CN111172127A

CN111172127A - 一种蔗糖磷酸化酶在制备甘油葡萄糖苷中的应用

Info

Publication number: CN111172127A
Application number: CN202010053780.1A
Authority: CN
Inventors: 陈小龙; 甘恬; 朱林江; 陆跃乐; 范永仙; 陈翰驰
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2020-05-19

Abstract

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶在制备甘油葡萄糖苷中的应用，将SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶基因lrsp克隆至枯草芽孢杆菌表达质粒上，构建重组质粒pP43‑lrsp，并将其转化到表达菌株枯草芽孢杆菌WB800中，构建重组菌枯草芽孢杆菌WB800(pP43‑lrsp)。该重组菌经过发酵，分泌型表达蔗糖磷酸化酶。将发酵液经过稀释后直接用于制备2‑αGG，其以蔗糖作为糖基供体，以丙三醇作为糖基化受体，具有催化效率高，生产速率快的特点，30‑40h内催化得到87‑110g/L的2‑αGG，平均生产强度大于2.1g·L^‑1·h^‑1。

Description

一种蔗糖磷酸化酶在制备甘油葡萄糖苷中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种甘油葡萄糖苷的制备，特别一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-甘油葡萄糖苷中的应用。

(二)技术背景

2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)是由各种植物、藻类和异样细菌为适应盐胁迫和干旱等极端条件而产生的相容性溶质，2-αGG是甘油分子上的二号位羟基被葡萄糖基化的产物，即通过糖苷键将一个D-吡喃葡萄糖与甘油的二号位羟基偶联，其结构如图1所示，其化学名为α-D-吡喃葡萄糖基-α-(1-2,2)-丙三醇，是一种有强效保湿、抗衰老、舒缓、修复、细胞激活多功能的活性化妆品原料。2-αGG不仅适用于日常肌肤的护理，而且同样适用于抗疲劳、抗环境压力(如UV辐射、PM2.5缓解污染)、抗衰老、抗敏感性、抗湿疹性等方面；它同时还具有无致龋性，也可以作为一种无致龋性的甜味剂，添加到食品中；而且它还是一种大分子物质的稳定剂，可用于蛋白质药物等的长期保存；此外，研究发现还具有治疗过敏性呼吸系统疾病、保护眼角结膜、降低血糖和控制内脏脂肪积累等人体保健的功效。

蔗糖磷酸化酶(Sucrosephosphorylase，SPase,EC 2.4.1.7)属于糖苷水解酶GH13家族，能够催化葡萄糖基的特异性转移，具备小分子化合物糖基化功能。相比于其他具有转糖苷能力的生物酶来说，蔗糖磷酸化酶具有糖基供体底物廉价易得，糖基受体底物广泛，反应区域选择性高，不水解糖基化产物等优点。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种土壤来源的革兰氏阳性细菌，具有优良的蛋白质分泌能力，被广泛用于工业酶的生产和蛋白质的异源表达。枯草芽孢杆菌作为表达宿主具备以下优点：其在发酵过程中不产生任何内毒素、无致病性，被认为是一种GRAS安全菌株；枯草芽孢杆菌只有一层膜，不具有外膜结构，所以产物可以被分泌到细胞外，极大地简化了产品的后续分离纯化步骤；营养要求低；遗传背景清晰，方便进行基因改造及代谢组学分析；已有大量关于其转录和翻译机制、大规模发酵的信息；无显著密码子使用偏好性等。因为其特有的优势，枯草芽孢杆菌已成为了目前生产各种工业酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的理想宿主菌株。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种蔗糖磷酸化酶在高效制备2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)中的应用，实现生物法一步催化转化，高效生产2-αGG。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)中的应用，所述蔗糖磷酸化酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述的应用方法为：以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液作为催化剂，以蔗糖作为糖基供体，以丙三醇作为糖基化受体，以pH为4.0-9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、磁力搅拌条件下反应，反应完全后，获得含2-αGG的反应液，经分离纯化得到2-αGG产品。所述反应体系中，湿菌体含量为5-50g/L(优选5-20g/L)，蔗糖的终浓度为200-500g/L(优选250-400g/L，最优选300g/L)，丙三醇终浓度为20-300g/L(优选90-180g/L，最优选90g/L)。

进一步，所述发酵液先用相应的缓冲液作适当倍数稀释作为催化酶液；再加入蔗糖和丙三醇，缓冲液溶制成反应体系。

进一步，所述缓冲液优选为pH8.0，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

进一步，所述反应条件优选为35-45℃(最优选37℃)，反应过程控制pH7.0-8.5之间，反应30-40h。

进一步，所述发酵液按如下方法制备：(1)将含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌接种在含50mg/L卡那霉素的种子培养基中，30-37℃，100-250rpm培养至对数生长中期(优选37℃、200prm培养)，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，溶剂为去离子水，pH为6.8-7.0。

(2)摇瓶发酵培养：将种子液以体积5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的TB培养基中，30-37℃、100-250rpm培养8-20h(优选37℃，200rpm，12h)获得发酵液；所述TB培养基终浓度组成：酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4mL/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

进一步，所述发酵液的发酵罐制备方法为：将新鲜种子液按体积浓度5％的接种量接种到含体积浓度0.05％(v/v)消泡剂和50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，发酵温度37℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8；从接种发酵罐开始添加补料培养基进行补料：在最初8个小时内，其补料速率从0ml/h/L起始发酵培养基增加至60ml/h/L起始发酵培养基，匀速递增，发酵8小时后，将补料速率降至30ml/h/L起始发酵培养基，继续培养20h，获得发酵液；补料培养基为质量浓度20％葡萄糖水溶液；发酵培养基终浓度组成：酵母粉50g/L、蛋白胨30g/L、KH₂PO₄ 6g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

进一步，所述含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌是将SEQ ID NO.1所示来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的蔗糖磷酸化酶(SPase)基因lrsp(GenBank登入号：DQ466578)克隆至枯草芽孢杆菌宿主细胞中获得的。所述枯草芽孢杆菌宿主优选为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WB800，具体构建方法为：将SEQ ID NO.1所示lrsp基因经过基因合成公司进行合成，并克隆至大肠杆菌质粒pET28a上，得到重组质粒pET28a-lrsp；再将lrsp基因从pET28a-lrsp质粒上克隆至枯草芽孢杆菌表达质粒上，优选枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭型的复制型质粒，比如构建表达载体pP43-lrsp，如图2所示；再将重组质粒pP43-lrsp转化到枯草芽孢杆菌中，优选蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WB800，得到重组枯草芽孢杆菌WB800(pP43-lrsp)，将该重组菌命名为重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis)IEF-lrsp。

本发明具有与SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列≥85％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；以及将SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽均属于本发明保护范围。

与现有技术相比，本发明有益效果体现在：①本发明提供了一种新的用于高效制备2-αGG的蔗糖磷酸化酶，该酶具有催化效率高，生产速率快的特点，30-40h内催化得到87-110g/L的2-αGG，平均生产强度大于2.1g·L^-1·h^-1；②本发明提供了重组枯草芽孢杆菌B.subtilisIEF-lrsp，实现蔗糖磷酸化酶胞外分泌的高效制备并用于生产2-αGG，且枯草芽孢杆菌属于食品级生产菌株，适用于食品级原料的制备。

(四)附图说明

图1为2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)分子结构式。

图2为重组质粒pP43-lrsp的结构示意图。

图3为2-αGG的HPLC分析图谱。

图4为甘油、蔗糖的HPLC分析图谱。

图5为甘油的标准曲线。

图6为2-αGG的标准曲线。

图7为蔗糖磷酸化酶催化反应液的HPLC图谱。

(五)具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

LB培养基组成：酵母粉5.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

种子培养基终浓度组成：酵母粉5.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

TB培养基终浓度组成：酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4mL/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

发酵培养基终浓度组成：酵母粉50g/L、蛋白胨30g/L、KH₂PO₄ 6g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

实施例1含蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌B.subtilisIEF-lrsp的构建

1)lrsp基因的合成。

将来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的蔗糖磷酸化酶(SPase)基因lrsp(GenBank登入号：DQ466578)，提交给基因合成公司(华大基因青兰生物科技有限公司)合成，并要求将人工合成lrsp基因克隆至大肠杆菌质粒pET28a上，即得到重组质粒pET28a-lrsp；将其转化至E.coli DH5α菌株中，得到重组大肠杆菌E.coli DH5α(pET28a-lrsp)。

2)lrsp基因的扩增。

提取重组质粒pET28a-lrsp作为DNA模板，以lreSP-F/lreSP-R为扩增引物，采用南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的高效保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增得到lrsp基因，其PCR扩增程序为：95℃ 30s；95℃15s、58℃ 15s、72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存。用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物。

lreSP-F:

TAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCCAATCAAAAATGAAGCAATG；

lreSP-R:

CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTATTTTTGTTCCATCACTTTTTC。

3)启动子P43的扩增。

提取枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pP43NMK(NCBI数据库的登录号：DQ264732)作为DNA模板，以引物P43-F/P43-R为引物，采用高效保真酶Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase进行PCR扩增得到启动子P43，其PCR扩增程序为：95℃ 30s；95℃ 10s、58℃15s、72℃ 20s，30个循环；72℃ 5min；4℃保存。用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物。

P43-F:

CGAGATTTTTTTGAGCAACTGGATCCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCT

P43-R:CATTGCTTCATTTTTGATTGGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTA

4)lrsp基因与启动子P43的融合PCR扩增。

以上述纯化的lrsp基因和P43启动子为DNA模板，以引物P43-F/lreSP-R为引物，采用高效保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，其PCR扩增程序为：95℃ 40s；95℃ 15s、58℃ 15s、72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存。用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，得到P43-lrsp的扩增产物。

5)P43-lrsp克隆至pP43NMK质粒上，得到重组质粒pP43-lrsp。

提取质粒pP43NMK，经过BamHI/HindIII酶切后，采用DNA胶回收试剂盒纯化酶切线性化的质粒pP43NMK；将已纯化的P43-lrsp的PCR产物与线性化的pP43NMK进行重组连接反应：采用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒One Step Cloning Kit(根据试剂盒说明书操作)，转化E.coliDH5α的高效感受态细胞中，在含终浓度50mg/L氨苄青霉素的LB平板上筛选。菌落PCR验证阳性克隆子，并提取质粒进行测序分析。阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pP43-lrsp(图2)，其中蔗糖磷酸化酶基因lrsp核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

6)将重组质粒pP43-lrsp转化到枯草芽孢杆菌中，得到重组芽孢杆菌IEF-lrsp。

从E.coli DH5α(pP43-lrsp)菌株中提取重组质粒pP43-lrsp，转化到枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WB800感受态中，涂布于含终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，菌落PCR验证阳性克隆子，获得含重组穿梭载体pP43-lrsp的阳性克隆子B.subtilisWB800(pP43-lrsp)，记为重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)IFE-lrsp。

实施例2、三角瓶摇瓶制备生产2-αGG的发酵液

1)种子活化。

将B.subtilis IFE-lrsp接种到含有50mg/L卡那霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

2)三角瓶发酵。

将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的TB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得湿菌体的含量为10g/L的发酵液。

将新鲜发酵液按需作适当倍数稀释，即可直接用作催化剂，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

实施例3、2L发酵罐制备生产2-αGG的发酵液

1)种子活化。

2)将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到1L含体积浓度0.05％(v/v)消泡剂和50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，发酵温度37℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8。从接种发酵罐开始进行补料：在最初8个小时内，其补料速率从0ml/h/L起始发酵培养基增加至60ml/h/L起始发酵培养基，匀速递增，补料培养基为质量浓度20％葡萄糖水溶液；发酵8小时后，将补料速率降至30ml/h/L起始发酵培养基，继续培养20h，最终获得湿菌体含量为60g/L的发酵液。

实施例4发酵液在生产2-αGG中的应用

1、发酵液中的蔗糖磷酸化酶的酶活力检测

将实施例3制得的发酵液，用pH8.0，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释至菌体量为10g/L，作为催化酶液。用pH8.0，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制催化反应体系，含300g/L的蔗糖及90g/L的丙三醇，以及以体积浓度50％(v/v)的催化酶液，再次校正pH8.0，共50mL体系，37℃恒温水浴，磁力搅拌，反应0.5h。反应液用于HPLC分析，测得残留的丙三醇浓度为84g/L，形成的产物2-αGG的浓度为20g/L。

液相色谱检测条件：取100μL反应液，加入到900μL的超纯水中，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：ZORBAXNH2柱，250×4.6mm；柱温：40℃；流动相：乙腈/水(8/2，v/v)；流速：1mL/min；检测器：示差检测器；进样量：10μL。

产物2-αGG标准品的HPLC图谱如图3所示，其出峰时间为11.0min。糖基供体蔗糖和糖基受体底物丙三醇的HPLC图谱如图4所示，其出峰时间分别为18.6min和5.6min。同样条件下，以丙三醇水溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制备丙三醇标准曲线，结果见图5所示；以2-αGG标准品水溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制备丙三醇标准曲线，结果见图6所示。

2、不同湿菌体用量制备2-αGG

(1)湿菌体终浓度10g/L：

取实施例3方法制备的发酵液，用50mM、pH为8.0甘氨酸氢氧化钠缓冲液稀释成湿菌体含量为20g/L的催化酶液。用pH8.0，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制催化反应体系：含300g/L的蔗糖及90g/L的丙三醇，以及以体积浓度50％的催化酶液(v/v)，再次校正pH8.0，共50mL体系，于37℃恒温水浴中，磁力搅拌反应40h。反应液用于HPLC分析，测得残留的底物丙三醇浓度为60g/L，形成的产物2-GG的浓度为87g/L。

(2)湿菌体终浓度15g/L：

取实施例3方法制备的发酵液，用50mM、pH为8.0甘氨酸氢氧化钠缓冲液稀释成湿菌体含量为30g/L的催化酶液。用pH8.0，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配置催化反应体系，含300g/L的蔗糖及90g/L的丙三醇，以及以体积计50％的催化酶液(v/v)，再次校正pH8.0，共50mL体系，于37℃恒温水浴中，磁力搅拌反应35h。反应液用于HPLC分析，测得残留的底物丙三醇浓度为55g/L，形成的产物2-α实GG的浓度为100g/L。

(3)湿菌体浓度20g/L：

取施例3方法制备的发酵液，用50mM、pH为8.0甘氨酸氢氧化钠缓冲液稀释成湿菌体含量为40g/L的催化酶液。用pH8.0，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配置催化反应体系，含300g/L的蔗糖及90g/L的丙三醇，以及以体积计50％的催化酶液(v/v)，再次校正pH8.0，共50mL体系，于37℃恒温水浴，磁力搅拌反应30h。反应液用于HPLC分析，测得残留的底物丙三醇浓度为52g/L，形成的产物2-αGG的浓度为110g/L。

(4)2-αGG产物浓度检测：

样品前处理：取100μL反应液，加入900μL的超纯水中，12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液稀释1/5后加入液相样品瓶中；色谱柱：ZORBAXNH2柱，250×4.6mm；柱温：40℃；流动相：乙腈/水(8/2)；流速：1mL/min；检测器：示差检测器；进样量：10μL。催化反应结束后的HPLC谱图如图7所示。底物丙三醇的出峰时间为5.6min，产物2-αGG的出峰时间为11.0min。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种蔗糖磷酸化酶在制备甘油葡萄糖苷中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)

<400> 1

atgccaatca aaaatgaagc aatgttaatt acttactctg actcaatggg taaaaatatt 60

aaagaaactc atgaagtatt aaagaactat atcggtgatg cgatcggcgg tgttcactta 120

cttccgttct tcccatcaac tggtgaccgt ggtttcgcac cataccgtta cgatgttgtt 180

gattctgctt ttggtaactg ggatgatgtt gaagcattag gtgaagacta ctacttaatg 240

tttgacttca tgattaacca tatttccaag aagtctgaaa tgtaccaaga cttcaagaag 300

aagcacgatg attctaagta caacgacttc tttattcgtt gggaaaagtt ctgggaaaaa 360

gctggtaaga accgtccaac tcaagaagat gttgatttaa tttacaagcg aaaggataag 420

gctcctaagc aagaaattac ctttgatgat ggtactactg aaaacttatg gaacactttc 480

ggtgaagaac aaattgatat taatgttaag agtaaggtag ctaacgaatt cttcaaggaa 540

acattaattg acatggttaa gcacggtgca gatatgattc gtcttgatgc ctttgcttac 600

gctattaaga aggttggtac taatgatttc ttcgttgaac ctgaaatctg ggatctctta 660

aatgaagttc aagatatttt ggctccttac aaggccatca tccttcctga aattcacgaa 720

cactacacca ttccacaaaa gatttcacaa catgacttct tcatctatga ctttacctta 780

ccaatgacta ctctttatac cctttactct ggtaagacta accgccttgc taagtggtta 840

aagatgtcac caatgaagca atttactact cttgatactc atgatggtat tggggttgtt 900

gatgctaagg atatcttaac tgatgatgaa atcgaatatg catccaatga attatacaag 960

gttggtgcta acgttaagcg gaaatactca agtgctgaat acaacaactt ggatatttac 1020

caaattaact ctacttacta ctctgcatta ggtgacgatg acaaagctta cttgctttct 1080

cgtgcattcc aagtatttgc acctggtatt ccaatggttt actatgttgg tttacttgct 1140

ggttcaaatg accttgaatt acttgaaaag actaaggaag gtcggaacat caaccgtcac 1200

tactacacta aagaagaagt tgcacaagaa gttcaacgtc cagtagttaa gaatctctta 1260

gacttacttg catggcggaa taaatttgca gcctttgatc ttgatggttc aattgaagtg 1320

gaaacaccaa ctgaaacaac tatcaaggtt acgcggaaag ataaggatgg caagaatgtg 1380

gctgttcttg atgctgatgc tgctaacaag actttcacta ttacagctaa tggtgaaaaa 1440

gtgatggaac aaaaatag 1458

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)

<400> 2

Met Pro Ile Lys Asn Glu Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ser Asp Ser Met

1 5 10 15

Gly Lys Asn Ile Lys Glu Thr His Glu Val Leu Lys Asn Tyr Ile Gly

20 25 30

Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Tyr Arg Tyr Asp Val Val Asp Ser Ala Phe

50 55 60

Gly Asn Trp Asp Asp Val Glu Ala Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Leu Met

65 70 75 80

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Lys Lys Ser Glu Met Tyr Gln

85 90 95

Asp Phe Lys Lys Lys His Asp Asp Ser Lys Tyr Asn Asp Phe Phe Ile

100 105 110

Arg Trp Glu Lys Phe Trp Glu Lys Ala Gly Lys Asn Arg Pro Thr Gln

115 120 125

Glu Asp Val Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Lys Ala Pro Lys Gln

130 135 140

Glu Ile Thr Phe Asp Asp Gly Thr Thr Glu Asn Leu Trp Asn Thr Phe

145 150 155 160

Gly Glu Glu Gln Ile Asp Ile Asn Val Lys Ser Lys Val Ala Asn Glu

165 170 175

Phe Phe Lys Glu Thr Leu Ile Asp Met Val Lys His Gly Ala Asp Met

180 185 190

Ile Arg Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Ile Lys Lys Val Gly Thr Asn

195 200 205

Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Leu Leu Asn Glu Val Gln

210 215 220

Asp Ile Leu Ala Pro Tyr Lys Ala Ile Ile Leu Pro Glu Ile His Glu

225 230 235 240

His Tyr Thr Ile Pro Gln Lys Ile Ser Gln His Asp Phe Phe Ile Tyr

245 250 255

Asp Phe Thr Leu Pro Met Thr Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys

260 265 270

Thr Asn Arg Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe

275 280 285

Thr Thr Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Lys Asp

290 295 300

Ile Leu Thr Asp Asp Glu Ile Glu Tyr Ala Ser Asn Glu Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Val Gly Ala Asn Val Lys Arg Lys Tyr Ser Ser Ala Glu Tyr Asn Asn

325 330 335

Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp

340 345 350

Asp Asp Lys Ala Tyr Leu Leu Ser Arg Ala Phe Gln Val Phe Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Pro Met Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Ser Asn Asp

370 375 380

Leu Glu Leu Leu Glu Lys Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His

385 390 395 400

Tyr Tyr Thr Lys Glu Glu Val Ala Gln Glu Val Gln Arg Pro Val Val

405 410 415

Lys Asn Leu Leu Asp Leu Leu Ala Trp Arg Asn Lys Phe Ala Ala Phe

420 425 430

Asp Leu Asp Gly Ser Ile Glu Val Glu Thr Pro Thr Glu Thr Thr Ile

435 440 445

Lys Val Thr Arg Lys Asp Lys Asp Gly Lys Asn Val Ala Val Leu Asp

450 455 460

Ala Asp Ala Ala Asn Lys Thr Phe Thr Ile Thr Ala Asn Gly Glu Lys

465 470 475 480

Val Met Glu Gln Lys

485

Claims

1.一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-甘油葡萄糖苷中的应用，其特征在于所述蔗糖磷酸化酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述蔗糖磷酸化酶编码基因核苷酸序列为SEQID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液作为催化剂，以蔗糖作为糖基供体，以丙三醇作为糖基化受体，以pH为4.0-9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、磁力搅拌条件下反应，反应完全后，获得含2-O-α-D-甘油葡萄糖苷的反应液，经分离纯化得到2-O-α-D-甘油葡萄糖苷。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反应体系中，湿菌体含量为5-50g/L，蔗糖的终浓度为200-500g/L，丙三醇终浓度为20-300g/L。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH8.0，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反应条件为35-45℃，磁力搅拌，反应过程控制pH7.0-8.5之间，反应30-40h。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：(1)将含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌接种在含50mg/L卡那霉素的种子培养基中，30-37℃，100-250rpm培养至对数生长中期，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH为6.8-7.0；

(2)摇瓶发酵培养：将种子液以体积5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的TB培养基中，30-37℃、100-250rpm培养8-20h获得发酵液；所述TB培养基终浓度组成：酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4mL/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液的发酵罐制备方法为：将新鲜种子液按体积浓度5％的接种量接种到含体积浓度0.05％消泡剂和50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，发酵温度37℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8；从接种发酵罐开始添加补料培养基进行补料：在最初8个小时内，其补料速率从0ml/h/L起始发酵培养基匀速增加至60ml/h/L起始发酵培养基，发酵8小时后，将补料速率降至30ml/h/L起始发酵培养基，继续培养20h，获得发酵液；补料培养基为质量浓度20％葡萄糖水溶液；发酵培养基终浓度组成：酵母粉50g/L、蛋白胨30g/L、KH₂PO₄ 6g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠1g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌是将SEQID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶基因克隆至枯草芽孢杆菌宿主细胞中获得的。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WB800。