CN111175368B - 一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别酿造醋中非法添加合成醋酸的方法，属于食品掺假检测领域，可用于食品掺假检测研究与日常检验。包括以下步骤：(1)排除乙酸羧基位点氢和醋中水分的干扰，用稳定同位素比值质谱仪测定乙酸甲基位点的氢同位素比值；(2)构架对照样品的氢同位素数据库；(3)测定待检样品乙酸甲基位点的氢同位素比值，对比对照样品数据库，得出结论。本发明利用稳定同位素比值质谱仪测定氢同位素比值，实现了酿造醋中非法添加合成醋酸的检验，解决了当前酿造醋中非法添加合成醋酸难以检测的技术难题。
Description
技术领域：
本发明涉及一种鉴别酿造醋中非法添加合成醋酸的方法，属于食品掺假检测领域，可用于食品掺假检测研究与日常检验。
背景技术：
酿造醋包括果醋饮料、果醋、米醋、食醋等。是以水果，包括苹果、山楂、葡萄、柿子、梨、杏、柑橘、猕猴桃、西瓜等或果品加工下脚料、粮食等为主要原料，利用现代生物技术酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品或饮品。
近年来，我国果醋饮料行业不断扩大，2017年的消费量达到了17.26万吨，市场规模约16.76亿元，全国有大大小小近千家果醋饮料生产企业。但行业快速发展的背后也存在一些问题：由于真正的果醋饮料是由果汁经过两次发酵(酒精发酵和醋酸发酵而成)而成，并且加入其它非乙酸材料制得的产品，但生产周期长、原料成本高。一些企业为了缩短时间、降低成本，以果汁加食醋来冒充果醋饮料，加入食用冰醋酸生产假冒伪劣产品，更有甚者掺入工业合成醋酸进行造假，这种低成本的假冒伪劣产品使得正规厂家的产品举步维艰，给果醋饮料行业的健康发展造成了相当大的困扰，合成醋酸的使用也给消费者带来了巨大的食品安全风险。
为规范酿造醋行业，我国制定了国家标准GB2719-2018《食品安全国家标准食醋》、GB/T30884-2014《苹果醋饮料》和农业部标准NY/T 2987-2016《绿色食品果醋饮料》，对酿造醋及相关饮品的生产原料和工艺进行了规定。上述标准的设立有益于保障和提高市场上酿造醋产品的质量，但依靠行业企业自律难以确保相关产品标准的有效实施，尤其是当前有效缺乏检测酿造醋中非法添加冰醋酸(尤其是合成醋酸)的假冒伪劣产品的技术手段。
同时，GB 2719中规定冰乙酸(又名冰醋酸)、冰乙酸(低压羰基化法)不可用于食醋，并且规定总酸(以乙酸计)含量应≥3.5g/100mL(甜醋品类≥2.5g/100mL)。为了提高产品乙酸浓度，或者牟取更多的利润，不法商贩可能采用外源添加冰乙酸的形式提高酿造食醋的乙酸含量、兑制米醋，该冰乙酸若为食用原料发酵产生还不至于有安全风险，但若冰乙酸是工业级合成醋酸，则会引入更多的食品安全隐患。现有的方法GB/T5009.41只能测定乙酸含量，不能检测乙酸的来源，难以说明产品中乙酸是来自于粮谷类等可食用原料，还是工业醋酸。
现阶段，我国鉴定合成醋酸的方法是依据GB/T 22099-2008，是基于乙酸中放射性同位素14C的天然度特征进行合成冰乙酸的检测，然而，由于放射性同位素的特殊性质和使用要求，食品质监部门无法检测天然度指标，全国范围内只有上海复旦大学放射医学研究所可做相关检测，并且该技术仅限于冰醋酸的检验而不适用于酿造醋及相关产品的分析，原因是分析果醋、食醋、果醋饮料等酿造醋样品时需要将醋中乙酸提纯，更增大了技术推广的难度。
国外研究表明，根据乙酸的氢同位素比值特征可辨别合成醋酸[Remaud,G.；Guillou,C.；Vallet,C.；Martin,G.J.A coupled NMR and MS isotopic method for theauthentication of natural vinegars.Fresenius J.Anal.Chem.1992,342,457.]，但由于酿造醋中含有大量水分，测定前需要排除水分的影响，并且乙酸羧基上的氢原子极易与环境中的水进行氢同位素交换，因此测定整个乙酸分子的氢同位素比值的意义和应用效果有限。Hermann等人开发了蒸馏提纯乙酸后使用点特异性分馏-核磁共振技术(SNIF-NMR)分析醋中乙酸甲基位点的稳定氢同位素比值的方法，[Hermann,A.(2001)Determination ofD/H isotope ratio in acetic acid from vinegars and pickled products by H-2-NMR spectroscopy.Eur Food Res Techn,212 683-686；Fauhl,C.,Wittkowski,R.(1996)On-line 1H-NMR to facilitate tube preparation in SNIF-NMR analysis.Z LebensmUnters Forsch(1996),541-545；Hsieh C W,Li P H,Cheng J Y,et al.Using SNIF-NMRmethod to identify the adulteration of molasses spirit vinegar by syntheticacetic acid in rice vinegar[J].Industrial crops and products,2013,50:904-908；Perini M,Paolini M,Simoni M,et al.Stable isotope ratio analysis for verifyingthe authenticity of balsamic and wine vinegar[J].Journal of agricultural andfood chemistry,2014,62(32):8197-8203]，但是由于氘在自然界中的丰度低(天然丰度为150*10-6左右)，并且氘核的共振频率较低、谱线分散度较低，SNIF-NMR法的灵敏度很低，单个样品需要较长的分析时间(＞8h)才能得到满意的信噪比信号和测定精度，并且醋样品中乙酸需特殊装置进行分离提纯，分析效率低且成本高。
稳定同位素比值质谱仪在测定物质的稳定氢同位素组成特征方面具有快速、方便的优势，而且我国很多质监部门已配备了该仪器，但是，在酿造醋分析领域，如何排除乙酸中氢同位素分析的干扰因素，准确测定氢同位素比值，确定酿造醋与合成醋酸的同位素特征差异是相关研究与应用的前提和关键。
发明内容：
为了解决酿造醋中缺乏简单快速、低成本检验合成醋酸方法的难题，本发明采用稳定同位素技术准确测定酿造醋中乙酸甲基位点的氢同位素特征，提供了构建酿造醋的氢同位素数据库的方法，并以此为基础检验产品中是否含有合成醋酸。
本发明所采用的方案如下：通过建立真实酿造醋中乙酸甲基位点氢同位素比值数据库，分析待检样品的乙酸甲基位点氢同位素特征差异进行判断；
所述的酿造醋包括果醋饮料、果醋、及食醋(含高粱醋、米醋等)等；
进一步地，本发明的方法包括以下步骤：
(1)对照样品：从酿造醋生产企业获得以水果或粮食为原料生产的酿造醋的真实样品；
进一步地，所述酿造醋为果醋饮料或果醋，符合国家标准GB/T 30884-2014《苹果醋饮料》和农业部标准NY/T 2987-2016《绿色食品果醋饮料》的定义要求；
进一步地，所述酿造醋为食醋，符合GB 2719《食品安全国家标准食醋》的定义要求；
(2)待检样品：需要检测是否含有合成醋酸的标记生产原料为水果或粮食的的酿造醋样品；
(3)分别检测对照样品和待检样品中乙酸甲基位点氢同位素比值(δD)；
进一步地，对照样品在全国范围内收集同一年份的20批次以上；
(4)对照样品中乙酸甲基位点氢同位素比值数据库构建：将步骤(3)测定的对照样品乙酸甲基位点氢同位素比值的数据按顺序排列，根据最大值和最小值确定乙酸甲基位点的氢同位素比值的数值范围；
(5)待测样品中合成醋酸判定：将步骤(3)测定的待检样品中乙酸甲基位点氢同位素比值与步骤(4)获得的对照样品的数值范围进行对比，若待检样品的数值超出步骤(4)的数值范围，则待测样品中含有合成醋酸；
进一步地，步骤(3)检测样品中乙酸甲基位点氢同位素比值(δD)的方法具体如下：
①用化学试剂去除乙酸羧基位点的氢，使乙酸转变成乙酸盐；
②用物理方法除去样品中的水分得固体样品；
③用稀酸溶液溶解上一步固体样品，得酸化样品；
④用有机试剂对酸化样品进行适当稀释，得稀释样品；
⑤使用毛细管色谱柱将得稀释样品中的乙酸和其他有机试剂、少量水分以及其他含氢化合物组分进行分离；
⑥乙酸组分经1420℃高温裂解转化成氢气(H2)，用稳定同位素比值质谱仪(IRMS)测定氢气的氢同位素比值D/H；
⑦用δD值已知的乙酸标准物质为基准进行数据校正，得样品δD。
进一步地，所述化学试剂包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾等碱性材料或碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾等碳酸盐中至少一种；
进一步地，所述化学试剂的添加量应保证将样品中所有乙酸转化成乙酸盐；优选氢氧化钙；
进一步地，所述物理方法包括但不限于烘干方法、色谱分离方法、冷冻干燥方法中至少一种；
优选地，所述物理方法是冷冻干燥方法；
进一步地，所述稀酸溶液包括但不限于稀硫酸、稀盐酸、稀磷酸、稀硝酸中至少一种。
进一步地，所述稀酸溶液的添加量应保证第一中和上一步中的过量化学试剂，第二使乙酸盐重新酸化生成乙酸；优选稀硫酸溶液；
进一步地，所述有机试剂包括但不限于乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、乙醚中至少一种；优选地，所述有机试剂是丙酮；
进一步地，所述有机试剂的添加量为稀释乙酸含量至1g/L～10g/L；优选4-8g/L；
更进一步地，所述稀释样品在低温条件下静置一段时间后除去沉淀再用于色谱柱分离；
进一步地，所述毛细管色谱柱包括但不限于极性色谱柱、分子筛色谱柱、碳基键合色谱柱、聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱、键合二乙烯基苯/乙二醇二甲基丙烯酸酯色谱柱；优选键合二乙烯基苯/乙二醇二甲基丙烯酸酯色谱柱；
优选地，进样体积1μL，气相色谱进样口温度270℃，气相色谱流速为恒流1.2mL/min，气相色谱进样口分流比20:1，气相色谱升温程序为180℃恒温；
进一步地，裂解模块的温度保证1420℃恒温；
进一步地，选择甲基位点δD值已知的乙酸标准物质，按照样品的前处理步骤处理并测定，最终校正得出样品中乙酸甲基位点的δD值。
有益效果：
本发明采用稳定同位素技术测定酿造醋中乙酸甲基位点的氢同位素比值，克服了酿造醋中乙酸整体氢同位素特征缺乏应用价值的缺陷，解决了酿造醋中乙酸甲基位点氢同位素比值难以测定的技术难题，利用稳定同位素分馏导致的酿造醋酸与合成醋酸的氢同位素特征差异特点，通过对比真实样品实现了酿造醋中合成醋酸的检测，为传统酿造醋产品的真实性鉴别提供了一种新方法。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
在本发明的以下实施例中，醋类产品中乙酸甲基位点氢同位素比值的测定方法包括以下步骤：
(1)用化学试剂去除乙酸羧基位点的氢，使乙酸转变成难挥发的乙酸盐，从而使得后续的乙酸纯化步骤变得简单；
(2)用物理方法除去样品中的水分，而不是单独提取乙酸成分，因此可以大批量处理样品，提高了样品处理效率；
(3)用稀酸溶液处理乙酸盐使之复溶具有挥发特性，得酸化样品；
(4)用有机试剂对酸化样品进行适当稀释，以使乙酸裂解产生的氢气(H2)能够满足IRMS的测定要求；
(5)使用毛细管色谱柱实现有机试剂、乙酸、少量水分以及其他含氢化合物的分离；
(6)乙酸组分经高温裂解转化成氢气(H2)后，用稳定同位素比值质谱仪测定，经标准物质校正得出样品中乙酸甲基位点的氢同位素比值(δD)。
在本发明的实施例中，醋类产品中乙酸甲基位点氢同位素比值的测定方法包括以下步骤：
(1)向样品中加入碱性试剂，后离心除去过量的碱性试剂，取上清液待用；
(2)将上清液放入烘箱或冷冻干燥机中，除去样品中原有的水分，取固体待用；
(3)用稀酸溶液酸化上述固体成分，使之反应变成乙酸；
(4)用有机试剂稀释上述含乙酸的稀酸溶液至乙酸含量1g/L～10g/L，静置一段时间后除去沉淀，取上清液待分析，优选地，乙酸稀释浓度为4-8g/L；
(5)设置气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪的参数，优选地，进样体积1μL，气相色谱进样口温度270℃，气相色谱流速为恒流1.2mL/min，气相色谱进样口分流比20:1，气相色谱升温程序为180℃恒温，裂解模块的温度保证1420℃恒温；
在此过程中，毛细管色谱柱将得稀释样品中的乙酸和其他有机试剂、少量水分以及其他含氢化合物组分进行分离；乙酸组分经高温裂解转化成氢气(H2)，进而用稳定同位素比值质谱仪(IRMS)测定氢气的氢同位素比值D/H；
具体地，确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合分析要求，然后检验仪器测定H2中δD的精密度和线性，必要时调整离子源参数值；
设置质谱参数：编制测定程序，使除乙酸外的含氢化合物(如水、丙酮等)流出色谱柱后排入空气中，而仅将乙酸导入裂解装置中裂解生成氢气(H2)；
测定样品：在氢同位素测定模式下，选定两点标准漂移校正模式在样品盘上摆好待测样品，在计算机控制下测定样品中乙酸的δD值；
(6)选择甲基位点δD值已知的乙酸标准物质，按照样品的前处理步骤处理并测定，采用测定值校正样品，得出样品中乙酸甲基位点的δD值。
以下将通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1：苹果醋饮料中乙酸甲基位点氢同位素比值测定
a)量取100mL苹果醋饮料样品，加入1g氢氧化钙后涡旋震荡2h，然后8000rpm离心30min，取上清液保存待用；
b)将上清液置于冷冻干燥机中冻干，保留粉末待用；
c)向样品粉末中加入15mL硫酸溶液(1moL/L)，涡旋震荡1h；
d)以原样品中的乙酸浓度为依据，向稀硫酸处理后的样品中加入无水丙酮至乙酸浓度4g/L左右，静置后取上清待分析；
e)设定气相色谱进样口温度270℃，设定气相色谱流速为恒流1.2mL/min，设定气相色谱进样口分流比20:1，设定气相色谱升温程序为180℃恒温，设定裂解模块的温度保证1420℃恒温；
f)确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验仪器测定H2中δD的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值；
g)以纯乙酸、水和丙酮为实验材料，分别进样测定确定各物质的保留时间；
h)将处理好的试样进样1μL，使得乙酸经色谱柱分离后进入高温裂解装置中转化为氢气(H2)后测定氢同位素比值(D/H，记为δD测)，结果见表1；
i)选择甲基位点氢同位素比值已知的乙酸作为标准物质(此处使用实验室工作标准WSD，δDCH3＝-223.93‰)，按上述处理方法进行处理后测定氢同位素比值，结果见表2；
j)数据校正：乙酸工作标准WSD的测定值与给定值之间存在27.66‰的差异，因此可知果醋饮料样品的δD值为实测值δD测减去27.66‰后得到的结果，结果见表3；
表1果醋饮料样品中乙酸测定结果δD测(‰)
| 重复-1 | 重复-2 | 平均值 | 标准偏差 | |
| 苹果醋饮料 | -278.82 | -275.69 | -277.26 | 2.21 |
表2乙酸工作标准WSD的测定结果
| 测定次数 | 重复-1 | 重复-2 | 平均值 |
| δD测(‰) | -195.48 | -197.06 | -196.27 |
表3果醋饮料样品中乙酸甲基位点氢同位素比值δDCH3(‰)
| 重复-1 | 重复-2 | 平均值 | 标准偏差 | |
| 苹果醋饮料 | -306.48 | -303.35 | -304.92 | 2.21 |
实施例2：待检苹果醋饮料样品中合成醋酸检测示例
a)从全国不同地方的正规苹果醋饮料生产企业中收集生产原料为苹果(汁)或浓缩苹果汁的真实果醋饮料样品，共计22个样品；
b)从市场上购买标签信息备注为苹果醋饮料的样品3个；
c)按实施例1的方法测定各样品中乙酸的甲基位点氢同位素比值；
d)经过统计，22个真实果醋饮料样品的δDCH3(‰)分布范围为-275.14‰～-321.50‰
e)市售待检果醋饮料样品的δDCH3(‰)结果见表2。
表2市售待检果醋饮料样品的δD值(‰)
| 样品编号 | 待检1#样 | 待检2#样 | 待检3#样 |
| δDCH3 | -287.51 | -292.11 | -321.01 |
由表2可知，3个市售果醋饮料样品中均不含合成醋酸。
实施例3：待检苹果醋样品中合成醋酸检测示例
a)从全国不同地方的正规苹果醋生产企业中收集生产原料为苹果(汁)或浓缩苹果汁的真实果醋样品，共计22个样品；
b)从市场上购买标签信息备注为苹果醋的样品3个；
c)按实施例1的方法测定各样品中乙酸的甲基位点氢同位素比值；
d)经过统计，22个真实果醋样品的δDCH3(‰)分布范围为-275.14‰～-322.6‰；
e)市售待检果醋样品的δDCH3(‰)结果见表3。
表3市售待检果醋样品的δD值(‰)
| 样品编号 | 待检1#样 | 待检2#样 | 待检3#样 |
| δDCH3 | -277.36 | -295.58 | -321.00 |
由表3可知，3个市售果醋样品中不含合成醋酸。
实施例4：待检食醋样品中合成醋酸检测示例
a)分别从浙江、北京、广东、江苏、山西等地的食醋生产企业中收集原料信息真实的食醋样品，共计21个样品；
b)从市场上购买标签信息备注为食醋的样品3个；
c)按实施例1的方法测定各样品中乙酸的甲基位点氢同位素比值；
d)经过统计，21个真实食醋样品的δDCH3(‰)分布范围为-310.31‰～-346.87‰；
e)市售待检食醋样品的δDCH3(‰)结果见表4。
表4市售待检食醋样品的δD值(‰)
| 样品编号 | 待检1#样 | 待检2#样 | 待检3#样 |
| δDCH3 | -342.15 | -312.59 | -339.37 |
由表4可知，3个市售食醋样品中不含合成醋酸。
实施例5：模拟样品中合成醋酸检测示例
实施例2～4中，各待检样品的乙酸δDCH3值均符合相应对照样品的数值范围，都显示未添加合成醋酸，这可能是由于所有待检样品均来自于正规厂商的合格品牌。为验证本发明检测酿造醋中合成醋酸的可行性，从市场上购得合成醋酸样品(δDCH3值为78.08‰)，分别向一个苹果醋和食醋样品中按乙酸含量掺入20％、40％、60％和80％的合成醋酸，并采用前述实施例的方法测得δDCH3值结果见表5。
表5模拟样品中乙酸δDCH3值(‰)
| 合成醋酸添加比例(％) | 100 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
| 苹果醋模拟样品 | 78.08 | -25.11 | -115.17 | -187.39 | -257.28 | -321.00 |
| 食醋模拟样品 | 78.08 | -3.76 | -88.49 | -165.33 | -239.08 | -312.59 |
上表结果显示，苹果醋中掺入20％时已超出了实施例3中苹果醋的数据库范围，因此各模拟样品中掺入的合成醋酸均可检出；米醋中掺入20％时已超出了实施例4中食醋的数值范围，可判定上述产品中均掺有合成醋酸。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (7)
1.一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)对照样品：从酿造醋生产企业获得以水果或粮食为原料生产的酿造醋的真实样品；
(2)待检样品：需要检测是否含有合成醋酸的标记生产原料为水果或粮食的的酿造醋样品；
(3)分别检测对照样品和待检样品中乙酸甲基位点氢同位素比值δD；
(4)对照样品中乙酸甲基位点氢同位素比值数据库构建：将步骤(3)测定的对照样品乙酸甲基位点氢同位素比值的数据按顺序排列，根据最大值和最小值确定乙酸甲基位点的氢同位素比值的数值范围；
(5)待测样品中合成醋酸判定：将步骤(3)测定的待检样品中乙酸甲基位点氢同位素比值与步骤(4)获得的对照样品的数值范围进行对比，若待检样品的数值超出步骤(4)的数值范围，则待测样品中含有合成醋酸；
步骤(3)中，乙酸甲基位点氢同位素比值δD的测定方法如下：
①用化学试剂去除乙酸羧基位点的氢，使乙酸转变成乙酸盐；
②用物理方法除去样品中的水分得固体样品；
③用稀酸溶液溶解上一步固体样品，得酸化样品；
④用有机试剂对酸化样品进行适当稀释，得稀释样品；
⑤使用毛细管色谱柱将稀释样品中的乙酸和其他有机试剂、少量水分以及其他含氢化合物组分进行分离；
⑥乙酸组分经1420℃高温裂解转化成氢气(H2)，用稳定同位素比值质谱仪(IRMS)测定氢气的氢同位素比值D/H；
⑦用δD值已知的乙酸标准物质为基准进行数据校正，得样品δD。
2.如权利要求1所述的一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法，其特征在于，所述酿造醋为果醋饮料或果醋，符合国家标准GB/T 30884-2014《苹果醋饮料》和农业部标准NY/T2987-2016《绿色食品果醋饮料》的定义要求。
3.如权利要求1所述的一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法，其特征在于，所述酿造醋为食醋，符合GB 2719《食品安全国家标准食醋》的定义要求。
4.如权利要求1所述的一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法，其特征在于，对照样品在同一年份全国范围内收集20批次以上。
5.如权利要求1所述的一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法，其特征在于，
所述化学试剂为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾中的至少一种；
所述物理方法包括烘干方法、色谱分离方法、冷冻干燥方法中至少一种；
所述稀酸溶液包括稀硫酸、稀盐酸、稀磷酸、稀硝酸中至少一种；
所述有机试剂包括乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、乙醚中至少一种。
6.如权利要求5所述的一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法，其特征在于，所述有机试剂的添加量为稀释乙酸含量至1g/L～10g/L。
7.如权利要求1所述的一种鉴别酿造醋中添加合成醋酸的方法，其特征在于，数据校正是选择甲基位点δD值已知的乙酸标准物质，按照样品的前处理步骤处理并测定，最终校正得出样品中乙酸甲基位点的δD值。
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