CN111269307A - 一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法 - Google Patents
一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111269307A CN111269307A CN202010120179.XA CN202010120179A CN111269307A CN 111269307 A CN111269307 A CN 111269307A CN 202010120179 A CN202010120179 A CN 202010120179A CN 111269307 A CN111269307 A CN 111269307A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- raw material
- inh
- peg
- esterase inhibitor
- igm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229940009550 c1 esterase inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 55
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 35
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 47
- 108050007539 Plasma protease C1 inhibitor Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 102100027637 Plasma protease C1 inhibitor Human genes 0.000 claims description 21
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 8
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 abstract description 43
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 abstract description 38
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 abstract description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 abstract description 7
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 abstract description 5
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- -1 salt ion Chemical class 0.000 description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 7
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 206010019860 Hereditary angioedema Diseases 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 3
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000012024 dehydrating agents Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 208000009481 Laryngeal Edema Diseases 0.000 description 1
- 206010023845 Laryngeal oedema Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008212 P-Selectin Human genes 0.000 description 1
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种去除C1酯酶抑制剂(C1‑INH)制备原料中杂蛋白IgM的方法，所述方法包括提供C1酯酶抑制剂制备原料以及对制备原料进行PEG(聚乙二醇)沉淀处理的步骤。本发明方法方便快捷，在进行层析步骤之前就对原料中最难去除的杂蛋白IgM进行去除，且去除方法简便高效，并减少了层析步骤，有效节省了树脂和仪器使用成本。本发明对于人C1 INH制备工艺的优化具有较高的参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法。
背景技术
C1酯酶抑制剂(C1-INH，C1-esterase inhibitor又称C1抑制剂或C1灭活剂)是一种不耐热的血浆蛋白，可以抑制补体因子1(C1)的酯水解活性。C1INH现在被定义为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)，它是一种血浆蛋白，能抑制多种蛋白酶，与补体、凝血、纤溶和激肽释放的活化与拮抗平衡有密切的联系，在多种生理系统中具有重要的调节作用。C1INH主要由肝脏合成，也可以由单核细胞、表皮成纤维细胞、内皮细胞分泌，其结构为单链糖蛋白，表观分子量为100～105kDa。血浆中含量约为0.2mg/ml，相当于1血浆单位(PU)每毫升，由于个体差异使含量处于0.14mg/ml和0.38mg/ml之间。
C1INH的缺乏会引起一种疾病，称为遗传性血管性水肿(HAE)，这是一种可以致残同时具有潜在致命性的疾病。它是由于C1抑制剂的合成障碍或功能缺陷所致的常染色体显性遗传病，临床特点为皮肤黏膜反复发作、自限性、局限性、非凹陷性水肿。当急性水肿发生在上呼吸道时常因喉头水肿导致患者窒息死亡。在疾病的多种治疗药物中，C1-INH副作用小，安全性和有效性高。除了在HAE的治疗中发挥作用，C1-INH还能与细菌内毒素、黏附分子E，P-选择素等结合发挥非蛋白酶抑制功能。
目前制备C1-INH的方法为三步层析：CM阳离子交换层析、DEAE阴离子交换层析、HIC疏水层析，层析步骤较多，一次实验的周期较长，实验前准备及试验后处理较复杂，且终产品中仍含有少量IgM无法去除。
发明内容
本发明提供了一种去除C1酯酶抑制剂(C1-INH)制备原料中杂蛋白IgM的方法，所述方法包括提供C1酯酶抑制剂制备原料以及对制备原料进行PEG沉淀处理的步骤。
具体而言，所述方法如下步骤：
(1)提供C1酯酶抑制剂制备原料，并调整原料的pH为6.0-7.0，优选，6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9，更优选，6.8；
(2)向步骤(1)的原料中加入一定量的PEG，混匀；优选的，所述PEG的用量占C1酯酶抑制剂制备原料的质量分数为10％-15％，优选，12％；
(3)对步骤(2)的混合物离心取上清，离心条件为3000g-20000g，离心10min-60min，优选的，10000g-15000g，离心10min-30min；温度条件为10℃-40℃，优选，20℃-30℃。
进一步的，步骤(2)在加入PEG之后，通过充分搅拌混匀。
优选的，所述PEG为PEG4000。
进一步的，在步骤(3)之后，还包括对得到的上清液进行离子交换层析的步骤。
优选的，所述离子交换层析为CM离子交换层析(羧甲基阳离子交换层析)；优选的，所述CM离子交换层析柱的类型包括但不限于XK16/20、BPG140/500等；
优选的，所述洗脱液的盐离子浓度为190mM-220mM，优选，200mM-210mM。
进一步的，所述C1酯酶抑制剂制备原料来源于血浆。
在优选的实施方式中，所述C1酯酶抑制剂制备原料为IgG FT UF/DF，所述原料IgGFT UF/DF是将血浆原料进行多次离子交换层析偶联亲和层析梯度分离提取Pg(人纤维蛋白溶酶原)、IgG(人免疫球蛋白)和Fg(人纤维蛋白原)离子交换后，经过UF/DF(超滤/透滤)得到的IgG FT UF/DF。具体的，所述制备方法包括如下步骤：
(1)冷冻血浆复融，使用深层过滤器1～4孔径滤器过滤；
(2)阴离子交换层析：层析柱型号BPG140/500，平衡条件pH7.0，收集流穿液；
(3)亲和层析：层析柱型号BPG140/500，树脂名称ECH-Lysine Sepharose 4FastFlow，平衡条件pH 7.5，收集流穿液；
(4)超滤浓缩UF/DF：获得C1 INH制备原料IgG FT UF/DF。
另一方面，本发明还提供了上述方法在制备杂蛋白IgM去除率高并且高活性的C1-INH中的应用。
其中，与C1-INH制备原料相比，最终得到的C1-INH中的IgM去除率高于99％，优选，高于99.5％、99.6％或99.7％。
C1 INH中的活性C1 INH高于1.0IU/ml，比活性高于4.0IU/mg。
本发明分别从pH值、PEG含量和离心条件三个方面考察了PEG用于人C1-INH制备原料IgG FT UF/DF中IgM的去除效果以及CM离子交换层析对活性与非活性C1-INH分离效果的判定。PEG沉淀法实验结果显示，将原料pH值调节为6.8后，加入占原料质量分数为12％的PEG4000干粉，在室温条件下连续充分搅拌1h后，以15000g，25℃条件离心20min，上清液中IgM的去除率和C1 INH的回收率达到最佳，分别为99.8％和86.2％；CM离子交换层析实验结果显示，当活性洗脱液盐离子浓度为200mM时，活性与非活性C1-INH分离效果达到最佳，活性达1.126IU/ml，比活性4.43IU/mg，明显高于上样样品，抗原回收率达39.3％，其中活性成分占比50％以上，且活性回收率达64％，同时绝大多数杂质蛋白去除率达99％以上。
通过特定蛋白检测仪(Neph)对上清液中蛋白种类及浓度进行检测，发现杂蛋白IgM的去除率较高，且目标蛋白C1-INH的回收率较高；经CM层析后，终产品中C1 INH纯度较高，且杂蛋白去除率较高。本发明方法方便快捷，在进行层析步骤之前就对原料中最难去除的杂蛋白IgM进行去除，且去除方法简便高效，并减少了层析步骤，有效节省了树脂和仪器使用成本。本发明对于人C1 INH制备工艺的优化具有较高的参考价值。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
本实施方式中采用如下方法去除C1 INH制备原料中的IgM：
调节原料pH；对原料进行称重，并向其中加入一定量的PEG4000粉末；放入与容器大小匹配的磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上，室温搅拌1h；搅拌结束后离心，离心条件：15000g，25℃，20min；离心结束后，回收上清液；之后，向PEG沉淀法获得的上清液中加入醋酸钠，调节样品至合适的上样盐离子浓度；样品充分混匀，静置后过滤；然后进行CM(羧甲基)阳离子交换层析分离。
本方案基于以下原理来实现：
蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。如破坏这两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)蛋白质便容易凝集析出。如将蛋白质溶液pH调节到等电点，蛋白质分子呈等电状态，此时虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失，但还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，若再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节p H到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。聚乙二醇具有一定的吸水性，且物理状态依相对分子质量不同而改变，随分子量的增大从无色无臭黏稠液体至蜡状固体。分子量200～600者常温下是液体，分子量在600以上者就逐渐变为半固体状。溶于水、乙醇和许多其它有机溶剂；蒸气压低，对热、酸、碱稳定；与许多化学品不发生反应；无毒，无刺激。PEG 4000常温下为白色固体粉末，具有一定吸湿能力，能有效破坏蛋白质分子的水化膜，使处于等电状态的蛋白质凝聚沉淀；同时，为确保对样品体积不发生较大波动，维持蛋白浓度，加入PEG 4000固体粉末较为合适。
离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性，极性，所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。层析开始前，功能基团与反离子稳定结合，就与反离子发生可逆交换，与层析剂结合被固定下来。因为盐离子可以与底物竞争功能基团，盐浓度越高样品与层析剂结合越不紧密，易被洗脱下来。不同物质与层析剂结合程度不同，洗脱下来的时间不同，因此得以分开。
实施例1、C1-INH制备原料中杂蛋白IgM的去除条件优化
1、C1-INH制备原料：
采用原料IgG FT UF/DF作为C1 INH制备原料，在其他的实施方式中，原料也可以为血浆或血浆冷上清液。
2、PEG沉淀：
离心条件初步定为3500g，25℃，20min，将原料分为两组，分别加入质量分数为10％和20％的PEG，原料初始pH值为7.8且未进行调节，加入PEG室温搅拌1h后离心，离心条件3500g、25℃，离心20min后，取上清液进行特定蛋白检测；初步确定PEG含量后，另取原料分为四组，分别调节pH值为8.0、7.0、6.0、5.0，加入PEG室温搅拌1h后离心，取上清液进行特定蛋白检测；对pH值进一步摸索，将原料分为四组，分别调节pH值为6.8、6.4、6.0、5.6，加入10％PEG室温搅拌1h后离心，取上清液进行特定蛋白检测。
PEG沉淀法条件进一步摸索：将离心力提高至15000g，离心温度与时间不变，将原料分为八组，分别调节pH值为7.0、6.8、6.6、6.4、6.3、6.1、5.9、5.7，加入10％PEG室温搅拌1h后离心，取上清液进行特定蛋白检测；将原料pH值调节为6.8，并分为八组，分别加入质量分数为5％、8％、10％、11％、14％、15％、17％、20％的PEG，室温搅拌1h，取上清液进行特定蛋白检测；进一步摸索，调节原料pH值为6.8并分为三组，分别加入质量分数为10％、12％、14％的PEG，室温搅拌1h，取上清液进行特定蛋白检测。
3、CM离子交换层析：
柱平衡：使用离子浓度为25mM的醋酸钠溶液对层析柱连续冲洗3至5个柱体积，使柱内树脂状态达到可上样标准。
上样样品处理：向PEG沉淀上清液中加入1M的醋酸钠溶液，加入量为上清液质量的1/39，使得醋酸钠离子浓度达到25mM；充分混匀后室温静置1h后过滤，作为上样样品。
流穿：目标蛋白C1-INH与少量其他杂质蛋白与树脂结合，同时PEG与Alb从流穿液中得以去除。
淋洗：使用含25mM醋酸钠和100mM氯化钠的淋洗缓冲液对层析柱进行冲洗，使CER(铜蓝蛋白)和TRF(转铁蛋白)等杂质蛋白与树脂分离，同时不影响目标蛋白与树脂的结合。
目标蛋白洗脱及活性与非活性成分分离：
活性C1-INH洗脱：原有方法为使用含25mM醋酸钠和180mM氯化钠的洗脱缓冲液对活性C1-INH进行洗脱，但未能完全将活性成分分离，现提高氯化钠盐离子浓度，分别用含190mM、200mM、210mM氯化钠的缓冲液对活性成分进行洗脱，根据蛋白含量及活性检测结果选取最佳的盐离子浓度。
非活性C1-INH及其他蛋白洗脱：使用常规洗脱液(25mM醋酸钠、500mM氯化钠)对非活性C1-INH及少量其他杂质蛋白进行洗脱。
实施例2、C1 INH制备原料中杂蛋白IgM的去除条件优化结果
2.1PEG沉淀
2.1.1预实验结果显示，在离心条件为3500g(25℃，20min)时，未调节pH的原料在分别加入10％和20％PEG时，IgM的去除率接近，分别为52.4％和52.8％，但C1-INH的回收率分别为93.8％和76.0％，结果见表1；故暂定PEG含量为10％，对pH值进行初筛及复筛，发现在pH6.4时，IgM去除率(>95.4％)和C1-INH回收率(90.8％)均较高，结果见表2、3，结果汇总见表4。
表1.在3500g，pH 7.8时不同PEG含量对原料中IgM和C1-INH的影响
表2.
3500g，PEG10％时，pH值5.0-8.0对原料中IgM和C1 INH的影响
表3.在3500g，PEG10％时，pH值5.7-7.0对原料中IgM和C1 INH的影响
表4.PEG沉淀预实验结果
2.1.2进一步摸索结果显示，在离心条件为15000g(25℃，20min)时，当加入PEG的含量为10％时，在pH6.8的条件下，IgM的去除率和C1-INH的回收率均较高，分别为99.5％和89.2％(表7)，PEG含量广筛结果见表5；确定pH值后，对PEG含量进行细致筛选，发现在PEG含量为12％时，IgM去除率和C1-INH回收率达到最佳，分别为99.8％和86.2％，结果见表6。汇总结果见表7。
表5.在pH值为6.8时，不同PEG含量对原料中IgM和C1 INH的影响
表6.在pH值为6.8时，PEG含量为10％、12％、14％对原料中IgM和C1-INH的影响
表7.PEG沉淀法条件进一步摸索结果
综上所述，PEG沉淀法最佳条件为：调节原料为pH6.8，加入占原料质量分数12％的PEG，在15000×g，25℃条件下，离心20min。
2.2CM离子交换层析
盐浓度线性梯度摸索结果显示，氯化钠浓度在200-210mM时洗脱液中的C1-INH比活性最高，故选择200mM氯化钠作为有活性的C1-INH洗脱条件进行纯化；过程样品的蛋白种类及浓度检测结果显示，与上样样品相比，Elu1(200mM)中7个主要杂质蛋白(IgM、Alb、TRF、CER、IgG)的去除率在99％以上，C1-INH的抗原回收率达39.3％，Elu2(500mM)中的抗原回收率达34.8％；活性检测结果显示，有活性的C1-INH主要集中在目标样品Elu1(200mM)中，其余样品中几乎不含活性成分，该纯化步骤的活性回收率达64.5％，且比活性明显高于上样样品，结果见表8、9。
表8.CM离子交换层析每步样品中C1-INH比活性检测结果
表9.CM离子交换层析每步样品蛋白种类及浓度检测结果
本发明分别从pH值、PEG含量和离心条件三个方面考察了PEG用于人C1-INH制备原料IgG FT UF/DF中IgM的去除效果以及CM离子交换层析对活性与非活性C1-INH分离效果的判定。PEG沉淀法实验结果显示，将原料pH值调节为6.8后，加入占原料质量分数为12％的PEG4000干粉，在室温条件下连续充分搅拌1h后，以15000g，25℃条件离心20min，上清液中IgM的去除率和C1INH的回收率达到最佳，分别为99.8％和86.2％；CM离子交换层析实验结果显示，当活性洗脱液盐离子浓度为200mM时，活性与非活性C1-INH分离效果达到最佳，活性达1.126IU/ml，比活性4.43IU/mg，明显高于上样样品，抗原回收率达39.3％，其中活性成分占比50％以上，且活性回收率达64％，同时绝大多数杂质蛋白去除率达99％以上。
Claims (10)
1.一种去除C1酯酶抑制剂(C1-INH)制备原料中杂蛋白IgM的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提供C1酯酶抑制剂制备原料，并调整原料的pH为6.0-7.0；
(2)向步骤(1)的原料中加入一定量的PEG，混匀，所述PEG的用量占C1酯酶抑制剂制备原料的质量分数为10％-15％；
(3)对步骤(2)的混合物离心取上清液，离心条件为3000g-20000g，离心时间为10min-60min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的pH为6.4-6.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PEG的用量占C1酯酶抑制剂制备原料的质量分数为12％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心条件为10000g-15000g，离心时间为10min-30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PEG为PEG4000。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之后，还包括对步骤(3)得到的上清液进行离子交换层析的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析为CM离子交换层析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析中洗脱液的盐离子浓度为190mM-220mM，优选，200mM-210mM。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C1酯酶抑制剂制备原料来源于血浆。
10.权利要求1-9任一所述的方法在制备杂蛋白IgM去除率高并且高活性的C1INH中的应用；其特征在于，与C1-INH制备原料相比，最终得到的C1-INH中的IgM去除率高于99％；C1-INH中的活性C1-INH高于1.0IU/ml，比活性高于4.0IU/mg。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010120179.XA CN111269307B (zh) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010120179.XA CN111269307B (zh) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111269307A true CN111269307A (zh) | 2020-06-12 |
| CN111269307B CN111269307B (zh) | 2021-12-21 |
Family
ID=70995478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010120179.XA Active CN111269307B (zh) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111269307B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3869436A (en) * | 1971-06-01 | 1975-03-04 | Statens Bakteriologiska Lab | Method for fractionating plasma proteins using peg and ion-exchangers |
| US5030578A (en) * | 1989-07-10 | 1991-07-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Process for the purification of C1-inhibitor |
| WO2001046219A2 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Baxter Aktiengesellschaft | Method for production of a c1 esterase inhibitor (c1-inh)-containing composition |
| CN102250240A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-11-23 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种从血浆分离组分ⅰ+ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法 |
| CN102584934A (zh) * | 2012-03-19 | 2012-07-18 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种静注人免疫球蛋白的制备工艺 |
| CN106349387A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-01-25 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法 |
-
2020
- 2020-02-26 CN CN202010120179.XA patent/CN111269307B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3869436A (en) * | 1971-06-01 | 1975-03-04 | Statens Bakteriologiska Lab | Method for fractionating plasma proteins using peg and ion-exchangers |
| US5030578A (en) * | 1989-07-10 | 1991-07-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Process for the purification of C1-inhibitor |
| WO2001046219A2 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Baxter Aktiengesellschaft | Method for production of a c1 esterase inhibitor (c1-inh)-containing composition |
| CN102250240A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-11-23 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种从血浆分离组分ⅰ+ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法 |
| CN102584934A (zh) * | 2012-03-19 | 2012-07-18 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种静注人免疫球蛋白的制备工艺 |
| CN106349387A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-01-25 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 朱丽华 等: "《输血与血液制品学》", 31 August 1986, 南京红十字中心输血站 * |
| 汪菲菲 等: "人C1酯酶抑制剂的研究进展", 《中国生物制品学杂志》 * |
| 陈志南: "《中华医学百科全书 生物药物学》", 11 November 2018, 中国协和医科大学出版社 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111269307B (zh) | 2021-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2698392C2 (ru) | Способ очистки фактора свертывания крови viii | |
| Olsson et al. | Cationic proteins of human granulocytes. II. Separation of the cationic proteins of the granules of leukemic myeloid cells | |
| Rosenberg et al. | Fractionation of the protein components of human erythrocyte membranes | |
| EP2681231B1 (en) | Method for isolating osteopontin using concentrated feeds | |
| JP2002517516A (ja) | 静脈投与用免疫グロブリン及び他の免疫グロブリン生成物の製造法 | |
| US11066441B2 (en) | Method for separating and purifying α2-macroglobulin from Cohn Fraction IV precipitation | |
| JPH09509165A (ja) | ミルクからのラクトフェリンの分離 | |
| EP0239565A2 (en) | Method of separating proteins | |
| GB2179947A (en) | Process for the extraction of proteins from milk | |
| CN106349387A (zh) | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法 | |
| JP2002508388A (ja) | 新規なＴＧＦ−βタンパク質精製方法 | |
| JP2024069288A (ja) | 治療用タンパク質組成物及び方法 | |
| US6001974A (en) | Method of separating albumin from serum by ion-exchange chromatography with membrane adsorbers | |
| US3904751A (en) | Process for isolating a fibrin stabilizing factor from human placenta | |
| CN111269307B (zh) | 一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法 | |
| CN111269316B (zh) | 抗her2单克隆抗体的纯化方法 | |
| US7214319B2 (en) | Method of separating protein from animal milk | |
| JPS6034916A (ja) | 第１ｘ因子および他のビタミンｋ依存性タンパク質の高純度精製 | |
| JPH0479359B2 (zh) | ||
| KR100361894B1 (ko) | 치환크로마토그라피방법및정제된헤모글로빈생성물 | |
| Pinder et al. | Preparation and properties of human red-cell ankyrin | |
| KR102087823B1 (ko) | 친화성 크로마토그래피를 이용한 항체 또는 항체절편 정제 방법 | |
| CN116120392B (zh) | 聚体蛋白的纯化方法 | |
| RU2799637C1 (ru) | Способ получения биологически активного пептидно-аминокислотного препарата на основе плазмы крови человека | |
| RU2769201C2 (ru) | Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека для медицинского применения |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 430207 No.1-1, Huangjin Industrial Park Road, Zhengdian, Jiangxia District, Wuhan City, Hubei Province Patentee after: Wuhan Biopharmaceutical Co., Ltd. of China National Pharmaceutical Group Address before: 430207 No.1-1, Huangjin Industrial Park Road, Zhengdian, Jiangxia District, Wuhan City, Hubei Province Patentee before: SINOPHARM WUHAN BLOOD PRODUCT CO.,LTD. |