
图157A至图157B是多肽序列。图157A：SEQ ID NO：294：抗PDL1抗体(阿特珠单抗)重链+TIGIT ECD。图157B：SEQ ID NO：295：抗PDL1抗体(阿特珠单抗)轻链。
图158A至图158B是多肽序列。图158A：SEQ ID NO：296：抗PDL1抗体(阿维单抗)重链+TIGIT ECD。图158B：SEQ ID NO：297：抗PDL1抗体(阿维单抗)轻链。
图159A至图159B是多肽序列。图159A：SEQ ID NO：298：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)重链+TIGIT ECD。图159B：SEQ ID NO：299：抗CTLA4抗体(伊匹单抗)轻链。
图160是CD160的细胞外结构域的多肽序列，SEQ ID NO：300。
图161是CD96的细胞外结构域的多肽序列，SEQ ID NO：301。
图162是LIGHT的细胞外结构域的多肽序列，SEQ ID NO：302。
图163是CD44的细胞外结构域的多肽序列，SEQ ID NO：303。
图164是TIM-3的细胞外结构域的一片段的多肽序列，SEQ ID NO：304。
图165是LIGHT的一片段的多肽序列，SEQ ID NO：305。
图166是LIGHT的一片段的多肽序列，SEQ ID NO：306。
图167是LAIR1的细胞外结构域的多肽序列，SEQ ID NO：307。
具体实施方式
本发明描述了多功能抗体-配体捕获，其被设计来消解癌症及传染性疾病中的免疫耐受或T细胞功能障碍。本发明的分子被设计成有效地中断涉及多种免疫受体-配体相互作用的多个自分泌/旁分泌信号回圈，这些相互作用导致肿瘤或病原体免疫微环境中的免疫功能障碍。通过消解调节T细胞的诱导/功能、免疫耐受及/或T细胞耗竭，本发明的分子及组合物可以恢复及增强有效的抗肿瘤免疫性，以治疗肿瘤性疾病/癌症，或针对病原体的免疫应答，用于预防或治疗传染性疾病。这类新型的多功能抗体-配体捕获释放出有效的抗肿瘤免疫反应的能力，为许多类型的进行癌以及难治性癌症提供了一种有前途的免疫治疗策略。
在描述本发明的组合物及方法之前，应理解的是，本发明不限于所描述的特定组合物、方法及实验条件，因为这样的组合物、方法及条件可以变化。还应理解的是，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
除非上下文另外明确指出，如本说明书及所附权利要求书中所使用的，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述”包括复数引用。因此，例如，在提及“所述方法”时，包括一个或多个本文描述以及/或者本领域普通技术人员在阅读本发明时会明暸的方法及/或步骤类型。
本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请均通过引用并入本文，程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请均被具体地及单独地指示以引用方式并入。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法及材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是应当理解，在本公开的精神及范围内包括各种修改及变化。现在描述优选的方法及材料。
肿瘤微环境中的免疫功能障碍–癌症的共同特征
由肿瘤细胞固有的基因组不稳定性引起的基因突变会产生新抗原，所述新抗原可以被免疫系统所识别。在抗原呈递树突细胞与T淋巴细胞之间的免疫突触处肿瘤抗原的交叉呈递可能会激活由CD4+辅助性T细胞(TH1)以及CD8+细胞毒性效应细胞介导并由肿瘤反应性中央型记忆T细胞维持的一适应性抗肿瘤免疫应答。然而，肿瘤不断进化以通过增选(co-opting)及扩大免疫耐受的机制来消解并最终击败这种免疫监视，以逃避免疫系统的消除。癌症产生功能失调的肿瘤免疫微环境的免疫调节因子的能力使得肿瘤进展的前提条件得以实现。这些因子包括调节免疫细胞(例如T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞及树突细胞)的分化、激活、增殖、存活、细胞毒性功能及募集的免疫调节配体、细胞因子及趋化因子。这些因子在肿瘤微环境中的独立及协同作用导致功能失调的免疫表型，其特征在于肿瘤浸润性T细胞的异常分化及功能异常：(i)TH1细胞减少、(ii)调节T细胞(regulatory Tcell,Tregs)升高，这是抑制效应T细胞并介导免疫耐受的CD4+T细胞的亚群、(iii)减少细胞毒性CD8+T细胞、(iv)不能响应抗原刺激而增殖并发挥效应功能例如细胞毒性及细胞因子分泌的耗竭T细胞升高。肿瘤浸润性免疫细胞的功能定位对癌症患者的预后有重大影响。TH1细胞以及细胞毒性CD8+T细胞与更长的无病生存期一致且密切相关，而肿瘤的Tregs以及耗竭CD8+T细胞的浸润与预后不良相关。
肿瘤微环境中免疫功能障碍的分子决定因素
癌症表达与T细胞抑制受体(T cell inhibitory receptors,TCIR)结合的免疫抑制配体并抑制T细胞的活化。这些TCIR-TCIR配体的相互作用作为“免疫检查点”，其通过共刺激受体及配体来消解及限制T细胞的活化(图1)。以下TCIR及TCIR配体在肿瘤微环境中介导免疫耐受及T细胞耗竭：
程序性死亡1(Programmed death 1,PD-1)/PD-1配体以及细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4)：
PD-1受体(分化簇(CD)279)及其配体、PD-1配体1(PD-L1、B7-H1、CD274)以及PD-1配体2(PD-L2、B7-DC、CD273)是B7-CD28家族中的成员，并在维持自身耐受方面起着关键作用。PD-1与PD-1配体的结合可抑制CD3/CD28介导的T细胞活化、抑制T细胞效应功能、诱导T细胞耗竭，并促进T细胞的细胞凋亡的PD-1/PD-L1信号，其促进Tregs的诱导、功能以及维持，Tregs是表达叉头状P3(FOXP3)转录因子以及CTLA-4的免疫抑制性CD4+T细胞的一亚群，CTLA-4是抑制T细胞活化的共抑制分子。
PD-1/PD-L1通路在诱导癌症中的免疫耐受以及T细胞耗竭中起关键作用。PD-L1在几种不同的癌症中高水平表达，并且PD-L1在肿瘤上的高表达与不良预后密切相关。PD-L1的肿瘤细胞表达通过信号通路(RAS-MEK-ERK、PI3K/AKT以及JAK/STAT)上调，所述信号通路被内在遗传畸变(例如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)激活或过表达、激活RAS突变、PIK3CA的扩增/突变或磷酸酯酶与张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)缺失)，或肿瘤微环境中的细胞因子(例如干扰素、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、转化生长因子(Transforming Growth Factor Beta,TGF-β))激活。在许多癌症中，表达PD-1的肿瘤浸润性CD8+T细胞表现出功能耗竭的耗竭表型，并且已示出在某些癌症中PD-1/PD-L1信号的抗体介导的阻断可改善临床结果并恢复功能性T细胞应答。
T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3(T cell immunoglobulin and mucin domaincontaining-3,TIM-3)以及癌胚抗原相关细胞粘附分子-1(Carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule-1,CEACAM-1)介导的免疫耐受以及T细胞耗竭：
TIM-3以及CEACAM-1共同抑制受体是免疫耐受以及T细胞耗竭的关键决定因素。TIM-3是在许多免疫细胞类型(例如产生IFN-γ的CD4+以及CD8+T细胞)上表达的I型跨膜蛋白，在调节先天以及适应性免疫应答中起关键作用。TIM-3表达是由参与效应T细胞分化的细胞因子诱导的，并且需要T-bet，其为TH1表型的标志转录因子。长期刺激的T细胞以及终末分化效应TH1细胞表现出稳定、高水平的TIM-3的表达。TIM-3抑制干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的表达、抑制TH1细胞，并诱导T细胞功能的逐步丧失(T细胞耗竭)。TIM-3除了在调节T细胞效应功能中起关键作用外，还在FOXP3+Tregs上表达，并增强了FOXP3+Tregs的抑制功能。在许多人类癌症中，TIM-3在CD4+以及CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)上均高度上调，并且T细胞上TIM-3表达升高与免疫功能低下、肿瘤演进以及预后不良有关。CD8+TILs上的TIM-3表达与PD-1紧密相关，而TIM-3+PD-1+CD8+T细胞代表最功能失调的深度耗竭的T细胞群体。癌症中PD-1+以及TIM-3+CD8+TILs的增加的频率与对治疗的反应以及临床结果呈负相关。TIM-3表达在肿瘤浸润Tregs上也显着上调，并且TILs中主要的TIM-3+FoxP3+Treg群体是多种形式的癌症的共同特征，其与不良的临床病理参数有关，例如淋巴结转移以及晚期。
TIM-3的免疫抑制功能需要它的异源二聚体与CEACAM-1相互作用，CEACAM-1是另一种1型跨膜蛋白，与TIM-3共表达于活化的T细胞上，以下调T细胞活性及功能。TIM-3及CEACAM-1的细胞外N端免疫球蛋白(IgV)结构域共享结构相似性，并通过沿其FG-CC'界面通过一共享的“裂缝(cleft)”结构相互作用。与CEACAM1的嗜异性结合促进TIM-3的成熟以及在T细胞表面的定位，并有助于TIM-3介导诱导外周耐受以及抑制抗肿瘤免疫力。除上述嗜异性顺式相互作用外，CEACAM1还可以反式连接TIM-3，这表明表达CEACAM1的肿瘤细胞可以通过T细胞上的TIM-3提供抑制信号。TIM-3的胞质尾区没有其他抑制受体中发现的经典的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIMs)，但含有保守的酪氨酸残基(Tyr 265、272)，这对于结合T细胞受体(T cellreceptor,TCR)信号通路的含SH2结构域的激酶以及HLA-B关联转录因子3(human HLA-B-associated transcript 3，BAT3)是至关重要的。CEACAM-1与TIM-3的相互作用诱导Y256/Y263磷酸化介导的Bat3的释放以及Bat3介导的TCR信号的丢失，从而使TIM-3与其他结合的配偶体(binding partners)协同抑制TCR信号并诱导T细胞耗竭。除了通过与TIM-3的嗜异性相互作用(CEACAM1/Tim-3)来促进免疫抑制的能力外，CEACAM-1还可以通过其细胞外结构域在顺式或反式(CEACAM1/CEACAM1)中的二聚化来抑制T细胞活性。CEACAM-1细胞外结构域ITIMs的磷酸化以及SHP-1/SHP-2酪氨酸磷酸酶的募集需要这种嗜同性相互作用，从而影响TCR/CD3复合信号的广泛近端抑制并抑制多种效应子功能，包括T细胞增殖、TH1细胞因子产生以及与T细胞活化相关的细胞毒性。这些机制的见解表明TIM-3/CEACAM1轴通过以下方式对T细胞产生多管抑制：(i)嗜异性TIM-3/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1/TIM-3异二聚、反式CEACAM1与TIM-3异二聚)、(ii)嗜同性CEACAM-1/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1二聚化、反式CEACAM1诱导的顺式CEACAM-1二聚化)。因此，共表达TIM-3以及CEACAM1的肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞在癌症中表现出最耗竭的表型，并且CEACAM1在几种人类癌症中的表达升高与转移以及不良预后相关。
T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂(V-domain Ig suppressor of Tcellactivation,VISTA)
VISTA是与PD-L1以及PD-1同源的免疫检查点分子，其在髓细胞上高度表达，从而引起T细胞活化的抑制。VISTA在髓样及粒细胞上高表达，在T细胞上低表达。VISTA抑制CD8+及CD4+T细胞的活性。即使没有VISTA，VISTA介导的T细胞抑制作用也会持久(Lines等人，2014)。VISTA可以充当一配体，与T细胞上的一受体结合，从而抑制增殖及细胞因子的产生。VISTA还可以充当T细胞的一受体，其连接类似地诱导增殖及细胞因子产生的抑制。VISTA还可以促进Treg的诱导，并在肿瘤浸润的Tregs中高表达。VISTA及PD-1非冗余地抑制T细胞活化。
淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte-Activated Gene-3,LAG-3)
LAG-3(也称为CD223)是在活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、Tr1细胞以及自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)、B细胞及树突细胞的子类上表达的一阳性检查点调节剂。LAG-3在结构上与CD4同源，并且类似地结合第二类MHC分子。T细胞上的LAG-3表达直接抑制T细胞活化。除了结合第二类MHC，LAG-3还与LSECtin及Galectin-3(Gal-3)相互作用，两者均在肿瘤微环境中表达。通过LSECtin或Galectin-3的LAG-3连接导致效应子细胞IFNγ产生减少，Treg IL-10产生增加。LAG-3并与PD-1及TIM-3共表达以及协同作用，以诱导及维持耗竭T细胞表型。
B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)
BTLA是与CTLA-4及PD-1具有结构同源性的一阴性检查点调节剂。BTLA在T细胞、成熟的树突细胞、巨噬细胞上表达，并且在B细胞上表达最高。BTLA与疱疹病毒进入介体(Herpesvirus Entry Mediator,HVEM)结合，HVEM在T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞及髓细胞上表达。HVEM还与CD160(在T细胞上表达的一阴性检查点调节剂)以及LIGHT(一共刺激受体)相互作用。通过HVEM连接或施用α-BTLA激动剂抗体，可在T细胞上产生BTLA信号，从而抑制T细胞增殖。BTLA表达还通过IL-17及TNFα的负调控来限制γδT细胞的扩增及激活。BTLA还能够充当一配体，与T细胞表达的HVEM结合并促进T细胞存活。BTLA与PD-1在CD8+TILs上共表达，并且似乎参与了协同以及非冗余免疫抑制机制。
T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(T cell Ig and ITIMDomain,TIGIT)
TIGIT是在CD8+T细胞、CD4+T细胞及NK细胞上表达的一免疫检查点分子。TIGIT已显示与脊髓灰质炎病毒受体(poliovirus receptor,PVR、也称为NECL5/CD155)以及PVR样蛋白PVRL2(也称为CD112)特异性结合。当CD226与CD155/CD112结合使用时，CD226提供一正共刺激信号，而TIGIT提供一抑制信号。与CD112相比，TIGIT对CD155具有更高的亲和力。TIGIT与CD155形成一异源四聚体复合物，其中核TIGIT同源二聚体结合一对CD155分子。当Th1/Th17 T辅助细胞上的CD226与T细胞上的CD155/CD112结合时，它们会提供正的共刺激作用。TIGIT还结合了CD155/CD112(并传递负信号)，因此它直接与CD226竞争与CD155/CD112的结合。此外，TIGIT已显示直接结合CD226并中断其同源二聚化，尽管尚不清楚此机制是否在体内起作用。TIGIT与树突细胞上的CD155结合以诱导致耐受的表型。CD155在树突细胞上高表达，在这种情况下，TIGIT/CD155相互作用导致产生诱导IL-10产生的抗性树突细胞，抑制T细胞增殖并限制IFN-γ的产生(Yu等人，2009)。CD155及CD112在肿瘤细胞中高度表达，表明TIGIT介导的免疫抑制是通过对T细胞的直接作用而形成的。确实，TIGIT独特地富含肿瘤浸润淋巴细胞，其对FOXP3+Tregs的功能构成了其最有效的免疫抑制能力。
TIGIT连接另外直接抑制效应T细胞功能。发现TIGIT与CD8+TILs上的PD-1、TIM-3及LAG-3共表达。TIGIT已显示与PD-1/PD-L1以及TIM-3协同作用，以削弱抗肿瘤免疫力(Kurtulus等人，2013)。TIGIT连接能够直接抑制T细胞增殖以及表达它的T细胞及NK细胞上的细胞因子的产生。TIGIT+CD8+TILs缺乏几种效应功能(例如IL-2以及TNF-α的产生)，并且通过增强的IL-10产生而有助于免疫抑制。在CD4+TILs中，TIGIT几乎仅在具有高表达Treg效应分子的FOXP3+Tregs的一子类上表达。TIGIT+Tregs似乎选择性抑制Th1及Th17反应，而不抑制Th2反应。TIGIT+Tregs与Tgfb1、Foxp3、Havcr2、Lag3及Ctla4的较高基因表达有关。此外，在Tregs的TIGIT信号下游发现了Ccl4、Cxcr3、Ccr8及Tbx21的基因。这表明TIGIT信号在Treg迁移及保留(Ccl4、Cxcr3、Ccr8)以及稳定性(Tbx21，也称为T-bet)中起重要的因果作用。
CC趋化因子受体4(C-C chemokine receptor type 4,CCR4)
CCR4是在Tregs上高度表达的一趋化因子受体，其允许通过CCL22连接将Tregs募集到肿瘤环境中。肿瘤细胞高表达CCL22，以通过Treg募集诱导免疫抑制。
白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1,LAIR1)
LAIR1是具有免疫球蛋白样结构域以及包含两个免疫受体酪氨酸的抑制基序的一胞质尾的一跨膜糖蛋白。当被活化后，LAIR1募集SHP-1及SHP-2磷酸酶，并可通过LAIR1抗原在NK细胞上的交联而强烈抑制NK细胞介导的细胞毒性。
转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGFβ)
TGFβ是一多功能细胞因子，在大多数癌症中均过表达。TGFβ与TGFβ受体II(TGFβRII)的高亲和力结合将TGFβ受体I募集至一异四聚体复合体中，所述异四聚体复合体使SMAD2/3磷酸化并使其与SMAD4相互作用，从而导致控制细胞生长、分化及迁移的基因被活化或抑制。肿瘤细胞通常变得难以抵抗TGFβ的生长抑制作用，而是利用其在肿瘤微环境中的活性来促进免疫耐受以及肿瘤进展。TGFβ在调节先天及适应性免疫系统中起关键作用。TGF-β抑制介导抗体依赖的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)的免疫效应细胞的活化及细胞毒性功能。肿瘤浸润性T细胞的局部微环境中的自分泌/旁分泌TGF-β信号减弱了CD8+T细胞的活性，限制了中央记忆型细胞的发展，并使CD4+T辅助细胞的分化偏向于有助于肿瘤进展的免疫抑制性调节T细胞。TGFβ诱导FOXP3的表达，FOXP3是决定及维持Treg谱系功能程序的标志性转录因子。FOXP3依次诱导CTLA-4(抑制T细胞共刺激的一免疫抑制受体)以及半乳糖凝集素-9(Galectin-9,GAL-9)的表达，GAL-9为与TIM-3免疫抑制受体结合并触发效应T细胞耗尽或细胞凋亡的一配体。GAL-9进一步与TGFβ受体相互作用，在涉及SMAD3活化的一正前馈自分泌环路中驱动FOXP3表达，从而诱导及维持Tregs。如此，富含TGFβ的肿瘤微环境促进了Tregs的发展，其减弱了免疫效应子的活化。由于肿瘤浸润免疫细胞的功能方向对癌症患者的预后产生重大影响，因此TGFβ使CD4+T细胞的分化自TH1型向Treg谱系偏向的能力具有重大的临床意义。TH1细胞、细胞毒性CD8+T细胞以及中央记忆T细胞与更长的无病生存期一致且密切相关，而Tregs浸润肿瘤与不良预后相关。TCGA-HNSCC数据集(利用从单细胞RNA测序中T细胞类型特异性参考基因表达谱(reference gene expression profiles，RGEP)中T细胞亚型的相对丰度的估计表明，绝大多数癌症表现出功能失调的免疫抑制表型，其特征是CD4+T细胞分化从TH1细胞向Tregs的异常偏向，并且耗尽的CD8+T细胞增加。TCGA数据集的分析表明，升高的TGFβ1/3与FOXP3 mRNA表达密切相关，并与较低的存活率显着相关。
当前的癌症免疫疗法的局限性：
当前，消解肿瘤诱导的免疫耐受的临床致力集中在靶向作为免疫检查点的T细胞抑制受体或配体的单克隆抗体，例如CTLA-4、PD-1及PD-L1。目前已批准一种CTLA-4抗体(伊匹单抗(ipilimumab))，两种PD-1拮抗剂(帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、纳武单抗(Nivolumab))以及三种PD-L1抑制剂(阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维单抗(Avelumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)，用于癌症免疫治疗的特定临床适应症，所述癌症例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌或膀胱癌。尽管一部分患有晚期癌症的患者因对CTLA-4、PD-1或PD-L1单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的反应而获得了持久的缓解并延长了生存期，但大多数患者对这种疗法没有反应。此类肿瘤可能使用其他免疫调节配体或细胞因子来诱导T细胞功能障碍以及抑制抗肿瘤免疫力。因为仅靶向PD-1–PD-L途径并不能完全恢复T细胞功能，并且在某些靶向PD-1–PD-L途径的癌症中根本无法恢复T细胞功能，因此有必要辨识并同时消解在肿瘤微环境中协同执行免疫耐受以及T细胞耗竭的多个分子以及抑制途径。当前的免疫治疗策略受到癌症免疫功能异常的以下挑战的限制：
(1)免疫耐受以及T细胞耗竭的多个独立的、合作的以及冗余的免疫受体-配体相互作用，各自通过反馈回路增强。靶向单个分子决定簇不足以消解癌症免疫功能障碍的多方面机制。
(2)促进Tregs并诱导T细胞耗竭的免疫抑制信号途径涉及肿瘤微环境中顺式及反式的自分泌及旁分泌免疫受体-配体相互作用。当前的单克隆抗体不能有效地中断肿瘤免疫细胞微环境中的过度活跃的免疫抑制自分泌/旁分泌配体-受体相互作用。需要新的策略来在靶向肿瘤细胞或肿瘤浸润T细胞的直接微环境中有效地竞争并物理中断此类自分泌/旁分泌信号回路。
(3)从头(De novo)及耐受的适应性机制：除了表现出免疫功能障碍的从头(Denovo)机制，肿瘤还在治疗过程中发展为获得免疫耐受的其他机制。如此，解决一种机制可能导致肿瘤利用正交途径获得等效的免疫抑制作用。
(4)癌症的免疫功能低下的特征在于，CD4细胞在肿瘤免疫微环境中自TH1表型向Treg或TH17谱系的的偏向分化。抑制免疫检查点(例如PD-1/PD-L1或CTLA-4)或活化共刺激受体(例如4-1BB或OX40)的抗体专注于调节免疫突触以共刺激T细胞，然而不能消解将CD4细胞自TH1细胞转向Treg或TH17谱系分化的近端配体，其促进免疫耐受及肿瘤发炎。
靶向多功能免疫调节抗体-配体捕获剂
本发明描述了靶向多功能免疫调节抗体-配体的捕获剂，其靶向一肿瘤细胞或一肿瘤浸润性T细胞，并同时隔离关键配体，所述关键配体在肿瘤微环境中促成免疫功能障碍。抗体-配体捕获剂包含靶向与一受体细胞外结构域(extracellular domain,ECD)融接的一肿瘤细胞或T细胞免疫受体/配体(靶向部分)的一抗体，所述ECD在所述靶向的细胞的直接微环境中同时捕获并禁用一个或多个免疫抑制配体(受体ECD，配体捕获)。抗体-配体捕获的靶向部分表现出其自身的特定功能，同时将融接的受体ECD(捕获)定位在靶向肿瘤或免疫细胞微环境中，从而有效地与天然受体竞争配体。受体ECD包含任何免疫调节受体的一配体结合序列，可调节任何免疫细胞(例如T淋巴细胞、髓细胞、NK细胞或树突细胞/抗原呈递细胞的分化、增殖、维持、存活、活性、功能或募集)。
本发明的靶向部分包含一多肽，所述多肽特异性地结合一肿瘤细胞、肿瘤微环境、肿瘤相关生长因子或受体、肿瘤相关细胞因子或受体、肿瘤相关T淋巴细胞、T细胞共刺激分子、T细胞共抑制分子、免疫细胞、病原体或病原体相关细胞的一组成部分。在特定实施方案中，所述靶向部分特异性地结合一免疫受体，其中所述免疫受体是CTLA-4(CD152)、PD-1、PD-L1、TIM-3、VISTA、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、LAG-3、B7-H3、CD39、CD73、腺甘酸A2a受体(adenosine A2a receptor)、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)、GITR、CD27、HVEM、CD40L、CD40、CD47、CCR4、CCR5、CXCR4、IL-12R、类铎受体(Toll-like receptor,TLR1-10)、CD4、CD25、CD3、ICOS、KIR或T细胞受体。
融接至所述靶向部分的所述受体ECD包括T淋巴细胞免疫受体、B淋巴细胞受体、DC受体、NK细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体、趋化因子受体或肿瘤细胞受体的细胞外配体结合序列。在特定的实施方案中，将靶向部分与以下多个受体ECD的其中一个的一配体结合序列融接：
表1
受体ECD 受体ECD捕获的同源配体
TGFβRII ecd 结合TGFβ
PD-1ecd 结合PD-L1以及PD-L2
TIM-3ecd 结合CEACAM-1
LIGHT ecd 结合HVEM
BTLA ecd 结合HVEM
CD226ecd 结合CD155、CD112
TIGIT ecd 结合CD155、CD112
CD44ecd 结合CD44配体
CSF1R ecd 结合CSF-1
CCR4 ecd 结合CCL22
KIR ecd 结合KIR配体
VEGFR ecd 结合VEGF-A、VEGF-B、PIGF
RANK ecd 结合RANKL
VSIG8 ecd 结合VISTA
VISTA ecd 结合VSIG8
LAIR1 ecd 结合LAIR1配体
抗体-配体捕获剂的融接的受体ECD序列在靶向细胞微环境中最佳地捕获配体：
a.通过受体发出信号的所有同源配体(以及同种型)高度特异性结合，没有脱靶作用的风险、
b.对诱饵受体ECD螯合的所有同源配体的可预测/可靠抑制、确保拮抗剂作用，没有悖论激动剂功能或多余的配体-受体相互作用的风险、
c.同源配体的最佳亲和力
d.由于靶向部分将融接的受体ECD定位到靶向细胞微环境，因此打乱了自分泌/旁分泌信号回路，从而使诱饵受体ECD能够有效地与天然受体竞争靶向配体。
e.降低天然受体ECD的免疫原性风险。
本发明的抗体-配体捕获剂可通过多功能能力来消解TME中的Treg以及适应性T细胞耐受/耗竭，从而活化抗肿瘤免疫性：
a.禁用免疫检查点受体/配体+消解免疫抑制配体、
b.活化共刺激受体+消解免疫抑制配体/检查点
c.靶向一肿瘤细胞(例如GFR)+消解免疫抑制配体/检查点
d.同时消解或限制多个(T细胞抑制受体)配体的可用性或限制多个TCIRs/TCIR配体。
本发明中描述的抗体-配体捕获剂可以在功能上阻断多个TCIR/TCIR配体，并且用作在TME中广泛靶向T细胞抑制途径的策略。在肿瘤/免疫细胞微环境中干扰多种肿瘤TCIR/TCIR配体相互作用及其自分泌/旁分泌信号传导比基于多种抗体的免疫检查点封锁更有效。它们削弱了从头开始的广泛的多基因耐药机制和适应性免疫耐受的能力，可能解决了联合免疫疗法的挑战和局限性。这可以通过本发明的抗体-配体捕获剂来举例说明，其同时抵消了PD-1/PD-L1和TIM-3/CEACAM-1介导的肿瘤微环境中免疫耐受和T细胞耗竭的机制。
尽管靶向程序性死亡受体-1(Programmed Death-1protein,PD-1)：程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1,PD-L1)免疫检查点的抗体具有令人信服的抗肿瘤活性，但经常观察到对这些疗法的从头及适应性耐药。靶向PD-1/PD-L1途径可能不足以打破耗竭T细胞的功能障碍，因为PD-1与其他检查点抑制剂之间存在复杂的交叉调节作用，以抑制抗肿瘤T细胞免疫，在某些情况下，PD-1封锁后可能会出现适应性抵抗。TIM-3/CEACAM1轴是从头确定对PD-1/PD-L1治疗的适应性的关键决定因素。
TIM-3/CEACAM1通过以下方式对T细胞及NK细胞施加多管抑制：(i)嗜异的TIM-3/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1/TIM-3异二聚、反式CEACAM1与TIM-3异二聚)；(ii)同源CEACAM-1/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1二聚化、反式CEACAM1诱导的顺式CEACAM-1二聚化)。因此，在小鼠模型和癌症患者中，共表达TIM-3及CEACAM1的肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞表现出最疲惫的表型。
由于PD-1、TIM-3及CEACAM-1在肿瘤微环境中携带了免疫耐受及T细胞耗竭的独立和协同机制，因此需要同时阻断这些检查点以释放有效的抗肿瘤先天性和适应性抗肿瘤免疫应答。除了在肿瘤浸润的免疫细胞上所有三个T细胞抑制受体(TCIR：PD-1、TIM-3、CEACAM-1)的共表达升高之外，肿瘤细胞还共表达参与这些TCIR的多种配体来抑制肿瘤-反应性T细胞(PD-L1、CEACAM-1、半乳凝素9)。这带来了破坏TME中多个自分泌/旁分泌的顺式及反式TCIR/配体相互作用的治疗挑战，这些相互作用共同诱导免疫耐受(PD-1/PD-L1、Tim-3/CEACAM-1、CEACAM-1/CEACAM-1)。通过发明新型的双功能抗体-配体捕获剂(Y-trap)，已经解决了这一治疗难题：(i)α-PDL1-TIM3 ecd，其包含融接至TIM-3IgV胞外域序列的靶向PD-L1的抗体、(ii)α-PD1-TIM3 ecd，其包含与TIM-3IgV胞外域序列融接的靶向PD-1的抗体。
aPDL1-TIM3 ecd和aPD1-TIM3 ecd的作用机制：aPDL1-TIM3ecd和aPD1-TIM3ecd在活化的T细胞和肿瘤细胞上结合PD-1或PD-L1，并同时用有效地TIM-3ecd诱饵修饰它们与天然细胞TIM-3竞争结合CEACAM-1的FG-CC'裂界面。因此，这些抗体-配体捕获剂不仅会破坏PD-L1/PD-1的相互作用，而且会同时破坏肿瘤微环境中涉及Tim-3/CEACAM-1以及CEACAM-1/CEACAM-1的顺式和反式相互作用(TME)。这些研究表明，a-PDL1-TIM3ecd和a-PD1-TIM3ecd在体外促进IFNγ表达和抵消共同刺激的T细胞耗竭方面比a-PDL1(阿特珠单抗)或a-PD-1(帕博利珠单抗)更有效。最重要的是，发现使用这些抗体-配体捕获剂对荷瘤人源化小鼠进行体内治疗会导致肿瘤浸润性CD4+和CD8+T细胞的数量显着增加，并且与抑制肿瘤进展相比，其抑制作用更为显着用a-PDL1(阿特珠单抗)、a-PD-1(帕博利珠单抗)，a-Tim-3抗体甚至是a-PDL1与a-Tim-3的组合进行等效治疗。这些数据表明，肿瘤微环境中的亲和性Tim-3/CEACAM-1相互作用限制了PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤功效，并且α-PDL1-TIM3ecd及α-PD1-TIM3ecd提供了更有效的抑制作用。通过同时禁用PD-1/PD-L1检查点和抵消Tim-3/CEACAM-1轴的两个组件来提供消解或逆转T细胞耗解竭的免疫治疗策略。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分子，包含一靶向部分以及一免疫调节部分，其中：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽特异性地结合一肿瘤细胞、肿瘤微环境、肿瘤相关生长因子或受体、肿瘤相关细胞因子或受体、肿瘤相关T淋巴细胞、T细胞共刺激分子、T细胞共抑制分子、免疫细胞、病原体或病原体相关细胞的一组成部分、以及所述免疫调节部分包含一T淋巴细胞免疫受体、T细胞抑制受体、T细胞共抑制分子、T细胞共刺激分子、B淋巴细胞受体、树突细胞受体、自然杀伤细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体、趋化因子受体或肿瘤细胞受体的一细胞外结构域序列或其配体结合片段。
如本文所用，“靶向部分”是指具有定位并结合至特定分子或细胞组分的能力的分子。靶向部分可以是免疫球蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、scFv、含Fc的多肽，多肽、肽或其任意组合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，靶向部分可以结合存在于细胞或组织中的分子。一方面，靶向部分可结合患病细胞或组织如癌细胞或肿瘤中的分子。在另一方面，靶向分子可以结合正常细胞或组织，例如免疫细胞。在另一方面，靶向部分可以结合调节免疫应答的细胞或细胞外分子。另一方面，靶向部分结合生长因子受体、生长因子、细胞因子受体、细胞因子或细胞表面分子。
在另一个实施方案中，靶向部分是肿瘤靶向部分。靶向肿瘤的部分可以结合肿瘤细胞的组分或结合在肿瘤细胞附近(例如，肿瘤脉管系统或肿瘤微环境)。在一个实施方案中，肿瘤靶向部分与肿瘤细胞、肿瘤微环境、肿瘤脉管系统、肿瘤相关淋巴细胞、肿瘤抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面分子，肿瘤抗原决定簇、包含肿瘤抗原的融合蛋白、肿瘤相关细胞、肿瘤相关免疫细胞或肿瘤疫苗的一部分连接。
例如，在各种实施方案中，靶向部分对分子或组分具有特异性或与之结合，所述分子或组分包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR、EGFR1、ErbB-1，HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配体家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、IGF结合蛋白(IGFBPs)、IGFR配体家族(IGF-1R)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)家族、PDGFR配体家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、FGFR配体家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、VEGF家族、HGF受体家族、TRK受体家族、ephrin(EPH)受体家族、AXL受体家族、白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族、TIE受体家族、血管生成素1、2、受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)受体家族、Discoidin域受体(DDR)家族、RET受体家族、KLG受体家族、RYK受体家族、MuSK受体家族、转化生长因子α(TGF-β)、TGF-β受体、转化生长因子-β(TGF-β)、TGF-β受体、介白素13受体alpha2链(lL13Ralpha2)、介白素6(IL-6)、介白素-6受体、介白素素-4、IL-4受体，细胞因子受体I类(造血素家族)和II类(干扰素/lL-10)家族)受体、肿瘤坏死因子(TNF)家族、TNF-α、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNTRSF)、死亡受体家族，TRAIL受体、趋化因子家族、趋化因子受体家族、癌-睾丸(CT)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原，α-actinin-4，ARTC1，断点簇区域-Abelson(Bcr-abl)融合产物、B-RAF、caspase-5(CASP-5)、caspase-8(CASP-8)、β-catenin(CTNNB1)、细胞分裂周期27(CDC27)，细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)，CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延伸率因子2(ELF2)、Ets变异基因6/急性髓性白血病1基因ETS(ETC6-AML1)融合蛋白、纤连蛋白(FN)、GPNMB，低密度脂质受体/GDP-L岩藻糖：β-半乳糖2-α-岩藻糖基转移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2，精氨酸与异亮氨酸在以下位置的α2-结构域的α-螺旋残基170交换HLA-A2基因(HLA-A*201-R170I)，MLA-A11，热休克蛋白70-2突变(HSP70-2M)，KIAA0205，MART2，黑素瘤普遍存在的1,2，3突变(MUM-1、2、3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、neo-PAP，1型肌球蛋白、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARalpha融合蛋白，PRDX5，PTPRK，K-ras(KRAS2)，N-ras(NRAS)，HRAS，RBAF600，SIRT2，SNRPD1，SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白，磷酸三糖异构酶，BAGE，BAGE-1，BAGE-2、3、4、5，GAGE-1,2、3、4、5、6、7、8、GnT-V(异常N-乙酰基葡糖胺基转移酶V，MGAT5)，HERV-K-MEL、KK-LC、KM-HN-1、LAGE、LAGE-1，CTL识别的黑色素瘤抗原(CAMEL)，MAGE-A1(MAGE-1)，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-AS，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-3，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-C1，MAGE-C2、粘蛋白1(MUC1)，MAR T-1/Melan-A(MLANA)，gp100，gp100/Pme117(S1LV)，酪氨酸酶(TYR)，TRP-1，HAGE，NA-88，NY-ESO-1，NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17，SSX-1、2、3、4，TRP2-1NT2、癌胚抗原(CEA)、激肽释放酶4，丙种球蛋白A，OA1，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺特异性膜抗原，TRP-l/gp75，TRP-2、脂肪亲和素、nielanorna 2(AIM-2)、BING-4、CPSF、cyclin D1，上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)，EppA3、成纤维细胞生长因子5(FGF-5)，糖蛋白250(gp250肠道羧基酯酶(iCE)、甲胎蛋白(AFP)、M-CSF，mdm-2，MUCI，p53(TP53)、PBF、FRAME、PSMA、RAGE-1、RNF43、RU2AS，SOX10，STEAP1，survivin(BIRCS)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)，端粒酶，威尔姆斯肿瘤基因(WT1)、SYCP1、BRDT、SPANX、XAGE、ADAM2、PAGE-5、LIP1、CTAGE-1、CSAGE、MMA1、CAGE、BORIS、HOM-TES-85、AF15q14、HCA66I、LDHC、MORC、SGY-1、SPO11、TPX1、NY-SAR-35、FTHLI7、NXF2 TDRD1、TEX 15、FATE、TPTE、免疫球蛋白独特型、Bence-Jones蛋白、雌激素受体(ER)和雄激素受体(AR)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、CD4、CD25、CD3、癌抗原72-4(CA 72-4)、癌抗原15-3(CA 15-3)、癌抗原27-29(CA 27-29)、癌抗原125(CA 125)、癌症抗原19-9(CA 19-9)、β-人绒毛膜促性腺激素、1-2微球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇化酶、热休克蛋白gp96、GM2、sargramostim、CTLA-4、707丙氨酸脯氨酸(707-AP)、被T细胞4识别的腺癌抗原(ART-4)、致癌性抗原肽1(CAP-1)、钙激活氯化物通道2(CLCA2)、亲环蛋白B(Cyp-B)、人印章环肿瘤2(HST-2)、人乳头瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6、HPV-E7、主要或次要衣壳抗原)等等)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)蛋白(EBV潜伏膜蛋白-LMP1、LMP2；其他)、乙型或丙型肝炎病毒蛋白以及HIV蛋白(包括gp120)。本发明的组合物可以进一步包括前述作为肽/多肽和/或编码它们。
在一方面，所述靶向部分的多肽特异性地结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(分化簇152)、程序性死亡受体-1蛋白、程序性死亡配体-1、程序性死亡配体-2、B7-H3(分化簇276)、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、癌胚抗原相关细胞粘附分子-1、癌胚抗原、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、疱疹病毒进入介体、分化簇160、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、分化簇226、分化簇96、淋巴细胞活化基因-3、转化生长因子β、转化生长因子β受体、核因子κB受体致活剂、核因子κB受体致活剂配体、4-1BB(分化簇137)、诱导性T细胞共刺激分子、OX-40(分化簇134)、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白、分化簇27、介白素-6受体、介白素-23受体、介白素-17受体、介白素-6、介白素-23、介白素-17、分化簇39、分化簇40、分化簇40L、分化簇47、分化簇73、CC趋化因子受体4、CC趋化因子受体5、趋化因子受体CXCR 4、介白素-12受体、分化簇4、介白素-2受体、分化簇25、分化簇3、糖蛋白120、表皮生长因子受体/人类表皮生长因子受体-1、表皮生长因子受体-2/人类表皮生长因子受体-2、表皮生长因子受体-3/人类表皮生长因子受体-3、表皮生长因子受体-4/人类表皮生长因子受体-4、表皮生长因子、转化生长因子α、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体-1、血管内皮生长因子受体-2或血管内皮生长因子受体-3中的一个或多个。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分子，该分子包括与“免疫调节部分”融合的靶向部分。如本文所用，“免疫调节部分”是指包含T淋巴细胞免疫受体、T细胞抑制受体(TCIR)、T细胞共抑制分子、T细胞的细胞外结构域(ECD)序列或其配体结合片段的多肽、共刺激分子、B淋巴细胞受体、DC受体、NK细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体、趋化因子受体或肿瘤细胞受体。在另一个方面，“免疫调节部分”特异性结合调节免疫系统的细胞因子、细胞因子受体、共刺激分子或共抑制分子。一方面，免疫调节部分是增加结合分子功能的激动剂。另一方面，免疫调节部分是抑制靶分子功能的拮抗剂。
在另一方面，所述免疫调节部分特异性地包含以下分子之一的胞外域或其配体结合片段：转化生长因子β受体II、程序性死亡受体-1蛋白、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、分化簇160、分化簇226、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、分化簇96、分化簇44、群落刺激因子1受体、CC趋化因子受体4、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、血管内皮生长因子受体、核因子κB受体致活剂、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1或T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂的细胞外配体结合序列或其配体结合片段。
在另一方面，免疫调节部分与靶向部分的C端融合。在另一方面，免疫调节部分与靶向部分的N端融合。一方面，融合分子由X-Fc-Y表示，其中X是靶向部分，Fc是免疫球蛋白Fc区，并且Y是免疫调节部分。在另一方面，融合分子由Y-Fc-X表示，其中X是靶向部分，并且Y是免疫调节部分。
如本文所用，术语“细胞外结构域”或“ECD”是指受体的一部分从细胞器和细胞的外膜突出到细胞外空间。ECD的多肽序列包括其氨基酸残基序列在本文中示出的多肽或肽的任何类似物或片段。
术语“类似物”包括任何多肽或肽或具有与本文具体显示的序列基本相同的氨基酸残基序列，其中一个或多个残基已经被功能相似的残基保守地取代并且显示出所述的活性在本文。保守取代的例子包括一个非极性(疏水)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)被另一个取代，一个极性(亲水)残基被另一个(例如精氨酸和赖氨酸之间)谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代。在甘氨酸和丝氨酸之间，一个碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸被另一个取代，或一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸被另一个取代。
术语“片段”是指氨基酸残基序列比本文公开的氨基酸残基序列的多肽短的氨基酸残基序列的任何主题多肽。
如本文所用，术语“配体结合片段”是指ECD的结合配体的部分或片段。在“配体结合片段”用于指分子本身被视为“配体”的部分或片段的情况下，“配体结合片段”是指所述分子的ECD的一部分或片段，其绑定其绑定伙伴。
抗体：在一个实施方案中，靶向部分或融合蛋白是免疫球蛋白。如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括天然或人工的单价或多价抗体，包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-Id)抗体(包括例如本发明抗体的anti-Id抗体)以及上述任何一个的表位结合片段。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即，包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如：IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
本文公开的抗体包括抗体片段，例如但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键-链接的Fv(sdfv)及包含VL或VH域的片段。在一个实施方案中，靶向部分是抗体或scFv。
抗原结合抗体片段，包括单链抗体，可以单独或与以下的全部或一部分组合地包含可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。抗原结合片段也可以包括可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。还包括Fc片段、抗原-Fc融合蛋白和Fc靶向部分。抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。一方面，抗体是人的，鼠的(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡或来自人。此外，这种抗体可以是抗体的人源化形式。抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更大的多特异性。
本文的抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrison等人(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，81：6851-6855)。本文中的目的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，所述抗体包括衍生自非人灵长类(例如，旧世界猴、Ape等等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
已经采用了多种方法来产生抗体。杂交瘤技术是指产生单一类型抗体的克隆细胞系，它使用各种物种的细胞，包括小鼠(鼠)，仓鼠，大鼠和人类。制备抗体的另一种方法是使用基因工程，包括重组DNA技术。例如，由这些技术制备的抗体尤其包括嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体结合了来自一种以上物种的DNA编码区。例如，嵌合抗体可以来自小鼠的可变区和来自人的恒定区。人源化抗体主要来自人类，即使它包含非人类部分。像嵌合抗体一样，人源化抗体可以包含完整的人恒定区。但是与嵌合抗体不同，可变区可以部分来源于人。人源化抗体的非人类合成部分通常来自鼠抗体中的CDR。无论如何，这些区域对于允许抗体识别并结合特定抗原至关重要。
在一个实施方案中，可以使用本领域中充分描述的重组DNA方法来合成本发明的分子。合成了用于抗体重链的cDNA和用于抗体轻链的cDNA，随后在哺乳动物启动子和聚腺苷酸化信号的控制下将其克隆到单独的质粒中。在大肠杆菌中扩增质粒DNA，并使用阴离子交换试剂盒纯化DNA以制备低内毒素质粒DNA。通过测量在260nm波长下的吸收来确定DNA浓度。序列的正确性通过Sanger测序验证(每个质粒最多进行两个测序反应，具体取决于cDNA的大小。)随后将重链和轻链的质粒DNA共转染到适应悬浮液的CHO K1细胞中(最初接受(来自ATCC)，并适合在evitria的悬浮培养中无血清生长。在一个实施方案中，杂交瘤可产生包含靶向部分和免疫调节部分的靶向融合蛋白。
在一个实施方案中，将包含抗体、抗体片段或多肽的靶向部分连接或融合至由多肽组成的免疫调节部分，具有连接体或不具有连接体。连接体可以是氨基酸连接体。在一个实施方案中，接头是(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8。例如，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)。在另一个实施方案中，接头是IEGRDMD(SEQ ID NO：5)。在各个方面，可以修饰连接体的长度以优靶部分的结合或免疫调节部分的功能。
在各个方面，免疫调节部分是与靶向抗体或含Fc的融合蛋白的重链的Fc区的C端融合的多肽。在另一方面，免疫调节部分是与靶向抗体的轻链的C端融合的多肽。在另一方面，融合蛋白包含X-Fc-Y序列，其中X是靶向多肽，而Y是免疫调节多肽。
抗体片段可以包括完整抗体的一部分，例如，抗体。包括其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2以及Fv片段；Fc片段或Fc融合产物；双体、线性抗体、单链抗体分子、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
完整的抗体是一种抗体，其包括抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体或任何其他修饰的Fc(例如糖基化或其他工程改造的Fc)。
完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区或任何其他修饰的Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用在一个实施方案中，靶向抗体或含Fc的融合蛋白促进抗原的聚焦或优先递送。细胞表面受体(例如，B细胞受体(BCR)的下调；以及抗原呈递细胞或树突状细胞的抗原交叉呈递。在另一方面，靶向抗体可诱导靶细胞死亡或使其对免疫细胞介导的细胞毒性敏感；在另一方面，Fc融合蛋白或抗体可促进免疫调节部分或抗体的递送。通过抗体结合的肿瘤靶标或两者兼有的免疫原性凋亡材料，通过其Fc与Fc受体之间的相互作用(在APC上)到达抗原呈递细胞(APC)。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将完整抗体分配给不同的“类别”。完整抗体有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，以及这些中的几个可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgC3、IgG4、IgA和IgA2。重链恒定域(对应于不同类别的抗体的帽子分别称为α、δ、ε、γ及μ。亚基结构和三不同种类的免疫球蛋白的尺寸构型是众所周知的。
在一方面，抗体特异性结合T细胞抑制受体(TCIR)、T细胞抑制受体配体(TCIR配体)、T细胞共抑制分子或T细胞共刺激分子。
T细胞的活化开始于在抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)被T细胞受体(TCR)识别抗原肽。T细胞活化的过程是通过诱导磷酸化，酶活化以及蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用的多种信号蛋白介导的。T细胞需要两个信号才能完全激活。通过T细胞受体(TCR)提供抗原特异性的第一信号，所述信号与抗原呈递细胞(APC)膜上的肽-MHC分子相互作用。第二信号，共刺激信号，是非抗原特异性的信号，由APC膜和T细胞膜上表达的共刺激分子之间的相互作用提供。T细胞共刺激是T细胞增殖，分化和存活所必需的。在没有共同刺激的情况下激活T细胞可能导致T细胞无反应、T细胞缺失或免疫耐受的发展。
由T细胞表达的最具特征的共刺激分子是CD28，其与APC膜上的CD80(B7.1)和CD86(B7.2)相互作用。T细胞表达的其他共刺激受体包括4-1BB(4-1BB配体受体)、ICOS(诱导型共刺激器)(ICOS-L受体)、OX40(OX40配体受体)、GITR(GITR配体受体)、CD27(与CD70作用)、CD40L/CD40，HVEM(与LIGHT作用)、CD226(与CD155作用)。
激活信号由称为共抑制受体的受体家族调节，所述受体包括CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、CEACAM-1、TIGIT、CD96、BTLA、CD160、VISTA、VSIG8、LAIR。共抑制受体通过利用诸如与反受体的胞外域竞争的机制以及通过使用诸如蛋白磷酸酶的细胞内介体来调节信号传导。共抑制受体可以充当阈值设定者、调节剂、检查点和反馈机制，可以微调T细胞免疫反应的质量和强度。
抑制T细胞功能的受体称为T细胞共抑制受体。抑制性受体减弱并抵消由刺激性受体引发的激活信号。T细胞功能的后续结果可能从暂时抑制到永久灭活和细胞死亡。TCR信号传导可以通过作用时间和/或靶分子不同的各种机制来控制。负调节机制已经到位，可在T细胞活化之前起作用以维持其静止状态。
大多数T细胞共抑制受体属于免疫球蛋白(Ig)超家族。一种机制涉及螯合共刺激受体的配体，使T细胞无法接收完全激活所必需的激活信号。第二种机制涉及通过构成某些抑制受体的细胞质尾部的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和/或基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)募集细胞内磷酸酶，从而使下游的信号分子磷酸化TCR和共刺激途径，导致激活诱导基因表达的数量减少。第三种机制涉及编码参与抑制免疫功能的蛋白质的基因的上调(或下调)。协同抑制受体可以使用上述以及可能还有其他尚未发现的机制的组合来调节T细胞信号转导。
共抑制性受体是跨膜糖蛋白，其主要通过与胞质结构域中磷酸化酪氨酸残基结合的细胞内磷酸酶传递显性负信号。协同抑制受体可以充当安全机制和阈值设置器，以通过抵消刺激信号来防止不受控制的有害的极端反应性。
可以掺入本文公开的分子，融合蛋白、组合物和方法中的抗体或其片段的实例包括但不限于抗体，例如曲妥珠单抗(抗HER2/neu抗体)；帕妥珠单抗(抗HER2 mAb)；西妥昔单抗(表皮生长因子受体EGFR的嵌合单克隆抗体)；帕尼单抗(抗EGFR抗体)；尼妥珠单抗(抗EGFR抗体)；扎芦木单抗(zalutumumab)(抗EGFR mAb)；耐昔妥珠单抗(抗EGFR mAb)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-447(人源化抗EGF受体双特异性抗体)；利妥昔单抗(嵌合鼠/人抗CD20 mAb)；奥比妥珠单抗(抗CD20 mAb)；奥法木单抗(抗CD20mAb)；Tositumumab-I131(抗CD20 mAb)；伊布利妥单抗tiuxetan(抗CD20mAb)；贝伐单抗(抗VEGF mAb)；雷米库单抗(抗VEGFR2 mAb)；雷尼单抗(抗VEGF mAb)；阿柏西普(与EGFR1 Fc融合的VEGFR1和VEGFR2的胞外域)；AMG386(与IgG1 Fc融合的血管生成素-1和-2结合肽)；达洛珠单抗(抗IGF-1R mAb)；吉妥单抗(抗CD33 mAb)；阿仑单抗(抗Campath-1/CD52 mAb)；本妥昔单抗(抗CD30 mAb)；卡妥索单抗(靶向上皮细胞粘附分子和CD3的双特异性mAb)；他那莫单抗(抗5T4 mAb)；吉瑞妥昔单抗(抗碳酸酐酶ix)；或Farletuzumab(抗叶酸受体)。其他实例包括抗体，例如PanorexTM(17-1A)(鼠单克隆抗体)；Panorex(@(17-1A)(嵌合鼠单克隆抗体)；BEC2(酰胺型独特抗体，模仿GD表位)(与BCG)；安可临单抗(Lym-1单克隆抗体)；SMART M195 Ab，人源化13'1LYM-1(Oncolym)，奥戈伏单抗(B43.13，抗独特型小鼠mAb)；与腺癌上的EGP40(17-1A)泛癌抗原结合的3622W94 mAb；Zenapax(SMART Anti-Tac(IL-2受体)；SMART M195 Ab，人源化Ab，人源化)；NovoMAb-G2(全癌特异性抗体)；TNT(组蛋白抗原嵌合单克隆抗体)；TNT(组蛋白抗原嵌合单克隆抗体)；Gliomab-H(单株-人源化Abs)；GNI-250Mab；EMD-72000(嵌合EGF拮抗剂)；LymphoCide(人源化IL.L.2抗体)；和MDX-260双特异性，靶向GD-2，ANA抗体，SMART IDIO抗体，SMART ABL 364抗体，ImmuRAIT-CEA，Zanulimumab(抗CD4 mAb)；凯利昔单抗(抗CD4 mAb)；伊匹木单抗(MDX-101；抗CTLA-4mAb)；曲米单抗(抗CTLA-4mAb)；达克珠单抗(抗CD25/IL-2R mAb)；巴利昔单抗(抗CD25/IL-2R mAb)；MDX-1106(抗PD1 mAb)；GITR抗体；GC1008(抗TGF-β抗体)；metelimumab/CAT-192(抗TGF-β抗体)；lerdelimumab/CAT-152(抗TGF-β抗体)；ID11(抗TGF-β抗体)；地诺单抗(抗RANKL单克隆抗体)；BMS-663513(人源化抗4-1BB mAb)；SGN-40(人源化抗CD40 mAb)；CP870893(人抗CD40 mAb)；英夫利昔单抗(嵌合抗TNF mAb；阿达木单抗(人类抗TNF mAb)；赛妥珠单抗(人源化Fab抗TNF)；戈利木单抗(抗TNF)；依那西普(Etanercept(与IgG1 Fc融合的TNFR的胞外结构域)；Belatacept(CTLA-4与Fc融合的胞外结构域)；Abatacept(CTLA-4与Fc融合的胞外域)；贝利木单抗(抗B淋巴细胞刺激物)；Muromonab-CD3(抗CD3 mAb)；奥昔珠单抗(抗CD3 mAb)；Teplizumab(抗CD3单克隆抗体)；托珠单抗(抗IL6R单克隆抗体)；REGN88(抗IL6R单克隆抗体)；乌斯妥单抗(抗IL-12/23单克隆抗体)；溴单抗(抗IL-12/23单克隆抗体)；纳他珠单抗(抗α4整联蛋白)；Vedolizumab(抗α4β7整联蛋白mAb)；T1h(抗CD6 mAb)；Epratuzumab(抗CD22 mAb)；Efalizumab(抗CD11a mAb)；Urelumab；Utomilumab(抗-41BB mAbs：激动剂)；BMS 986178(抗OX40 mAb：激动剂)；埃洛妥珠单抗(抗SLAM7/CS1 mAb)；Daratumumab(抗CD38 mAb)；古塞库单抗(抗IL23)；纳武利尤单抗(抗PD-1)；匹博利组单抗(抗PD)-1)；阿特珠单抗(抗PD-L1)；阿维单抗(抗PD-L1)；度伐鲁单抗(抗PD-L1)；Relatlimab，BMS-986016(抗LAG3mAb)；NKTR-214(CD-122激动剂mAb)。抗体的实例包括在US5736167、US7060808及US5821337中所公开的那些。
肽：在本发明的一些方面，靶向部分或免疫调节部分是肽或多肽。肽包括其氨基酸残基序列在本文中显示的肽的任何类似物，片段或化学衍生物。因此，本发明的肽可以经历各种变化、替代、插入和缺失，其中这种变化为其使用提供了某些优势。在这方面，本发明的肽对应于而不是等同于所述肽的序列，其中进行了一个或多个改变，并且其保留了在一种或多种测定中用作未修饰的肽的功能。
如本文所用，“肿瘤靶向肽”包括含有少于100个氨基酸的聚合物，其中所述聚合物特异性结合肿瘤细胞的细胞组分，肿瘤脉管系统和/或肿瘤微环境的组分。
本发明的肽可以通过“多肽领域”技术人员已知的任何技术合成，包括重组DNA技术。优选合成化学技术，例如固相Merrifield型合成，因为其纯度、抗原特异性不受不希望的副产物的影响，且易于生产等等。许多可用技术的出色总结，请参见：Steward等人的“固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)”*W.H.Freeman Co.，旧金山，1969年；Bodanszky等人的，“肽合成(Peptide Synthesis)”，John Wiley&Sons，第二版，1976年；J.Meienhofer的，“激素蛋白和肽(Hormonal Proteins and Peptides)”，卷2、页46，Academic Press(纽约)，1983年；Merrifield,Adv，酶(Enzymol)，32：221-96，1969；Fields等人，Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214,1990；美国专利第4,244,946号关于固相肽合成；以及Schroder等人，“肽(The Peptides)”，Vol.1，Academic Press(纽约)，1965年，经典解法合成(classical solution synthesis)。在上述文本及J.F.W.McOmie，“有机化学中的保护基(Protective Groups in Organic Chemistry)”，Plenum Press，纽约，1973年，中描述了可用于这种合成的合适的保护基。
在一个方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β或VEGF，以及所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一具体方面，所述免疫调节部分包含TIM-3的CEACAM1结合片段。在另一方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β或VEGF，以及所述免疫调节部分包含CD226的ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述配体结合片段包含CD155或CD112结合片段。在另一方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β或VEGF，并且所述免疫调节部分包括CD44的ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β或VEGF，以及所述免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β或VEGF，并且免疫调节部分包含VSIG8的ECD或其配体结合片段。在一方面，所述配体结合片段包含VISTA结合片段。在某些方面，所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β或VEGF，并且所述免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。
在一方面，所述分子包含对应于SEQ ID NO：10及145、11及146、12及147、13及148、14及149、15及150、16及151、17及152、18及153、19及154、20及155、21及156、22及157、23及158、24及159、25及160、26及161、27及162、28及163、29及164、30及165、31及166、32及167、33及168、34及169、35及170、37及171、38及172、39及173、40及174、41及175、42及176、43及177、44及178、45及179、46及180、47及181、48及182、49及183、50及184、51及185、52及186、53及187、58及188、59及189、60及61、62及63、64及65、66及67、68及69、70及71、72及73、74及75、76及77、78及79、80及81、82及83、84及85、86及87、88及89、90及91、92及93、94及95、96及97、98及99、100及101、102及103、104及105、106及107、108及109、110及111、112及113、114及115、116及117、118及119、120及121、122及123、124及125、126及127、128及129、130及131、132及133、134及135、136及137、138及139、140及141、142及143、192及193、209及210、211及212、221及222、223及224、233及234、235及236、245及246、247及248、257及258、259及260、269及270、271及272、275及276、279及280、283及284、287及288、290及291、292及293、294及295、296及297，或298及299所示的序列。
在某些方面，所述靶向部分包含结合PD-1或PD-L1的一抗体，并且所述免疫调节部分包含Tim-3的ECD或其配体结合片段及/或包含SEQ ID NO：51、52、53或192所示的序列。在一个方面，所述靶向部分包含结合CTLA-4的一抗体，而所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一具体方面，所述分子包含SEQ ID NO：50所示的序列。在另一个方面，所述靶向部分包含结合LAG-3的一抗体，并且所述免疫调节部分是TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：26所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合VISTA的一抗体，而所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述分子包含SEQ ID NO：12所示的序列。在一个方面，所述靶向部分包含结合TIGIT的一抗体，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一具体方面，所述分子包含SEQ ID NO：17所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合BTLA的一抗体，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述分子包含SEQ ID NO：22所示的序列。在一方面，所述靶向部分包含与CCR-4结合的一抗体，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：31所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合4 1BB的一抗体，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一具体方面，所述分子包含SEQ ID NO：116所示的序列。在一个方面，所述靶向部分包含结合VEGF的一抗体，并且所述免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述分子包含SEQ ID NO：88所示的序列。
另一方面，所述免疫调节部分包含BTLA或LIGHT的ECD或其配体结合片段，而所述配体结合片段包括HVEM(CD 270)结合片段。在另一方面，所述免疫调节部分包含CCR4的ECD或其配体结合片段，并且所述配体结合片段包括CCL22结合片段。
在另一方面，所述免疫调节部分包含CD160的ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述免疫调节部分包含SEQ ID NO：300所示的序列。
在另一方面，所述免疫调节部分包含LAIR1的ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述免疫调节部分包含SEQ ID NO：307所示的序列。
在一另一个实施方案中，本发明提供了一种分子，所述分子包含一靶向部分、一第一免疫调节部分以及一第二免疫调节部分，其中所述靶向部分包含一多肽，所述多肽特异性地结合于CTLA-4(CD152)、PD-1、PD-L1、VISTA、BTLA、TIGIT、LAG-3、4-1BB配体(CD137)、OX-40(CD134)、GITR、RANKL、TGF-β、IL6R、EGFR、HER2或VEGF、所述第一免疫调节部分包含TGFβRII、PD-1、TIM-3、BTLA、CD226、TIGIT、CD44、CSF1R、CCR4、KIR、VEGFR、RANK、VSIG8、LIGHT、TNFSF14或VISTA、以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII、PD-1、TIM-3、BTLA、CD226、TIGIT、CD44、CSF1R、CCR4、KIR、VEGFR、RANK、VSIG8、LIGHT(TNFSF14)或VISTA。
在一个方面，所述靶向部分的多肽包含一免疫球蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单链可变片段、二价单链可变片段、多价单链可变片段、自一受体的所述细胞外结构域的一配体结合序列或含有可结晶片段多肽的一抗原结合结构域。在某些方面，所述多肽是一抗体。
在另一方面，所述第一免疫调节部分连接至所述抗体的重链或轻链的C端、所述第二免疫调节部分连接至抗体的重链或轻链的C端，及/或所述第二免疫调节部分连接至所述第一免疫调节部分。
在另一方面，所述第一及所述第二免疫调节部分通过一连接体连接至所述抗体的重链或轻链，及/或所述第二免疫调节部分通过一连接体连接至所述第一免疫调节部分。在某些方面，所述连接体具有SEQ ID NO 3所示的序列。
在一方面，所述第一免疫调节部分连接至所述抗体的重链，所述第二免疫调节部分连接至所述抗体的轻链。
在某些方面，所述第一免疫调节部分包含TIM3的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段、所述第一免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段、所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段、及/或所述第一免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段。在另一方面，所述靶向部分特异性地结合IL6R、CTLA-4、PD-1、PD-L1、EGFR、HER2、VEGF或gp120。
在一个方面，所述靶向部分包括结合CTLA-4的一多肽，所述第一免疫调节部分包括PD-1的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包括TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：201以及SEQ ID NO：202所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合CTLA-4的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：205以及SEQ ID NO：206所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：207以及SEQ ID NO：208所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合CTLA-4的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ IDNO：203以及SEQ ID NO：204所示的序列。在另一方面，所述靶向部分的多肽包括伊匹单抗。在另一方面，所述抗体包含曲美木单抗。
在一个方面，所述靶向部分包含结合PD-1或PD-L1的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：273及SEQ ID NO：274所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：277以及SEQ ID NO：278所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：285以及SEQ ID NO：286所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ IDNO：281以及SEQ ID NO：282所示的序列。另一方面，所述靶向部分的多肽包括纳武单抗或帕博利珠单抗。在另一方面，所述抗体包含阿特珠单抗、阿维单抗或度伐鲁单抗。
在一个方面，所述靶向部分包含结合IL-6R的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：213及SEQ ID NO：214所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合IL-6R的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：217以及SEQ ID NO：218所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：219以及SEQ ID NO：220所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合IL-6R的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：215及SEQ ID NO：216所示的序列。另一方面，所述靶向部分的多肽包含结合IL-6R的一抗体。在另一方面，所述抗体包含托珠单抗。
在一个方面，所述靶向部分包含结合VEGF的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，并且所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：250所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合VEGF的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：253及SEQ ID NO：254所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQID NO：255及SEQ ID NO：256所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合VEGF的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：251及SEQ ID NO：252所示的序列。另一方面，所述靶向部分的多肽包含贝伐单抗。在另一方面，所述靶向部分包含VEGFR的配体结合细胞外结构域。在另一方面，所述靶向部分包含阿柏西普。
在一个方面，所述靶向部分包含结合EGFR的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：226所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合EGFR的多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：229和SEQ ID NO：230所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：231和SEQ ID NO：232所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合EGFR的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：227和SEQ ID NO：228所示的序列。另一方面，所述靶向部分的多肽包括西妥昔单抗、帕尼单抗或耐昔妥珠单抗。
在一个方面，所述靶向部分包括结合HER2/Neu的一多肽，所述第一免疫调节部分包括PD-1的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包括TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：238所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合HER2的一多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：243和SEQ ID NO：244所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ IDNO：241和SEQ ID NO：242所示的序列。另一方面，所述靶向部分包含结合HER2的一多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：239和SEQ ID NO：240所示的序列。另一方面，所述靶向部分多肽包括曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。
在一个方面，所述靶向部分包含结合HIV gp120的多肽，所述第一免疫调节部分包含PD-1的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：261和SEQ ID NO：262所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包括结合gp120的多肽，所述第一免疫调节部分包括PD-1的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：265和SEQ ID NO：266所示的序列。在一个方面，所述分子包含SEQ IDNO：267和SEQ ID NO：268所示的序列。在另一方面，所述靶向部分包含结合gp120的多肽，所述第一免疫调节部分包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，所述第二免疫调节部分包含TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述分子包含SEQ ID NO：263和SEQID NO：264所示的序列。另一方面，所述靶向部分多肽包括曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。
在一方面，所述分子包含SEQ ID NO：201及202、203及204、205及206、207及208、213及214、215及216、217及218、219及220、225及226、227及228、229及230、231及232、237及238、239及240、241及242、243及244、249及250、251及252、253及254、255及256、261及262、263及264、265及266、267及268、273及274、277及278、281及282、或285及286所示的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其包含TIM-3的ECD或其配体结合片段，以及TGFRβII、PD-1、BTLA、LIGHT、CD226或VSIG8的ECD或其配体结合片段。在一个方面，所述融合蛋白包含TIM-3的ECD或其配体结合片段以及TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO：190所示的序列。在另一方面，所述融合蛋白包含TIM-3的ECD或其配体结合片段以及PD-1的ECD或其配体结合片段。在特定方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：195、196或197所示的序列。在另一方面，所述融合蛋白包含Fc。
术语“融合分子”及“融合蛋白”可互换使用，并且是指具有或没有其他效应子分子的生物活性多肽，通常是通过重组体、化学或其他合适的方法共价连接(即：融接)的蛋白质或肽序列。如果需要，融合分子可以在一个或几个位置包含肽连接体序列。可选地，肽连接体可用于辅助融合分子的构建。特别优选的融合分子是融合蛋白。通常，融合分子还可以包括缀合物分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其包含TIM-3的ECD或其配体结合片段以及TGFRβII、PD-1、BTLA、LIGHT、CD226或VSIG8的ECD或其配体结合片段。在一个方面，融合蛋白包含TIM-3的ECD或其配体结合片段以及TGFβRII的ECD或其配体结合片段。在某些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：190所示的序列。在另一方面，所述融合蛋白包含TIM-3的ECD或其配体结合片段以及PD-1的ECD或其配体结合片段。在特定方面，融合蛋白包含SEQ ID NO：195、196或197所示的序列。在另一方面，融合蛋白包含Fc。
在另一个实施方案中，本发明提供了含有Fc的多肽与TIM-3的ECD或其配体结合片段的融合蛋白，其中TIM-3ECD特异性地融接至含有Fc多肽的C端。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，其包括免疫球蛋白Fc和TIM-3的ECD或其配体结合片段的融合蛋白，以及结合PD-1或PD-L1的抗体。在一个方面，所述融合蛋白的结构为(N端)Fc-TIM3(C端)的形式。在另一方面，所述融合蛋白的结构为(N端)TIM3-Fc(C端)的形式。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以例如与抗体-配体捕获剂组合使用。例如，在US8993524、US9441044以及US9850306中公开的抗体-配体捕获剂可以与本发明的组合物组合使用。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含前述分子或融合蛋白以及药学上可接受的载体的组合物。
“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有癌症或一传染病的一受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用先前描述的分子、融合蛋白或组合物。
术语“治疗”在本文中与术语“治疗方法”可互换使用，并且是指以下两者：(1)治愈、减慢、减轻所诊断的病理状况的症状或者疾病，及/或中止所诊断的病理状况的症状或者疾病的进展的治疗方法或措施、以及(2)以及预防法/预防措施。需要治疗的人可能包括已经患有特定医学疾病的个体以及最终可能患有疾病的个体(即，需要预防措施的个体)。
术语“的施用(administration of)”及/或“施用(administering)”应理解为是指向需要治疗的受试者提供治疗有效量的药物组合物。给药途径可以是肠内、局部或肠胃外给药。因此，施用途径包括但不限于皮内、皮下、静脉内、腹腔内、动脉内、鞘内、包膜内、眼窝内、心内、真皮内、经皮、经气管、表皮层下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊椎内、胸骨内、口腔、舌下颊、直肠、阴道、鼻腔或眼部给予而被施用，以及输注、吸入或雾化。本文所用的术语“肠胃外施用”及“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式。本文所用的术语“肠胃外施用(parenteral administration)”及“肠胃外施用(administeredparenterally)”是指除肠内及局部施用以外的施用方式。
术语“治疗有效量(therapeutically effective amount)”、“有效剂量(effective dose)”、“治疗有效量(therapeutically effective dose)”、“有效量(effective amount)”等是指引起组织、系统、动物、人类的生物学或医学反应的目标化合物的量，其为研究人员、兽医、医生或其他临床医生所正在寻找的量。通常，反应是患者症状的减轻或期望的生物学结果。有效量可以如本文所述确定。
如本文所用，术语“受试者”是指对其执行目标方法的任何个体或患者。通常，受试者是人类，尽管本领域技术人员将理解，受试者可以是动物。因此，其他动物，包括脊椎动物，例如啮齿动物(包括老鼠、大鼠、仓鼠及豚鼠)、猫、狗、兔子、农场动物，包括牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡等等，以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩及大猩猩)包含在标的的定义中。
术语“癌症”是指一组疾病，其特征在于从一个部位(原发部位)开始的异常及不受控制的细胞增殖，并可能侵入并扩散到其他部位(次要部位、转移灶)，从而将癌症与良性肿瘤区分开。几乎所有器官都可能受到影响，导致可能影响人类的100多种癌症。癌症可由多种原因引起，包括遗传易感性、病毒感染、暴露于电离辐射、暴露于环境污染物、使用烟草及/或酒精、肥胖症、饮食不佳、缺乏体育锻炼或其任何组合。
如本文中所使用的，“肿瘤(neoplasm)”或“肿瘤(tumor)”包括其语法变化，意指组织出现新的异常生长，可能是良性或癌性的。在相关方面，所述肿瘤(neoplasm)指示肿瘤(neoplasm)疾病或病症，包括但不限于各种癌症。例如，此类癌症可包括前列腺癌、胰腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、肾癌、肺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌及头颈癌、黑色素瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等等。
美国国家癌症研究所描述的示例性癌症包括：急性淋巴细胞白血病，成人、急性淋巴性白血病，儿童、急性骨髓性白血病，成人、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质癌，儿童、艾滋病相关淋巴瘤、与艾滋病有关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤，儿童小脑、星形细胞瘤，儿童大脑、肝外胆管癌、膀胱癌、膀胱癌，儿童、骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤，儿童、脑肿瘤，成人、脑肿瘤，脑干胶质瘤，儿童、脑肿瘤，小脑星形细胞瘤，儿童、脑肿瘤，大脑星形细胞瘤/恶性脑胶质瘤，儿童、脑肿瘤，室管膜瘤，儿童、脑肿瘤，髓母细胞瘤，儿童、脑肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童、脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤，儿童、脑肿瘤，儿童(其他)、乳癌、乳癌及妊娠、乳癌，儿童、乳癌，男性、支气管腺瘤/类癌，儿童：类癌，儿童、类癌，胃肠道、肾上腺皮质癌、胰岛细胞癌、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤，原发、小脑星形细胞瘤，儿童、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，儿童、子宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、腱鞘透明细胞肉瘤、结肠癌、大肠癌，儿童、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤，儿童、卵巢上皮癌、食道癌、食道癌，儿童、尤文氏肿瘤家族、颅外生殖细胞肿瘤，儿童、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌，眼内黑色素瘤、眼癌，视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃癌，儿童、胃肠道类癌、生殖细胞肿瘤，颅外，儿童、生殖细胞肿瘤，性腺外、生殖细胞肿瘤，卵巢、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤，儿童脑干、神经胶质瘤，儿童的视觉通路及下丘脑、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌，成人(原发)、肝细胞(肝)癌，儿童(原发)、霍奇金(Hodgkin's)淋巴瘤，成人、霍奇金淋巴瘤，儿童、霍奇金淋巴瘤，怀孕期间、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、喉癌，儿童、急性淋巴细胞性白血病，成人、急性淋巴细胞性白血病，儿童、急性髓样白血病，成人、急性髓样白血病，儿童、慢性淋巴白血病、慢性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、唇及口腔癌、肝癌，成人(原发)、肝癌，儿童(原发)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴细胞性白血病，成人，急性、淋巴细胞性白血病，儿童，急性、慢性淋巴细胞性白血病、与艾滋病相关的淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，成人、霍奇金氏淋巴瘤，儿童、霍奇金淋巴瘤，妊娠期间、非霍奇金淋巴瘤，成人、非霍奇金淋巴瘤，儿童、非霍奇金淋巴瘤，妊娠期间、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(Macroglobulinemia,Waldenstrom's)、男性乳癌、恶性间皮瘤，成人、恶性间皮瘤，儿童、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤，儿童、黑色素瘤、黑色素瘤，眼内、默克(Merkel)细胞癌、间皮瘤，恶性、原发性隐匿转移性颈部鳞状癌、多发性内分泌瘤形成综合症，儿童、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病，慢性、骨髓性白血病，儿童，急性、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生异常、鼻腔及鼻旁窦癌、鼻咽癌、鼻咽癌，儿童、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤，成人、非霍奇金淋巴瘤，儿童、非霍奇金淋巴瘤，怀孕期间、非小细胞肺癌、口腔癌，儿童、口腔及唇癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌，儿童、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰腺癌，儿童、胰腺癌，胰岛细胞、鼻旁窦及鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、松果及幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠及乳癌、妊娠及霍奇金淋巴瘤、妊娠及非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌，成人、原发性肝癌，儿童、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌，儿童、肾盂及输尿管，移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤，儿童、唾液腺癌、唾液腺癌，儿童、肉瘤，尤文氏肿瘤家族、肉瘤，卡波西肉瘤、肉瘤，骨头的骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤、肉瘤，横纹肌肉瘤，儿童、肉瘤，软组织，成人、肉瘤，软组织，儿童、塞扎里综合症(Sezarysyndrome)、皮肤癌、皮肤癌，儿童、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌，默克细胞、小细胞肺癌、小肠癌、成人软组织肉瘤、软组织肉瘤，儿童期、原发性隐匿转移性颈部鳞状癌、胃癌、胃癌，儿童、上腔原始神经外胚层肿瘤，儿童、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤，儿童、胸腺瘤，恶性、甲状腺癌、甲状腺癌，儿童、肾盂及输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤，妊娠、未知的原发部位，儿童的癌症、不寻常的儿童的癌症、输尿管及肾盂，移行细胞癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路及下丘脑胶质瘤，儿童、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、以及威尔姆氏肿瘤(Wilms Tumor)。
如本文所用，术语“传染病”是指由传染引起的疾病。传染是指致病因子对生物体的身体组织的侵入，它们的繁殖以及宿主组织对传染原及其产生的毒素的反应。传染原包括病毒、类病毒、朊毒体、细菌、线虫(例如：寄生线虫及蛲虫)、节肢动物(例如：蜱虫、螨虫、跳蚤及虱子)、真菌(例如：癣菌)以及其他大寄生虫(例如：绦虫及其他蠕虫)。短期传染是急性传染，因此，如本文所用，“慢性传染”是指长期传染或持续传染。
传染病包括：急性弛缓性脊髓炎、边虫病、炭疽病、巴贝氏虫症、肉毒杆菌中毒、布氏杆菌病、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽)、类鼻疽伯克氏菌(类鼻疽)、弯曲杆菌症(弯曲菌属)、抗碳青霉烯类感染(抗碳青霉烯类肠道菌(Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)/抗碳青霉烯类的绿脓杆菌(Carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA)、软性下疳、基孔肯雅热病毒感染、披衣菌、雪卡鱼毒素(Ciguatera)、艰难梭菌感染、产气荚膜梭菌(ε毒素)、球霉菌真菌感染(溪谷热)、克雅二氏病，传染性海绵状脑病、隐孢子虫病、环孢子虫病、登革热1、2、3、4、白喉、大肠杆菌感染、东部马脑炎、埃博拉出血热、艾利希氏体症(Ehrlichiosis)、脑炎、节足动物携带性病毒或副传染性病、肠道病毒感染，非小儿麻痹症(非小儿麻痹症肠病毒)、肠道病毒感染、D68(肠病毒D68型)、贾第氏滴虫感染症(贾第鞭毛虫)、淋球菌感染(淋病)、腹股沟肉芽肿、流感嗜血杆菌症、B型(B型流行性感冒嗜血杆菌或血凝素-流感)、汉坦病毒肺综合征、溶血性尿毒症综合征、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、疱疹、带状疱疹、水痘带状疱疹病毒、组织胞浆菌病感染(组织胞浆菌病)、人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征、人类乳头瘤病毒、流感、铅中毒、军团病、麻风病(汉森病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病(李斯特菌)、莱姆病、性病性淋巴肉芽肿感染、疟疾、麻疹、脑膜炎、病毒(脑膜炎，病毒)、脑脊髓膜炎、细菌(脑膜炎，细菌)、中东呼吸综合症冠状病毒、腮腺炎、诺如病毒、麻痹性贝毒(麻痹性贝毒，雪卡鱼毒素(Ciguatera))、虱病(虱子、头虱及体虱)、骨盆腔炎、百日咳、瘟疫、鼠疫、败血症，肺炎(瘟疫)、肺炎球菌病(肺炎)、脊髓灰质炎、波瓦桑(Powassan)、牛皮癣、虱(蟹，阴虱侵扰)、脓疱性疾病(小痘、猴痘、牛痘)、Q型热、狂犬病、蓖麻毒素中毒、立克次病(落基山斑热)、风疹，包括先天性风疹(德国麻疹)、沙门氏菌胃肠炎、疥疮侵扰、鲭鱼、严重急性呼吸系统综合症、志贺氏菌肠胃炎(志贺菌)、天花、葡萄球菌感染，耐甲氧西林、葡萄球菌食物中毒、B型肠毒素中毒(葡萄球菌性食物中毒)、葡萄球菌感染、万古霉素中间体、葡萄球菌感染、抗万古霉素、链球菌病，A组(侵入性)(链球菌A)、链球菌病，B组(链球菌B)、链球菌中毒性休克综合症、毒性休克、梅毒，原发性、继发性、早期潜伏、晚期潜伏、先天性、破伤风感染，破伤风、旋毛虫感染(旋毛虫病)、结核病、结核病(潜伏)、兔热病、伤寒，D组、斑疹伤寒、阴道病，细菌(酵母菌感染)、水痘、霍乱弧菌(霍乱)、弧菌病(弧菌)、病毒性出血热(埃博拉、拉萨、马尔堡)、西尼罗河病毒、黄热病、耶尔辛氏菌病(耶尔辛氏菌属)、寨卡病毒感染、不动杆菌感染、放线菌病、非洲昏睡病(非洲锥虫病)、阿米巴症、边虫病、海兽胃线虫症、溶血弧菌感染、阿根廷Teagan发烧(Argentine Teagan fever)、蛔虫病、曲霉病、星状病毒感染、蜡状芽孢杆菌感染、细菌性肺炎、细菌性阴道病、小袋纤毛虫病、巴氏杆菌病、贝蛔虫(Baylisascaris)感染、BK病毒感染、黑毛症、Blastocystosis、玻利维亚出血热、巴西出血热、鼠疫、布如里氏溃疡、杯状病毒感染、弯曲菌病、念珠菌病、毛细血管病肠道疾病、卡里翁病(Carrion's Disease)，细菌性巴东体、猫抓病(Cat Scratch Disease)，韩瑟勒巴通氏菌(Bartonella henselae)、蜂窝组织炎，一般、恰加斯病(美国锥虫病)、软性下疳、水痘、肺炎衣原体感染、色母细胞病、霉菌病、支气管扩张、克罗拉多壁虱热、普通感冒、克里米亚-刚果出血热、隐孢子虫病、皮肤幼虫移行、环孢子虫病、囊虫病、巨细胞病毒感染、Desmodesmus感染、双核阿米巴症(Dientamoebiasis)、白喉、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、棘球蚴病、犬艾利希体症(Ehrlichiosis)、蛲虫感染、肠球菌感染、肠道病毒感染、流行性斑疹伤寒立克次体、感染性红斑(第五病)、幼儿急疹(第六病)、片吸虫症、姜片虫病、致命性家族性失眠症、象皮病、自由生活阿米巴原虫感染多重、梭状杆菌感染、气性坏疽(梭菌肌坏死)、吉斯曼-史特斯勤-先克症候群(Gerstmann-
Figure BDA0002378535940000871
-Scheinker syndrome,GSS)、贾第虫病、马鼻疽、鼻角虫病、腹股沟肉芽肿、链球菌感染、流感嗜血杆菌感染、手足口病、汉坦病毒肺综合症、辛诺贝病毒(Sin Nombre virus)、心脏病毒病，心脏病毒、幽门螺杆菌感染、溶血尿毒症综合征、肾综合征出血热、组织胞浆菌病、钩虫感染、人博卡病毒感染、人埃利希病(Humanewingii)、人粒细胞无形体病、人类偏肺病毒(Human metapneumovirus)感染、人单核球艾利希氏体症(human monocytic ehrlichiosis,HME)、人类乳头瘤病毒感染、人副流感病毒感染、血膜增生、爱泼斯坦-巴尔病毒传染性单核细胞增多症、流行性感冒、等孢球虫病、川崎病、角膜炎多发、金格杆菌(Kingella Kingae)感染、库鲁病，朊蛋白基因(Prion proteingene,PRNP)、拉萨热、军团病(庞帝亚克热)、利什曼病、麻风、钩端螺旋体病，钩端螺旋体、淋巴丝虫病、淋巴细胞脉络膜脑膜炎、中东呼吸综合征、类鼻疽、脑膜炎多发、脑膜炎球菌病、横川吸虫症(Metagonimiasis)、微胞子虫症、传染性软疣、猴痘、腮腺炎、鼠伤寒(地方性斑疹伤寒)、支原体肺炎、足菌病、寄生虫病、新生儿结膜炎、诺如病毒(儿童和婴儿)、土壤丝菌病、蟠尾丝虫症、气胸病、副球孢子菌病(南美芽生菌病)、肺吸虫病、巴氏杆菌病、头虱病(头虱)、体虱、耻骨病(公共虱，蟹虱)、盆腔炎、百日咳、肺炎球菌感染、瘟疫、肺炎链球菌感染、肺囊虫肺炎(PCP)、肺炎多发、脊髓灰质炎、小肠杆菌感染、原发性阿米巴脑膜脑炎、进行性多灶性白质脑病、牛皮癣、Q型流感、狂犬病、回归热、呼吸道合胞病毒感染呼吸道合胞病毒、鼻孢子虫病、鼻病毒感染、立克次体感染、立克次体痘、裂谷热(RVF)、落矶山斑点热、轮状病毒感染、风疹、沙门氏菌病、严重急性呼吸系统综合症、疥疮、猩红热AS组、败血症多发、志贺氏菌病(杆菌性痢疾)、带状疱疹(带状疱疹)、天花、孢子丝菌、葡萄球菌食物中毒、葡萄球菌感染、圆线虫病、梅毒、条虫病、破伤风(Lockjaw)、须癣、头癣、体癣、股癣、手癣、黑癣、足癣、甲癣、汗斑、弓形虫病(眼幼虫移行症)、弓形虫病(内脏幼虫移行症)、弓形虫病、沙眼、旋毛虫病、毛滴虫病、滴虫病(鞭虫感染)、结核、兔热病、伤寒、斑疹伤寒、解脲脲原体感染、谷热、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、创伤弧菌感染、副溶血性弧菌、病毒性肺炎、西尼罗河热、白秃疮(Tinea blanca)、假结核耶尔森氏菌感染、耶尔辛氏菌症、接合霉菌感染症。
在某些方面，施用可以与一种或多种其他治疗剂组合。术语“组合疗法”，“与......组合”等是指同时使用一种以上药物或治疗以增加反应。本发明的组合物可以例如与其他药物或治疗例如免疫疗法或化学疗法联合使用。可以在施用本发明的组合物之前，同时或之后施用此类疗法。
如本文所用、术语“化学治疗剂”是指用于治疗癌症的任何治疗剂。化学治疗剂的实例包括但不限于放线菌素、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、氯丁酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、欧洲紫杉醇、去氧氟尿甙、阿霉素、泛艾霉素、埃博霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、艾达霉素、伊马替尼、伊立替康、甲氧乙胺、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷(Teniposid)、硫鸟嘌呤、托泊替康、缬沙星(Valrubicin)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、温诺平(Vinorelbine)、帕尼单抗、西妥昔单抗、马妥珠单抗、IMC-IIF 8、TheraCIM hR3、地诺单抗、贝伐单抗、阿达木单抗、曲妥珠单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、帕利珠单抗、吉妥单抗、依法利珠单抗、那他珠单抗、达利珠单抗、法索单抗(99mTc)、托珠单抗、卡罗单抗喷地肽、托西莫单抗、替伊莫单抗(与钇90共轭)、Xolair(奥马珠单抗)、利妥昔单抗、阿昔单抗、阿列单抗、巴利昔单抗、硫索单抗(LeukoScan/sulesomab)、阿西莫单抗、巯诺莫单抗、依决洛单抗、阿仑单抗、赛妥珠单抗(CDP 870)、那他珠单抗(Gilotrif/afatinib)、奥拉帕利(Lynparza/olaparib)、帕妥珠单抗、纳武利尤单抗、博舒替尼(Bosulif/bosutin)、卡博替尼(Cabometyx/cabozantinib)、曲妥珠单抗-dkst(trastuzumab-dkst/Ogivri)、苹果酸舒尼替尼(Sutent/sunitinibmalate)、本妥昔单抗(Adcetris/brentuximab vedotin)、安立适(Alecensa/alectinib)、阿卡替尼(Calquence/acalabrutinib)、Yescarta(ciloleucel)、玻玛西林(Verzenio/abemaciclib)、帕博利珠单抗、来那替尼(Nerlynx/neratinib)、度伐鲁单抗、达雷木单抗、阿特珠单抗及厄洛替尼。免疫治疗剂的实例包括但不限于介白素(II-2、II-7、II-12)、细胞因子(干扰素、G-CSF、咪喹莫特)、趋化因子(CCL3、CCl26、CXCL7)、免疫调节酰亚胺药物(沙利度胺及其类似物)。
抗生素的实例包括但不限于阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、大观霉素、格尔德霉素、除草霉素、利福昔明、氯碳头孢、厄他培南、多立培南、亚胺培南/西拉他汀、美罗培南、头孢氨苄、头孢唑林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢曲唑、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢替丁、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢比普利、替考拉宁、万古霉素、特拉万星、达巴万星、奥利万星、林可酰胺、克林霉素、林可霉素、脂肽、达托霉素、大环内酯类、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素、单环菌素(Monobactams)、安曲南、硝基呋喃、呋喃唑酮、呋喃妥因、恶唑烷酮、利奈唑胺、泼斯唑来、雷得唑来、托瑞唑利特、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、阿奇洛林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、纳夫西林、奥沙西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、青霉素组合、阿莫西林/克拉维酸盐、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸盐、多肽、杆菌肽、粘杆菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、纳地沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格雷帕沙星、司帕沙星、特氟沙星、磺酰胺、马芬尼、磺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲唑、磺胺甲恶唑、磺胺类、柳氮磺吡啶、磺胺异恶唑、甲氧苄啶-磺胺甲基恶唑、磺酰胺基甲啶、四环素、去甲环素、强力霉素、甲环素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、霉素、阿糖胞苷、乙胺丁醇、乙酰胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷丁、链霉素阿斯帕明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、板霉素、奎奴普丁/达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑和甲氧苄氨嘧啶。
在另一个实施方案中，本发明提供了诱导或促进免疫耐受的方法。所术方法包括向有此需要的受试者施用一个或多个本发明的分子。
提供以下实施例以进一步说明本发明的实施方案，但不旨在限制本发明的范围。尽管它们是可能使用的典型方法，但也可以使用本领域技术人员已知的其他过程、方法或技术。
实施例
尽管针对程序性死亡1(PD-1)的抗体具有令人信服的抗肿瘤活性：程序性死亡配体1(PD-L1)免疫检查点，经常观察到对这些疗法的从头及适应性耐药。靶向PD-1/PD-L1途径可能不足以打破耗竭的T细胞的功能障碍，因为PD-1与其他检查点抑制剂之间存在复杂的交叉调节作用，以抑制抗肿瘤T细胞免疫，在某些情况下，PD-1封锁后可能会出现适应性抵抗。TIM-3/CEACAM1轴是从头确定对PD-1/PD-L1治疗的适应性的关键决定因素。
TIM-3/CEACAM1通过以下方式对T细胞及NK细胞施加多管抑制：(i)嗜异的TIM-3/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1/TIM-3异二聚、反式CEACAM1与TIM-3异二聚)；(ii)同源CEACAM-1/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1二聚化、反式CEACAM1诱导的顺式CEACAM-1二聚化)。因此，在小鼠模型及癌症患者中，共表达TIM-3及CEACAM1的肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞表现出最疲惫的表型。
由于PD-1、TIM-3及CEACAM-1在肿瘤微环境中带有免疫耐受及T细胞耗竭的独立即协同机制，因此需要同时阻断这些检查点才能释放出强大的抗肿瘤先天性及适应性抗肿瘤免疫反应。除了在肿瘤浸润的免疫细胞上所有三个T细胞抑制受体(TCIRs：PD-1、TIM-3、CEACAM-1)的共表达升高之外，肿瘤细胞还共表达参与这些TCIRs的多种配体来抑制肿瘤-反应性T细胞(PD-L1、CEACAM-1、半乳凝素9)。这带来了破坏TME中多个自分泌/旁分泌的顺式和反式TCIR/配体相互作用的治疗挑战，这些相互作用共同诱导免疫耐受(PD-1/PD-L1；Tim-3/CEACAM-1；CEACAM-1/CEACAM-1)。通过发明新型的双功能抗体-配体捕获剂(Y-trap)解决了这一治疗挑战：(i)a-PDL1-TIM3ecd，其包含与TIM-3IgV胞外域序列融接的靶向PD-L1的抗体、(ii)α-PD1-TIM3ecd，其包含与TIM-3IgV细胞外结构域序列融接的靶向PD-1的抗体。
aPDL1-TIM3ecd及aPD1-TIM3ecd的作用机制：aPDL1-TIM3 ecd及aPD1-TIM3 ecd在活化T细胞及肿瘤细胞上结合PD-1或PD-L1，并同时用有效地TIM-3ecd诱饵修饰它们与天然细胞TIM-3竞争结合CEACAM-1的FG-CC'裂界面。因此，这些抗体-配体捕获剂不仅会破坏PD-L1/PD-1的相互作用，而且会同时破坏肿瘤微环境中涉及Tim-3/CEACAM-1以及CEACAM-1/CEACAM-1的顺式及反式相互作用。这些研究表明，a-PDL1-TIM3ecd及a-PD1-TIM3ecd在体外促进IFNγ表达和抵消共同刺激的T细胞耗竭方面比a-PDL1(阿特珠单抗)或a-PD-1(帕博利珠单抗)更有效。最重要的是，发现使用这些抗体-配体捕获剂对荷瘤人源化小鼠进行体内治疗会导致肿瘤浸润性CD4+和CD8+T细胞的数量显着增加，并且与抑制肿瘤进展相比，其抑制作用相较于a-PDL1(阿特珠单抗)、a-PD-1(帕博利珠单抗)、a-Tim-3抗体甚至是a-PDL1与a-Tim-3的组合进行等效治疗更为显着。这些数据表明，肿瘤微环境中的嗜异性及嗜同性的Tim-3/CEACAM-1相互作用限制了PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤功效，并且通过同时禁用PD-1/PD-L1检查点及消解Tim-3/CEACAM-1轴的两个组件，α-PDL1-TIM3 ecd及α-PD1-TIM3 ecd提供了更有效的免疫治疗策略来抵消或逆转T细胞耗竭。
图1：抑制T细胞活化并诱导免疫耐受及T细胞耗竭的自分泌/旁分泌受体-配体相互作用的示意图。自分泌/旁分泌TGFβ诱导FOXP3的表达，FOXP3是Treg谱系的标志性转录因子。FOXP3诱导CTLA-4的表达，CTLA-4是一种T细胞抑制性受体，通过干扰B7-CD28相互作用来抑制T细胞共刺激。Tregs表达Galectin-9，它是一种与TIM-3结合并通过TIM-3/CEACAM-1共同抑制轴触发效应T细胞的耗尽或凋亡的配体。PD-L1与PD-1的结合可促进TGFβ诱导的FOXP3表达，以诱导和维持Tregs，并与TIM-3/CEACAM-1信号传导共同诱导T细胞的耗竭及死亡。
图2：a-PDL1-TIM3 ecd及a-PD1-TIM3ecd通过同时中断PD-L1/PD-1信号传导及TIM-3/CEACAM-1共同抑制轴来抵消免疫耐受及T细胞耗竭。
(A)a-PDL1-TIM3ecd和a-PD1-TIM3ecd的结构和靶标的示意图。a-PD1-TIM3ecd包含：(i)通过柔性连接肽(GGGGS)3在C端与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列融合的人a-PD-1抗体的重链(SEQ ID NO：53)和(ii)人α-PD-1抗体的轻链(SEQ ID NO：187)。a-PDL1-TIM3ecd包含：(i)通过柔性连接肽(GGGGS)3在C端与TIM-3的配体结合IgV胞外域序列融接的人a-PD-L1抗体的重链(SEQ ID NO：51)及(ii)人α-PD-L1抗体的轻链(SEQ ID NO：185)。(B)a-PDL1-TIM3 ecd及a-PD1-TIM3 ecd破坏抑制T细胞活化并诱导T细胞耗竭的自分泌/旁分泌受体-配体相互作用的靶标和机制的示意图。自分泌/旁分泌的TGFβ诱导FOXP3的表达，FOXP3是Treg谱系的标志性转录因子。FOXP3诱导CTLA-4的表达，CTLA-4是一种T细胞抑制性受体，通过干扰B7-CD28相互作用来抑制T细胞共刺激。Tregs表达Galectin-9，其是与TIM-3结合并通过TIM-3/CEACAM-1共同抑制轴触发效应T细胞的耗尽或凋亡的配体。PD-1与PD-1的结合可促进TGFβ诱导的FOXP3表达，以诱导及维持Treg，并与TIM-3/CEACAM-1信号传导协同诱导T细胞的耗竭及死亡。a-PDL1-TIM3ecd和a-PD1-TIM3ecd禁用PD-1/PD-L1信号传导，同时破坏涉及TIM-3及CEACAM-1共抑制途径的顺式/反式相互作用。(C)此机制的示意图a-PDL1-TIM3ecd及a-PD1-TIM3ecd通过PD-L1/PD-1和TIM-3/CEACAM-1共抑制轴同时消解了对T细胞的多重抑制。a-PDL1-TIM3ecd及a-PD1-TIM3ecd中断PD-L1/PD-1相互作用并同时破坏：(i)嗜异TIM-3/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1/TIM-3异二聚；使用TIM-3反式CEACAM1异二聚)、(ii)同源CEACAM-1/CEACAM-1相互作用(顺式CEACAM-1二聚化、反式CEACAM1诱导的顺式CEACAM-1二聚化)。
图3：a-PDL1-TIM3ecd和a-PD1-TIM3ecd的表征和目标结合能力。(A)使用SDS-PAGE在还原(R)和非还原(NR)条件下比较a-PD1-TIM3ecd和a-PD1-TIM3ecd的全长(FL)，重链(HC)和轻链(LC)-PD1抗体(纳武单抗)。与a-PD1抗体的重链相比，SDS-PAGE证实了a-PD1-TIM3ecd的重链预期具有更高的分子量(上图)。使用还原(R)和非还原(NR)条件下的SDS-PAGE比较a-PDL1-TIM3ecd和a-PDL1抗体的全长(FL)、重链(HC)及轻链(LC)(阿特珠单抗)。SDS-PAGE证实了与a-PDL1抗体的重链相比，a-PDL1-TIM3ecd的重链具有更高的预期分子量(下图)。(B)显示a-PD1-TIM3与rhPD-1结合的ELISA(上图)：将生物素化的rhPD-1(0-250ng/ml)添加到涂有a-PD1-TIM3ecd(1μg/ml)的板上。ELISA显示a-PDL1-TIM3与rhPD-L1结合(下图)：将生物素化的rhPD-L1(0-250ng/ml)加入涂有a-PDL1-TIM3(1μg/ml)或a-PDL1抗体(阿特珠单抗)(阳性对照)。(C)a-PD1-TIM3ecd和a-PDL1-TIM3ecd在体外结合重组人(rh)CEACAM-1。将rhCEACAM-1(5μg)在存在或不存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-gp120-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)(各10μg)，然后与蛋白A-琼脂糖珠(10μl)孵育6h，然后与蛋白A-琼脂糖珠免疫沉淀。沉淀的复合物用免疫沉淀缓冲液洗涤，重悬于含还原剂的NuPAGE样品缓冲液中，煮沸，在Bis-Tris Criterion XT凝胶系统上溶解，并转移到PVDF膜上。膜用一抗(CEACAM1(D1P4T)；TIM3(D5D5RTM))过夜，洗涤，与二抗一起孵育，并通过Amersham ECL Western Blotting检测试剂进行显像。免疫印迹分析检测到a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd及-gp120-TIM3ecd蛋白A沉降的免疫沉淀物中的rhCEACAM-1，但未在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)的免疫沉淀物中检测到。(D)α-PD1-TIM3ecd和α-PDL1-TIM3ecd结合CEACAM-1在共刺激的人T细胞上。在存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)的情况下，将人PBMC与抗CD3/抗CD28珠共刺激6天。细胞裂解物用蛋白A–琼脂糖珠(10μl)免疫沉淀6h。沉淀的复合物用免疫沉淀缓冲液洗涤，重悬于含还原剂的NuPAGE样品缓冲液中，煮沸，在Bis-Tris Criterion XT凝胶系统上溶解，并转移到PVDF膜上。膜用一抗(CEACAM1(D1P4T)；TIM3(D5D5RTM))过夜，洗涤，与二抗一起孵育，并通过Amersham ECL WesternBlotting检测试剂进行显像。用CEACAM-1抗体进行的免疫印迹分析在处理过的a-PD1-TIM3ecd和a-PDL1-TIM3ecd处理的细胞裂解物中的蛋白A免疫沉淀物中检测到CEACAM-1，但在a-PD-L1mAb(阿特珠单抗)或在a-PD1 mAb(纳武单抗)处理的细胞裂解液的免疫沉淀物中未检测到CEACAM-1。用TIM-3ecd抗体进行的免疫印迹分析在a-PD1-TIM3 ecd和a-PDL1-TIM3ecd处理的细胞裂解物的蛋白A免疫沉淀物中检测到a-PD1-TIM3ecd或a-PDL1-TIM3ecd的重链，但未在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)处理的免疫沉淀物中检测到。
图4：a-PD1-TIM3ecd与a-PDL1-TIM3ecd在促进IFN-γ表达以及抵消共同刺激的T细胞耗竭方面比a-PD-1mAb或a-PD-L1 mAb有效得多。(A)在存在或不存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1的情况下，用抗CD3/抗CD28珠(5μg/ml)及rhIL-2刺激人PBMC mAb(阿特珠单抗)，a-PD1 mAb(纳武单抗)，a-人TIM3 Ab(F38-2E2)或a-PD1 mAb和a-TIM3 Ab的组合(各5μg/ml)3-9d。在每个指示的时间(3d，6d和9d)，细胞上清中的干扰素-γ(IFN-γ)通过ELISA进行定量(数据代表每组3次体外复制的平均值±SEM)。ELISA表明，与a-PDL1(阿特珠单抗)、a-PD-1(帕博利珠单抗)、a-TIM3 Ab或甚至a-PD1 mAb和a-TIM3 Ab的组合相比，a-PDL1-TIM3ecd和a-PD1-TIM3ecd在体外促进IFNγ表达和抵消共同刺激的T细胞耗竭方面更有效。(B)在存在或不存在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb的情况下，用抗CD3/抗CD28珠(5μl/ml)和rhIL-2刺激人PBMC阿特珠单抗)、a-PD1 mAb(纳武单抗)、a-人TIM3 Ab(F38-2E2)或a-PD1 mAb和a-TIM3 Ab的组合(各5μg/ml)持续16h或40h，以及IFN通过ELISA对细胞上清液中的-γ进行定量(每组3个体外重复试验的平均值±SEM)。与a-PDL1(阿特珠单抗)、a-PD-1(帕博利珠单抗)、a-TIM3 Ab或甚至a-PD1 mAb和a-TIM3 Ab的组合相比，a-PDL1-TIM3ecd在体外通过共同刺激的T细胞促进IFNγ表达明显更有效(数据代表与没有抗体的共同刺激相比，每个抗体治疗组的IFNγ表达的倍数变化)。(C)α-PD1-TIM3ecd抵消了TGFβ介导的共同刺激的T细胞中IFNγ表达的抑制。在存在或不存在rhTGFβ1(5ng/ml)或有或没有a-PDL1-TIM3(5μg/ml)的情况下，用抗CD3/抗CD28和rhIL-2刺激人PBMC 16h或40h，并通过ELISA对细胞上清液中的IFN-γ进行定量分析(数据代表每组3次体外重复的平均值±SEM)。
图5：a-PD1-TIM3ecd比a-PD-1，a-TIM-3或a-TIM-3和a-PD1的组合更有效地抑制肿瘤生长。(A)将NSG小鼠(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8周)通过过继转移3x106个人外周血单个核细胞(PBMC)(与抗CD3/抗CD28磁珠共同刺激)和rhIL-2在以下指定处理条件下进行重组，共8天(各5/毫升)：a-PD1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(纳武单抗)、α-人TIM3 Ab(F38-2E2)，a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab的组合，或单独使用安慰剂。重组小鼠皮下注射2x106个D-MUT1人结肠直肠癌细胞，每组均进行体内治疗(5mg/kg i.p.每5天)，与用于过继转移的PBMC的体外治疗相同，如所示：a-PD1-TIM3ecd、a-PD1(纳武单抗)、a-TIM-3(F38-2E2)、a-PD1与a-TIM-3的组合；单独的安慰剂(未治疗的对照)[≥5只小鼠/组]。测量对治疗组不知情的肿瘤大小，并使用公式(长×宽×高)计算肿瘤体积。显示体内肿瘤生长曲线(平均值+SEM)。使用不成对的双向t检验得出p值。p值(p<0.02，学生未配对t检验)表示a-PD1-TIM3ecd与其他治疗组之间存在显着差异。(B)以200cGy照射免疫缺陷的NSG小鼠(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8周)，并通过过继转移HLA A2匹配的人CD34+造血细胞重建免疫。重组的人源化小鼠皮下注射人类三阴性乳腺癌(TNBC)HLA A2+肿瘤细胞(MDA-MB-231-Luc)(基质胶中1x106；乳腺脂肪垫)。肿瘤接种后第3天，将小鼠随机分组，并单独用安慰剂(未治疗的对照)或以下抗体(每周ip 5mg/kg)治疗：a-PD1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(纳武单抗)、a-人TIM3 Ab(F38-2E2)、a-PD1 mAb和a-TIM3 Ab的组合[≥5只小鼠/组]。测量对治疗组不知情的肿瘤大小，并使用公式(长×宽×高)计算肿瘤体积。显示了体内肿瘤生长曲线(平均值+SEM)。使用不成对的双向t检验得出p值。p值(p<0.02，学生未配对t检验)表示a-PD1-TIM3ecd与其他治疗组之间存在显着差异。
图6：a-PDL1-TIM3 ecd比a-PD-L1、a-PD-1、a-TIM-3或a-PD-L1与a-TIM-3的组合更有效地抑制肿瘤生长。免疫缺陷的NSG小鼠(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8周)受到200厘格雷(cGy)的照射，并通过过继转移HLA A2人CD34+造血细胞来重建免疫。重组的人源化小鼠皮下注射人类三阴性乳腺癌HLA A2+肿瘤细胞(MDA-MB-231-Luc)(基质胶中1x106、乳腺脂肪垫)。肿瘤接种后第3天，将小鼠随机分组，并单独用安慰剂(未治疗的对照)或以下抗体(5mg/kg、腹腔注射(Intraperitoneal,IP、每周)治疗：a-PDL1-TIM3 ecd、a-PD1 mAb(阿特珠单抗)、a-PD1 mAb(帕博利珠单抗)、a-人TIM3 Ab(F38-2E2)、a-PD-L1mAb与a-TIM3Ab的组合(≥5只小鼠/组)。(A)测量对治疗组不知情的肿瘤大小，并使用公式(长×宽×高)计算肿瘤体积。显示了体内肿瘤生长曲线(平均值+SEM)。使用不成对的双向t检验得出p值。p值(p<0.02，学生未配对t检验)表示a-PDL1-TIM3 ecd与其他治疗组之间存在显着差异。(B)在肿瘤细胞接种后7和27天，未治疗的对照或指定的治疗组中的原发性肿瘤的生物发光测定。(C)肿瘤中T细胞密度的定量：肿瘤体积和流式细胞仪用于评估每mm3肿瘤CD4+和CD8+T细胞的绝对数量。
图7：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于一靶标表位、TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列以及PD-1的配体结合细胞外结构域序列。所述多功能抗体-配体捕获剂可以结合一靶标表位(通过抗原结合CDR)，结合PD-1配体、PD-L1及PD-L2(通过PD-1ecd)以及TIM-3配体(CEACAM-1)(通过TIM-3ecd)。(A)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接体在C端与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列融接，并且所述抗体的轻链通过一连接体在C端与PD-1的配体结合细胞外结构域序列融接。在一个方面，所述连接体是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。(B)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与PD-1的配体结合细胞外结构域序列融接，并且所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与TIM-3的配体结合细胞外结构域序列融接。在一个方面，所述连接是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂的靶向抗体结合以下分子之一：CTLA-4、(CD152)、B7-H3(CD276)、VISTA、VSIG8、BTLA、HVEM、CD160、TIGIT、CD226、CD96、LAG-3、TGF-β、TGFβR、4-1BB(CD137)、ICOS、OX-40(CD134)、GITR、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD73、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、EGFR(EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3(HER3)、ErbB-4(HER4)、EGFR配体、VEGF、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2)、RANKL、RANK、gp120。
图8：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于CTLA-4、TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列以及PD-1的配体结合细胞外结构域序列。多功能抗体-配体捕获剂可以结合CTLA-4(通过抗原结合CDR)，结合PD-1配体、PD-L1及PD-L2(通过PD-1ecd)以及TIM-3配体(CEACAM-1)(通过TIM-3ecd)。(A)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含结合CTLA-4的一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列融接(SEQ ID NO：207)，并且所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与PD-1的配体结合细胞外结构域序列融接(SEQ IDNO：208)。在一个方面，所述连接是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，其包含结合CTLA-4的一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与PD-1的配体结合细胞外结构域序列融接(SEQ ID NO：205)，所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与TIM-3的配体结合细胞外结构域序列(SEQ ID NO：206)融接。在一个方面，所述连接是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。
图9：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于一靶标表位、TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列以及TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列。所述多功能抗体-配体捕获剂可以结合一靶标表位(通过抗原结合CDR)，结合TGFβ(通过TGFβRII ecd)以及TIM-3配体(CEACAM-1)(通过TIM-3ecd)。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包括一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列(TGF ligandRII ecd)融接(SEQ IDNO：6)，并且所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列(SEQ ID NO：2)融接。在一个方面，所述连接是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂的靶向抗体结合以下分子之一：CTLA-4(CD152)、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3(CD276)、VISTA、VSIG8、BTLA、HVEM、CD160、TIGIT、CD226、CD96、LAG-3、4-1BB、CD137、ICOS、OX-40(CD134)、GITR、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD73、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、EGFR(EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3(HER3)、ErbB-4(HER4)、EGFR配体、VEGF、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2)、RANKL、RANK。
图10：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意图，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于T细胞抑制性受体或配体、TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列以及TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列。(A)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于PD-1、TIM-3的配体结合的IgV细胞外结构域序列以及TGFβRII的配体结合的细胞外结构域序列。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于PD-1，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列(SEQ ID NO：6)融接，并且所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列(SEQ ID NO：2)融接。在一个方面，所述连接是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在一个示例中，多功能抗体-配体捕获剂包含对应于SEQ ID NO：273的一重链以及对应于SEQ ID NO：274的一轻链。在另一个示例中，多功能抗体-配体捕获剂包含对应于SEQ ID NO：277的一重链以及对应于SEQ ID NO：278的一轻链。(B)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于PD-L1、TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列以及TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含结合PD-L1的一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列(SEQ IDNO：6)融接，并且所述抗体的轻链在C端通过一连接肽与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列(SEQ ID NO：2)融接。在一个方面，所述是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在一个示例中，多功能抗体-配体捕获剂包含对应于SEQ ID NO：285的一重链以及对应于SEQ ID NO：285的一轻链。在另一个示例中，多功能抗体-配体捕获剂包含对应于SEQ ID NO：281的一重链以及对应于SEQ ID NO：282的一轻链。(C)本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于CTLA-4、TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列以及TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含结合CTLA-4的一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列融接(SEQ ID NO：6)，并且所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与TIM-3的配体结合IgV细胞外结构域序列融接(SEQ ID NO：2)。在一个方面，所述连接是一肽(GGGGS)，n(SEQ ID NO：3)。在一个示例中，多功能抗体-配体捕获剂包含对应于SEQ ID NO：203的重链以及对应于SEQ ID NO：204的轻链。
图11：本发明的多功能抗体-配体捕获剂的示意性设计，包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于一靶标表位、PD-1的配体结合细胞外结构域序列以及TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列。多功能抗体-配体捕获剂可以结合靶标表位(通过抗原结合CDR)，结合TGFβ(通过TGFβRII ecd)以及PD-1配体、PD-L1及PD-L2(通过PD-1ecd)。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含一靶向抗体，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列(SEQ ID NO：6)融接，而所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与PD-1的配体结合细胞外结构域序列(SEQ ID NO：7)融接。在一个方面，所述连接是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂的靶向抗体结合以下分子之一：CTLA-4(CD152)、TIM-3、CEACAM-1、CEA、VISTA、VSIG8、BTLA、HVEM、CD160、TIGIT、CD226、CD96、LAG-3、4-1BB(CD137)、ICOS、OX-40(CD134)、GITR、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD73、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、EGFR(EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3(HER3)、ErbB-4(HER4)、EGFR配体、VEGF、VEGFR、RANKL、RANK。
图12：在各种实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于一T细胞抑制性受体或配体、PD-1的配体结合细胞外结构域序列以及TGFβRII的配体-结合细胞外结构域序列。在一个实施方案中，本发明的多功能抗体-配体捕获剂包含一靶向抗体，所述靶向抗体结合于CTLA-4，其中所述抗体的重链通过一连接肽在C端与TGFβRII的配体结合细胞外结构域序列(SEQ ID NO：203)融接，并且所述抗体的轻链通过一连接肽在C端与PD-1的配体结合细胞外结构域序列(PD-1ecd：SEQ ID NO：202)融接。在一个方面，所述连接是一肽，(GGGGS)n，(SEQ ID NO：3)。在一个示例中，多功能抗体-配体捕获剂包含对应于SEQ ID NO：202的重链以及对应于SEQ ID NO：203的轻链。
抗体-配体捕获剂(Y-捕获剂)的设计及特征。
合成了用于抗体重链的cDNA以及用于抗体轻链的cDNA，然后在哺乳动物启动子以及聚腺苷酸化信号的控制下将其克隆到单独的质粒载体(pEvi3、evitria AG，瑞士)中。在大肠杆菌中扩增质粒DNA，并使用阴离子交换试剂盒纯化DNA，以制备低内毒素质粒DNA。通过测量在260nm波长下的吸收来确定DNA浓度。通过Sanger测序验证了序列的正确性(每个质粒最多进行两个测序反应，具体取决于cDNA的大小。)随后将重链及轻链的质粒DNA共转染到适应悬浮液的CHO K1细胞中(最初来自ATCC，并适应于在evitria悬浮培养中的无血清生长)。种在eviGrow培养基中生长，所述培养基是化学定义的，不含动物成分的无血清培养基。使用eviFect(evitria AG，瑞士)转染细胞。然后在无血清且无动物成分的培养基eviMake2(evitria AG，瑞士)中培养CHO细胞。一旦存活率达到75％(即转染后第8天)，生产就会终止。通过离心及随后的过滤(0.2um过滤器)收集上清液。使用MabSelectTM SureTM纯化抗体。通过液相色谱FTFT质谱联用(LCMS/MS)从CHO-K1细胞上清液中纯化的抗体进行蛋白质鉴定，以确认重链及轻链的氨基酸序列(例如图2A，a-PDL1-TIM3 ecd以及a-PD1-TIM3ecd)。使用在还原和非还原条件下的SDS-PAGE比较抗体-配体捕获剂及其相应的亲本抗体(例如，图3A，a-PDL1-TIM3 ecd、a-PD1-TIM3 ecd、a-PDL1 mAb(阿特珠单抗)及a-PD1 mAb(纳武单抗))的全长、重链及轻链。
抗体-配体捕获剂的靶向结合能力。
(i)与PD-1配体的结合(ELISA)：将生物素化的rhPD-L1(0-250ng/ml)加入涂有抗体-配体捕获剂(1μg/ml)或a-PDL1抗体(阿特珠单抗)(阳性对照)(1μg/ml)的ELISA盘，并通过HRP-Avidin(R&D系统)进行检测。每个实验进行两次，每种指示条件重复三孔。ELISA显示a-PDL1-TIM3(1μg/ml)或a-PDL1抗体(阿特珠单抗)(阳性对照)(1μg/ml)结合rhPD-L1的能力，如图3A所示。此测定法还用于评估包含PD-1细胞外结构域(PD-1ecd)的一配体结合序列的任何抗体-配体捕获剂与生物素化的rhPD-L1以及rh PD-L2的结合。
(ii)与PD-1的结合(ELISA)：将生物素化的rhPD-1(0-250ng/ml)加入涂有抗体-配体捕获剂(1μg/ml)或a-PD1抗体(纳武单抗或帕博利珠单抗)(阳性对照)(1μg/ml)的盘中，并通过HRP-Avidin(R&D系统)进行检测。每个实验进行两次，每种指示条件重复三孔。ELISA显示a-PD1-TIM3 ecd与rhPD-1的结合，如图3A所示。此测定法也用于评估包含PD-1靶向抗体的任何抗体-配体捕获剂的结合。
(iii)在体外与TIM-3配体/共抑制受体(CEACAM-1)的结合。
将rhCEACAM-1(5μg)在存在或不存在包含TIM-3细胞外结构域(TIM3ecd)(抗体-TIM3 ecd)或a-gp120-TIM3 ecd(阳性对照)(各10μg)的一配体结合序列的抗体配体捕获剂的情况下进行孵育(过夜、4℃)，然后与蛋白A-琼脂糖珠(10μl)孵育6h，然后使用蛋白A-琼脂糖珠进行免疫沉淀。使用免疫沉淀缓冲液洗涤沉淀的复合物，将其重悬于含还原剂的NuPAGE样品缓冲液中，煮沸，在Bis-Tris Criterion XT凝胶系统上溶解，并转移至PVDF膜。将膜使用一抗(CEACAM1(D1P4T)、TIM3(D5D5RTM))免疫印迹过夜，洗涤，与二抗一起孵育，并通过Amersham ECL Western Blotting检测试剂进行显像。a-PD1-TIM3 ecd及a-PDL1-TIM3ecd在体外与重组人(rh)CEACAM-1的结合显示在图2C中。免疫印迹分析检测到rhCEACAM-1在a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3 ecd以及a-gp120-TIM3 ecd蛋白A沉降的免疫沉淀物中，但未在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)的免疫沉淀物中(图2C)。此测定法还用于评估包含TIM-3细胞外结构域(TIM-3ecd)的一配体结合序列的一配体结合序列的任何抗体-配体捕获剂与rh CEACAM-1的结合。
(iv)在共刺激的人T细胞上与TIM-3配体/共抑制受体(CEACAM-1)的结合。在存在或不存在包含TIM3 ecd(抗体-TIM3 ecd)或a-gp120-TIM3ecd(阳性对照)(各10μg)的一配体结合序列的抗体-配体捕获剂的情况下，在ImmunoCult培养基(STEMCELL Technologies)中将人PBMC与抗CD3/抗CD28珠共刺激6天。使用蛋白A-琼脂糖珠(10μl)免疫沉淀细胞裂解物6小时。使用免疫沉淀缓冲液洗涤沉淀的复合物，将其重悬于含还原剂的NuPAGE样品缓冲液中，煮沸，在Bis-Tris Criterion XT凝胶系统上溶解，并转移至PVDF膜。将膜使用一抗(CEACAM1(D1P4T)、TIM3(D5D5RTM))免疫印迹过夜、洗涤、与二抗一起孵育，并通过AmershamECL Western Blotting检测试剂进行显像。在共刺激的人T细胞上，a-PD1-TIM3 ecd及a-PDL1-TIM3 ecd与CEACAM-1的结合如图2D所示。以CEACAM-1抗体进行的免疫印迹分析在a-PD1-TIM3 ecd以及a-PDL1-TIM3 ecd处理过的细胞裂解物中的蛋白A免疫沉淀物中检测到CEACAM-1，然而未在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)处理过的细胞裂解物的免疫沉淀物中检测到。使用TIM-3ecd抗体进行的免疫印迹分析在a-PD1-TIM3 ecd以及a-PDL1-TIM3 ecd处理过的细胞裂解物的蛋白A免疫沉淀物中检测到a-PD1-TIM3 ecd或a-PDL1-TIM3 ecd的重链，然而未在a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)或a-PD1 mAb(纳武单抗)处理过的细胞裂解液的免疫沉淀物中检测到。此测定法还用于评估包含TIM-3细胞外结构域(TIM-3ecd)的一配体结合序列的任何抗体-配体捕获剂与共刺激的人T细胞上的CEACAM-1的结合。
(v)与TGFβ的结合(ELISA)。通过ELISA评估包含TGFβRII细胞外结构域(TGFβRII)(抗体-TGFβRII ecd)的配体结合序列的抗体-配体捕获剂结合TGFβ的能力，其中将重组人TGFβ(rhTGFβ1，0-2000pg/ml)加入涂覆有抗体-TGFβRII(1βg/ml)的盘中，并通过生物素化的抗TGFβ1及HRP-avidin(R&D系统)进行检测。将非特异性IgG-TGFβRII以及rhTGFβRII-Fc涂覆的盘用作阳性对照，以分析测试样品结合TGFβ的能力。
标准ELISA用于评估任何抗体-配体捕获剂结合一抗靶标，并且还捕获融合的同源受体细胞外结构域序列(受体ecd)靶向的配体的多功能能力。在每种情况下，将使用抗体-配体捕获剂(1μg/ml)涂覆ELISA盘，然后添加生物素化的靶标分子(0-1000ng/ml)，并用HRP-Avidin检测(R&D系统)。
抗体-配体捕获剂促进IFNγ表达并消解共刺激的T细胞耗竭的能力：
(A)在存在或不存在a-PD1-TIM3 ecd、a-PDL1-TIM3 ecd、a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)、a-PD1 mAb(纳武单抗)、a-human TIM3 Ab(F38-2E2)或a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab(各5g/ml)的组合的情况下，使用抗CD3/抗CD28珠(5μl/ml)以及rhIL-2刺激人PBMCs 3至9天。在每个指示的时间(3天、6天及9天)，细胞上清中的IFN-γ通过ELISA进行定量(数据代表每组3次体外重复的平均值±SEM)。ELISA证明，与a-PDL1(阿特珠单抗)、a-PD-1(帕博利珠单抗)、a-TIM3 Ab或甚至a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab的组合相比，a-PDL1-TIM3 ecd以及a-PD1-TIM3ecd在体外促进IFNγ表达以及消解共刺激T细胞的耗竭方面更为有效。
(B)在存在或不存在a-PD1-TIM3 ecd、a-PDL1-TIM3 ecd、a-PD-L1 mAb(阿特珠单抗)、a-PD1 mAb(纳武单抗)、a-human TIM3 Ab(F38-2E2)或a-PD1 mAb与a-TIM3 Ab(各5μg/ml)的组合的情况下，使用抗CD3/抗CD28珠(5μl/ml)以及rhIL-2刺激人PBMCs 16小时或40小时，并通过ELISA定量测定细胞上清液中的IFN-γ(每组3次体外重复试验的平均值±SEM)。
(C)α-PD1-TIM3 ecd消解TGFβ介导的在共刺激的T细胞中对IFNγ表达的抑制。在存在或不存在rhTGFβ1(5ng/ml)的情况下，使用或不使用a-PDL1-TIM3(5μg/ml)的情况下，使用抗CD3/抗CD28以及rhIL-2刺激人PBMCs 16小时或40小时，并通过ELISA对细胞上清液中的IFN-γ进行定量分析(数据代表每组3次体外重复的平均值±SEM)。
携带人肿瘤异种移植物的人源化小鼠的治疗。免疫缺陷的NSG小鼠(NOD/Shi-scidIL-2rgnull)(4-8周大)通过过继转移正常供体的人外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs)或人骨髓CD34+细胞而重建。对人源化的小鼠接种人肿瘤细胞。接种肿瘤后，使用盲区随机分组将小鼠分为几组，并单独使用安慰剂(未治疗的对照)或以下抗体进行治疗(每5天腹腔注射5mg/kg)：a-PDL1-TIM3 ecd、a-PDL1-TIM3 ecd、a-PDL1(阿特珠单抗)、a-TIM-3、a-PD-1(帕博利珠单抗)、a-PDL1与a-TIM-3的组合、a-PDL1与a-TIM-3的组合。
原发性肿瘤的生物发光成像。使用Xenogen IVIS Spectrum系统通过体内萤光素酶活性的可视化评估带有MDA-MB-231-Luc的小鼠的肿瘤负担。注射后10分钟后采集图像，萤光素的剂量为50mg/kg i.p.。为了检测转移，在重新成像之前将每只动物的下部都屏蔽起来，以最大程度地减少原发肿瘤的生物发光。得到肺并离体成像以证实体内观察。光子通量用于量化治疗组之间肿瘤负荷的差异。
治疗效果的评估：每周测量肿瘤大小(长度、宽度、高度)，持续6周，并计算肿瘤体积。使用治疗组(T)以及未治疗的对照组(C)的初始(i)以及最终(f)肿瘤体积，通过以下公式计算肿瘤生长抑制率(％TGI)值：％TGI＝[1-(Tf-Ti)/(Cf-Ci)]x100。
T细胞的免疫表型分析-流式细胞仪：
从未治疗的对照组以及治疗组(治疗结束时)的小鼠中得到肿瘤、引流淋巴结(draining lymph node,DLN)以及骨髓(bone marrow,BM)，用于T细胞的免疫表型分析，如下：(a)调节T细胞：通过流式细胞术测量从每组小鼠中分离的肿瘤浸润中的Tregs、DLN或BMT细胞。使用抗人CD4-PE，抗人CD25-PE-CYTM5以及抗人CD127-FITC(BD Biosciences)对细胞进行细胞外染色。然后将细胞通透并用抗人FOXP3-APC或对应的同型对照IgG1-APC(eBioscience)进行细胞内染色，然后通过流式细胞仪进行分析以定量Tregs(CD4+CD25+CD127lowFOXP3+细胞)。(b)记忆T细胞：在从每组小鼠分离出的的BM、DLN以及肿瘤浸润T细胞中测量具有中央记忆(CD45RO+CD62L+)或效应记忆(CD45RO+CD62L-)免疫表型的CD8+以及CD4+T细胞。使用抗人CD4-PE、抗人CD8-PE-CYTM7、抗人CD45RO-APC以及抗人CD62L-FITC(BDBiosciences)染色细胞，并通过流式细胞仪进行分析，以量化具有中央记忆表型的T细胞(CD45ROhighCD62Lhigh)。(c)表达IFNγ的肿瘤反应性CD4+及CD8+T细胞：评估被放置(2x105细胞/盘)在存在有肿瘤细胞裂解液、非特异性对照肽或培养基情况下的T细胞、DLN或BM细胞中肿瘤特异性IFNγ的表达。将细胞培养72小时，然后使用Golgi stop培养4小时。使用抗CD4-FITC以及抗CD8-APC抗体对细胞进行细胞外染色、通透、使用抗IFNγ进行细胞内染色、使用抗CD4-FITC及抗CD8-APC抗体进行细胞外染色、通透(d)原发肿瘤中的T细胞密度：计算肿瘤体积，并使用流式细胞仪计算每mm3肿瘤中CD4+以及CD8+T细胞的绝对数量。
TME中的免疫抑制受体/配体的评估：
分析来自未治疗的对照组以及治疗组(治疗结束时)的小鼠的肿瘤中抑制T细胞活化或诱导T细胞耗竭的以下免疫受体/配体的表达：(a)PD-1及PD-L1在肿瘤浸润性T细胞、DLN T细胞及肿瘤细胞上的表达：使用抗人CD4-APC、CD8-FITC以及抗人PD-1-PE或PD-L1-PE染色细胞，并且通过流式细胞仪定量表达PD-1或PD-L1的T细胞以及表达PD-L1的肿瘤细胞的平均百分比。还通过IHC评估了肿瘤中PD-L1表达的水平。(b)TIM-3以及TIM-3配体(Galectin-9及CEACAM-1)在肿瘤浸润性T细胞、DLN T细胞及肿瘤细胞上的表达：使用抗人CD4-APC、CD8-FITC以及抗人TIM-3-PE，Galectin-9-PE或CEACAM-1-PE(BD Biosciences)染色细胞，并且表达TIM-3的T细胞以及表达Galectin-9或CEACAM-1的肿瘤细胞的平均百分比通过流式细胞仪定量。(c)TGFβ信号：T细胞的免疫印迹分析-Smad-2/3/4的表达及活性(磷酸化)。
评估TILs中免疫功能障碍的特征(升高的Tregs及/或T细胞耗竭)。从肿瘤(所有治疗及对照组)中提取RNA，并进行RNA-Seq(包括质量检查、文库制备、测序及数据处理)。使用来自癌症单细胞RNA测序数据的细胞类型特异性参考基因表达谱(reference geneexpression profiles,RGEP)，将数学反卷积应用于大量的RNA-Seq数据。反卷积是使用一些差异表达的基因来进行的，其有助于注解四种T细胞亚型，例如幼稚型、调节型、细胞毒性型及耗竭型，并为每个样品105计算每种亚型的评估比例。此方法用于根据T细胞标记的差异表达来评估四种不同T细胞亚型(CD4+TH1细胞、CD4+Tregs、CD8+细胞毒性T细胞及CD8+耗竭T细胞)的相对指数。以下比率用作具有不同CD4+或CD8+TILs子类的肿瘤的相对浸润的数值替代指标：(i)Treg/TH1以及(ii)耗尽CD8+T细胞/细胞毒性CD8+T细胞。同时，特异性标记的表达表征TH1细胞(TBET、IFNγ细胞、TBET、IFNed CD8+T细胞/细胞毒性CD8+T细胞)。同时，在平行多重RT-PCR反应(QuantiTect，Qiagen)中测量特异性表达，以计算以下比率：(i)Treg/TH1＝FOXP3/TBET或CTLA-4/IFN、(ii)耗竭T细胞/细胞毒性T细胞＝(TIM3+PD-1/GZMB。RNA-Seq数据也可用于评估免疫抑制配体的表达。
尽管已经参考以上示例描述了本发明，但是应该理解的是，修改及变化都包含在本发明的精神及范围内。因此，本发明仅由所附权利要求书限制。

Claims (97)

1.一种分子，其特征在于：包含一靶向部分以及一个或多个免疫调节部分，其中：
(a)所述靶向部分包含一多肽，所述多肽特异性地结合一肿瘤细胞、肿瘤微环境、肿瘤相关生长因子或受体、肿瘤相关细胞因子或受体、肿瘤相关T淋巴细胞、T细胞共刺激分子、T细胞共抑制分子、免疫细胞、病原体或病原体相关细胞的一组成部分、以及
(b)所述免疫调节部分包含一T淋巴细胞免疫受体、T细胞抑制受体、T细胞共抑制分子、T细胞共刺激分子、B淋巴细胞受体、树突细胞受体、自然杀伤细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体、趋化因子受体或肿瘤细胞受体的一细胞外结构域序列或其配体结合片段。
2.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述靶向部分的多肽包含一免疫球蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单链可变片段、二价单链可变片段、多价单链可变片段或一含有可结晶片段多肽的一抗原结合结构域。
3.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述靶向部分的多肽是特异性地结合一T细胞抑制受体、一T细胞抑制受体配体、一T细胞共抑制分子、或一T细胞共刺激分子的一抗体、或包含来自一受体或一配体的所述细胞外结构域的一配体结合序列。
4.根据权利要求2所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是一抗体，以及所述免疫调节部分与所述抗体的重链的C端融合。
5.根据权利要求2所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是一抗体，以及所述免疫调节部分与所述抗体的轻链的C端融合。
6.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述靶向部分的多肽特异性地结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(分化簇152)、程序性死亡受体-1蛋白、程序性死亡配体-1、程序性死亡配体-2、B7-H3(分化簇276)、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、癌胚抗原相关细胞粘附分子-1、癌胚抗原、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、疱疹病毒进入介体、分化簇160、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、分化簇226、分化簇96、淋巴细胞活化基因-3、转化生长因子β、转化生长因子β受体、核因子κB受体致活剂、核因子κB受体致活剂配体、4-1BB(分化簇137)、诱导性T细胞共刺激分子、OX-40(分化簇134)、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白、分化簇27、介白素-6受体、介白素-23受体、介白素-17受体、介白素-6、介白素-23、介白素-17、分化簇39、分化簇40、分化簇40L、分化簇47、分化簇73、CC趋化因子受体4、CC趋化因子受体5、趋化因子受体CXCR 4、介白素-12受体、分化簇4、介白素-2受体、分化簇25、分化簇3、糖蛋白120、表皮生长因子受体/人类表皮生长因子受体-1、表皮生长因子受体-2/人类表皮生长因子受体-2、表皮生长因子受体-3/人类表皮生长因子受体-3、表皮生长因子受体-4/人类表皮生长因子受体-4、表皮生长因子、转化生长因子α、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体-1、血管内皮生长因子受体-2或血管内皮生长因子受体-3中的一个或多个。
7.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含转化生长因子β受体II、程序性死亡受体-1蛋白、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、分化簇160、分化簇226、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、分化簇96、分化簇44、群落刺激因子1受体、CC趋化因子受体4、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、血管内皮生长因子受体、核因子κB受体致活剂、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1或T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂的细胞外配体结合序列或其配体结合片段。
8.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述分子还包含一连接体。
9.根据权利要求8所述的分子，其特征在于：所述连接体融接所述靶向部分以及所述免疫调节部分。
10.根据权利要求8所述的分子，其特征在于：所述连接体包含SEQ ID NO：3、4或5所示的序列。
11.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其一配体结合片段。
12.根据权利要求11所述的分子，其特征在于：所述配体结合片段包含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述癌胚抗原相关细胞粘附分子-1结合片段。
13.根据权利要求11所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含SEQ ID NO：2所示的序列。
14.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是一多肽，所述多肽结合于程序性死亡受体-1蛋白、程序性死亡配体-1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、淋巴细胞活化基因-3、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、CC趋化因子受体4、41BB、OX40、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白、血管内皮生长因子、核因子κB受体致活剂配体、转化生长因子β、介白素-6受体、表皮生长因子受体、人类表皮生长因子受体-2或糖蛋白120，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其一配体结合片段。
15.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含分化簇226的所述细胞外结构域或其一配体结合片段。
16.根据权利要求15所述的分子，其特征在于：在所述免疫调节部分中包含SEQ ID NO：9所示的序列。
17.根据权利要求15所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、CC趋化因子受体4、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、淋巴细胞活化基因-3、程序性死亡受体-1蛋白、程序性死亡配体-1、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂、41BB、OX40、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白、核因子κB受体致活剂配体、转化生长因子β、介白素-6受体、表皮生长因子受体、人类表皮生长因子受体-2、血管内皮生长因子或糖蛋白120。
18.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分是分化簇44的所述细胞外结构域或其一配体结合片段。
19.根据权利要求15所述的分子，其特征在于：在所述免疫调节部分中包含SEQ ID NO：36所示的序列。
20.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、CC趋化因子受体4、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、淋巴细胞活化基因-3、程序性死亡受体-1蛋白、程序性死亡配体-1、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂、41BB、OX40、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白、核因子κB受体致活剂配体、转化生长因子β、介白素-6受体、表皮生长因子受体、人类表皮生长因子受体-2、血管内皮生长因子或糖蛋白120，并且所述免疫调节部分是分化簇44的所述细胞外结构域或其一配体结合片段。
21.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8的所述细胞外结构域或其一配体结合片段。
22.根据权利要求15所述的分子，其特征在于：在所述免疫调节部分中包含SEQ ID NO：55所示的序列。
23.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、CC趋化因子受体4、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、淋巴细胞活化基因-3、程序性死亡受体-1蛋白、程序性死亡配体-1、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂、41BB、OX40、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白、核因子κB受体致活剂配体、转化生长因子β、介白素-6受体、表皮生长因子受体、人类表皮生长因子受体-2、血管内皮生长因子或糖蛋白120，并且所述免疫调节部分是V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8的所述细胞外结构域或其一配体结合片段。
24.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：10及145、11及146、12及147、13及148、14及149、15及150、16及151、17及152、18及153、19及154、20及155、21及156、22及157、23及158、24及159、25及160、26及161、27及162、28及163、29及164、30及165、31及166、32及167、33及168、34及169、35及170、37及171、38及172、39及173、40及174、41及175、42及176、43及177、44及178、45及179、46及180、47及181、48及182、49及183、50及184、51及185、52及186、53及187、58及188、59及189、60及61、62及63、64及65、66及67、68及69、70及71、72及73、74及75、76及77、78及79、80及81、82及83、84及85、86及87、88及89、90及91、92及93、94及95、96及97、98及99、100及101、102及103、104及105、106及107、108及109、110及111、112及113、114及115、116及117、118及119、120及121、122及123、124及125、126及127、128及129、130及131、132及133、134及135、136及137、138及139、140及141、142及143、192及193、209及210、211及212、221及222、223及224、233及234、235及236、245及246、247及248、257及258、259及260、269及270、271及272、275及276、279及280、283及284、287及288、290及291、292及293、294及295、296及297，或298及299所示的序列。
25.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于程序性死亡受体-1蛋白或程序性死亡配体-1，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
26.根据权利要求25所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一抗体，并且所述免疫调节部分与所述靶向部分的重链或轻链融接。
27.根据权利要求26所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：51及185所示的序列。
28.根据权利要求26所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：52及186所示的序列。
29.根据权利要求26所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：53及187所示的序列。
30.根据权利要求26所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：192及193所示的序列。
31.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
32.根据权利要求31所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：50及184所示的序列。
33.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于淋巴细胞活化基因-3，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
34.根据权利要求33所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：26及161所示的序列。
35.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
36.根据权利要求35所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：12及147所示的序列。
37.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
38.根据权利要求37所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：17及152所示的序列。
39.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
40.根据权利要求39所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：22及157所示的序列。
41.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于CC趋化因子受体4，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
42.根据权利要求41所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：31及166所示的序列。
43.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于4-1BB，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
44.根据权利要求43所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：116及117所示的序列。
45.根据权利要求14所述的分子，其特征在于：所述靶向部分包含一多肽，所述多肽结合于血管内皮生长因子，并且所述免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
46.根据权利要求45所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：88及89所示的序列。
47.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子或LIGHT的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
48.根据权利要求47所述的分子，其特征在于：所述配体结合片段包含一疱疹病毒进入介体(分化簇270)结合片段。
49.根据权利要求48所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含SEQ ID NO：8或302所示的序列。
50.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含分化簇226的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
51.根据权利要求50所述的分子，其特征在于：所述配体结合片段包含一分化簇155或分化簇112结合片段。
52.根据权利要求51所述的分子，其特征在于：所述配体结合片段包含SEQ ID NO：9所示的序列。
53.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
54.根据权利要求53所述的分子，其特征在于：所述配体结合片段包含一T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂结合片段。
55.根据权利要求52所述的分子，其特征在于：所述配体结合片段包含SEQ ID NO：55所示的序列。
56.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述免疫调节部分包含CC趋化因子受体4的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
57.根据权利要求56所述的分子，其特征在于：所述配体结合片段包含一趋化因子C-C基序配体22结合片段。
58.一种分子，其特征在于，包含一靶向部分、一第一免疫调节部分以及一第二免疫调节部分，其中：
(a)所述靶向部分包含一多肽，所述多肽特异性地结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(分化簇152)、程序性死亡受体-1蛋白、程序性死亡配体-1、程序性死亡配体-2、B7-H3(分化簇276)、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、癌胚抗原相关细胞粘附分子-1、癌胚抗原、T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、疱疹病毒进入介体、分化簇160、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、分化簇226、分化簇96、淋巴细胞活化基因-3、转化生长因子β、转化生长因子β受体、核因子κB受体致活剂、核因子κB受体致活剂配体、4-1BB(分化簇137)、诱导性T细胞共刺激分子、OX-40(分化簇134)、糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白、分化簇27、介白素-6受体、介白素-23受体、介白素-17受体、介白素-6、介白素-23、介白素-17、分化簇39、分化簇40、分化簇40L、分化簇47、分化簇73、CC趋化因子受体4、CC趋化因子受体5、趋化因子受体CXCR 4、介白素-12受体、分化簇4、介白素-2受体、分化簇25、分化簇3、糖蛋白120、表皮生长因子受体/人类表皮生长因子受体-1、表皮生长因子受体-2/人类表皮生长因子受体-2、表皮生长因子受体-3/人类表皮生长因子受体-3、表皮生长因子受体-4/人类表皮生长因子受体-4、表皮生长因子、转化生长因子α、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体-1、血管内皮生长因子受体-2或血管内皮生长因子受体-3中的一个或多个、
(b)所述第一免疫调节部分包含转化生长因子β受体II、程序性死亡受体-1蛋白、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、分化簇226、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、分化簇44、群落刺激因子1受体、CC趋化因子受体4、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、血管内皮生长因子受体、核因子κB受体致活剂、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1或T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂的一细胞外配体结合序列或其配体结合片段、以及
(c)所述第二免疫调节部分包含转化生长因子β受体II、程序性死亡受体-1蛋白、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、分化簇226、T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域、分化簇44、群落刺激因子1受体、CC趋化因子受体4、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、血管内皮生长因子受体、核因子κB受体致活剂、V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1或T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制剂的一细胞外配体结合序列或其配体结合片段。
59.根据权利要求58所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：201及202、203及204、205及206、207及208、213及214、215及216、217及218、219及220、225及226、227及228、229及230、231及232、237及238、239及240、241及242、243及244、249及250、251及252、253及254、255及256、261及262、263及264、265及266、267及268、273及274、277及278、281及282、或285及286所示的序列。
60.根据权利要求58所述的分子，其特征在于：所述靶向部分的多肽包含一免疫球蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单链可变片段、二价单链可变片段、多价单链可变片段、自一受体的所述细胞外结构域的一配体结合序列或含有可结晶片段多肽的一抗原结合结构域。
61.根据权利要求58所述的分子，其特征在于：所述靶向部分的多肽是一抗体。
62.根据权利要求61所述的分子，其特征在于：所述第一免疫调节部分连接至所述抗体的一重链或一轻链的C端。
63.根据权利要求61所述的分子，其特征在于：所述第二免疫调节部分连接至所述抗体的一重链或一轻链的C端。
64.根据权利要求58所述的分子，其特征在于：所述第二免疫调节部分连接至所述第一免疫调节部分。
65.根据权利要求62至63中任一项所述的分子，其特征在于：所述第一免疫调节部分以及所述第二免疫调节部分通过一连接体连接至所述抗体的所述重链或所述轻链。
66.根据权利要求64所述的分子，其特征在于：所述第二免疫调节部分通过一连接体连接至所述第一免疫调节部分。
67.根据权利要求65或66所述的分子，其特征在于：所述连接体包含SEQ ID NO：3、4或5所示的序列。
68.根据权利要求62及63所述的分子，其特征在于：所述第一免疫调节部分连接至所述抗体的所述重链，而所述第二免疫调节部分连接至所述抗体的所述轻链。
69.根据权利要求68所述的分子，其特征在于：所述第一免疫调节部分包含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
70.根据权利要求68所述的分子，其特征在于：所述第二免疫调节部分包含程序性死亡受体-1蛋白的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
71.根据权利要求65所述的分子，其特征在于：所述第一免疫调节部分包含转化生长因子β受体II的所述细胞外结构域或其配体结合片段，而所述第二免疫调节部分包含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
72.根据权利要求71所述的分子，其特征在于：所述第一免疫调节部分包含程序性死亡受体-1蛋白的所述细胞外结构域或其配体结合片段，而所述第二免疫调节部分包含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
73.根据权利要求62及63所述的分子，其特征在于：所述第一免疫调节部分包含转化生长因子β受体II的所述细胞外结构域或其配体结合片段，而所述第二免疫调节部分包含程序性死亡受体-1蛋白的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
74.根据权利要求61所述的分子，其特征在于：所述抗体特异性地结合于介白素-6受体、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、表皮生长因子受体、人类表皮生长因子受体-2或血管内皮生长因子。
75.根据权利要求65所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的一抗体，所述第一免疫调节部分是转化生长因子β受体II的所述细胞外结构域或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
76.根据权利要求75所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：203及204所示的序列。
77.根据权利要求65所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的一抗体，所述第一免疫调节部分是转化生长因子β受体II的所述细胞外结构域或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分是程序性死亡受体-1蛋白的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
78.根据权利要求77所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：201及202所示的序列。
79.根据权利要求65所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的一抗体，所述第一免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分是程序性死亡受体-1蛋白的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
80.根据权利要求65所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的一抗体，所述第一免疫调节部分是程序性死亡受体-1蛋白的所述细胞外结构域或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
81.根据权利要求79或80所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：205及206或是207及208所示的序列。
82.根据权利要求65所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是结合于程序性死亡受体-1蛋白或程序性死亡配体-1的一抗体，所述第一免疫调节部分是转化生长因子β受体II的所述细胞外结构域或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
83.根据权利要求82所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：273及274、277及278、285及286，或281及282所示的序列。
84.根据权利要求65所述的分子，其特征在于：所述靶向部分是结合于介白素-6受体的一抗体，所述第一免疫调节部分是转化生长因子β受体II的所述细胞外结构域或其配体结合片段，以及所述第二免疫调节部分是T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结构域或其配体结合片段。
85.根据权利要求84所述的分子，其特征在于：所述分子包含SEQ ID NO：215及216所示的序列。
86.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含：T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的一细胞外结合结构域或其配体结合片段、以及转化生长因子β受体II、程序性死亡受体-1蛋白、B淋巴细胞及T淋巴细胞衰减子、LIGHT、分化簇226、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1或V型及免疫球蛋白结构域的蛋白质8的一细胞外结合结构域或其配体结合片段。
87.根据权利要求86所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结合结构域或其配体结合片段，以及转化生长因子β受体II的所述细胞外结合结构域或其配体结合片段。
88.根据权利要求87所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含SEQ ID NO：190所示的序列。
89.根据权利要求86所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域-3的所述细胞外结合结构域或其配体结合片段，以及程序性死亡受体-1蛋白的所述细胞外结合结构域或其配体结合片段。
90.根据权利要求89所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含SEQ ID NO：195、196或197所示的序列。
91.根据权利要求86至90中任一项所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白还包含一可结晶片段。
92.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：如权利要求1至90中任一项所述的分子或融合蛋白以及一药学上可接受的载体。
93.一种治疗患有癌症或一传染病的一受试者的方法，其特征在于，所述方法包含：对所述受试者施用如权利要求1至90中任一项所述的分子或融合蛋白，或如权利要求91所述的组合物。
94.根据权利要求93所述的方法，其特征在于：所述分子或组合物通过皮内、皮下、静脉内、腹腔内、动脉内、鞘内、包膜内、眼窝内、心内、真皮内、经皮、经气管、表皮层下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊椎内、胸骨内、口腔、舌下颊、直肠、阴道、鼻腔或眼部给予而被施用、通过输注、吸入或雾化而被施用，或通过肠胃外给予而被施用。
95.根据权利要求93所述的方法、其特征在于：所述癌症选自于由肺癌、乳癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、子宫颈癌、食道癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、肾脏癌、子宫内膜癌、头颈癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、卵巢癌、黑素瘤、胆囊癌、喉癌、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌以及卡波西肉瘤所组成的群组。
96.根据权利要求93所述的方法，其特征在于：所述传染病选自于由流行性感冒、结核病、人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征、疟疾、肝炎、单纯疱疹病毒以及人类乳头瘤病毒所组成的群组。
97.根据权利要求93所述的方法，其特征在于：在所述分子、融合蛋白或组合物施用的同时、之前或之后，同时施用一化学治疗剂、免疫治疗剂或抗生素。
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