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CN111234015B - 用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用 - Google Patents

用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用 Download PDF

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CN111234015B CN202010089248.5A CN202010089248A CN111234015B CN 111234015 B CN111234015 B CN 111234015B CN 202010089248 A CN202010089248 A CN 202010089248A CN 111234015 B CN111234015 B CN 111234015B
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Abstract

本发明属于治疗性抗体药领域，具体涉及一种用于延长药物半衰期的抗体。所述抗体序列是针对人血清白蛋白的仅包含特定重链可变区的抗体。所述抗体可以与短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、肿瘤标志分子等治疗性蛋白质或多肽药物在原核系统中融合表达，产物具有延长的药物半衰期和提高的生物利用率。

Description

用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用
技术领域
本发明属于治疗性抗体药领域，涉及一种用于延长药物半衰期和提高药物 生物利用率的抗体及其应用。
背景技术
大多数蛋白和多肽药物的半衰期很短，一是因为蛋白质药物会被体内的蛋 白酶降解而快速清除；二是由于肾小球的过滤作用使分子量小于60kDa的药 物在肾脏代谢中也易被清除。
现有技术中，尝试了各种方法延长药物体内半衰期，包括对分子结构进行 改造和缀合，然而各种分子设计都或多或少存在一些问题。以GLP-1(胰高血 糖样素-1)分子为例，天然的GLP-1在人体血循环中可以被二肽酶Ⅳ(dipeptidyl pepidiaseⅣ，DPPⅣ；CD26)迅速降解，其体内半衰期只有2-5分钟，不具 备成药性。采用氨基酸突变、赖氨酸残基脂肪链修饰、PEG化等技术可以达 到每天一次用药。已经上市的此类GLP-1类似物包括(1)艾塞那肽(商品名 Byetta)是第一个上市的GLP-1类似物，皮下注射，初始计量一次5ug，一天 两次；(2)利拉鲁肽(商品名Victoza/Saxenda)每日注射一次，每次注射 0.6mg-1.8mg；(3)利司那肽(商品名Lyxumia)起始剂量为10μg，每日一次， 应用14天，维持剂量：在第15天开始20μg为固定维持剂量，每日一次。上 述方法中，较为常用的方法是将多肽或蛋白质药物直接与化合物PEG相连形 成聚合物，然而这样会使药物的分子量变大，同时会增加药物的副作用。
在此基础之上研制的二代GLP-1类似物，采用HSA或Fc蛋白融合技术， 可以达到一周一次用药。例如，将多肽或蛋白质药物直接与人Fc区相连融合 表达的杜拉鲁肽(商品名：
Figure BDA0002383164600000011
)是由美国Lily公司研发的新型长效 GLP-1R激动药，由两个具有DPP-4抑制作用的GLP-1类似物和人免疫球蛋 白重链IgG4-Fc片段融合得到，其活性与内源性GLP-1相似，半衰期为5天， 能有效延缓肾脏的清除作用。FDA于2014批准的杜拉鲁肽皮下注射液上市。 每周给药一次，每次给药量0.75mg-1.5mg。然而与人Fc区融合表达的药物具 有引发ADCC、CDC的风险。另一种方法是将多肽或蛋白质药物直接与化合 物PEG相连形成聚合物，然而这样会使药物的分子量变大，同时会增加药物 的副作用。还有一种方法是将多肽或蛋白质药物直接与人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)相连融合表达。人血清白蛋白是人体血液中的主要蛋白， 该蛋白由585个氨基酸构成，是人体循环系统内的含量最多的可溶性蛋白，在 血液中的浓度为34～54g/L.白蛋白是最丰富的血浆蛋白，具有高度的可溶性， 非常稳定，能与人体内药物分子结合运输到体内各个部位发挥疗效。目前市场 上的阿必鲁肽(Albiglutide)，是两个GLP-1分子串联后在C端连上改造后的人 血清白蛋白，建议给药量30毫克，每周一次。然而与人血清白蛋白融合表达 的药物分子量较大，不具有很好的细胞穿透性。
尽管目前市场上已有多种延长多肽或蛋白质药物半衰期的药物，但不是用 量大就是半衰期短，仍有必要进一步开发具有延长的药物半衰期，同时成本更 为低廉，患者依从性更好的药物结构。
发明内容
本发明涉及一种延长治疗性蛋白质治疗效果特别是延长其半衰期的方法， 特别是该方法中使用的具有特定结构的抗体，以及依照该方法所获得的包含治 疗性蛋白质的融合蛋白。
具体而言，本发明利用特定引物扩增获得的抗体cDNA而构建噬菌体库， 并筛选得到了与人血清白蛋白结合的一组抗人血清白蛋白抗体，该抗体在与特 定治疗性蛋白质药物融合表达后可延长药物半衰期。
本发明的一方面涉及一种抗体，其特征在于仅包含抗人血清白蛋白抗体的 重链可变区，优选由FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2、CDR3组成。
优选的，所述抗体的CDR区如表1的SEQ ID NO:1-28任一序列的三个 CDR区的组合所示。
表1如SEQ ID NO:1-28所示的抗体氨基酸序列结构
Figure BDA0002383164600000021
Figure BDA0002383164600000031
Figure BDA0002383164600000041
优选的，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-28的任一项所示，或者 与SEQ IDNO:1-28的任一项具有至少70％的序列同一性，更优选的，与SEQ ID NO:1-28的任一项具有至少80％的同一性，再优选的，与SEQ ID NO:1-28 的任一项具有至少90％的同一性，进一步优选的，与SEQ ID NO:1-28的任一 项具有至少95％的同一性。
本发明的第二方面涉及一种包含治疗性蛋白质以及上述抗体的融合蛋白。
可选的，所述治疗性蛋白质选自短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因 子，干扰素，肿瘤坏死因子，肿瘤标志分子。
优选的，所述治疗性蛋白质为GLP-1或其类似物、衍生物。
优选的，使用胰高血糖素样肽-1(glucagon-like-peptide 1，GLP-1)，其是已 发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素。GLP-1(7-37)的序列如SEQ ID NO:70所示：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。
GLP-1的类似物或衍生物是指与GLP-1具有同源性，并且具有相同生物 学活性的结构类似物，包括但不限于下列药物的治疗性蛋白部分：杜拉鲁肽 (Dulaglutide)、利拉鲁肽(Liraglutide)、索马鲁肽(Semaglutide)、阿比鲁 泰(Albiglutide)、他司鲁泰(Taspoglutide)、Tirzepatide、利西拉来(Lixisenatide) 等。
本发明的抗体片段包括但不限于，例如单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)及其多价形式，Fab和重链抗体。
本发明的第三方面涉及包含GLP-1或其类似物、衍生物，以及由抗人血 清白蛋白抗体重链可变区组成的抗体的融合蛋白。
作为进一步优选的实施方案，本发明的融合蛋白在抗体和治疗性蛋白质之 间包含连接短肽，所述连接短肽具有下述任一种结构：
(1)(GX1GGS)n其中X1为G或S，n为2-7任一值，或
(2)(GGGS)n，其中n＝2。
作为具体的实施方式，本发明融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:35-41。
本发明的又一方面涉及一种上述抗体的筛选方法。
所方法包括如下步骤：
(1)以人血清白蛋白免疫羊驼(llama)；
(2)分离羊驼外周血PBMC，提取mRNA，反转录成cDNA；
(3)两轮PCR扩增目的片段，构建成噬菌体库，利用ELISA筛选免疫阳 性克隆；
(4)将阳性克隆进行诱导表达纯化，测定与人血清的亲和力；
进一步的，本发明还涉及利用所述抗体制备融合蛋白的方法，其进一步包 括以下步骤：
(5)将阳性克隆序列与治疗性蛋白质序列在原核系统中融合表达、纯化。
在上述制备方法中，使用特定的引物扩增目的抗体片段是关键的。本发明 利用统一的两套引物分别进行两轮PCR扩增，实现了对目的抗体DNA序列的 扩增。所述引物为：
引物名称引物序列
Kz-001 CAGGTGAAGGTCATCGARTC(SEQ ID NO:29)
Kz-002 GATGCTCTTGTGACTCAGGAATC(SEQ ID NO:30)
Kz-003 GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACGCAGAGAC AGTGACCAGAGT(SEQID NO:31)
Kz-004 GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACAGGTCACCT TGAAGGAGTCTGG(SEQID NO:32)
Kz-005 GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACAGGTGCAGC TGCAGGAGTCGGG(SEQID NO:33)
Kz-006 CCACGATTCTGCGGCCGCTTACTGAGGAGACAGTGACCTGGG TCC(SEQ ID NO:34)
其中，第一轮扩增使用引物Kz-001和Kz-002，第二轮扩增使用引物Kz-003、 Kz-004、Kz-005和Kz-006。
本发明的融合蛋白具有治疗活性，根据所包含的治疗性蛋白的生物活性， 所述融合蛋白表达后保留甚至提高了原有生物活性，其可用于原有治疗性蛋白 所覆盖的任何疾病以及治疗领域。
优选的，本发明结合了GLP-1或其类似物、衍生物的融合蛋白可以用于 治疗糖尿病，更优选为非胰岛素依赖性糖尿病。所述融合蛋白还可以具有以下 治疗活性：减少体重：GLP-1主要通过作用于大脑与胃肠道起到减肥效果，一 方面其可降低大脑的进食欲望并使人体的能量消耗加强，另一方面可减缓胃排 空增加饱胀感，减少患者进食，从而达到降体重的效果。心血管受益与肾脏保 护：GLP-1可通过降血压、加强心肌收缩与肾脏的钠排泄等作用机制从而达到 轻度降压、保护肾脏的作用，可降低多重心血管危险因素，有效减少心血管事 件的发生(参考文献：Diabetes Care.1998；21:1925-1931；Diabetes Sectrum，2004；17:183-190；Diabetes Sectrum.2004；17:183-190)。
技术效果：
本发明实现了将抗体与蛋白质药物融合表达，在保留甚至进一步提高了蛋 白质药物药效的前提下，延长了药物的半衰期，提高了生物利用率，同时相比 其他蛋白质药物改构方式而言，工艺简单，成本低廉。具体而言，本发明在以 下方面获得了有益效果。
1.产品结构与性质方面
与Fc区或完整HSA融合蛋白形式相比，本发明的抗体融合蛋白是新一代 GLP-1类似物。将GLP-1与本发明的抗体融合，具有分子量小，易穿过屏障 的优点，避免了Fc区融合蛋白具有的引发ADCC、CDC的风险。更为重要的 是，依照本发明所获得的融合蛋白相比其他改构形式具有更长的半衰期，前期 数据表明，半衰期能达到两周甚至更长。如背景技术所述，这样的半衰期相较 于目前的第一代和二代GLP-1类似物而言，半衰期大大提高，增加了患者服 药的方便性和依从性。同时，本发明获得的融合蛋白取得了相比类似治疗活性 的药物更高的生物利用率。
2制备工艺方面
本发明与现有的延长半衰期的技术相比，无需PEG修饰、微球释放、脂 肪酸修饰、掺入非天然氨基酸等复杂的技术工艺。并且，本发明的融合蛋白无 需担心翻译后修饰，特别是不需要糖基化，融合蛋白可以直接选用原核细胞如 大肠杆菌进行表达，而无需采用昂贵的哺乳动物细胞表达系统，制备工艺更为 简单，使成本大大降低。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为利用抗原免疫血清cDNA获取抗体目的片段的第一轮PCR扩增产 物电泳图。第1泳道：DL2000marker(2000bp,1000bp,750bp，500bp,250bp,100bp)， 2-5泳道：PCR产物。
图3为利用抗原免疫血清cDNA获取抗体目的片段的第二轮PCR扩增产 物电泳图。第1泳道：DL2000marker(2000bp,1000bp,750bp，500bp,250bp,100bp)， 2-5泳道：PCR产物。
图4为抗人血清白蛋白抗体与抗原结合的ELISA结果，每个样品左侧的 柱形为OD490值，右侧为空白孔。
图5为抗人血清白蛋白抗体与人血清ELISA结合结果。
图6为本发明中各实例抗体端ELISA活性检测。
图7为实例1-7的融合蛋白在猕猴体内的降糖长效实验结果。
图8为融合表达的蛋白在纯化后的SDS-PAGE图。M：marker，泳道1-7： 依次是纯化后7个样品。
具体实施方式
以下实施例将进一步说明本发明内容，但本发明的范围不限于此。如无具 体说明，以下实施例中使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通 过商购途径获得；所使用的实验方法是常规实验方法，本领域技术人员根据现 有技术完全可以知道如何重复所述实验并获得相应结果。
实施例1：免疫羊驼及其效价测定
将人血清白蛋白多点皮下注射进羊驼体内，经多次免疫后取少量血清测效 价(酶联免疫法，靶抗原为人HSA蛋白，一抗为抗his-HRP，TMB显色，450nm 检测O.D值)。当效价达到血清稀释32万倍后酶联免疫结果在1.0以上即可。
检测时将血清用pH7.4 PBS缓冲液稀释，其中血清被稀释倍数为100倍、 1000倍、10000倍、40000倍、8万倍、16万倍、32万倍、64万倍。
表2不同血清稀释倍数下的效价测定结果
血清被稀释倍数 1:100 1:1K 1:10K 1:40K 1:80K 1:160K 1:320K 1:640K 空白孔
ELISA结果 3.262 3.316 3.458 3.426 3.508 3.296 3.17 1.02 0.057
实施例2：构建噬菌体库及筛选
1.cDNA的获取
对实施例1获得的血清满足效价要求的羊驼进行大量采血，分离PBMC， 用15×106个PBMC细胞提取总RNA，提取总RNA的方法为TRZOL手提操 作法。使用Thermo公司反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，将得到的 cDNA混匀分装备用。
2抗体目的片段的获取
利用下列2组PCR引物进行两步PCR扩增，获得目的片段。
引物名称引物序列
Kz-001 CAGGTGAAGGTCATCGARTC
Kz-002 GATGCTCTTGTGACTCAGGAATC
Kz-003 GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACGCAGAGAC AGTGACCAGAGT
Kz-004 GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACAGGTCACC TTGAAGGAGTCTGG
Kz-005 GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACAGGTGCAG CTGCAGGAGTCGGG
Kz-006 CCACGATTCTGCGGCCGCTTACTGAGGAGACAGTGACCTGGG TCC
反应试剂如下：
Figure BDA0002383164600000091
反应程序如下：
以Kz-001和Kz-002为引物进行第一轮PCR，用TAKARA公司高保真PCR 聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3分钟,(94℃变性30秒，53℃ 退火30秒，72℃延伸40秒)循环18轮，72℃末端延伸10分钟，4℃降温1 分钟。回收750bp条带。
以Kz-003、Kz-004、Kz-005和Kz-006为引物进行第二轮PCR，用TAKARA 公司高保真PCR聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3分钟,(94℃ 变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒)循环20轮，72℃末端延伸10 分钟，4℃降温1分钟。回收450bp条带。
.3抗HSA抗体库的构建与筛选
经过两轮PCR扩增得到大量目的片段后进行SfiI/NotI双酶切，使用商业 化T4DNA连接酶将酶切完成的目的片段连入噬菌体载体中，之后电击转入 TG1感受态。建库库容为1.07×108，随机挑取20个克隆进行测序，测序结果 分析显示，插入的片段皆为重链可变区片段，阳性率100％，包装成噬菌体库， 滴度为：2.15×1012pfu/ml。
采用固相筛选方法筛选噬菌体库。筛选流程是将靶分子包被在96孔表面 用，洗去未吸附的靶分子，然后封闭，之后用扣除背景的噬菌体抗体库加入到 孔中结合。洗去未结合的噬菌体，再用0.2M甘氨酸-盐酸洗脱得到亲和噬菌体。 每轮通过降低包被靶分子浓度和加大洗涤力度(本发明是减小靶分子浓度增加 洗液中吐温20浓度)得到高亲和力噬菌体。每经一轮淘选扩增试验，就会使 能与靶分子结合的抗体在噬菌体库中得到富集。
经过3轮筛选后富集达到1000倍以上，进行挑取单克隆验证。3轮筛选, 筛选结果如下：
表3富集筛选结果
筛选轮数 投入量 产出 富集 空白 扩增后滴度
1 2.15×10<sup>11</sup> 3.58×10<sup>7</sup> 6.01×10<sup>4</sup> 8.5×10<sup>6</sup> 3.06×10<sup>12</sup>
2 3.06×10<sup>11</sup> 1.24×10<sup>7</sup> 2.47×10<sup>4</sup> 1.4×10<sup>6</sup> 2.33×10<sup>13</sup>
3 2.33×10<sup>11</sup> 1.64×10<sup>8</sup> 1.42×10<sup>3</sup> 2×10<sup>5</sup> 1.62×10<sup>13</sup>
从第3轮筛选产物中挑取80个单克隆进行ELISA鉴定，ELISA鉴定方法 如下：
用PH9.6包被液稀释靶蛋白HSA，37℃静置1小时进行包被，PBS洗3 次。加入封闭液进行封闭37℃静置1小时，甩出多余的封闭液PBS洗3次。 取扩增产物用1％的M-PBS(脱脂奶粉-PBS)10倍稀释混匀50μl/孔37℃静 置1小时。一抗：用1％M-PBS按1：1000稀释兔抗M1350μl/孔37℃静置 1.0h。二抗：用1％的M-PBS按1：3000稀释HRP-羊抗兔50μl/孔37℃静置1.0h。显色：取0.2M Na2HPO4+0.1M柠檬酸各4.5ml加入少量OPD，60μl H2O2混匀，50μl/孔。2M硫酸终止50μl/孔。490nm检测。Phage ELISA最少要重 复一次。阳性克隆保存：取0.5mlPhage+0.3ml 50％甘油，混匀。-80℃保存。
鉴定结果如图4，共获得28个阳性克隆，命名为nbHSA。将ELISA中所 有阳性序列送测序，得到不同抗体序列，按照图4由左至右依次为编号为1-28， 对应SEQ ID:1-28，对应的DNA序列如SEQ ID NO:42-69所示。
实施例3抗HSA抗体阳性克隆体外活性检测
将实施例2得到的28个阳性克隆进行进化树分析后选择13个克隆进行诱 导表达纯化，得到小量样品进一步进行活性鉴定。将初步留下的序列进行人血 清ELISA结合实验，用来判断这些序列是否与人血清结合，结果见图5。
将初步得到的抗人血清白蛋白抗体与抗原进行亲和力测定，使用仪器octet red96自动读值，使用生物素标签标记抗原，抗原浓度为20μg/ml，检测每个 样品，每个样品的稀释梯度为6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM， 同一样品不同浓度下获得了相同的亲和力，结果见表4。
表4不同nbHSA与抗原亲和力由小到大的示意图
编号 KD(M)
21 1.985E-09
8 2.884E-09
1 3.229E-09
4 3.476E-09
5 4.105E-09
6 5.124E-09
7 8.188E-09
18 9.943E-09
11 13.779E-09
10 21.118E-09
12 50.811E-09
9 142.022E-09
16 157.102E-09
从测定的亲和力数值表中选择7号克隆进行ELISA验证活性，与亲和力 验证。
实施例4 GLP-1与nbHSA进行融合
将不同序列的GLP-1与本发明实施例3中的7号抗体序列进行融合设计， 所涉及的氨基酸序列可以通过化学合成的方式获得，也可以通过重组表达获得。
融合蛋白的氨基酸序列如下:
实例1：使用杜拉鲁肽的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGSQVQLVESGGA LVQAGGSLRLSCAASGLALEYYHMGWFRQAPEKEREFVAGITWTGRNTIY ADSVTGRFTIARDNAKNTMFLQMNSLQPEETAVYYCAASAAGDLTKDMK DYKYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:35)
实例2：使用利拉鲁肽的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRGGGGGSGGGGSGGGGSQVQL VESGGALVQAGGSLRLSCAASGLALEYYHMGWFRQAPEKEREFVAGITWT GRNTIYADSVTGRFTIARDNAKNTMFLQMNSLQPEETAVYYCAASAAGDLT KDMKDYKYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:36)
实例3：使用索马鲁肽的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白
HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRGGGGGSGGGGSGGGGSQVQL VESGGALVQAGGSLRLSCAASGLALEYYHMGWFRQAPEKEREFVAGITWT GRNTIYADSVTGRFTIARDNAKNTMFLQMNSLQPEETAVYYCAASAAGDLT KDMKDYKYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:37)
其中X是非天然氨基酸氨基异丁酸
实例4：使用阿比鲁泰的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLV ESGGALVQAGGSLRLSCAASGLALEYYHMGWFRQAPEKEREFVAGITWTG RNTIYADSVTGRFTIARDNAKNTMFLQMNSLQPEETAVYYCAASAAGDLTK DMKDYKYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:38)
实例5：使用他司鲁泰的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白
HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKXRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLV ESGGALVQAGGSLRLSCAASGLALEYYHMGWFRQAPEKEREFVAGITWTG RNTIYADSVTGRFTIARDNAKNTMFLQMNSLQPEETAVYYCAASAAGDLTK DMKDYKYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:39)
其中X是非天然氨基酸氨基异丁酸
实例6：使用Tirzepatide的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白
YXEGTFTSDYSIXLDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGG GGSQVQLVESGGALVQAGGSLRLSCAASGLALEYYHMGWFRQAPEKEREF VAGITWTGRNTIYADSVTGRFTIARDNAKNTMFLQMNSLQPEETAVYYCAA SAAGDLTKDMKDYKYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:40)
其中X是非天然氨基酸氨基异丁酸
实例7：使用利西拉来的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKKGGGGSG GGGSGGGGSQVQLVESGGALVQAGGSLRLSCAASGLALEYYHMGWFRQA PEKEREFVAGITWTGRNTIYADSVTGRFTIARDNAKNTMFLQMNSLQPEETA VYYCAASAAGDLTKDMKDYKYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:41)
实施例5融合蛋白的重组表达
将表达实施例4的氨基酸序列的DNA序列(其中编码nbHSA部分的DNA 序列如SEQID NO:48所示，GLP-1部分的DNA序列为本领域已知，可分别 从相应蛋白的Gengbank数据库获得，对于原始GLP-1的DNA序列可以参考 例如SEQ ID NO:71)，利用NdeI/XhoI两个酶切位点，直接插入原核载体 PET30a(+)中，转化大肠杆菌，利用浓度1mM IPTG 37℃诱导表达，培养基为 LB培养基。Tris缓冲液进行包涵体清洗，8-25ml变性液溶解包涵体，复性液 中复性12-72h。阳离子或者阴离子树脂进行层析，随后凝胶层析(SDS-PAGE)， 纯化目标蛋白。经过复性纯化后得到纯度不低于95％的样品，纯化后的电泳图 如图8所示。
变性液配方：3-6M盐酸胍或者4-8M尿素或者采用碱变性，氧化还原电 对(包括但不限于GSH/GSSG,胱氨酸/半胱氨酸等)Ph7.5-12。
复性液配方：(0-4M尿素，氧化还原电对(包括但不限于GSH/GSSG, 胱氨酸/半胱氨酸等)Ph7.5-10)。
实施例6各样品中抗体端ELISA活性检测
将实施例5得到的7个样品中抗体端进行ELISA活性检测，用PH9.6包 被液稀释人血清，37℃静置包被，2％牛奶封闭。取13个样品用1％M-PBS 10 倍稀释混匀50μl/孔37℃静置1小时。一抗：用1％M-PBS按1：2000稀释 HRP-Etag 50μl/孔37℃静置1.0h。显色：取0.2MNa2HPO4+0.1M柠檬酸各4.5ml 加入少量OPD，60μl H2O2混匀，50μl/孔。2M硫酸终止50μl/孔，490nm检测。 结果见图6结果显示，每个样品中的抗体均呈现阳性。
实施例7实例1的融合蛋白GLP-1-nbHSA与多肽GLP-1的药效对比实验
购买雄性6-8周小鼠15只，禁食24小时，只供饮水，称重，分成5组； 合成多肽GLP-1与实例1样品GLP-1-nbHSA的浓度均用PBS稀释至1μg/ul； 第一组空白组注射100μlPBS；第二组注射0.55μg/100μl的纯GLP-1多肽；第 三组注射低剂量终浓度为0.26μg/100μl的实例1样品；第四组注射中剂量2.6μ g/100μl的实例1样品；第五组注射高剂量26μg/100μl的实例1样品。灌糖时， 灌糖后30分钟、45分钟、60分钟、90分钟之后抽血，用三诺安稳免调码血糖 仪测量数值，所有数值单位均是mMol/L(毫摩尔每升)。结果如表5所示： 实例1样品与GLP-1阳性对照比较有较好的药效。
表5不同剂量实例1与多肽GLP-1小鼠灌糖实验结果
Figure BDA0002383164600000131
Figure BDA0002383164600000141
实施例8实例1-7的融合蛋白GLP-1-nbHSA与多肽GLP-1的药效对比实验
利用实例1的数据作为参考，将多肽GLP-1和7个实例样品进行小鼠灌 糖实验，具体实验如下：购买雄性6-8周小鼠36只，禁食24小时，只供饮水， 称重,分成9组；合成多肽GLP-1与实例7个样品GLP-1-nbHSA的浓度均用PBS 稀释至1μg/μl；第一组空白组注射100μlPBS；第二组注射0.6μg/100μl的纯 GLP-1多肽；第三组注射低剂量终浓度为2.4μg/100μl的实例1样品；第四组 注射中剂量2.4μg/100μl的实例2样品；第五组注射高剂量2.4μg/100μl的实例 3样品；第六组注射中剂量2.4μg/100μl的实例4样品；第七组注射高剂量 2.4μg/100μl的实例5样品；第八组注射中计量2.4μg/100μl的实例6样品；第 九组注射高剂量2.4μg/100μl的实例7样品。
表6 7个实例在同一浓度下小鼠体内降糖效果
Figure BDA0002383164600000142
结果如表6所示：实例1样品与GLP-1阳性对照比较有较好的药效，所 有实例均有较好的降糖效果。
当然本发明中存在小鼠实验是用实例1的样品进行剂量摸索，这样得到的 是实例1的适合浓度，但从表6总体数据来看可以看出，所有实例均有较好得 降血糖作用。
实施例9猕猴降糖长效实验
购买8只糖尿病猕猴，一只用来进行空白对照；7只用来进行实验；实验 开始前3天每天对四只猕猴进行早餐前抽血，与早餐餐后2小时，早餐后4 小时抽血。记录血糖值，保证糖尿病猴血糖值稳定；根据猴体重与小鼠体重比 例进行剂量换算(换算方法见参考文献：实验动物与人用药量的新换算，熊远 珍，江西医学院学报，1997年04期)，注射，给药量为130μg/kg。每隔4小 时进行采血测血糖，直至检测到血糖又恢复注射样品前值。再继续抽少量血液 进行持续检测，保证8只猕猴的血糖值又回升到初始糖尿病数值。结果见表7 以及图7。从结果中可以看到GLP-1多肽半衰期约2小时，而实例1-7最短半 衰期约9天最长可达2周甚至更长。
表7各个实例在猴子体内长效实验结果
Figure BDA0002383164600000151
以上数据表明，本发明的融合蛋白半衰期可达2周，并且在用量上会有所 减少，用量少，半衰期长，代表生物利用率高。而现有技术中已有药物半衰期 均在一周以内。例如，杜拉鲁肽：每周一次，初始计量0.75mg，以后增加到 去1.5mg；利拉鲁肽：每天给药一次，初始计量0.6后-增加到1.8mg；索马鲁 肽：每-周一次，初始剂量0.25毫克，后增至1毫克；阿比鲁泰：每周一次， 每次30毫克，后可增加至50毫克；他司鲁泰：皮下注射1次/周，目前正在进行3期临床；Tirzepatide：礼来正在进行2期临床研究，每周给药1次，皮 下注射；利西拉来：每天一次，10微克，15天后增加到20微克每天一次。
序列表
<110> 康维众和（中山）生物药业有限公司
<120> 用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用
<160> 71
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 1
Pro Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ala
20 25 30
Pro Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Leu
35 40 45
Ala Cys Ile Ala Asn Asn Pro Gly Gly Leu Trp Tyr Lys Gln Gly Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ser Ala Val Ser Tyr Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Tyr Glu His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Pro Asn Leu Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Ser Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Ile Asn Ser Ala Tyr Thr Ser Ala Thr Asp Trp Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Gln Asn
115 120 125
His Lys
130
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<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Asp Ile Phe Gly Phe Asn
20 25 30
Gly His Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Phe Thr Asp Val Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Arg Ile Val Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile Lys
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Arg Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Thr Glu Asn Thr Val His Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Ala Asp Glu Phe Gly Glu Arg Pro Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro
115 120 125
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<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ile Gly Gly Gly Leu Val Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ile Pro Tyr
20 25 30
Thr Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Trp Ser Gly Ala Ser Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Leu Tyr Thr Thr Ser Trp Gln Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
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<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Gly Gln Ala Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ala Tyr
20 25 30
Gln Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Lys Lys Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Asn Leu Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Lys Lys Ile Ala Lys Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Gly Gly Gly Arg Tyr Arg Asp Ala Pro Ser Tyr Glu
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
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<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Trp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ala Ala Gly Asp Leu Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Lys Ile Ser Gly Ile Asn
20 25 30
Phe Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Asp Thr Lys Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Met Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp
85 90 95
Thr Tyr Tyr Asp Leu Gly Gly Asp Lys Met Val Phe Asp Asn Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Thr Arg Asp
20 25 30
Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys His Arg Val Leu Val
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Ser Gly Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Asp Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Ala Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Gly Ala Tyr
20 25 30
Gln Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Asn Val Gly Ser Thr Phe Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Glu Ile Ala Lys Asn Thr Val His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Arg Tyr Arg Asp Ala Pro Ser Tyr Glu
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ala Tyr
20 25 30
Gln Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Asn Leu Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Glu Ile Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Ile Tyr Arg Asp Ala Pro Met Tyr Glu
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 12
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<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Gln Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Asn Leu Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Glu Ile Ala Lys Asn Ala Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Ala Ala Pro Met Tyr Glu
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Gly Pro Tyr
20 25 30
Gln Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Asn Leu Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Glu Ile Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Tyr Ala Pro Met Tyr Glu
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 128
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Ala Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Met Ser Leu Tyr
20 25 30
Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Val Asn Arg Trp Ser Thr Gly Ser Ala Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Val Gly Ala Thr Ala Arg Leu Glu Asp Leu Tyr Ser Ser
100 105 110
Ser Tyr Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Thr Ser
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly Asn Ala Glu Thr Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly Ser Ser Glu Thr Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly Asn Ala Glu Thr Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asn Arg Arg Thr Ala Trp Arg Thr Ser Gln Val Gly Ser Asp
100 105 110
Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly Asn Ser Glu Thr Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly Asn Ser Glu Thr Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Ala Asn Ser Glu Thr Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 124
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Leu Glu Phe Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Trp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ala Ala Gly Gly Leu Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 126
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Thr Ala Ile Gly Trp Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asn Arg Arg Thr Ala Trp Arg Thr Ser Gln Val Gly Ser Asp
100 105 110
Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Pro Ser Glu Ala Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 115
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Met Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly Asn Ala Glu Thr Arg Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 124
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ile Pro Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Trp Ser Gly Ala Ser Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Leu Tyr Thr Ser Ser Trp Gln Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Thr Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asn Arg Asn Thr Ala Trp Arg Thr Ser Gln Val Gly Ser Asp
100 105 110
Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Ser Asp Ile Val
20 25 30
Leu Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ile Thr Arg Gly Ser His Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Lys Ala Ser Thr Tyr Ala Ala Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Ser Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caggtgaagg tcatcgartc 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gatgctcttg tgactcagga atc 23
<210> 31
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggaattccat atggattata aagatgatga taaacgcaga gacagtgacc agagt 55
<210> 32
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggaattccat atggattata aagatgatga taaacaggtc accttgaagg agtctgg 57
<210> 33
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggaattccat atggattata aagatgatga taaacaggtg cagctgcagg agtcggg 57
<210> 34
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccacgattct gcggccgctt actgaggaga cagtgacctg ggtcc 45
<210> 35
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
35 40 45
Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
50 55 60
Ser Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
65 70 75 80
Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Thr Trp Thr Gly Arg
85 90 95
Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg
100 105 110
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro
115 120 125
Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ala Gly Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Ser
<210> 36
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
35 40 45
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
50 55 60
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr His Met
65 70 75 80
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly
85 90 95
Ile Thr Trp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly
100 105 110
Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe Leu Gln
115 120 125
Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Ala Ala Gly Asp Leu Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Trp
145 150 155 160
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170
<210> 37
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>MISC FEATURE
<222> (2)
<223> 氨基异丁酸
<400> 37
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
35 40 45
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
50 55 60
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr His Met
65 70 75 80
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly
85 90 95
Ile Thr Trp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly
100 105 110
Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe Leu Gln
115 120 125
Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Ala Ala Gly Asp Leu Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Trp
145 150 155 160
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170
<210> 38
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
35 40 45
Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
50 55 60
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr His Met Gly
65 70 75 80
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile
85 90 95
Thr Trp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly Arg
100 105 110
Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe Leu Gln Met
115 120 125
Asn Ser Leu Gln Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Ala Ala Gly Asp Leu Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Trp Gly
145 150 155 160
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165
<210> 39
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>MISC FEATURE
<222> (2,29)
<223> 氨基异丁酸
<400> 39
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
35 40 45
Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
50 55 60
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr His Met Gly
65 70 75 80
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile
85 90 95
Thr Trp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly Arg
100 105 110
Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe Leu Gln Met
115 120 125
Asn Ser Leu Gln Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Ala Ala Gly Asp Leu Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Trp Gly
145 150 155 160
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165
<210> 40
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>MISC FEATURE
<222> (2,13)
<223> 氨基异丁酸
<400> 40
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Ile Ala Gln Lys Ala Phe Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu
85 90 95
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Thr Trp Thr Gly Arg Asn Thr
100 105 110
Ile Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn
115 120 125
Ala Lys Asn Thr Met Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Glu
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ala Gly Asp Leu Thr Lys
145 150 155 160
Asp Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
165 170 175
Ser Ser
<210> 41
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
50 55 60
Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Tyr His Met Gly Trp Phe
85 90 95
Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Thr Trp
100 105 110
Thr Gly Arg Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly Arg Phe Thr
115 120 125
Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe Leu Gln Met Asn Ser
130 135 140
Leu Gln Pro Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ala
145 150 155 160
Gly Asp Leu Thr Lys Asp Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly
165 170 175
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
180
<210> 42
<211> 366
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 42
ccggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc cgggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag tctctggcct cacttcagaa gacgctccag tgggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgcgaggg cctcgcatgc attgccaata atccgggcgg tctatggtat 180
aaacaaggca taaagggccg attcaccatc tcgagaaaca acgccaacaa cacggtatat 240
ctgcaaatga acagccttga acctggggac acggccgttt atcattgttc agcagtttct 300
tattgttatt atggattggg tctttatgaa cactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 43
<211> 390
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 43
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga tcggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcaa cctctggacc taacttgagt aggtattaca tcggctggtt ccgtcaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt agtcgcagct atctcctggc gtggtaccac atacaattca 180
gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagagaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtttatt actgtgcagc ggaaatcaac 300
agtgcctata cctccgctac ggactgggac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcagaac ccaagacaca aaaccacaag 390
<210> 44
<211> 361
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 44
caggtgcagc caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc 60
tctgagactc tcctgtgcag cctctcgaga catcttcggt ttcaatggtc acaccatggc 120
ctggtaccgc caggctccag ggaagcagcg cgagttggtc gcctctatta ctagtggtgg 180
attcaccgat gtagcggact ccgtgaaggg ccgattcacc atatccagag ccaacgccaa 240
gaatacggtg tatctgcaga tggacagcct gaaatctgag gacacagcca tttattactg 300
taatgcaagg atagtgcgag ttgactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc 360
a 361
<210> 45
<211> 381
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 45
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc acggtgcagg cgggggggtc tctgagactc 60
tcctgttcag cctccggaag catccgcagc atcaaagcca tgggttggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgaatt ggtcgcgact atcaccagtc gtggtgatac attctacgga 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacggaa cggagaacac ggttcacctg 240
caaatgaacg gcctgaaagt cgaggacaca gccgtctatt actgtggagc agatgaattc 300
ggggaacgac ccacatttga ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcagaa 360
cccaagacac caaaaccaca a 381
<210> 46
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 46
caggtgcagc tggtagagat tgggggagga ttggtgctcg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcatt ccctatacca cgggctggtt ccgccaggct 120
ccaggcaagg agcgtgagtt tgtagcgact attacctgga gtggtgcgag cataaagtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatgg acagcctgaa gcctgaggac acggccgttt attactgtgc agcgggcagt 300
gggggaggct tatatactac ttcgtggcag tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 47
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 47
caggtgcagc tggtggagtc tggggaagga ttggggcagg ctgggaactc tctaagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg cacctttggt gcctatcaaa tggcctggtt ccgccaggct 120
ccaaaaaagg agcgtgcgtt tgtagcaggt attagctgga atcttggtag cacgtactat 180
tcaaactccg tgaagggccg attcaccatg tccaaaaaaa ttgccaaaaa tacggggtat 240
ctgcaaatgg acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc aaaaggcctt 300
ggggggggcc gctaccgcga tgccccgagc tatgaattgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 48
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 48
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagcc ttggtgcagg cggggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggact cgccctcgag tactatcaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccggagaagg agcgtgagtt tgtggcaggc attacttgga caggtcgtaa cacaatttac 180
gcagactccg tgacgggccg attcaccatc gccagagaca acgccaagaa cacgatgttc 240
ctacaaatga acagcctgca acccgaagag acggccgttt attattgtgc cgcgagcgcc 300
gccggggatt tgactaagga tatgaaagac tacaagtact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtttcct ca 372
<210> 49
<211> 366
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 49
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggaaa aatctcggga atcaatttca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgaatt ggtcgcagat accaaaggtg acacaaacta tgcagacgcc 180
gtgaagggcc ggttcaccat ctccatggac aacgccaaga atacagtgta tctacaaatg 240
aacagcctaa aacctgagga cacggccgtc tattactgta atgcagacac gtactacgac 300
ttaggtggcg acaagatggt ttttgacaac tcctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 50
<211> 333
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 50
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagc ctggggagtc tctgacactc 60
tcctgtgcag cctctggagg catcttcacg agagatggca tgggttggta tcggcaggtt 120
ccagggaaac atcgcgtttt ggtcgcattt attactagcg gtggtggcac acggtatgca 180
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaacg ccaaaaacac ggtttatctg 240
cacatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gacgtctatt attgtggagc acagggttac 300
tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tca 333
<210> 51
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 51
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgaacg cacctttggc gcctatcaaa tggcctggtt ccgccaggct 120
ctagggaagg aacgcgagtt tgtagcaggt attagctgga acgttggtag tacgttctat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatg tccagagaga ttgccaagaa tacggtgcat 240
ctacaaatga acagcctgag gcctgaggac acggccgttt attactgtgc aagaggcctt 300
ggtggtggca gataccgcga tgccccgagc tatgaattgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 52
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 52
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctaagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg cacctttggt gcctatcaaa tggcctggtt ccgccaggct 120
ccagagaagg agcgtgagtt tgtagcaggt attagctgga atcttggtag cacgtactat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatg tccagagaga ttgccaagaa tacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag acctgaggac acggccgttt attactgtgc aagaggcctt 300
ggtggtggca tttaccgcga tgccccgatg tatgaattgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctccc ca 372
<210> 53
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 53
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgaacg cacctttgat tcctaccaaa tggcctggtt ccgccaggcg 120
ccagggaagg aacgtgagtt tgtagcaggt attagctgga atcttggtag cacgtactat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatg tccagagaga ttgccaagaa tgcggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag acctgaggac acggccgttt attactgtgc aagaggcctt 300
ggtggtggca catatcgcgc tgccccgatg tatgaactgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 54
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 54
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgaacg cacctttggt ccctatcaaa tggcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg aacgtgagtt cgtagcaact attagttgga atcttggtag cacgtactat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatg tccagagaga ttgccaagaa tacggtgtat 240
ctgcaaatga acaacctgag acctgaggac acggccgttt attactgtgc aagaggcctt 300
ggtggtggca cataccgcta tgccccgatg tatgaactgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 55
<211> 384
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 55
caggtgcagc tggtggagtc tgggggacga ttggcgcagg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtgctg cctctggacg tagtatgagt ctgtatagta tggcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg accgtgagtt tgtagcagtt aatagatgga gtaccggtag cgcgtactat 180
cgtgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcaggagta 300
ggagcgaccg cccgacttga agacttgtac agtagtagtt actattctta ttggggccag 360
gggacccagg tcaccgtcac ctca 384
<210> 56
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 56
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttcgtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcgga atgtttggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtgtcacgt attaatagtg atggtagtac gacattgtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtgc aattggaaac 300
gccgaaacac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 57
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 57
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttcgtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcgga atgtttggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ctaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacgt attaatagtg atggtactac gacattgtat 180
ccagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acaatctgaa acctgaggat acggccctgt attactgtgc aattggaagt 300
tccgaaacac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 58
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 58
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttcgtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcgga atgtttggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtgtcacgt attaatagtg atggtagtac gacattgtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtgc aattggaaac 300
gccgaaacac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 59
<211> 378
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 59
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttcagt agttatgtga tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgaggc agtagcagct attggctgga gtggcagtag cacatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgatgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa tcctgaggac acggccgttt attactgtgc agcaaatcga 300
aggacggctt ggcgcacgtc gcaggtgggc agtgattatg acgtctgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tttcctca 378
<210> 60
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 60
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttcgtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcgga atgtttggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacgt attaatagtg atggtagtac gacattgtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtgc aattggaaat 300
agcgaaacac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 61
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 61
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttcgtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcggg atgtttggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacgt attaatagtg atggtagtac gacattgtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa ccctgaggac acggccctgt attactgtgc aattgggaat 300
tccgaaacac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 62
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 62
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttcgtgcagc ctgcgggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcgga atgtttggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacgt attaatagtg atggtagtac gacattgtat 180
gcagactccg tgaaggcccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa ccctgaggac acggccctgt attactgtgc aattgcaaat 300
tccgaaacac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 63
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 63
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagcc ttggtgcagg cggggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggact cgccctcgag ttctatcaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagagaagg agcgtgagtt tgtagcaggc attacttgga caggtcgtaa cacaatttac 180
gcagactccg tgacgggccg attcaccatc gccagagaca acgccaagaa cacgatgtcc 240
ctacaaatga acagcctgca acccgaagag acggccgttt attattgtgc cgcgagcgcc 300
gccgggggtt tgactaagga tatgaaagac tacaagtact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtttcct ca 372
<210> 64
<211> 378
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 64
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttcagt agttatgtga tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgaggc agtaacagct attggctgga gtggcactag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgatgtat 240
ttgcaaatga acagcctgaa tcctgaggac acggccgttt attactgtgc agcaaatcga 300
aggacggctt ggcgcacgtc gcaggtgggc agtgattatg acgtctgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tttcctca 378
<210> 65
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 65
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc tccgtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcgga atgtttggta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacgt attaatagtg atggtagtag cacattgtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtac aattgggcca 300
tccgaagcac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 66
<211> 345
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 66
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttcgtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcgga atgtttggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacgt attaatagtg atggtagtac gacattgtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag aacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtgc aattggaaac 300
gccgaaacac gtacgggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 67
<211> 372
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 67
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgctcg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcatt ccctacacca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attacatgga gtggtgcgag cataacctat 180
gcagactccg tgaagggccg atttaccatc tccaaagaca acgccaagaa cacgatgtat 240
ctgcaaatgg acagcctgaa gcctgaggac acggccgttt attactgcgc agcgggcagt 300
gggggaggtt tatatacgtc ttcctggcag tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 68
<211> 378
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 68
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg caccttcagt agttatgtga tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgaggc agtaacagct attggctgga gtggcagtag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgatgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa tcctgaggac acggccgttt attactgtgc agcaaatcga 300
aacacggctt ggcgcacgtc gcaggtgggc agtgattatg acgtctgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tttcctca 378
<210> 69
<211> 354
<212> DNA
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 69
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgacactc 60
tcctgtgcag cctctggaag cgtctccgat atcgttctca tgtcctggtt ccgccaggct 120
ccaggaaagg agcgcgagtt cgtctctact attagtatta ctaggggtag tcacacaaac 180
tatgcggact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaacacgatc 240
tatctccaaa tggacagcct gaaagctgag gacacaggcg tctattactg taaagcaagt 300
acgtacgctg catacaccta ctggggccag gggacccagg tctccgtctc ctca 354
<210> 70
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 71
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
catggcgagg gtacatttac aagtgatgtg tcttcatatt tggaagagca ggcagctaaa 60
gagttcattg cgtggctggt caaaggaggt ggc 93

Claims (7)

1.一种抗体，其特征在于仅包含抗人血清白蛋白抗体的重链可变区，并由FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2、CDR3组成，所述抗体的CDR1、CDR2和CDR3分别选自由下列序列顺次组合组成的组：
SEQ ID NO:1的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-111位氨基酸；
SEQ ID NO:4的第26-33位氨基酸、第51-57位氨基酸、第96-108位氨基酸；
SEQ ID NO:5的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-113位氨基酸；
SEQ ID NO:6的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-113位氨基酸；
SEQ ID NO:7的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-113位氨基酸；
SEQ ID NO:8的第26-33位氨基酸、第51-57位氨基酸、第96-111位氨基酸；
SEQ ID NO:9的第26-33位氨基酸、第51-57位氨基酸、第96-100位氨基酸；
SEQ ID NO:10的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-113位氨基酸；
SEQ ID NO:11的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-113位氨基酸；
SEQ ID NO:12的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-113位氨基酸；
SEQ ID NO:16的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-104位氨基酸；
SEQ ID NO:18的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-115位氨基酸；
SEQ ID NO:21的第26-33位氨基酸、第51-58位氨基酸、第97-104位氨基酸。
2.根据权利要求1的抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1、4-12、16、18或21中的任一项所示。
3.根据权利要求2的抗体，其编码基因序列如SEQ ID NO:42、45-53、57、59或62中的任一项所示。
4.一种融合蛋白，包含治疗性蛋白质以及抗体，其中，所述治疗性蛋白质为GLP-1，且氨基酸序列如SEQ ID NO:35的第1-31位、SEQ ID NO:36的第1-31位、SEQ ID NO:37的第1-31位、SEQ ID NO:38的第1-30位、SEQ ID NO:39的第1-30位、SEQ ID NO:40的第1-39位，或SEQID NO:41的第1-44位所示；所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
5.根据权利要求4的融合蛋白，在抗体和治疗性蛋白质之间包含连接短肽，所述连接短肽具有下述任一种结构：
(1)(GX1GGS)n其中X1为G或S，n为2-7任一整数值，或
(2)(GGGS)n，其中n＝2。
6.根据权利要求5的融合蛋白，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:35-41。
7.权利要求4-6任一项的融合蛋白在制备治疗性药物中的用途，其中，所述治疗性药物用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病，或者所述治疗性药物为减肥药或心血管疾病治疗药。
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