CN111269309B - 一种glp-1类似多肽的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种GLP‑1类似多肽的纯化方法，所述纯化方法采用超临界色谱法；其特征在于，以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，流动相中A1相为二氧化碳；B相为有机溶剂；所述有机溶剂选自甲醇、乙腈或其混合物；所述柱温度为30‑40℃，并一定洗脱压力下的线性洗脱；洗脱压力为自柱温度×0.25的柱压力至柱温度×0.3的柱压力的线性洗脱，其中柱压力单位为MPa。本发明的方法制备环保，且效率高，纯度高，收率高。

Description

一种GLP-1类似多肽的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种多肽的纯化方法，具体公开了超临界流体色谱法纯化GLP-1类似多肽的方法。

背景技术

Ⅱ型糖尿病，是一种胰岛素分泌缺陷和作用障碍为特征的慢性疾病。根据国际糖尿病联盟(IDF)统计，预计到2030年，全球将有5亿人罹患糖尿病，我国也已成为糖尿病的重灾区。

根据肠促胰岛素的特性，目前已研发上市的药品有2大类，即GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂，GLP-1是胃肠内分泌细胞产生的肽类物质，能够促进胰岛素的分泌、刺激β细胞增生，抑制胰高血糖素的释放等等，国内已上市的GLP-1受体激动剂主要有艾塞那肽和利拉鲁肽，均为皮下注射剂，索马鲁肽(semaglutide)是GLP-1的受体激动素之一，由丹麦诺和诺德公司研制的。semaglutide的临床数据显示，每周一次的剂量，由于其血糖控制、减肥、低水平的低血糖的药物属性，在改善2型糖尿病患者治疗方面，具有巨大的潜力。

分子式如下：

现有索马鲁肽等GLP-1类似物纯化也基本采用反相色谱纯化，有机溶剂使用量大，工业污水多，环境污染重、回收处理难度大成本高。因此相对绿色环保的索马鲁肽纯化工艺是制备工艺中的难点，尤其大规模制备纯化减少环境污染已成为制约多肽产业化的瓶颈之一，本发明可以解决此问题。

专利CN 105017381 A工艺中，采用乙腈作为流动相进行梯度洗脱，洗脱过程中，产生大量的有机废水溶液，并且里面含有盐酸等酸性物质，不仅有机废水较多，并且处理难度较大。

专利CN 103421092 A工艺中，采用酸性条件的醋酸铵和乙腈作为流动相进行洗脱，纯化过程中，同样产生大量的有机溶剂废水，污染较大，处理较困难。

现有多肽纯化方法基本采用反相色谱方法，需要用到大量的水、有机溶剂，进而会产生大量的工业废水，难处理、难回收。

发明内容

一种GLP-1类似多肽的纯化方法，采用超临界流体色谱进行纯化，一步即可完成。以一定浓度、温度和压力的二氧化碳为A相，以乙腈和甲醇作为夹带剂为B相，压力梯度洗脱的，收集溶液旋蒸冻干即得到GLP-1类似多肽。

超临界流体色谱法基本原理是以超临界流体作流动相，以固体吸附剂(如硅胶)或键合在载体(或毛细管壁)上的有机高分子聚合物作固定相的色谱方法，采用的超临界气体为二氧化碳，主要是因为当二氧化碳当温度超过31.05℃，压力超过7.38mpa，即进入超临界二氧化碳状态，并且二氧化碳性质稳定、无毒、不易燃爆和价格低廉而备受青睐。因未采用水作为流动相，所以没有工业废水，因采用的为二氧化碳和甲醇、乙腈，回收较容易，成本较低。

本发明一个方面提供了一种GLP-1类似多肽的纯化方法，所述纯化方法采用超临界色谱法；其特征在于，以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，流动相中A1相为二氧化碳；B相为有机溶剂；所述有机溶剂选自甲醇、乙腈或其混合物；

所述柱温度为30-40℃，并在一定洗脱压力下的线性洗脱；

洗脱压力为自柱温度×0.25的柱压力至柱温度×0.3的柱压力的线性洗脱，其中柱压力单位为MPa。

在本发明的技术方案中，流动相流速为50ml/min-20L/min，优选为60-200ml/min。所述的流动相流速可以根据色谱柱长度和直径调整。

在本发明的技术方案中，柱压力范围为7.50-12.0MPa。

在本发明的技术方案中，检测器为紫外检测器，检测波长为220-240nm，优选为230nm。

在本发明的技术方案中，B相为甲醇和乙腈的体积比例为2-10:1。

在本发明的技术方案中，在洗脱前进行清洗和平衡，所述清洗和平衡为将色谱柱用50％A+50％B，压力10MPa清洗，用70％A+30％B平衡。

在本发明的技术方案中，色谱柱直径为5cm以上，直径25cm以上。

在本发明的技术方案中，所述的GLP-1类似多肽为疏水基团修饰的GLP-1类似多肽，优选地，疏水基团修饰的GLP-1类似多肽选自索马鲁肽、利拉鲁肽。

索马鲁肽等多肽肽链较长，侧链含有较长的修饰，并且含有如Ser等合成过程中易异构化的氨基酸而导致粗肽中具有异构体杂质，同时肽序中含有疏水性较强的氨基酸，传统反相色谱制备大量使用有机溶剂，增加其洗脱能力，产生大量的有机工艺废水。本发明通过采用超临界流体色谱方法，以丁基键合硅胶为固定相，以二氧化碳为超临界气体，以乙腈和甲醇为夹带剂，采用压力梯度洗脱，可以一次性将粗肽中的异构体杂质和其他难分离杂质很好的分离而去除，且有效的解决了有机溶剂使用环境污染问题，回收处理容易，同时操作简便，有利于实现规模化的制备。

本发明一个方面提供了一种索马鲁肽的超临界流体色谱纯化方法，所述的超临界流体色谱纯化的条件为，以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，流动相中A1相为二氧化碳；B相为有机溶剂。流速：60-80ml/min。温度33℃，检测波长：230nm。压力梯度：8.25-9.9MPa，60min。

作为优选，本发明所述流动相A1二氧化碳的温度为30-40℃，夹带剂流动相B中甲醇和乙腈的比例为4:1。

本发明发现在30-40℃范围内，温度与压力呈0.25～0.3倍关系梯度洗脱时，纯化效果呈相关性，即纯化时洗脱超临界压力＝T(温度)*倍数。压力范围为7.38～14.5MPa。

作为优选，压力范围为7.50-12.0MPa。

作为优选，本发明所述纯化HPLC方法的固定相为丁基键合硅胶。纯化规模包括以下规格色谱柱：5cm×25cm(柱子直径×长度)、10cm×25cm。

有益效果

本发明采用超临界色谱法，二氧化碳性质稳定、无毒、不易燃爆和价格低廉而备受青睐。因未采用水作为流动相，所以没有工业废水，因采用的为二氧化碳和甲醇、乙腈，回收较容易，成本较低。本发明的方法制备效率高，纯度高，收率高。

具体实施方式

实施例1：索马鲁肽粗肽纯化

将索马鲁肽粗肽2.0g用甲醇：乙腈(4:1)，含0.1％氨水溶解过滤，收集滤液备用。

1、纯化条件：色谱柱：以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。第一步：流动相：A1相：二氧化碳；B相：色谱纯甲醇：乙腈(4：1)。流速：60-80ml/min。温度33℃，检测波长：230nm。压力梯度：8.25-9.9MPa，60min。

纯化过程：将色谱柱用50％A+50％B，压力10MPa清洗10min，用70％A+30％B平衡5min，上样量为1.5-3g样品溶液。压力线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的合格目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0％的符合标准索马鲁肽。

冻干后得白色粉末状固体精肽0.98g。纯度99.3％。纯化收率70％(以粗品中索马鲁肽含量计算)，总收率49％。

实施例2：索马鲁肽粗肽纯化

将索马鲁肽粗肽2.0g用甲醇：乙腈(9:1)，含0.1％氨水溶解过滤，收集滤液备用。

1、纯化条件：色谱柱：以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。第一步：流动相：A1相：二氧化碳；B相：色谱纯甲醇腈：乙腈(9：1)。流速：60-80ml/min。温度38℃，检测波长：230nm。压力梯度：9.5-11.4MPa，60min。

纯化过程：将色谱柱用50％A+50％B，压力10MPa清洗10min，用70％A+30％B平衡5min，上样量为1.5-3g样品溶液。压力线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的合格目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0％的符合标准索马鲁肽。

冻干后得白色粉末状固体精肽0.96g。纯度99.17％。纯化收率68.5％(以粗品中索马鲁肽含量计算)，总收率48％。

实施例3：索马鲁肽粗肽纯化

将索马鲁肽粗肽2.0g用甲醇：乙腈(4:1)，含0.1％氨水溶解过滤，收集滤液备用。

1、纯化条件：色谱柱：以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。第一步：流动相：A1相：二氧化碳；B相：色谱纯甲醇腈：乙腈(7：3)。流速：60-80ml/min。温度37℃，检测波长：230nm。压力梯度：9.25-11.1MPa，60min。

纯化过程：将色谱柱用50％A+50％B,压力10MPa清洗10min，用70％A+30％B平衡5min，上样量为1.5-3g样品溶液。压力线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的合格目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0％的符合标准索马鲁肽。

冻干后得白色粉末状固体精肽0.98g。纯度99.57％。纯化收率70％(以粗品中索马鲁肽含量计算)，总收率49％。

实施例4：索马鲁肽粗肽纯化

将索马鲁肽粗肽2.0g用甲醇：乙腈(9:1)，含0.1％氨水溶解过滤，收集滤液备用。

1、纯化条件：色谱柱：以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。第一步：流动相：A 1相：二氧化碳；B相：色谱纯甲醇腈：乙腈(4：1)。流速：60-80ml/min。温度33℃，检测波长：230nm。压力梯度：8.25-9.9MPa，60min。

纯化过程：将色谱柱用50％A+50％B，压力10MPa清洗10min，用70％A+30％B平衡5min，上样量为1.5-3g样品溶液。压力线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的合格目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0％的符合标准索马鲁肽。

冻干后得白色粉末状固体精肽1.1g。纯度99.52％，单个杂质均小于0.15％。纯化收率78％(以粗品中索马鲁肽含量计算)，总收率55％。

实施例5：索马鲁肽粗肽纯化

将索马鲁肽粗肽15.0g用甲醇：乙腈(9:1)，含0.1％氨水溶解过滤，收集滤液备用。

1、纯化条件：色谱柱：以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：10cm×25cm。第一步：流动相：A 1相：二氧化碳；B相：色谱纯甲醇腈：乙腈(4：1)。流速：200-250ml/min。温度31℃，检测波长：230nm。压力梯度：7.75-9.3MPa，60min。

纯化过程：将色谱柱用50％A+50％B，压力10MPa清洗10min，用70％A+30％B平衡5min，上样量为15g样品溶液。压力线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的合格目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0％的符合标准索马鲁肽。

冻干后得白色粉末状固体精肽1.02g。纯度99.47％。纯化收率72.8％(以粗品中索马鲁肽含量计算)，总收率50％。

实施例6：利拉鲁肽粗肽纯化

将利拉鲁肽粗肽15.0g用甲醇：乙腈(8:2)，含0.1％氨水溶解过滤，收集滤液备用。

1、纯化条件：色谱柱：以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：10cm×25cm。第一步：流动相：A 1相：二氧化碳；B相：色谱纯甲醇腈：乙腈(3：1)。流速：170-230ml/min。温度39℃，检测波长：230nm。压力梯度：9.75-11.7MPa，60min。

纯化过程：将色谱柱用50％A+50％B，压力10MPa清洗10min，用70％A+30％B平衡5min，上样量为15g样品溶液。压力线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的合格目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0％的符合标准利拉鲁肽。

冻干后得白色粉末状固体精肽6.3g。纯度99.36％。纯化收率63％(以粗品中利拉鲁肽含量计算)，总收率42％。

实施例7：利拉鲁肽粗肽纯化

将利拉鲁肽粗肽15.0g用甲醇：乙腈(8:2)，含0.1％氨水溶解过滤，收集滤液备用。

1、纯化条件：色谱柱：以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：10cm×25cm。第一步：流动相：A 1相：二氧化碳；B相：色谱纯甲醇：乙腈(9：1)。流速：170-230ml/min。温度38℃，检测波长：230nm。压力梯度：9.5-11.4MPa，60min。

纯化过程：将色谱柱用50％A+50％B,压力10MPa清洗10，用70％A+30％B平衡5min，上样量为15g样品溶液。压力线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的合格目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0％的符合标准利拉鲁肽。

冻干后得白色粉末状固体精肽6.25g。纯度99.36％。纯化收率62.5％(以粗品中利拉鲁肽含量计算)，总收率41.6％。

对比例1：索马鲁肽粗肽纯化(201810663478.0)

样品处理：将含3g索玛鲁肽粗肽(粗肽：4.6克)样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用。

第一步HPLC纯化色谱条件：以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(30mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.2％磷酸(取1000ml水，加2ml磷酸，混合均匀，用氨水调节pH值至2.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为0.6g，B相洗脱梯度如下：10％-42％(55min)。收取纯度大于95％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，

真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽第一步样品溶液。

第二步HPLC纯色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(30mm×250mm，10μm)的色谱柱；以20mmol/L的乙酸铵溶液(取1000ml水加乙酸铵1.54g，氨水调节pH至7.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为0.43g。B相洗脱梯度如下：5％-45％(45min)。

收取纯度大于99.8％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。溶液经对照品定量含索玛鲁肽2.20g，收率达73.3％。本对比例需要消耗大量的有机溶剂，产生大量的有机废水。

对比例2：利拉鲁肽粗肽纯化(CN 105017381 A)

样品处理：将固相合成所得的利拉鲁肽用质量百分浓度为10％左右的稀氨水来溶解(溶解浓度约为15mg/ml)，用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用；

①第一步纯化条件：色谱柱：以聚苯乙烯二乙烯苯基质的填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：3cm×25cm.流动相：A相：配比含有质量百分浓度为0.1％的氨水水溶液；B相：配比含有质量百分浓度为0.1％的氨水乙腈溶液。流速：25-30ml/min。检测波长：245nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：20-65％，梯度处理时间40-55min。进样量为0.8g；

纯化过程：将色谱柱用质量百分浓度90％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为溶解过滤之后的样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，纯度为92％左右，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；将纯化后收集的肽溶液用20％的碳酸氢胺调样品溶液PH值至偏中性，减压浓缩至一定体积50-100ml除过多的乙腈，为了第二步纯化做准备)

②第二步纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：3cm×25cm,流动相：A相配比含有质量百分浓度为0.01％的盐酸水溶液；B相：色谱纯乙腈溶液；流速：25-30ml/min；检测波长：245nm.梯度：流动相B的质量百分浓度：40-60％，梯度处理时间45-60min；进样量为第一步纯化浓缩之后含量92％的样品溶液；

纯化过程：将色谱柱用质量百分浓度90％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为第一步纯化浓缩之后含量92％的样品溶液，线性梯度洗脱，收集目的峰，纯度为98％左右，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；

③转盐：取100g阴离子交换树脂Lewatit MP60置于大小合适的转盐玻璃柱中，用超纯水，乙醇，碱洗，酸洗，再碱洗等一系列步骤冲洗至中性后再上样使用，将浓缩后的肽溶液倒入转盐玻璃柱中，通过控制液体样品的流速来达到转盐的目的，同时收集转盐后的肽溶液；将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至1g/50ml，浓缩温度不超过40℃,然后冷冻干燥得纯度大于98.0％的利拉鲁肽，纯化收率可得60％以上。本对比例需要消耗大量的有机溶剂，产生大量的有机废水。

Claims (4)

1.一种GLP-1类似多肽的纯化方法，所述纯化方法采用超临界色谱法；其特征在于，以丁基键合硅胶为固定相的色谱柱，流动相中A1相为二氧化碳；B相为有机溶剂；所述有机溶剂选自甲醇、乙腈或其混合物；

所述柱温度为30-40℃，并在一定洗脱压力下的线性洗脱；

洗脱压力为自柱温度×0.25的柱压力至柱温度×0.3的柱压力的线性洗脱，其中柱压力单位为MPa；

所述的GLP-1类似多肽为进行了疏水基团修饰的GLP-1类似多肽，疏水基团修饰的GLP-1类似多肽选自索马鲁肽、利拉鲁肽；

所述有机溶剂为甲醇和乙腈的混合物，并且B相中甲醇和乙腈的体积比例为2-10:1。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，柱压力范围为7.50-12.0MPa。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，在洗脱前进行清洗和平衡，所述清洗和平衡为将色谱柱用50％A+50％B，压力10MPa清洗10min，用70％A+30％B平衡5min。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，色谱柱直径为5cm以上，直径25cm。