CN111394389A - 基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统及基于该系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供了针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统以及利用该拯救系统可定向设计SVA反向重组疫苗及构建SVA定向突变毒株在病毒基因功能、病毒变异及致病机制等研究中的应用。本发明利用聚合酶I和聚合酶II启动子、终止子、核酶等元件构建的单质粒塞内卡病毒拯救系统，实现了在质粒水平上编辑病毒基因组，为病毒定向设计、构建和拯救提供了技术平台。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用。
背景技术
塞内卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，也称塞内卡病毒(Senecavirus)、塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，也是该属的唯一成员。该病毒感染猪能够引起猪的原发性水泡病，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状难以区分。SVA感染后能引起断奶仔猪、保育、育肥和繁殖的各年龄段的猪发生水泡性病变，同时伴随跛行、发热、厌食、嗜睡等临床症状，新生仔猪除了上述症状外，还可能存在持续的腹泻、脱水等症状，甚至会突然死亡。
塞内卡病毒先后在美国、加拿大、巴西、哥伦比亚、中国、泰国等多个国家引发疫情，2015年传入我国，首次在广东出现疫情，并迅速扩散，在福建、广西、湖北、河南、河北、山东、辽宁等省均引起大量猪场发病，传播速度和致病力均比此前报道的有所增强，且有研究表明目前我国SVA流行毒株复杂，防控形势依然严峻。由于塞内卡病毒引起的临床发病症状与口蹄疫相似，且能与其形成混合感染，对口蹄疫的防控形成严重干扰，因此急需一个技术平台开展塞内卡病毒基础理论研究和防控产品创制。利用反向遗传操作技术平台建立SVA感染性克隆，研究塞内卡病毒变异、致病机制及高效疫苗研制等工作，显得尤为重要和迫切。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种针对正链RNA病毒的单质粒高效拯救系统，包括用所述单质粒拯救系统构建SVA感染性克隆的方法，以及利用该拯救系统定向构建、拯救SVA用于病毒基因功能、病毒变异及致病机制等基础研究和定向设计制备反向重组疫苗的应用研究。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统，所述单质粒拯救系统为包含有正链RNA病毒核酸序列的真核转录质粒，所述真核转录质粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子、鼠源RNA聚合酶I启动子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；
所述正链RNA病毒包括塞内卡病毒。
优选的，所述真核转录质粒的骨架载体包括pcDNA3.1。
优选的，当所述正链RNA病毒为塞内卡病毒时，将所述塞内卡病毒的核苷酸序列插入pcDNA3.1的PacI和NotI酶切位点之间。
优选的，所述插入的塞内卡病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明提供了一种塞内卡病毒全长感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的A基因；所述特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的B基因，所述特异性引物对包括上游引物SVA-BF和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的A基因和B基因分别与pMD20T载体连接，转化JM109感受态细胞，得质粒PMD-A和PMD-B；
(4)将质粒PMD-A用PacI和NheI双酶切、质粒PMD-B用NheI和NotI双酶切后，回收目的片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的所述真核质粒中，转化至JM109感受态细胞中，得真核转录质粒prSVV/FJ；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的限制关系。
优选的，步骤(1)扩增所述A基因时，包括：以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用上游引物SVA-1F0和下游引物SVA-AR进行扩增，得第一PCR产物；以第一PCR产物为模板，用上游引物SVA-1F和下游引物SVA-AR进行扩增，得A基因。
优选的，步骤(1)所述扩增和步骤(2)所述扩增的程序，均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min30s，35个循环；72℃延伸10min。
本发明还提供了利用所述构建方法构建得到的塞内卡病毒全长感染性克隆在拯救塞内卡病毒中的应用。
本发明提供了一种拯救塞内卡病毒的方法，包括以下步骤：将真核转录质粒prSVV/FJ转染塞内卡病毒敏感细胞，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，当80％～90％的细胞出现病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种塞内卡病毒敏感细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，得重组病毒rSVV/FJ。
优选的，所述转染的方法包括脂质体转染或非脂质体转染。
优选的，所述塞内卡病毒敏感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。
优选的，所述细胞病变包括细胞变圆、脱落，逐渐形成空斑、崩解成碎片。
本发明提供了一种塞内卡重组病毒rSVV/FJ，所述塞内卡重组病毒rSVV/FJ能在BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞中增殖，并引起细胞病变。
优选的，所述塞内卡重组病毒rSVV/FJ的基因中含沉默突变的NheI分子标记，该遗传标记可与亲本野生型毒株相鉴别。
本发明还提供了利用所述的方法获得的塞内卡重组病毒或所述的重组病毒在制备SVA重组疫苗中的应用。
本发明还提供了利用所述的单质粒拯救系统在构建SVA定向突变毒株中的应用。
本发明还提供了利用所述的单质粒拯救系统在定向设计SVA反向重组疫苗中的应用。
本发明提供了一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统及基于该系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法，以及利用该拯救系统定向设计SVA反向重组疫苗及构建SVA定向突变毒株在病毒基因功能、病毒变异及致病机制等研究中的应用。本发明利用聚合酶I和聚合酶II启动子、终止子、核酶等元件构建了单质粒的塞内卡病毒拯救系统，实现了在质粒水平上编辑病毒基因组，为病毒定向设计、构建和拯救提供了技术平台。
基于单质粒拯救系统构建SVA感染性克隆拯救病毒，可以实现SVA基因的定向设计，能够解决快速制备疫苗种毒的技术问题；且能够利用该技术平台开展SVA病毒基因功能、病毒变异及致病机制等相关的基础研究。
常规体外转录系统拯救病毒的操作繁琐、不稳定、且试剂昂贵，而本发明的单质粒拯救系统是在质粒水平操作，操作简便，拯救效率高效且稳定。用该系统拯救获得的塞内卡病毒与亲本毒具有高度一致性。
本发明技术实现了更为主动有效的SVA构建方式，具有重要应用价值。
附图说明
图1为实施例1中扩增SVA的A片段和B片段的电泳结果，其中1为A片段扩增产物；2为B片段扩增产物；M为DL 5000DNAMarker；
图2为实施例2中塞内卡病毒全长cDNA感染性克隆构建示意图；
图3为实施例3中重组病毒rSVV/FJ株感染BHK-21细胞后引起的细胞病变效应(CPE)，其中A表示正常BHK-21细胞；B表示出现CPE的BHK-21细胞；
图4为实施例3中重组病毒rSVV/FJ株感染PK-15细胞和IBRS-2细胞后引起的细胞病变效应(CPE)，其中A表示出现CPE的PK-15细胞；B表示出现CPE的IBRS-2细胞；
图5为实施例4中接种了rSVV/FJ株和SVV/FJ/001株的间接免疫荧光结果，其中A表示正常细胞对照，B表示接种rSVV/FJ株后的检测结果，C表示接种SVV/FJ/001株后的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统，所述单质粒拯救系统为包含有正链RNA病毒核酸序列的真核转录质粒，所述真核转录质粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子、鼠源RNA聚合酶I启动子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；所述正链RNA病毒包括塞内卡病毒。
本发明所述真核转录质粒的骨架载体包括pcDNA3.1。在本发明中，当所述正链RNA病毒为塞内卡病毒时，将所述塞内卡病毒的核苷酸序列插入pcDNA3.1的PacI和NotI酶切位点之间；所述插入的塞内卡病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。本发明在SVA全长cDNA基因组的5'端引入榔头锤酶核心序列(HamRz)，该酶核心序列有58nt，其3'末端C处具有自我剪切修饰位点；在SVA全长cDNA基因组的3'端引入丁型肝炎酶核心序列(HdvRz)，该酶核心序列有88nt，其5'末端G处具有自我剪切修饰位点。当将含有SVA基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体，再经榔头锤酶和丁型肝炎酶的剪切修饰，即可产生具有感染性的病毒RNA。
本发明提供了一种塞内卡病毒全长感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的A基因；所述特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的B基因，所述特异性引物对包括上游引物SVA-BF和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的A基因和B基因分别与pMD20T载体连接，转化JM109感受态细胞，得质粒PMD-A和PMD-B；
(4)将质粒PMD-A用PacI和NheI双酶切、质粒PMD-B用NheI和NotI双酶切后，回收目的片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的所述真核质粒中，转化至JM109感受态细胞中，得真核转录质粒prSVV/FJ；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的限制关系。
本发明以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的A基因；所述特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述塞内卡病毒株SVV/FJ/001株优选为保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.V201802的SVV/FJ/001，且已经在中国授权专利“塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用”ZL201810003888.2中进行过公开。本发明在扩增所述A基因时，优选包括：以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用上游引物SVA-1F0和下游引物SVA-AR进行扩增，得第一PCR产物；以第一PCR产物为模板，用上游引物SVA-1F和下游引物SVA-AR进行扩增，得A基因。本发明扩增A基因用的引物序列如下所示：
SVA-1F0：5'-gtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcttgaaagggggggctgggcc-3'(SEQ ID NO.1)；
SVA-1F：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactatagga-3'(SEQ ID NO.2)；
SVA-AR：5'-gttgtcgctagcagggccagggttggtctc-3'(SEQ ID NO.3)。
本发明在A基因扩增过程中的程序，优选为94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min30s，35个循环；72℃延伸10min。本发明扩增A基因所用上游引物SVA-1F、SVA-1F0中引入PacI酶切位点和榔头锤酶核心序列，以保证在转录后经剪切修饰产生具有感染性的病毒RNA，其下游引物SVA-AR含NheI酶切位点，将SVA3512-3514位编码丝氨酸的TCT同义突变为AGC，引入了NheI酶切位点，该位点突变不仅可以用于全长cDNA的构建，还能够作为分子标记/遗传标记区别于亲本毒。
本发明以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的B基因，所述特异性引物对包括上游引物SVA-BF和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明扩增B基因所用的引物序列如下所示：
SVA-BF：5'-ccccagctagcgacaacccgatcctg-3'(SEQ ID NO.4)；
SVA-2R：5'-ttttctagagcggccgct38-3'(SEQ ID NO.5)。本发明扩增B基因的上游引物SVA-BF同样引入了NheI酶切位点，其下游引物SVA-2R含NotI酶切位点和38nt的poly(T)。本发明在B基因扩增过程中的程序，优选为94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min30s，35个循环；72℃延伸10min。
本发明对SVV/FJ/001株的cDNA的来源并没有特殊限定，优选利用RNAeasy MiniKit(Qiagen)提取SVV/FJ/001的总RNA，用引物SVA-2R反转录合成第一链cDNA。
本发明将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的A基因和B基因分别与pMD20T载体连接，转化JM109感受态细胞，得质粒PMD-A和PMD-B。本发明对所述连接和转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明将质粒PMD-A用PacI和NheI双酶切、质粒PMD-B用NheI和NotI双酶切后，回收目的片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的所述5'端引入聚合酶启动子基因、3'端引入丁型肝炎酶核心序列、聚合酶终止子序列的真核质粒中，转化至JM109感受态细胞中，得真核转录质粒prSVV/FJ。本发明所述真核转录质粒prSVV/FJ的构建流程优选如图2所示，利用所述方法，可获得含改造的SVV/FJ/001全长基因的真核转录质粒prSVV/FJ。
本发明还提供了一种利用所述构建方法构建得到的塞内卡病毒全长感染性克隆在拯救塞内卡病毒中的应用。
本发明还提供了一种塞内卡病毒拯救的方法，包括以下步骤：将真核转录质粒prSVV/FJ转染塞内卡病毒敏感细胞，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，当80％～90％的细胞出现病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种塞内卡病毒敏感细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，得重组病毒rSVV/FJ。本发明所述转染的方法优选包括脂质体转染或非脂质体转染；当在脂质体的介导下将真核转录质粒prSVV/FJ转染塞内卡病毒敏感细胞时，有80％～90％的细胞出现细胞病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种塞内卡病毒敏感细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，得重组病毒rSVV/FJ。本发明所述塞内卡病毒敏感细胞优选包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。本发明实施例中在BHK-21细胞生长至80％时用于转染，按照脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen)说明书，将重组质粒在其介导下转染BHK-21细胞。本发明所述转染培养优选在培养箱中进行，所述培养箱中优选含5％CO2，所述培养箱的温度优选为37℃。
本发明所述细胞病变优选包括细胞变圆、脱落，逐渐形成空斑、崩解成碎片。
本发明还提供了一种塞内卡重组病毒rSVV/FJ，所述塞内卡重组病毒rSVV/FJ能在BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞中增殖，并引起细胞病变。本发明所述塞内卡重组病毒rSVV/FJ的基因中含沉默突变的NheI分子标记，该遗传标记可与亲本野生型毒株相鉴别。
本发明利用所述的方法获得的塞内卡重组病毒或所述的重组病毒在制备SVA重组疫苗中的应用。由于利用所述方法获得的所述塞内卡重组病毒具有与野生亲本毒相似的生物学特性，并含特有的遗传标记，可用于制备SVA重组疫苗。
本发明利用所述的单质粒拯救系统在构建SVA定向突变毒株中的应用。用本发明所述单质粒拯救系统为技术平台，针对性构建SVA基因定点突变、缺失等毒株，为病毒基因功能、病毒变异及致病机制等基础研究提供平台与技术支撑。
本发明利用所述的单质粒拯救系统在定向设计SVA反向重组疫苗中的应用。用本发明所述单质粒拯救系统为技术平台，以SVA基础理论研究为指导，突变、改造SVA关键基因，以提升和改良制苗种毒的多种性能，如提高产能、提高抗原性、降低免疫抑制性及致病性等，为SVA反向重组疫苗种毒设计构建提供平台与支撑。
下面结合实施例对本发明提供的基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
塞内卡重组病毒感染性克隆的构建
所用SVV/FJ/001毒株保藏于中国典型培养物保藏中心(微生物保藏号：CCTCC NO:V201802)，(公开于授权专利“塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用”ZL201810003888.2中，其全文通过引用并入本申请中)，根据SVA基因组序列(Genebank：KY747510)，通过比较分析，设计引入拯救元件且覆盖SVA全基因组的扩增引物：
SVA-1F0：5'-gtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcttgaaagggggggctgggcc-3'(SEQ ID NO.1)；
SVA-1F：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactatagga-3'(SEQ ID NO.2)；
SVA-AR：5'-gttgtcgctagcagggccagggttggtctc-3'(SEQ ID NO.3)；
SVA-BF：5'-ccccagctagcgacaacccgatcctg-3'(SEQ ID NO.4)；
SVA-2R：5'-ttttctagagcggccgct38-3'(SEQ ID NO.5)；
在以上的特异引物中，扩增A片段所用上游引物SVA-1F、SVA-1F0中引入PacI酶切位点和榔头锤酶核心序列，以保证在转录后经剪切修饰产生具有感染性的病毒RNA，其下游引物SVA-AR含NheI酶切位点，该酶切位点是通过基因序列分析，将SVA3512-3514位编码丝氨酸的TCT同义突变为AGC，引入了NheI酶切位点，该位点突变不仅可以用于全长cDNA的构建，还能够作为分子标记区别于亲本毒；扩增B片段的上游引物SVA-BF同样引入了NheI酶切位点，其下游引物SVA-2R含NotI酶切位点和38nt的poly(T)。
用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取SVV/FJ/001的总RNA，用引物SVA-2R反转录合成第一链cDNA，用具有极强延伸能力的PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa公司)反转录酶，按照产品说明书配制20μL反应体系，于42℃反应1h备用，以反转录的第一链cDNA为模板，用引物SVA-1F0和SVA-AR扩增，以该扩增产物为模板，用引物SVA-1F和SVA-AR进行第二轮扩增，获得第一个基因片段A片段；以反转录的第一链cDNA为模板，用引物SVA-BF和SVA-2R扩增获得第二个基因片段B片段。上述扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA
(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，35个循环后，72℃10min，纯化回收PCR扩增产物，扩增产物的电泳结果如图1所示，A和B大小分别为3580bp和3820bp，与预期大小相符。
将上述A和B基因片段分别进行胶回收，与pMD20 T载体连接，转化JM109感受态细胞，筛选、测序鉴定阳性克隆，分别命名为PMD-A和PMD-B。
实施例2
塞内卡病毒全长cDNA感染性克隆的构建
构建方法示意图如图2所示：将质粒PMD-A用PacI和NheI双酶切、质粒PMD-B用NheI和NotI双酶切后，分别回收目的片段，然后将含有聚合酶启动子基因、聚合酶终止子、核酶序列的真核质粒用PacI和NotI双酶切，纯化回收载体片段，经T4连接酶连接、转化至JM109感受态细胞中，经酶切、测序鉴定阳性克隆，获得含改造的SVV/FJ/001全长基因的真核转录质粒prSVV/FJ。
实施例3
塞内卡病毒的拯救及不同细胞的培养特性
3.1塞内卡病毒的拯救
用
Plasmid Plus Maxi Kit(QIAGEN公司)制备由实施例2得到的真核转录质粒prSVV/FJ。接种BHK-21细胞于T12.5细胞瓶中，当细胞生长至80％时用于转染，在脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen)的介导下将4μg重组质粒转染BHK-21细胞，同时设立脂质体对照和正常细胞对照，放置于含5％CO2的37℃培养箱中，转染6h后弃去上清，加入MEM培养基，继续培养，观察细胞状态及细胞病变情况，待80％～90％左右的细胞出现病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆、脱落，逐渐形成空斑、崩解成碎片的病变现象。将得到的重组病毒命名为rSVV/FJ，在图3中，A：为正常对照BHK-21细胞图片；B：拯救的重组病毒rSVV/FJ-M感染BHK-21。
3.2塞内卡病毒在不同细胞的培养特性
将上述3.1拯救获得的重组塞内卡病毒rSVV/FJ株感染不同细胞，结果发现该重组毒株能够在BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞等细胞中增殖，并引起典型的细胞病变，与野生亲本毒株SVV/FJ/001株在上述不同细胞上的培养特性相似。rSVV/FJ株在PK-15细胞、IBRS-2细胞上引起的病变如图4所示。
实施例4
塞内卡病毒的鉴定
4.1 RT-PCR鉴定
将稳定传代的rSVV/FJ株感染BHK-21细胞的上清用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA，反转录后，扩增P1基因和P2基因，扩增P1基因的引物为：
P1F：5'-ggtaatgtccagacaacctc-3'(SEQ ID NO.6)；
P1R：5'-ttgcatcagcatcttctgc-3'(SEQ ID NO.7)；
扩增P2基因的引物为：
P2F：5'-tcaggcgacgtcgagaccaac-3'(SEQ ID NO.8)；
P2R：5'-ctgtagaaccagagtctgc-3'(SEQ ID NO.9)
纯化回收扩增片段后送测序，结果显示获得的P1基因与SVV/FJ/001株参考序列一致，P2基因中引入的区分于亲本毒的分子标记序列可以稳定存在。
4.2间接免疫荧光鉴定
将rSVV/FJ株和SVV/FJ/001分别感染BHK-21细胞的培养物反复冻融后，接种至底部放置了载玻片的生长有BHK-21细胞的六孔板里(单层细胞生长至60～70％)，置于含5％CO2的37℃培养箱中，按常规方法做间接免疫荧光，一抗为SVA豚鼠阳性血清，二抗为FITC标记山羊抗豚鼠IgG(Sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种rSVV/FJ株和SVV/FJ/001培养物的细胞中均可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光产生(图5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgaggacga aactatagga aaggaattcc tatagtcttg aaaggggggg ctgggcc 57
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataggtttaa ttaatgttaa gcgtctgatg agtccgtgag gacgaaacta tagga 55
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgtcgcta gcagggccag ggttggtctc 30
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccccagctag cgacaacccg atcctg 26
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttttctagag cggccgcttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttt 55
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtaatgtcc agacaacctc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgcatcagc atcttctgc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaggcgacg tcgagaccaa c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgtagaacc agagtctgc 19
<210> 10
<211> 7319
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgaaagggg gggctgggcc ctcatgccca gtccttcctt tccccttccg gggggtaaac 60
cggctgtgtt tgctagaggc acagaggagc aacatccaac ctgcttttgt ggggaacagt 120
gcggctccaa ttcctgcgtc gccaaaggtg ttagcgcacc caaacggcgc atctaccaat 180
gctattggtg tggtctgcga gttctagcct actcgtttct cccctactca ctcatttaca 240
cacaaaaact gtgttgtaac tacaggattt ggccctcgca cgggatgtgc gataaccgca 300
agattgactc aagcgcggaa agcgttgtaa ccacatgctg ttagtccctt tatggctgtg 360
agatggctat ccacctcgga tcactgaact ggagctcgac cctccttagt aagggaaccg 420
agaggccttc ctgcaacaag ctccgacaca gagtccacgt gattgctacc accatgagta 480
catggttctc ccctctcgac ccaggacttc tttttgaata tccacggctc gatccagagg 540
gtggggcatg atccccctag catagcgagc tacagcggga actgtagcta ggccttagcg 600
tgccttggat actgcctgat agggcgacgg cctagtcgtg tcggttctat aggtagcaca 660
tacaaatatg cagaactctc atttttcttt cgatacagcc tctggcacct ttgaagacgt 720
aaccggaaca aaagtcaaga tcgttgaata ccccagatcg gtgaacaatg gtgtttacga 780
ttcgtccact catttagaga tactgaacct acagggtgaa attgaaattt taaagtcttt 840
caacgaatac caaattcgcg ccgctaaaca acaacttgga ctggacatcg tatacgaact 900
acagggtaat gtccagacaa cctcaaagaa cgattttgat tcccgcggca ataatggtaa 960
catgaccttc aattactacg caaacactta ccagaattca gtagacttct cgacctcctc 1020
gtcggcgtca ggcgccggac ccgggaactc ccggggcgga ttagcgggtc tcctcacaaa 1080
tttcagtgga atcttgaacc ctcttggcta cctcaaagat cacaataccg aagaaatgga 1140
aaactctgct gatcgagtca taacgcaaac ggcgggcaac actgccataa acacgcaatc 1200
atcactgggt gtgttgtgtg cctacgttga agacccgacc aaatctgacc ctccgtccag 1260
cagcacagat caacccacca ccacttttac tgccatcgac aggtggtaca ctggacggct 1320
caattcttgg acaaaagctg taaaaacctt ctcttttcag gccgtcccgc tccctggagc 1380
cttcctgtct aggcagggag gcctcaacgg aggggccttc acggctaccc tacatagaca 1440
tttcttaatg aagtgcgggt ggcaagtgca ggtccaatgc aatttgacac aattccacca 1500
aggcgctctt cttgttgcca tggtccccga aaccaccctt gatgtcaaac ctgacggcaa 1560
ggcaaagagc ttacaagagc tgaatgaaga gcagtgggtg gagatgtctg acgattaccg 1620
gaccgggaaa aacatgcctt ttcagtctct tggcacttac tatcggcccc ctaactggac 1680
ttggggcccc aatttcatca acccctatca agtaacagtc ttcccacacc aaattctgaa 1740
cgcgagaacc tctacctcgg tagacataag tgtcccatac atcggggaga ctcctacgca 1800
atcctcagag acacagaact cctggaccct cctcgttatg gtgcttgtcc ccctggacta 1860
caaggaggga gccacaactg acccagaaat tacattttct gtaaggccta caagtcctta 1920
cttcaacggg cttcgtaacc gtttcacgac cgggacggac gaggagcagg ggcccattcc 1980
cacagcaccc agagaaaatt cgcttatgtt tctctcaacc atccctgacg acactgttcc 2040
tgcttacggg aatgtgcgta cccctcccgt caattacctc cctggtgaaa taaccgacct 2100
cttacaactg gcccgtatac ccactctcat ggcgtttggg cgggtgtctg aacccgagcc 2160
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catggtggca agagggaaat tcctgctctc gtattctccc ccaaatggag cacaaccaca 2400
gaccctttct gaagctatgc agtgcacata ctctatttgg gatataggct tgaactctag 2460
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acagcaggac gatggttact tttgtcttct aacaccccgc ccaacagtcg cttcccgacc 2940
cgccactcgt ttcggcctgt acgtcaaccc gtctgacaat ggcgttctcg ctaacacttc 3000
actggatttc aatttttaca gtttggcctg tttcacttac tttagatcag accttgaagt 3060
cacggtggtc tcactggagc cagatctgga attcgccgtg gggtggttcc cctctggcag 3120
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gcgcactccc cgcgctttca ccagcaaggg tggaaaggta tccttcgtgc tcccttggaa 3240
ctctgtctct tccgtgcttc ccgtgcgctg ggggggcgcc tccaagcttt cttctgccac 3300
gcggggtctg ccggctcatg ctgactgggg gaccatttac gcctttatcc cccgtcctaa 3360
cgagaagaaa ggcaccgctg taaagcacgt ggcggtgtac gttcggtaca agaacgcgcg 3420
tgcctggtgc cccagcatgc ttccctttcg cagctacaag cagaagatgc tgatgcaatc 3480
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agcggaaaac gatctagtca ctctggcctc tctctggaag atggtacact ctgttcaaca 3600
gacctggaga aagtacgtga agaacgacaa tttttggccc aacttgctca gtgagctagt 3660
gggggaaggc tccatcgcct tggccgccac gctatctaac caagcttcag tgaaagctct 3720
cttgggcctg cattttctct ctcgagggct caattacaca gatttttact ctttactgat 3780
agagaaatgc tctagtttct ttactgtaga accgcctcct ccaccagctg aaaatctgat 3840
gaccaagccc tccgtgaagt cgaaattccg aaagctgttt aagatgcaag gacccatgga 3900
cacagtcaaa gactggaacc aaatagccgc cggcttgaag aatttccaat ttgttcgtga 3960
cctagtcaag gaggtggtcg actggctcca ggcctggatc aacaaagaga aagccagccc 4020
tgtcctccag taccagctgg agatgaagaa gctcgggccc gtggctttgg ctcatgatgc 4080
cttcatggcc ggttccgggc cccctcttgg tgacgaccag attgaatacc tccagaacct 4140
caaatctctt gccctaacac tgggaaagac taatttggcc caaagcctca ccactatgat 4200
caatgccaag cagagctccg cccaacgagt cgaacccgtt gtggtggtcc tcagaggcaa 4260
gccgggatgc ggcaaaagct tggcctccac gttgattgcc caggctgtgt ccaagcgtct 4320
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gaagggacgt cccttcacct ccaatcttat cattgcgact acaaacctcc ctcactttag 4560
ccctgtcacc attgctgatc cttctgcagt ctctcggcgt atcaactacg acctgactct 4620
agaagtatct gaggcttaca agaagcacac acggctgaat ttcgacctgg ctttcagacg 4680
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agacattcgg gccaagcaac aaggtgctcg aaatatgcag actctggttc tacagagccc 4860
taacgagaac gacgacaccc ccgtcgacga ggcgttgggt agagttctca cccccgctgc 4920
ggtcgacgag gcgcttgtcg acctcgctcc agatgccgac ccggttggcc gcctggctat 4980
tctcgccaag ctaggtcttg ccctagctgc ggtcacccct ggtttgataa tcttggcagt 5040
gggactctac aagtacttct ctggctctga cacagaccaa gaagaaacag aaactgagga 5100
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gtccaacccc tcctggacca gcttcacaat ccgtggtgag gtgcacactc gtgatgagcc 5400
tttccaaacg gttcatttta ctcaccatgg tcttcccaca gatctgatga tggtacgtct 5460
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acgtaactcc cgtgtggttg gcgtttcggc tagttacggt aacttcttct tctctgggaa 5580
cttcctcggg tttgttgact ccattacctc tgaccaagga acctatgcga gacttttcag 5640
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tgtccgacgc ataattggta tgcattctgc tggtgccgct ggtatcggcg ccgggactta 5760
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gcaaggactg atgactgagc tagagcctgg agtcaccgta catgtacccc gaaaatctaa 5880
attgagaaag acgaccgcac acgcggtgta caaaccggag tttgaacctg ctgtgttgtc 5940
aaaatttgat cccagactga acaaggatgt tgacctagat gaggtaattt ggtctaaaca 6000
caccgccaac gtcccttatc aacctccttt gttctacaca tacatgtcag agtacgctca 6060
tcgggttttc tcctttttgg gaaaagacaa tgacgttctg accgtcaaag aagcaatcct 6120
gggcatccct ggactagacc ctatggatcc ccacacagct ccgggtttgc cctacgccat 6180
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tctgaaagat gaaatcagac cctcagagaa ggtccgggcg ggaaaaaccc gcattgtcga 6360
tgtgccctcc ctggcgcact gcattgtggg cagaatgctg cttgggcgct ttgccgccaa 6420
gtttcaatcc catcctggct ttctccttgg ctccgctatc gggtctgacc ccgatgtctt 6480
ctggaccgtc ataggggctc agctcgaggg aagaaagaac acgtatgacg tggactacag 6540
tgcctttgac tcttcacacg gcactggctc cttcgaggct ctcatctatc actttttcac 6600
cgtggacaat ggtttcagcc ctgcgctggg accgtatctc agatccctgg ctgtctcggt 6660
gcacgcttac ggcgagcgtc gcatcaagat taccggaggc ctcccctctg gttgtgccgc 6720
gaccagcctg ctgaacacag tgctcaacaa tgtgatcatc aggactgctc tggcattgac 6780
ctacaaggaa tttgaatatg acatggttga tatcatcgcc tacggtgacg accttttggt 6840
tggtgcggat tacgatctgg acttcaatga ggtggcgcgg cgcgctgcca aactggggta 6900
taagatgact cccgccaaca agggttctgt cttccctccg acttcctctc tctccgatgc 6960
tgtttttcta aaacgcaaat tcgtccaaaa caatgacggc ttatataaac cagttatgga 7020
tttaaagaat ttggaagcca tgctctccta cttcaaacca ggaacactac tcgagaagct 7080
gcaatctgtt tctatgttgg ctcaacattc tggaaaagaa gaatatgata gattgatgca 7140
ccccttcgct gactacggtg ccgtaccgag tcacgagtac ctgcaggcaa gatggagggc 7200
cttgttcgac tgacctggat agcccaacgc gcttcggtgc tgccggcgat tctgggagaa 7260
ctcagtcgga acagaaaagg gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 7319
Claims (9)
1.一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统，其特征在于，所述单质粒拯救系统为包含有正链RNA病毒核酸序列的真核转录质粒，所述真核转录质粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子、鼠源RNA聚合酶I启动子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；
所述正链RNA病毒包括塞内卡病毒。
2.一种塞内卡病毒全长感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的A基因；所述特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的B基因，所述特异性引物对包括上游引物SVA-BF和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的A基因和B基因分别与pMD20T载体连接，转化JM109感受态细胞，得质粒PMD-A和PMD-B；
(4)将质粒PMD-A用PacI和NheI双酶切、质粒PMD-B用NheI和NotI双酶切后，回收目的片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的权利要求1或2所述真核质粒中，转化至JM109感受态细胞中，得真核转录质粒prSVV/FJ；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的限制关系。
3.利用权利要求2所述构建方法构建得到的塞内卡病毒全长感染性克隆在拯救塞内卡病毒中的应用。
4.一种拯救塞内卡病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：将真核转录质粒prSVV/FJ转染塞内卡病毒敏感细胞，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，当80％～90％的细胞出现病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种塞内卡病毒敏感细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，得重组病毒rSVV/FJ。
5.一种塞内卡重组病毒rSVV/FJ，其特征在于，所述塞内卡重组病毒rSVV/FJ能在BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞中增殖，并引起细胞病变。
6.如权利要求5所述的塞内卡重组病毒rSVV/FJ，其特征在于，所述塞内卡重组病毒rSVV/FJ的基因中含沉默突变的NheI分子标记，该遗传标记可与亲本野生型毒株相鉴别。
7.利用权利要求4所述的方法获得的塞内卡重组病毒或权利要求5或6所述的重组病毒在制备SVA重组疫苗中的应用。
8.利用权利要求1所述的单质粒拯救系统在构建SVA定向突变毒株中的应用。
9.利用权利要求1所述的单质粒拯救系统在定向设计SVA反向重组疫苗中的应用。
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