CN111175428B - 补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，它包括步骤1、补肾助孕颗粒供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，补肾助孕颗粒指纹图谱仪器导出，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次补肾助孕颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成补肾助孕颗粒的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；将补肾助孕颗粒指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认主要成分峰。本发明所提供的补肾助孕颗粒指纹图谱，能全面，客观地表征补肾助孕颗粒的质量。且检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法。

背景技术

补肾助孕颗粒处方为江苏省中医院国医大师夏桂成教授的经验方，由莵丝子、炒白芍、酒萸肉、丹参、山药、醋柴胡、鹿角片、紫石英8味药组成，具有使“阳长至重”，舒畅心肝气机，安定心肝魂魄的功效，临床上用于治疗肾虚偏阳、夹有肝郁型黄体功能不全性不孕症，应用多年，有长期临床经验，且经过多个药理试验揭示疗效。但目前尚未无制剂批准文号，因此，对其进行医疗机构制剂及新药研究的药学研究，包括制备工艺及质量标准、稳定性试验等十分必要。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量分析方法，能够较好地反映出中药制剂的整体质量，广泛应用于中药制剂质量控制。为了更好地控制补肾助孕颗粒的制剂质量，本发明采用HPLC法建立特征图谱，并同时建立了外标法测定没食子酸、 5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的含量。为补肾助孕颗粒的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种补肾助孕颗粒的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价补肾助孕颗粒的质量，对控制补肾助孕颗粒的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B对照品，加甲醇制成混合对照品溶液；

步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪分析，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的补肾助孕颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次补肾助孕颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成补肾助孕颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B对照品，加甲醇制成混合对照品溶液；

步骤3，缺失药材的阴性样品溶液的制备

分别取缺失酒萸肉、菟丝子、丹参、炒白芍或酒萸肉-炒白芍药材的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得缺失各药材的阴性样品溶液；

步骤4，分别精密吸取步骤1供试品溶液，步骤2混合对照品溶液和步骤3 缺失药材的阴性样品溶液，注入高效液相色谱仪分析，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的各批次的补肾助孕颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择各批次补肾助孕颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成补肾助孕颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；

并将对照指纹图谱与缺失药材的阴性样品溶液的色谱图进行比较，指认出对照指纹图谱中共有峰与药材的相关性。

一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B对照品，加甲醇制成混合对照品溶液；

步骤3，线性回归方程的建立

分别精密吸取步骤2的混合对照品溶液，分别稀释成1、2、5、10、20、40 倍的混合对照品溶液，精密吸取各混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪分析，以测得的响应信号峰和被测成分的进样浓度用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的线性回归方程以及线性范围；

步骤4，供试品溶液的检测

精密吸取步骤1制备得到的供试品溶液10μL，注入高效液相色谱检测，通过步骤(3)获得的线性回归方程，检测供试品溶液中各化学成分的含量。

作为优选方案，以上所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，以上步骤1 补肾助孕颗粒供试品溶液制备方法为：取补肾助孕颗粒，研细，精密称定0.8g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度70％甲醇水10mL，密塞，称量，200W, 40kHz超声处理30min，放置至室温，再称量，用体积浓度70％甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

作为优选方案，以上所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成浓度分别为0.540mg·mL^-1、1.600mg·mL^-1、0.637mg·mL^-1、0.225mg·mL^-1、 0.623mg·mL^-1、1.053mg·mL^-1、0.638mg·mL^-1、0.480mg·mL^-1、0.365mg·mL^-1、0.877 mg·mL^-1的混合对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

作为优选方案，以上所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，高效液相色谱仪分析的色谱条件为：

色谱柱为：Hedera ODS-2C18色谱柱，规格250mm×4.6mm，5μm，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0mL·min^-1，检测波长237nm，柱温30℃，进样量10μL。梯度洗脱程序为：0～15min， 5％A→7％A；15～30min，7％A→9.5％A；30～31min，9.5％A→11％A；31～55min， 11％A；55～65min，11％A→20％A；65～95min，20％A→22％A；95～100min， 22％A→5％A。

本发明的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，指纹谱图中共有峰23个。其中2号峰为没食子酸、3号峰为5-羟甲基糠醛、6号峰为莫诺苷、8号峰为当药苷、9号峰为马钱苷、12号峰为芍药苷、16号峰为金丝桃苷、19号峰为紫云英苷、21号峰为迷迭香酸、23号峰为丹酚酸B。

本发明所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其中1、2、3、4、5、6、 8、9、20号峰为酒萸肉饮片中的成分；7、13、14、15、16、17、19号峰为菟丝子饮片中的成分；2、10、11、12、18号峰为炒白芍饮片中的成分；20、21、 22、23号峰为丹参饮片中的成分；其中2号峰为酒萸肉和炒白芍共有的成分； 20号峰为酒萸肉和菟丝子共有的成分。

本发明所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，各化合物的线性回归方程如下：

成分	回归方程	线性范围/(μg·mL<sup>-1</sup>)	r
				没食子酸	Y＝8 145.2X+27 742	13.50～540.00	0.9999
5-羟甲基糠醛	Y＝8 251X+86 250	40.02～1600.84	0.9999
				莫诺苷	Y＝17 063X+39 070	15.92～636.80	0.9998
当药苷	Y＝15 767X-11 585	5.02～200.80	0.9998
				马钱苷	Y＝17 806X-35 604	15.59～623.60	0.9997
芍药苷	Y＝12 710X-195 305	26.32～1 052.84	0.9996
				金丝桃苷	Y＝17 290X-24 182	15.96～638.42	0.9998
紫云英苷	Y＝17 653X-49 093	12.00～480.07	0.9995
				迷迭香酸	Y＝13 862X-40 387	9.12～364.81	0.9998
丹酚酸B	Y＝11 925Xx+118 000	21.92～876.80	0.9999

指纹图谱检测条件的优化：

1.1检测波长的选择

本发明对混合对照品进行了Waters2998PDA全波长扫描，发现目标成分在 237nm左右均有较好吸收，且色谱中目标峰的峰形也均较好。莫诺苷是酒萸肉的重要活性成分，在本制剂中含量较高，性质稳定，分离度好，其最大吸收波长是237nm，故选择237nm为检测波长。

1.2流动相的选择

本发明考察不同流动相(乙腈-0.2％磷酸水溶液，甲醇-0.2％磷酸水溶液，乙腈-水)，结果采用乙腈-0.2％磷酸水系统，相较于甲醇-0.2％磷酸水溶液，出峰速度快，芍药苷理论塔板数略降低但无较大影响；相对于乙腈-水，莫诺苷、马钱苷、金丝桃苷和丹酚酸B峰形与分离度均较好，基线较为平稳，故选择其作为流动相。

1.3流动相梯度的选择

本实验中测定的成分多为极性成分，故在确定流动相选择为乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)的基础上，研究了梯度变化对分离效果的影响。本制剂中，5-羟甲基糠醛、马钱苷、芍药苷及金丝桃苷附近干扰峰较多，难以分离；故选择该时间段内选择等度洗脱或低流动相变化洗脱，保证峰的分离度达到要求。其中15～30 min部分的梯度本发明还筛选了7％A等度洗脱、8％A等度洗脱、7％A→9％A梯度洗脱、7％A→10％A梯度洗脱多种条件，发现梯度为7％A→9.5％A时，莫诺苷分离度较好，且对后续色谱峰无影响；31～55min部分，此处使用12％A等度洗脱约20min即可出峰，而11％A的长时间等度洗脱相较于12％A短时间等度洗脱虽然出峰时间延后，但可以使马钱苷、芍药苷的分离度更好，且理论塔板数较高；11％A→20％A流动相部分色谱峰较少，但为了使基线平稳采用较长时间来过渡；65～95min部分的梯度20％A等度洗脱、20％A→21％A、20％A→22A％梯度洗脱均能使目标峰分离，除了出峰时间不同外差别较小，故选择出峰时间较快的20％A→22％A。综上所述，最终确定HPLC方法为以乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0～15min，5％A→7％A；15～30min，7％A→9.5％A； 30～31min，9.5％A→11％A；31～55min，11％A；55～65min，11％A→20％A；65～95 min，20％A→22％A；95～100min，22％A→5％A。

1.4柱温的选择

本发明在筛选出上述梯度条件下，柱温对其中莫诺苷、马钱苷、当药苷和金丝桃苷的分离度也有影响，本发明考察不同的柱温(25，30，35℃)。《中华人民共和国药典》关于酒萸肉中的莫诺苷和马钱苷的测定方法中柱温为35℃。柱温为30℃时，莫诺苷和马钱苷的分离度能够达到要求，且此时其他峰分离度良好；柱温为35℃时，当药苷的分离度下降，其余成分分离度良好；柱温为25℃时，当药苷的分离度更优，但莫诺苷及金丝桃苷分离度下降。综合考虑，选择30℃作为柱温。

本发明所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，补肾助孕颗粒的制备方法为：称取鹿角10份、莵丝子15份、炒白芍15份、酒萸肉15份、丹参15 份、山药15份、醋柴胡6份、紫石英10份；

先取鹿角10份与紫石英10份，加水8倍，先煎0.5h，滤过，滤液备用；

药渣与莵丝子15份、炒白芍15份、酒萸肉15份、丹参15份、山药15 份、醋柴胡6份，加水煎煮两次，第一次加饮片重量的8倍体积量的水，浸泡 0.5h，煎煮0.5h，滤过；第二次加饮片重量8倍体积量水，煎煮0.5h，滤过。合并上述滤液，减压浓缩至相对密度约1.10左右(60℃)，直管式高速离心机离心(转速：16000r/min，流量：4～6L/min)。取糊精适量，置流化床中，设置进风温度为100℃，当物料温度升至70℃时，开始进液，进液速度控制在 80～150r/min，雾化压力外0.2MPa，内0.15MPa。喷雾结束，70℃继续干燥1 小时，即得。

有益效果：

1、本发明根据补肾助孕颗粒中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的补肾助孕颗粒指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价补肾助孕颗粒的质量，为保证临床补肾助孕颗粒疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的补肾助孕颗粒指纹图谱，能有效地表征补肾助孕颗粒的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，既可避免因测定个别化学成分而判定补肾助孕颗粒质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，还可以测定其中10 个有效成分的含量，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明的补肾助孕颗粒样品的对照指纹图谱。

图2为本发明补肾助孕颗粒样品的8批次供试品指纹图谱。

图3为本发明混合对照品的色谱图。

图4为缺失药材的阴性样品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例用到的仪器与试剂如下：

1仪器与试药

1.1仪器

Waters e2695HPLC高效液相色谱仪，Waters 2998PDA检测器；Sartorius BP-211D电子分析天平(赛多利斯公司)；SK6200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2试剂

乙腈(Tedia，色谱纯)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3对照品及样品

丹酚酸B、金丝桃苷、紫云英苷、莫诺苷、当药苷、迷迭香酸的对照品购于南京聚康医药化工有限公司(批号分别为160508、181025、180924、160928、 181211、161110，质量分数均≥98％)，没食子酸、马钱苷、芍药苷购于中国食品药品检定研究院(批号分别为110831-201204、111640-201005、110736-201337，计算浓度时浓度分别以89.9％、99.2％、94.9％折算)，5-羟甲基糠醛购于南京宁岐医药有限公司(批号为130911，质量分数≥98％)。

丹参(批号20180101-01，产地贵州)、醋柴胡(批号20181002-01，产地陕西)均购于贵州同德药业有限公司，酒萸肉(批号190201，产地河南)、山药 (批号190101，产地河南)均购于马鞍山井泉中药饮片有限公司，菟丝子(批号181101，产地内蒙)、紫石英(批号181101，产地江苏)均购于安徽井泉中药饮片股份有限公司，鹿角片(批号190101，产地吉林)购于安徽万生中药饮片有限公司，炒白芍(批号19010712，产地安徽)购于安徽协和成药业饮片有限公司，经过南京中医药大学附属医院周琴妹主任中药师鉴定，分别为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.干燥根的炮制品，山茱萸科植物山茱萸Cornus oficinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉的炮制品，薯蓣科植物薯蓣Dioscotea opposita Thunb.的干燥根茎，旋花科植物菟丝子Cuscuta chinesis Lam.的干燥成熟种子，主含氟化钙的氟化物类矿物荧石族荧石，鹿科动物马鹿Cervus elaphus Linnaeus 已骨化的角，毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.干燥根的炮制品。编号为 S1～S15的15批补肾助孕颗粒均由江苏省中医院提供(制备工艺同前)，批号分别为171011、171012、171015、171026、171027、171028、171203、171205、171208、171221、171225、180110、180112、180113、180320。缺酒萸肉阴性样品、缺菟丝子阴性样品、缺丹参阴性样品、缺炒白芍阴性样品及缺酒萸肉-炒白芍的阴性样品由实验室按制剂相同工艺自制。

实施例1一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取上述15批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定0.8g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度70％甲醇水10mL，密塞，称量，200W,40kHz 超声处理30min，放置至室温，再称量，用体积浓度70％甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成浓度分别为0.540mg·mL^-1、1.600mg·mL^-1、0.637mg·mL^-1、0.225mg·mL^-1、0.623mg·mL^-1、 1.053mg·mL^-1、0.638mg·mL^-1、0.480mg·mL^-1、0.365mg·mL^-1、0.877mg·mL^-1的混合对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

步骤3，分别精密吸取步骤1的15批次供试品溶液和步骤2混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪分析，记录色谱图；色谱条件为：色谱柱为：Hedera ODS-2 C18色谱柱，规格250mm×4.6mm，5μm，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～15min，5％A→7％A；15～30min，7％A→9.5％A； 30～31min，9.5％A→11％A；31～55min，11％A；55～65min，11％A→20％A；65～95 min，20％A→22％A；95～100min，22％A→5％A)，流速1.0mL·min^-1，检测波长237nm，柱温30℃，进样量10μL。

步骤4，将步骤3中获得的15批次的补肾助孕颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择15批次补肾助孕颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰(如图1)；用平均值计算法生成补肾助孕颗粒的对照指纹图谱(如图2所示)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图(如图3所示)的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

所得的指纹谱图中共有峰23个。其中2号峰为没食子酸、3号峰为5-羟甲基糠醛、6号峰为莫诺苷、8号峰为当药苷、9号峰为马钱苷、12号峰为芍药苷、16号峰为金丝桃苷、19号峰为紫云英苷、21号峰为迷迭香酸、23号峰为丹酚酸B。以莫诺苷峰为参照峰，计算15批样品的特征图谱与对照特征图谱的相似度，S1～S15的相似度分别为0.995、0.984、0.991、0.998、0.997、0.998、0.997、0.995、0.983、0.998、0.984、0.997、0.996、0.997、0.997，15批样品的相似度均大于0.98。

实施例2

一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取上述15批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定0.8g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度70％甲醇水10mL，密塞，称量，200W,40kHz 超声处理30min，放置至室温，再称量，用体积浓度70％甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成浓度分别为0.540mg·mL^-1、1.600mg·mL^-1、0.637mg·mL^-1、0.225mg·mL^-1、0.623mg·mL^-1、 1.053mg·mL^-1、0.638mg·mL^-1、0.480mg·mL^-1、0.365mg·mL^-1、0.877mg·mL^-1的混合对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

步骤3，缺失药材的阴性样品溶液的制备

分别取缺失酒萸肉、菟丝子、丹参、炒白芍或酒萸肉-炒白芍药材的补肾助孕颗粒，研细，精密称定0.8g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度70％甲醇水10mL，密塞，称量，200W,40kHz超声处理30min，放置至室温，再称量，用体积浓度70％甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得缺失各药材的阴性样品溶液；

步骤4，分别精密吸取步骤1供试品溶液，步骤2混合对照品溶液和步骤3 缺失药材的阴性样品溶液，注入高效液相色谱仪分析，记录色谱图；色谱条件为：色谱柱为：HederaODS-2 C18色谱柱，规格250mm×4.6mm，5μm，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～15min，5％A→7％A； 15～30min，7％A→9.5％A；30～31min，9.5％A→11％A；31～55min，11％A；55～65 min，11％A→20％A；65～95min，20％A→22％A；95～100min，22％A→5％A)，流速1.0mL·min^-1，检测波长237nm，柱温30℃，进样量10μL。

步骤4，将步骤3中获得的各批次的补肾助孕颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择各批次补肾助孕颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成补肾助孕颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；所得的指纹谱图中共有峰23个。其中2号峰为没食子酸、3号峰为5-羟甲基糠醛、6号峰为莫诺苷、8号峰为当药苷、9号峰为马钱苷、12号峰为芍药苷、16号峰为金丝桃苷、19号峰为紫云英苷、21号峰为迷迭香酸、23号峰为丹酚酸B。

并将对照指纹图谱与缺失药材的阴性样品溶液的色谱图进行比较，指认出对照指纹图谱中共有峰与药材的相关性。如图4所示(图中缺酒萸肉阴性样品 (C)、缺菟丝子阴性样品(D)、缺丹参阴性样品(E)、缺炒白芍阴性样品(F)及缺酒萸肉-炒白芍阴性样品(G)的色谱图)，其中1、2、3、4、5、6、8、9、20号峰为酒萸肉饮片中的成分；7、13、14、15、16、17、19号峰为菟丝子饮片中的成分；2、10、11、12、18号峰为炒白芍饮片中的成分；20、21、22、23号峰为丹参饮片中的成分；其中2号峰为酒萸肉和炒白芍共有的成分；20号峰为酒萸肉和菟丝子共有的成分。

实施例3一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取上述15批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定0.8g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度70％甲醇水10mL，密塞，称量，200W,40kHz 超声处理30min，放置至室温，再称量，用体积浓度70％甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成浓度分别为0.540mg·mL^-1、1.600mg·mL^-1、0.637mg·mL^-1、0.225mg·mL^-1、0.623mg·mL^-1、 1.053mg·mL^-1、0.638mg·mL^-1、0.480mg·mL^-1、0.365mg·mL^-1、0.877mg·mL^-1的混合对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

步骤3，线性回归方程的建立

分别精密吸取步骤2的混合对照品溶液，分别稀释成1、2、5、10、20、40 倍的混合对照品溶液，精密吸取各混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪分析，以测得的响应信号峰和被测成分的进样浓度用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的线性回归方程以及线性范围；如下表1.

表1 10个成分的线性回归方程

步骤4，供试品溶液的检测

精密吸取步骤1制备得到的15批次的供试品溶液10μL，注入高效液相色谱检测，通过步骤(3)获得的线性回归方程，检测供试品溶液中各化学成分的含量。如表2所示。

表2 15批样品中10个成分含量测定结果(mg·g^-1)

实施例4方法学研究

1、精密度试验

分别精密吸取实施例1同一混合对照品溶液10μL，连续进样6次进行测定。按峰面积计算，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分别为1.1％、1.6％、1.9％、2.5％、2.7％、2.6％、3.0％、2.9％、1.6％、2.7％，结果表明仪器精密度良好。

2、重复性试验

取171011同一批号的补肾助孕颗粒6份，按实施例1供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，进样测定峰面积。按峰面积计算，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B含量的RSD分别为1.3％、0.45％、1.1％、3.0％、1.4％、2.6％、2.9％、1.4％、 1.2％、1.3％，结果表明该方法重复性良好。

3、稳定性试验

取批号为171011的S1样品0.8g，按实施例1供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样测定，测定峰面积。按峰面积计算，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分别为1.8％、1.9％、2.0％、1.8％、 1.1％、2.7％、2.4％、2.2％、3.2％、2.1％，结果表明该方法重复性良好。

4、加样回收率试验

取已知含量的171011同一批号补肾助孕颗粒各6份，每份约0.4g，分别精密加入体积浓度70％甲醇水配制得的浓度分别为1.60、1.80、1.84、0.49、1.05、 1.00、1.44、1.60、1.20、1.18mg/ml的没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B 0.25、0.25、 0.50、0.10、0.25、1.0、0.25、0.20、0.40、2.5ml，并按实施例1供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果见表3。试验结果表明该方法准确度良好。

表3补肾助孕颗粒加样回收试验结果(n＝6)

以上实验结果表明，本发明提供的补肾助孕颗粒指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价补肾助孕颗粒的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成混合对照品溶液；

步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪分析，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的补肾助孕颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次补肾助孕颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成补肾助孕颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；

步骤3中高效液相色谱条件为：色谱柱为：Hedera ODS-2 C18色谱柱，规格250 mm×4.6mm，5 μm，以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，检测波长237 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL；

梯度洗脱程序为：0~15 min，5%A→7%A；15~30 min，7%A→9.5%A；30~31 min，9.5%A→11%A；31~55 min，11%A；55~65 min，11%A→20%A；65~95 min，20%A→22%A；95~100 min，22%A→5%A。

2.一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成混合对照品溶液；

步骤3，缺失药材的阴性样品溶液的制备

分别取缺失酒萸肉、菟丝子、丹参、炒白芍或酒萸肉-炒白芍药材的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得缺失各药材的阴性样品溶液；

步骤4，分别精密吸取步骤1供试品溶液，步骤2混合对照品溶液和步骤3缺失药材的阴性样品溶液，注入高效液相色谱仪分析，记录色谱图；

步骤5，将步骤4中获得的各批次的补肾助孕颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择各批次补肾助孕颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成补肾助孕颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；

并将对照指纹图谱与缺失药材的阴性样品溶液的色谱图进行比较，指认出对照指纹图谱中共有峰与药材的相关性；

步骤4中高效液相色谱条件为：色谱柱为：Hedera ODS-2 C18色谱柱，规格250 mm×4.6mm，5 μm，以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，检测波长237 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL；

梯度洗脱程序为：0~15 min，5%A→7%A；15~30 min，7%A→9.5%A；30~31 min，9.5%A→11%A；31~55 min，11%A；55~65 min，11%A→20%A；65~95 min，20%A→22%A；95~100 min，22%A→5%A。

3.一种补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，补肾助孕颗粒供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的补肾助孕颗粒，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成混合对照品溶液；

步骤3，线性回归方程的建立

分别精密吸取步骤2的混合对照品溶液，分别稀释成1、2、5、10、20、40倍的混合对照品溶液，精密吸取各混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪分析，以测得的响应信号峰和被测成分的进样浓度用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的线性回归方程以及线性范围；

步骤4，供试品溶液的检测

精密吸取步骤1制备得到的供试品溶液10μL，注入高效液相色谱检测，通过步骤（3）获得的线性回归方程，检测供试品溶液中各化学成分的含量；

高效液相色谱仪分析的色谱条件为：

步骤3和步骤4中高效液相色谱条件为：色谱柱为：Hedera ODS-2 C18色谱柱，规格250mm×4.6 mm，5 μm，以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0mL·min^-1，检测波长237 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL；

梯度洗脱程序为：0~15 min，5%A→7%A；15~30 min，7%A→9.5%A；30~31 min，9.5%A→11%A；31~55 min，11%A；55~65 min，11%A→20%A；65~95 min，20%A→22%A；95~100 min，22%A→5%A。

4.根据权利要求1至3任一项所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1补肾助孕颗粒供试品溶液制备方法为：取补肾助孕颗粒，研细，精密称定0.8 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度70%甲醇水10 mL，密塞，称量，200 W, 40 kHz超声处理30min，放置至室温，再称量，用体积浓度70%甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

5.根据权利要求1至3任一项所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸和丹酚酸B对照品，加甲醇制成浓度分别为0.540mg·mL^-1、1.600mg·mL^-1、0.637mg·mL^-1、0.225mg·mL^-1、0.623mg·mL^-1、1.053mg·mL^-1、0.638mg·mL^-1、0.480mg·mL^-1、0.365mg·mL^-1、0.877 mg·mL^-1的混合对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

6.根据权利要求1或2所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有峰23个。

7.根据权利要求6所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，23个共有峰中2号峰为没食子酸、3号峰为 5-羟甲基糠醛、6号峰为莫诺苷、8号峰为当药苷、9号峰为马钱苷、12号峰为芍药苷、16号峰为金丝桃苷、19号峰为紫云英苷、21号峰为迷迭香酸、23号峰为丹酚酸B。

8.根据权利要求6所述的补肾助孕颗粒指纹图谱的检测方法，其特征在于，1、2、3、4、5、6、8、9、20号峰为酒萸肉饮片中的成分；7、13、14、15、16、17、19号峰为菟丝子饮片中的成分；2、10、11、12、18号峰为炒白芍饮片中的成分；20、21、22、23号峰为丹参饮片中的成分；其中2号峰为酒萸肉和炒白芍共有的成分；20号峰为酒萸肉和菟丝子共有的成分。

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