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CN111164094A - 抗癌肽及其用途 - Google Patents

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CN111164094A CN201880064056.XA CN201880064056A CN111164094A CN 111164094 A CN111164094 A CN 111164094A CN 201880064056 A CN201880064056 A CN 201880064056A CN 111164094 A CN111164094 A CN 111164094A
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Abstract

本发明本发明提供一种式(I)的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽的N‑端基团是式–NHR1的单价基团；所述肽的C‑端基团是式–C(O)‑R2的单价基团；R1是选自氢和–C(O)‑(C1‑C20)烷基的单价基团；R2是选自‑OH和–NR3R4基团的单价基团；R3和R4独立地选自氢和(C1‑C10)烷基；“a”至“j”是0至1的整数，条件是“a”至“j”中的至少一个是1；X1表示任意氨基酸。本发明还提供包含式(I)的肽的缀合物和组合物。

Description

抗癌肽及其用途
本申请要求2017年10月5日提交的欧洲专利申请EP17382667的权益。
技术领域
本发明涉及抗肿瘤化合物领域，特别是涉及抗癌肽和包含所述肽的抗癌组合物。本发明还涉及所述肽和所述组合物用于预防性或治疗性治疗胰腺癌的用途。
背景技术
在细胞内发挥作用的蛋白质和肽的治疗用途对于治疗癌症和其它疾病而言是非常有前景的。
癌症是涉及异常的细胞生长的一组疾病，其具有侵入或扩散到身体其它部分的潜力。癌症是一种多因素疾病，即它是多种因素发生的结果。所述因素通常集中导致在原癌基因中产生突变，其导致细胞增殖增加。突变也可发生在其正常功能是调节细胞增殖的肿瘤抑制基因中。突变也可发生在DNA修复酶中，损害细胞在增殖之前修复损伤的能力，因此产生基因组不稳定性。
目前，对于许多常见癌症类型的治疗，几乎没有有效的选择。对于给定个体的治疗过程取决于诊断、疾病发展的阶段和诸如患者的年龄、性别和一般健康状况的因素。最常规的癌症治疗选择是手术、放射疗法和化学疗法。这些治疗中的每一种都具有不同程度的功效，并且伴随有不同的副作用。这些副作用，连同已经公开的对于传统化学疗法的多药物抗性，已经促使迫切需要新的抗癌药物或治疗方法。
一种特别致命的癌症类型是胰腺癌。这种类型的癌症是胰腺的恶性生长，其主要发生在胰管的细胞中。该疾病是第九最常见的癌症形式，然而它分别是男性和女性癌症死亡的第四和第五主要原因。胰腺癌几乎总是致命的，五年存活率小于3％。
胰腺癌最常见的症状包括黄疸、腹痛和体重减轻，这些与其它呈现因素一起在性质上是非特异性的。因此，在肿瘤生长的早期，诊断胰腺癌常常是困难的，并且需要大量的诊断工作，通常包括探查手术。内窥镜超声检查和计算机断层摄影是目前可用于诊断胰腺癌的最佳非侵入性手段。然而，难以可靠地检测小肿瘤以及区分胰腺癌和局灶性胰腺炎。目前绝大多数胰腺癌患者在晚期才被诊断，此时肿瘤已经扩展到囊外侵入周围器官和/或已经广泛转移。该疾病的晚期检测是常见的，而早期胰腺癌诊断在临床背景下是罕见的。
目前可用于胰腺癌的治疗方法不导致治愈，也不会导致显著改善的存活时间。手术切除一直是提供存活机会的唯一方式。然而，由于大的肿瘤负荷，仅有10％至25％的患者是"治疗性切除术"的候选者。对于那些经历手术治疗的患者，五年存活率仍然很差，平均仅约10％。因此，胰腺癌是更需要开发有效疗法的癌症类型之一。
目前正在开发的针对癌症的最有前景的治疗替代方案之一是抗癌肽。这些肽具有优于传统抗癌剂的几个重要优点，例如高活性、特异性和亲和力，以及最小的药物-药物相互作用。其可以与外科切除术组合使用。其还表现出相对于基于蛋白质或抗体的疗法的几个优点：它们尺寸小，易于合成，它们具有穿透细胞膜的能力，并且具有最小的生物和化学多样性。使用肽治疗的额外益处是它们不在特定器官(例如肾或肝)中积累，这可以有助于使它们的毒副作用最小化。它们还能够快速合成并容易修饰，并且比重组抗体或蛋白的免疫原性低。所有这些特征使得肽治疗剂成为新兴抗癌剂的有前景的领域。
然而，治疗性肽确实具有一些显著的缺点，例如低稳定性或对蛋白酶的抗性，这阻碍了它们的开发和临床到达。
因此，尽管进行了努力，在肿瘤性疾病的临床领域中仍然需要治疗替代物，例如有效的抗癌肽。
发明内容
本发明人已经开发了能够抑制癌细胞生长的多种肽。令人惊奇的是，本发明人发现，在末端存在至少一个半胱氨酸残基赋予本发明的肽强效的癌症抑制活性。重要的是，本文提供的肽还在冷冻溶液中显示高溶解性和高稳定性，这使得它们适合于治疗性组合物。所有这些特征使得本发明的肽在治疗实际上尚不能治愈的肿瘤(例如胰腺肿瘤)方面成为重要的药理学替代物。
在第一方面，本发明提供了式(I)的肽或其药学上可接受的盐，
CaCbCcCdCeFEX1SKYCfCgChCiCj (I)
其中：
所述肽的N-端基团是式–NHR1的单价基团；
所述肽的C-端基团是式–C(O)-R2的单价基团；
R1是选自氢和–C(O)-(C1-C20)烷基的单价基团；
R2是选自-OH和–NR3R4基团的单价基团；
R3和R4独立地选自氢和(C1-C10)烷基；
“a”至“j”是0至1的整数，条件是“a”至“j”中的至少一个是1；并且
X1表示任意氨基酸。
如下所示，本发明的肽是高度特异性的，能够特异性地靶向癌细胞。也就是说，本发明的肽能够"区分"正常细胞和癌细胞。这意味着在癌症领域的巨大进步，因为目前抗癌疗法最广泛已知的副作用之一是由于它们缺乏特异性而引起的副作用。这种对癌细胞的特异性也解释了下面提供的实验数据，支持了当将所述肽施用于各种类型的人原代细胞时所述肽的无毒性。
这些特性使得本发明的式(I)的肽适合作为癌症治疗剂。
在第二方面，本发明涉及包含第一方面的肽的缀合物。
本发明的第三方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的第一方面的式(I)的肽或其药学上可接受的盐或第二方面的缀合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明的第四方面涉及用作药物的本发明的肽、缀合物或药物组合物。
最后，在第五方面，本发明提供了用于治疗或预防肿瘤性疾病的本发明的肽、缀合物或药物组合物。
附图说明
图1涉及测定1，是两个柱状图，其显示出，与经模拟处理的细胞相比，两种不同浓度下的本发明的各种肽对人胰腺肿瘤细胞(BXPC3)生长的抑制作用。y轴表示处理72小时后的细胞数，以模拟处理细胞数(其设为100％值)的百分比计。(A)用20μM浓度的肽处理细胞。第一个条柱(对照)对应于模拟处理的细胞；第二个条柱(P1)对应于N-端被乙酰化而C-端被酰胺化的P1肽；第三个条柱(P1C)对应于具有末端半胱氨酸的P1肽变体，其中N-端被乙酰化且C-端被酰胺化；第四个条柱(P2)对应于N-端被乙酰化而C-端被酰胺化的P2肽；第五个条柱(P2C)对应于具有末端半胱氨酸的P2肽变体，其中N-端被乙酰化且C-端被酰胺化；第六个条柱(P1A)对应于P1C肽的变体，其中N-端是游离的(未乙酰化)并且C-端被酰胺化；第七个条柱(P1B)对应于P1C肽的变体，其中N-端被乙酰化，C-端被酰胺化，且异亮氨酸被缬氨酸替代。(B)用40μM浓度的肽处理细胞。第一个条柱(对照)对应于模拟处理的细胞，第二、第三、第四和第五个条柱分别对应于用P1、P1C、P1A和P1B肽处理的细胞。肽的序列在实施例2中进一步详述。
图2涉及测定2，是显示出与模拟处理的细胞相比P1C肽(Ac-CFEISKY-NH2)在不同浓度下对人脐带原代内皮细胞(HUVEC)的毒性作用的柱状图。y轴表示处理72小时后的细胞数，以模拟处理的细胞(对照)数(其设为100％值)的百分比计。第一个条柱(DMSO)对应于用溶解肽的载剂处理的细胞。第二至第五个条柱分别对应于用10、20、30、40μM浓度的P1C肽处理的细胞。
具体实施方式
除非另有说明，本申请中所用的所有术语都应以本领域已知的普通含义来理解。本申请中所用的某些术语的其它更具体的定义如下所述，并且旨在统一地应用于整个说明书和权利要求书，除非另外明确地给出的定义提供了更广泛的定义。
如上所述，本发明人提出了一组具有强效的癌症抑制活性的式(I)的肽或其药学上可接受的盐。
如本文所用，术语"药学上可接受的盐"当描述本发明的肽时，是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人和非人动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的收益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是用无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或用有机酸(例如乙酸、三氟乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或使用本领域使用的其它方法(例如离子交换)形成的氨基的盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包括碱金属、碱土金属和铵。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。适当时，其它药学上可接受的盐包括使用抗衡离子(例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。
在本发明中，术语"氨基酸"是指同时含有氨基和羧基的分子。
合适的氨基酸包括但不限于：α氨基酸(例如20种常见天然存在的α氨基酸的α氨基酸L-异构体：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)；天然β-氨基酸(例如，β-丙氨酸)；和非天然氨基酸。
术语"非天然氨基酸"包括20种常见天然存在的α-氨基酸的D-异构体或式(A)的氨基酸
Figure BDA0002433231660000051
其中R和R’具有下表1中提供的含义。
Figure BDA0002433231660000061
非天然氨基酸的其它说明性非限制性实例概述于表2中：
表2
三字母代码 氨基酸
Aad 2-氨基己二酸
bAad 3-氨基己二酸
bAla β-丙氨酸，β-氨基丙酸
Abu 2-氨基丁酸
4Abu 4-氨基丁酸，哌啶酸
Acp 6-氨基己酸
Ahe 2-氨基庚酸
Aib 2-氨基异丁酸
bAib 3-氨基异丁酸
Apm 2-氨基庚二酸
Dbu 2,4二氨基丁酸
Des 锁链素
Dpm 2,2’-二氨基庚二酸
Dpr 2,3-二氨基丙酸
EtGly N-乙基甘氨酸
EtAsn N-乙基天冬酰胺
Hyl 羟基赖氨酸
aHyl 别羟基赖氨酸
3Hyp 3-羟基丙氨酸
4Hyp 4-羟基丙氨酸
Ide 异锁链素
aIle 别异亮氨酸
Nva 正缬氨酸
Nle 正亮氨酸
Orn 鸟氨酸
形成本发明肽的氨基酸中的每一个都可以彼此独立地具有L-或D-构型。
用于制备本发明肽的氨基酸可以通过有机合成制备，或通过其它途径获得，例如，天然来源的降解或从天然来源分离。
在第一方面的一个具体实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，X1选自氨基酸Ala、Ile、Leu、Phe、Val、Pro和Gly。更特别地，X1是Ile或Val。甚至更特别地，X1是Ile。
在第一方面的另一具体实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，R1是–C(O)(C1-C10)烷基。更特别地，R1是–C(O)(C1-C5)烷基。甚至更特别地，R1是–C(O)-CH3。
在第一方面的另一具体实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，R2为–NR3R4。更特别地，R3和R4相同或不同，并且选自氢和(C1-C5)烷基。
在本发明中，术语"烷基"包括直链和支化烃链。
"烷基"的说明性非限制性实例是：甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)、辛基(C9)、壬基(C9)和癸基(C10)等。
在又一个具体实施方式中，任选地与上文或下文的任何实施方式组合，“a”至“j”中的一个是1并且其它是0。特别地，“a”是1并且“b”、“c”、“d”、“e”、“f”、“g”、“h”、“i”和“j”是0。
第一方面的另一个具体实施方式包括选自由序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3组成的组中的肽，其概括于表3中。
表3
肽 SEQ ID 序列
P1A SEQ ID NO:1 CFEISKY-NH<sub>2</sub>
P1B SEQ ID NO:2 CH<sub>3</sub>-C(O)-CFEVSKY-NH<sub>2</sub>
P1C SEQ ID NO:3 CH<sub>3</sub>-C(O)-CFEISKY-NH<sub>2</sub>
本发明的肽可以按照常规方案制备，例如通过固相合成，其中进行(a)使待结合的氨基酸脱保护和(b)受保护的氨基酸偶联循环的连续步骤。
保护基可以是N-保护基、C-保护基或侧链保护基。所有这三类的保护基都有市售。
氨基酸保护基的说明性非限制性实例是N-保护基t-Boc(或Boc)和Fmoc。当在肽的合成中使用t-Boc或Fmoc时，主要的四个步骤是：(a)在脱保护反应中从拖尾氨基酸(商购)除脱保护基团；(b)洗去脱保护试剂以提供清洁的偶联环境，(c)将溶解于溶剂(例如二甲基甲酰胺(DMF))中的受保护的氨基酸与偶联试剂一起泵送通过合成柱，和(d)洗去偶联试剂以提供清洁的脱保护环境。根据具体的N-保护基，脱保护试剂和偶联试剂是一种或另一种。本领域技术人员基于其常识，如果需要，可以通过常规方法优化特定条件。
作为选择，本发明的肽可通过重组DNA技术获得。
如上所述，本发明的第二方面涉及包含第一方面的肽的缀合物。更特别地，缀合物包含细胞穿透元件。甚至更特别地，细胞穿透元件是细胞穿透肽(CPP)。
如本文所用的术语"缀合物"是指通过将本发明的肽与一种或多种化合物经由共价键或非共价键连接起来而形成的化合物。
在本发明中，术语"细胞穿透肽"("CPP")是指促进各种分子货物(从纳米尺寸颗粒到小的化学分子和大的DNA片段)被细胞摄取的短肽。通过共价键化学连接或非共价相互作用，所述"货物"经由C(t)或N(t)与肽结合。CPP的功能是将货物递送到细胞中，这是通过胞吞作用而通常发生的过程，货物被递送到研究用和医学用的递送载体。目前的应用受到CPP介导的货物递送中缺乏细胞特异性和对它们的摄取模式理解不足的限制。CPP的氨基酸组成通常含有相对高丰度的带正电的氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)或者具有含有极性/带电氨基酸和非极性、疏水氨基酸的交替模式的序列。这两种类型的结构分别被称为聚阳离子或两亲性的。第三类CPP是疏水肽，其仅含有非极性残基，具有低净电荷，或具有对于细胞摄取至关重要的疏水氨基酸基团。CPP与本发明提供的肽的缀合可以按照熟知的常规方案进行，例如固相合成或溶液选择性加帽。(参见Copolovici D.M.等，“Cell-PenetratingPeptides:Design,Synthesis,and Applications”，2014，ACS Nano，2014，8(3)，1972-1994页)。
实际上，可以使用具有将肽内化在细胞中的能力的任何细胞穿透肽；然而，在一个具体实施方式中，所述载体肽是包含"PTD"("蛋白转导结构域")区段的肽。包含蛋白转导结构域(PTD)的蛋白的说明性非限制性实例包括：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)TAT("反式翻译蛋白")蛋白、果蝇触角足同源异型转录因子(Antp)和单纯疱疹病毒1(HSV-1)VP22 DNA结合蛋白，但也已经提示其它蛋白具有将肽内化在细胞中的这种性质，例如流感病毒血凝素、乳铁蛋白、成纤维细胞生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2和Hoxa-5、Hoxb-4和Hoxc-8蛋白(Ford K.G.等，Gene Therapy，2001；8:1-4)。
本发明的肽可以结合到载体肽的任何一个(氨基或羧基)末端，所述载体肽具有将本发明的肽内化在细胞中的能力。因此，在一个具体实施方式中，本发明的肽的羧基末端与所述载体肽的氨基末端结合，而在另一个具体实施方式中，本发明的肽的氨基末端与所述载体肽的羧基末端结合。
本发明的肽可以直接或不直接与细胞穿透肽结合。因此，在一个具体实施方式中，任选地与上文或下文提供的任一实施方式组合，本发明的肽与细胞穿透肽直接结合。在另一实施方式中，任选地与上文或下文提供的任一实施方式组合，本发明第二方面的缀合物还包含位于本发明第一方面定义的肽与细胞穿透肽之间的间隔肽。所述间隔肽有利地是具有结构柔性的肽，例如产生非结构化域的肽。事实上，具有结构柔性的任何肽都可以用作间隔肽；然而，所述间隔肽的示例性非限制性实例包括含有氨基酸部分的重复(例如Gly和/或Ser的重复)或任何其它合适的氨基酸部分重复的肽。
在本发明第二方面的另一个实施方式中，细胞渗透剂是纳米颗粒递送系统，已知其是生物相容的并且保护活性成分免于降解。
如本文所用，术语"纳米颗粒"是指在至少两个维度上为纳米级、特别是在所有三个维度上都为纳米级的颗粒，其中纳米级为约1nm至约300nm。特别地，当纳米颗粒是具有基本上圆形横截面的基本上棒状时，例如纳米线或纳米管时，"纳米颗粒"是指至在少两个维度上为纳米级的颗粒，所述两个维度是纳米颗粒的横截面。
也可使用增加细胞内摄取的生物可降解纳米颗粒递送系统，例如，如US2009/0136585中所述的表面改性的聚合物纳米颗粒。实例包括聚DL-丙交酯-co-乙交酯(PLGA)纳米颗粒，其例如用已知的表面改性剂表面改性过，所述表面改性剂为例如肝素、十二烷基甲基溴化铵(DMAB)、DEAE-葡聚糖、lipofectin和纤维蛋白原等。
如本文所用的术语"脂质纳米颗粒"是指其膜完全由脂质制成的纳米颗粒。合适的脂质包括但不限于磷脂，例如磷脂酰胆碱("PC")、磷脂酰乙醇胺("PE")、磷脂酰丝氨酸("PS")、磷脂酰甘油("PG")、磷脂酰肌醇("PI")和磷脂酸("PA")。这种磷脂通常具有两个酰基链，这两个酰基链都是饱和的，或者都是不饱和的，或者一个是饱和的且另一个是不饱和的；所述链包括但不限于：肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、花生四烯酸酯、山嵛酸酯和二十四烷酸酯链。磷脂也可以通过连接合适的反应性基团来衍生化。这样的基团通常是氨基，因此衍生化的磷脂通常是磷脂酰乙醇胺。适于与PE连接的不同的部分包括但不限于：酰基链，其用于增强脂质体与生物膜的可融合性；肽，其用于使靶细胞附近的脂质体去稳定；生物素和马来酰亚胺部分，其用于将靶向性部分(例如抗体)连接至脂质体；和各种分子，例如神经节苷脂、聚亚烷基醚、聚乙二醇和有机二羧酸。可以构成纳米颗粒的膜的其它脂质包括但不限于胆固醇和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在一个实施方式中，脂质纳米颗粒选自脂质体和固体脂质纳米颗粒。在另一个实施方式中，脂质纳米颗粒是脂质体。
术语"固体脂质纳米颗粒"是指平均直径为10至1000纳米的通常为球形的颗粒。固体脂质纳米颗粒具有固体脂质核基质，其可以使亲脂性分子增溶。脂质核通过表面活性剂(乳化剂)稳定化。这里使用的术语“脂质”是广义的，包括甘油三酯(例如三硬脂酸甘油酯)、甘油二酯(例如山嵛酸甘油酯)、甘油单酯(例如单硬脂酸甘油酯)、脂肪酸(例如硬脂酸)、类固醇(例如胆固醇)和蜡(例如棕榈酸十六烷基酯)。所有种类的乳化剂(就电荷和分子量而言)都已用于稳定脂质分散体。
在本发明中，术语"脂质体"应理解为包含一个或多个脂质双层的自组装结构，所述脂质双层中的每一个都包含两个含有相反取向的两亲性脂质分子的单层。两亲性脂质包含共价连接至一个或两个非极性(疏水性)酰基链的极性(亲水性)头基区域。疏水酰基链和周围水性介质之间的能量上不利的接触诱导两亲性脂质分子排列自身，使得它们的极性头基朝向双层的表面，而酰基链朝向双层的内部重新定向。因此形成能量稳定的结构，其中酰基链被有效地屏蔽以免与水性环境接触。
脂质体可具有单个脂双层(单层脂质体，"ULV")或多个脂双层(多层脂质体，"MLV"或"SPLV")。每个双层包围或包封水性区室。鉴于水性体积被这样包封在脂质分子的保护性屏障内，脂质体能够隔离包封的分子(例如核酸)，使其远离存在于外部环境中的因子(例如核酸酶)的降解作用。
脂质体可以具有多种尺寸，例如，平均直径低至25nm或高至10,000nm以上。尺寸受许多因素影响，例如脂质组成和制备方法，这些完全在本领域普通技术人员确定和解释的范围内，并且由许多技术例如准弹性光散射确定，这些也在本领域技术人员的知识范围内。
可以使用同样是本领域技术人员公知的各种方法(例如超声处理、或匀质化和研磨)来从较大的脂质体制备较小尺寸的脂质体。挤出可用于使脂质体尺寸减小，即通过在压力下迫使脂质体通过限定的选定尺寸的滤孔而产生具有预定平均尺寸的脂质体。切向流过滤也可用于调整脂质体的尺寸，即，产生具有较小的尺寸不均匀性和更均匀的、确定的尺寸分布的脂质体群。
本发明的肽可以使用本领域公知的方法包封在颗粒内，例如在Tandrup SchmidtS等，“Liposome-Based Adjuvants for Subunit Vaccines:Formulation Strategies forSubunit Antigens and Immunostimulators”,Pharmaceutics,2016Mar 10；8(1)中公开的那些方法。
细胞穿透剂可以用能够识别和结合肿瘤细胞表面上的分子的缀合性分子来进一步官能化。
在一个实施方式中，细胞穿透剂还保护本发明的肽免于从体内快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微囊包封的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂可以使用标准技术制备，或商购获得。
如果需要，本发明的肽可以任选地包括可用于分离或纯化本发明的肽的氨基酸序列。所述序列将位于本发明的肽的不会不利地影响本发明的肽的功能的区域。事实上，可用于分离或纯化蛋白质的任何氨基酸序列(一般称为标签肽)都可存在于本发明的肽中。作为非限制性的说明，用于分离或纯化蛋白质的所述氨基酸序列可以是，例如，精氨酸标签(Arg-标签)、组氨酸标签(His-标签)、FLAG-标签、Strep-标签、可被抗体识别的表位例如c-myc-标签、SBP-标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合域、几丁质结合域、谷胱甘肽S-转移酶标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-标签或β-半乳糖苷酶等。
本发明的肽可以通过本发明的肽与能够将肽内化在细胞中的细胞穿透肽的偶联反应而获得，其可以通过常规合成方法获得，例如先前已经提及的那些(例如，固相化学合成)，或通过重组技术获得。
本发明的第三方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的式(I)的肽、其药学上可接受的盐或其缀合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
表述"药物组合物"包括用于人以及用于非人动物的组合物。
如本文所用的表述"治疗有效量"是指当施用时足以预防所针对的疾病的一种或多种症状的发展或在一定程度上减轻所述一种或多种症状的肽或缀合物的量。根据本发明施用的化合物的具体剂量当然将由病例周围的具体情况决定，包括施用的化合物、施用途径、治疗的具体病症和类似的考虑。
表述"药学上可接受的赋形剂或载体"是指药学上可接受的材料、组合物或载剂。每种成分必须是药学上可接受的，即与药物组合物的其它成分相容。它还必须适合与人和非人动物的组织或器官接触使用，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
合适的药学上可接受的赋形剂的实例是溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体载剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除了任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容(例如通过产生任何不希望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用)的情况之外，其用途被认为在本发明的范围内。
本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、大小和/或状况、并且还根据组合物的施用途径而变化。
用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。根据配方设计师的判断，诸如着色剂、包衣剂、甜味剂和调味剂等赋形剂可存在于组合物中。
含有本发明的肽或缀合物的药物组合物可以以任何剂型存在，例如固体或液体，并且可以通过任何合适的途径施用，例如口服、肠胃外、直肠、局部、鼻内或舌下途径，对于这些途径，它们将包括对于配制所需剂型而言必要的药学上可接受的赋形剂，例如配制局部制剂(软膏、乳膏、脂凝胶、水凝胶等)、滴眼剂、气雾剂、注射液、渗透泵等。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉及其组合。
示例性的成粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣(citrus pulp)、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(Veegum)、十二烷基硫酸钠、季铵化合物及其组合。
示例性的粘合剂包括但不限于：淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰苔藓提取物、潘瓦尔胶(panwar gum)、印度胶(ghatti gum)、伊莎贝(Isapol)壳粘液、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、硅酸铝镁(Veegum)和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；以及它们的组合。
示例性的防腐剂可以包括抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其它防腐剂。示例性的抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸油酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、一硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠。示例性的螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和依地酸三钠。
示例性的缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、碱式磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇及其组合。
示例性的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠及其组合。
如上所述，本发明的另一方面涉及用作药物的本发明的肽、缀合物或药物组合物。
在第五方面，本发明提供了本发明的肽、缀合物或药物组合物用于治疗或预防肿瘤疾病，更特别地，用于治疗或预防胰腺癌。这方面也可以表述为本发明的肽、缀合物或药物组合物在制造治疗或预防肿瘤性疾病的药物中的应用。这方面也可以表述为治疗或预防肿瘤性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的肽、缀合物或药物组合物。
可以用本发明的肽、缀合物和药物组合物治疗的肿瘤性疾病的说明性非限制性实例包括但不限于乳头状瘤、腺瘤、脂肪瘤、骨瘤、肌瘤、血管瘤、痣、成熟畸胎瘤、癌、肉瘤、未成熟畸胎瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、基底细胞瘤、脊柱瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肺癌、支气管癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、肝癌、头颈癌等。在第五方面的一个具体实施方式中，所述肿瘤性疾病是胰腺癌。根据本文提供的数据，本发明的肽、缀合物和药物组合物还可用于治疗其它疾病，例如代谢性疾病、神经性疾病和炎性疾病。
在整个说明书和权利要求书中，词语"包括"和该词语的变体并不旨在排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语"包括"包含“由…组成”的情况。本发明的其它目的、优点和特征对于本领域技术人员来说在阅读了说明书之后将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践而习得。以下实施例和附图是作为说明提供的，它们不旨在限制本发明。此外，本发明涵盖本文所述的特定和优选实施方式的所有可能组合。
实施例
实施例1：本发明的肽的合成。
肽是化学合成的，使用固相合成(SPPS)技术，按照经典的Fmoc/tBu策略，通过自动肽合成仪进行或手动进行。
Rink-酰胺树脂用于合成，和用于N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)与作为二甲基甲酰胺(DMF)中的添加剂的1-羟基苯并三唑(HOBt)的Fmoc-氨基酸偶联。用20％哌啶的DMF溶液进行脱保护。
在乙酰化序列的情况下，使用乙酸酐(Ac2O)与二异丙基乙胺(DIEA)的DMF溶液在固相中进行乙酰化，然后干燥树脂。用三氟乙酸(TFA)混合物处理干燥的肽基树脂以从树脂上切割肽。得到的肽粗品使用利用TFA的H2O/乙腈(CAN)纯化系统，通过制备型反相HPLC纯化，并将纯的级分冻干。HPLC分析结果总结于表4中。
表4
肽 MS谱的鉴定 肽纯度
P1 827.6u.m.a. 90.54％
P1A 887.4u.m.a. 97.54％
P1B 915.5u.m.a. 97.45％
P1C 930.7u.m.a. 97.00％
P2 678.4u.m.a. 94.14％
P2C 781.5u.m.a. 99.12％
实施例2：细胞培养和用本发明的肽处理细胞
细胞培养
来自人胰腺原发腺癌的BXPC3细胞系由巴塞罗那生物医学研究所(IRB)提供，人脐带原代内皮细胞(HUVEC)由研究者直接获得并在实验室中将其储存在液氮中。BXPC3细胞维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的RPMl-1640培养基(Gibco)中。HUVEC细胞维持在补充有20％胎牛血清、内皮细胞生长补充物(ECGS)、肝素(Hep)和抗生素的M199培养基(Gibco)中。于37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中，将培养物维持在细胞温育器中。
将不同的待测肽以50mM的浓度容易地溶解于DMSO中，随后在Dulbecco氏PBS中制备5mM的中间稀释液，对所述中间稀释液进行两个短周期的超声处理，这使得所述肽完全可溶。从后一稀释液，在补充培养基中制备10、20、30和40μM浓度的不同处理样。以双倍浓度制备不同的处理样，并将100μL的处理样加入到孔中的相同体积的细胞生长培养基中，以达到上述公开的最终浓度。
细胞处理
按照以下说明的方案使用不同的肽进行测定。在BXPC3细胞的情况下，通过用胰蛋白酶0,25％-EDTA进行胰蛋白酶/EDTA消化而使细胞重悬浮，在HUVEC细胞的情况下，通过胰蛋白酶0,25％-EDTA而使细胞重悬浮。一旦重悬浮于培养基中，用台盼蓝1:1稀释后，在Newbauer氏室中对它们计数。这种染色使得可以得知悬浮液中活细胞的数量。从计数可知，制备了合适的细胞稀释液(BXPC3为5000细胞/100μl/孔，HUVEC为10000细胞/100μl/孔)。在细胞温育器中使细胞在培养物中温育24小时。温育24小时后，加入100μl/孔的如上所述制备的肽的双倍浓缩液。通过将细胞保持在细胞温育器中来维持处理样72小时。用于测定的肽的序列示于表5。
表5
本发明的肽 序列 SEQ ID NO:
P1A CFEISKY-NH2 SEQ ID NO:1
P1B CH<sub>3</sub>-C(O)-CFEVSKY-NH2 SEQ ID NO:2
P1C CH<sub>3</sub>-C(O)-CFEISKY-NH2 SEQ ID NO:3
用于比较目的的肽 序列 SEQ ID NO:
P1 CH<sub>3</sub>-C(O)-FEISKY-NH2 SEQ ID NO:4
P2 CH<sub>3</sub>-C(O)-VFSTAL-NH2 SEQ ID NO:5
P2C CH<sub>3</sub>-C(O)-CVFSTAL-NH2 SEQ ID NO:6
72小时后，通过倾析除去培养基，用DPBS洗涤细胞两次，然后用100μl 4％多聚甲醛溶液固定细胞30分钟。接着用100μl mQ H2O进行两次洗涤，并立即加入50μl0.25％的Violet Crystal溶液(在蒸馏水中制备)，并在室温(RT)下保持30分钟。在染色时间结束时，用蒸馏水洗涤数次以完全除去过量的Violet Crystal，然后将板在烘箱中在37℃完全干燥。
每孔的光密度值如下获得：通过Biotek SynergyTM2多检测微板读数器，使用590nm滤光器，扫描读数，由此获得每孔的平均值。
结果
测试肽的癌症生长抑制活性的体外增殖测定
为了测试本发明的肽的抗癌作用，对人胰腺肿瘤细胞系BXPC3进行增殖试验。
如图1-A中所观察到的，当用终浓度为20μM的肽处理BXPC3细胞时，相对于经模拟处理的细胞的生长(其设为100％的值)，P1C肽(SEQ ID NO:3)将癌细胞生长降低到40％。当P1C肽的羧基端乙酰化丧失(肽P1A(SEQ ID NO:1))或者异亮氨酸残基被缬氨酸残基取代(肽P1B(SEQ ID NO:2))时，仍保持了肽的显著抑制能力。当以40μM的终浓度施用肽时(图1-B)，它们的生长抑制作用甚至更高。
对于任何其它测试的肽，没有观察到对癌细胞生长的抑制。
用于测试本发明的肽的毒性的体外增殖测定
肽P1C——其在癌细胞中呈现出最高的生长抑制活性(见测定1)——的施用不影响正常的非转化细胞的生长。这种无毒性得以保持，与所施用的肽的剂量无关(终浓度为10μM至40μM，图2的第二至第五个条柱)。
考虑到本发明的肽在非转化细胞中的低毒性和在癌细胞中的高生长抑制活性，这些结果明确地证明了本发明的肽作为抗癌剂的高治疗潜力。
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 1
Cys Phe Glu Ile Ser Lys Tyr
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 2
Cys Phe Glu Val Ser Lys Tyr
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 3
Cys Phe Glu Ile Ser Lys Tyr
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 4
Phe Glu Ile Ser Lys Tyr
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 5
Val Phe Ser Thr Ala Leu
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 6
Cys Val Phe Ser Thr Ala Leu
1 5

Claims (15)

1.式(I)的肽或其药学上可接受的盐，
CaCbCcCdCeFEX1SKYCfCgChCiCj (I)
其中：
所述肽的N-端基团是式–NHR1的单价基团；
所述肽的C-端基团是式–C(O)-R2的单价基团；
R1是选自氢和–C(O)-(C1-C20)烷基的单价基团；
R2是选自-OH和–NR3R4基团的单价基团；
R3和R4独立地选自氢和(C1-C10)烷基；
“a”至“j”是0至1的整数，条件是“a”至“j”中的至少一个是1；并且
X1表示任意氨基酸。
2.如权利要求1所述的肽，其中X1选自Ala、Ile、Leu、Phe、Val、Pro和Gly。
3.如权利要求1-2中任一项所述的肽，其中X1是Ile或Val。
4.如权利要求1-3中任一项所述的肽，其中R1是–C(O)(C1-C10)烷基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的肽，其中R1是–C(O)-CH3。
6.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中R2是–NR3R4。
7.如前述权利要求中任一项所述的肽，其中R3和R4是氢。
8.如前述权利要求中任一项所述的肽，其中“a”至“j”中的一个是1并且其它是0。
9.如前述权利要求中任一项所述的肽，其中“a”是1并且“b”、“c”、“d”、“e”、“f”、“g”、“h”、“i”和“j”是0。
10.如前述权利要求中任一项所述的肽，其选自由序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3组成的组。
11.一种缀合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的肽。
12.一种药物组合物，其包含：治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的式(I)的肽或其药学上可接受的盐或权利要求11所述的缀合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
13.如权利要求1-10中任一项所定义的肽、如权利要求11所定义的缀合物或如权利要求12所定义的药物组合物，其用途为药物。
14.如权利要求1-10中任一项所定义的肽、如权利要求11所定义的缀合物或如权利要求12所定义的药物组合物，其用途为治疗或预防肿瘤性疾病。
15.如权利要求14所述的用途的肽、缀合物或药物组合物，其中所述肿瘤性疾病是胰腺癌。
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KUZMENKOV等: "Variability of Potassium Channel Blockers in Mesobuthus eupeus Scorpion Venom with Focus on Kv1.1: AN INTEGRATED TRANSCRIPTOMIC AND PROTEOMIC STUDY", 《J BIOL CHEM》 *
陈彩霞等: "生物活性肽在抗癌领域的应用研究进展", 《中国医药导报》 *
高德民等: "多肽类药物结构稳定性的研究进展", 《中国医药生物技术》 *

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