CN111378649A

CN111378649A - 一种高效洗涤液

Info

Publication number: CN111378649A
Application number: CN202010096626.2A
Authority: CN
Inventors: 杨俊�; 范明姣; 唐续; 高骏
Original assignee: Guangzhou Dazheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Dazheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-02-17
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明公开了一种高效洗涤液。它包括70％～80％V/V乙醇、50mM～100mM NaCl、0.5mM～1mM EDTA、5mM～15mM Tris‑HCl、1mg/ml～1.5mg/ml BSA，溶剂为DEPC水。本发明的洗涤液中，EDTA可以螯合多种离子，乙醇可清洗掉有机溶剂，BSA可去除样本在裂解过程中产生的蛋白，进而得到纯度较高的核酸。即本发明采用高效洗涤液系统，可以将杂质盐类、蛋白、糖类、有机溶剂等冲洗干净，获得高质量高纯度的核酸。该洗涤液系统配置方法简单，易操作，且不含有毒有害成分。

Description

一种高效洗涤液

技术领域：

本发明属于DNA提取领域，具体涉及一种高效洗涤液。

背景技术：

核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取RNA或DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。不过在PCR分子诊断过程中，获得的RNA或DNA的总拷贝数和质量纯度会直接影响到后续检验实验的结果，所以，获得高纯度高质量的核酸是下游研究顺利进行的最基本前提。

试剂盒法是目前临床应用广泛且最简便的方法，商品化的核酸提取试剂盒种类繁多，性能迥异，但提取效率不尽相同，试剂盒主要组成有裂解液、蛋白酶K溶液、结合液、洗涤液、洗脱液，2小时内即可完成大批量样本核酸提取工作，但目前常用的试剂盒往往存在一个问题：1.洗涤液纯化效果不好，获得的核酸浓度高但是纯度很低，常常掺杂有许多杂质，例如盐类、蛋白、糖类、有机溶剂等，PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是一种用于扩增特定的核酸片段的分子生物学技术，其最大特点，是能将微量的核酸进行大量的富集和加倍，从而达到便于检测微量核酸的目的。其对于核酸的纯度要求极高，当核酸有污染时往往会严重影响PCR分子诊断，进而影响下游实验的开展。

因此，现在急需一种高效洗涤液来更好地解决核酸纯度低的难题。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种高效洗涤液配方，采用该洗涤液纯化DNA和RNA可以将杂质盐类、蛋白、糖类、有机溶剂等冲洗掉，获得纯度较高的核酸。

本发明的高效洗涤液，包括70％～80％V/V乙醇、50mM～100mM NaCl、0.5mM～1mMEDTA、5mM～15mM Tris-HCl、1mg/ml～1.5mg/ml BSA，溶剂为DEPC水。

优选，包括70％V/V乙醇、50mM NaCl、0.5mM EDTA、10mM Tris-HCl、1mg/ml BSA，溶剂为DEPC水。

本发明的洗涤液中，EDTA可以螯合多种离子，乙醇可清洗掉有机溶剂，BSA可去除样本在裂解过程中产生的蛋白，进而得到纯度较高的核酸。即本发明采用高效洗涤液系统，可以将杂质盐类、蛋白、糖类、有机溶剂等冲洗干净，获得高质量高纯度的核酸。该洗涤液系统配置方法简单，易操作，且不含有毒有害成分。

具体实施方式：

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1：

高效洗涤液成分包括：70％v/v乙醇，50mMNaCl，0.5mMEDTA，10mMTris-Hcl，1mg/mlBSA，溶剂为DEPC水。其配制方法是将各成分按其含量混合均匀。

对100例样品分离纯化RNA，并与常用试剂盒进行平行对比，样品为2年内的石蜡包埋临床样本。

1、提取RNA

所用试剂除洗涤液为本发明的高效洗涤液，其他试剂均为常用试剂盒组分，按照常用试剂盒说明书进行平行实验。

本发明所述的常用试剂盒是RNApure FFPE Kit(固定组织RNA提取试剂盒)，目录号：CW0535S(50preps)，保存条件：室温(15-30℃)；

提取方法为：

备注：Buffer RW2为RNApure FFPE Kit试剂盒中的洗涤液，当测试本发明的高效洗涤液的时候，将其换成本发明的高效洗涤液。

产品内容

操作步骤

a.取约1×1cm²的切片(共约4-5片切片)置于离心管(自备)中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。

b.12,000rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

c.加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12,000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。

注意：乙醇可以除去样品中残余的二甲苯。

d.打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。

e.加入150μl Buffer GTL，重悬沉淀；加入10μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。

f.56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成RNA断裂，产生RNA碎片。2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到80℃后再把样品置于80℃孵育。

g.加入320μl Buffer GL，涡旋震荡彻底混匀。

h.将步骤g中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的过滤柱(Spin ColumnsFM)中。12,000rpm离心1分钟，收集滤液。

i.在步骤h得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。

注意：加入无水乙醇后，可能有少量沉淀物析出，但不影响后续操作。

j.将步骤i中所得的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RS)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

k.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

l.重复步骤k。

m.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。

注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。

n.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μlRNase-Free Water，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-20℃保存RNA。

注意：1)RNase-Free Water体积不应小于20μl，体积过小影响回收率。

2)如果要提高RNA的产量，可用20-50μl新的RNase-Free Water重复步骤n。

3)如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤n。

2.所提RNA含量值检测

采用Nondrop one对本发明的高效洗涤液提取的RNA进行含量及纯度检测，结果如表1所示：

表1本发明方法提取的RNA含量、纯度以及常用试剂盒提取的RNA含量、纯度

结果显示，本发明所述的高效洗涤液所纯化的核酸纯度显著高于常用试剂盒。

实施例2：

本实施例与实施例1基本相同，只是高效洗涤液成分包括：80％v/v乙醇，100mMNaCl，1mMEDTA，5mMTris-Hcl，1mg/mlBSA，溶剂为DEPC水。其配制方法是将各成分按其含量混合均匀。

实施例3：

本实施例与实施例1基本相同，只是高效洗涤液成分包括：80％v/v乙醇，100mMNaCl，1mMEDTA，15mMTris-Hcl，1mg/mlBSA，溶剂为DEPC水。其配制方法是将各成分按其含量混合均匀。

Claims

1.一种高效洗涤液，其特征在于，包括70％～80％V/V乙醇、50mM～100mM NaCl、0.5mM～1mM EDTA、5mM～15mM Tris-HCl、1mg/ml～1.5mg/ml BSA，溶剂为DEPC水。

2.根据权利要求1所述的高效洗涤液，其特征在于，包括70％V/V乙醇、50mM NaCl、0.5mM EDTA、10mM Tris-HCl、1mg/ml BSA，溶剂为DEPC水。