CN111150748A

CN111150748A - 重组溶瘤病毒在制备治疗消化道癌药物中的用途

Info

Publication number: CN111150748A
Application number: CN201911373616.2A
Authority: CN
Inventors: 钱文斌; 王世兵; 王俊杰; 黄筛
Original assignee: Hangzhou Ronggu Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Ronggu Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明提供了一种重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗消化道癌的药物中的应用，属于基因工程学和肿瘤学，涉及携带人IL‑33的重组溶瘤痘苗病毒在治疗癌症中的用途。本发明将恶性肿瘤的基因治疗与病毒治疗有效结合起来，制备了可高效表达IL‑33的溶瘤痘苗病毒，相对于单纯的基因疗法或病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。本发明采用了肿瘤靶向治疗策略，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性增殖。从而大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。本发明采用病毒复制相关基因缺失的方式，确保病毒的肿瘤内特异性复制，大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。本发明通过构建携带人IL‑33的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好的抗胃癌、结肠癌和胰腺癌的效果。

Description

重组溶瘤病毒在制备治疗消化道癌药物中的用途

技术领域

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种携带IL-33编码基因的重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗胃癌、结肠癌和胰腺癌的药物组合物、药物或试剂盒中的用途。

背景技术

根据《2018全球癌症统计》的资料显示，全球新增癌症患者超过1800万例。其中胃癌、结肠癌和胰腺癌新增患者分别为6.1％、5.7％和2.5％，而死亡率分别为5.8％、8.2％和4.5％。发病率高，死亡率高是消化道癌症的重要特点，而发展新型安全有效的治疗方法以提高消化道癌症患者生存期具有非常重要的意义。

溶瘤病毒免疫疗法(Oncolytic Virotherapy)是近年来发展非常迅速的一种肿瘤治疗新方法，并已取得一些令人鼓舞的成果，很多产品正在国内和国际上进行I期、II期和III期临床研究。其中，美国安进公司的重组人GM-CSF溶瘤腺病毒(T-VEC)在临床试验中表现优异，已于2015年获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，用于首次手术后复发的黑色素瘤患者不可切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶的局部治疗。国内有重组人p53腺病毒(今又生)获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书，临床上用于治疗实体肿瘤患者。这些结果表明溶瘤病毒是一种非常具有前景的治疗癌症的新方法。溶瘤痘苗病毒(Oncolytic Poxvirus)是溶瘤病毒免疫疗法的新型载体，其优点在于：病毒稳定性好、致病性低、基因转染效力高、安全性良好。溶瘤痘苗病毒能够选择性感染肿瘤细胞并在细胞内复制、杀死肿瘤细胞，而对正常组织和细胞几乎没有感染性，因此毒性很小。

人白细胞介素-33(Interleukin-33，IL-33)与IL-1α、IL-1β和IL-18是IL-1细胞因子家族的一员，它们在局部应激后启动炎症反应。IL-33通过由il1rl1基因编码的异二聚体ST2受体传递信号，il1rl1基因在包括肥大细胞、2型固有淋巴细胞(ILC2)和调节性T细胞(Treg)在内的一些固有免疫细胞表面组成性表达。Akimoto等报道了在结直肠癌中，肿瘤微环境中可溶性ST2受体的升高能够增加可溶性IL-33的捕获，从而抑制了肿瘤的生长和转移，因此能与结直肠癌的良好预后相关。此外，肺腺癌患者IL-33蛋白水平与肿瘤分级和大小呈负相关，提示IL-33表达水平低与预后不良有关。Fang等报道IL-33能够抑制胰腺癌细胞系mia-paca-2的增殖并诱导其凋亡。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的治疗癌症的方法效果较弱，提供一种重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗消化道癌的药物中的应用，具体而言，将携带人白细胞介素33(IL-33)的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-IL-33)制成药物并施用于受试者。

本发明一方面提供了重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述重组溶瘤痘苗病毒OVV-IL-33上编码人白细胞介素33的外源基因。

进一步地，所述重组溶瘤痘苗病毒上携带编码人白细胞介素33的外源基因通过如下方法实现：在所述溶瘤痘苗病毒插入编码人IL-33的外源基因；所述编码人IL-33的外源基因为在严紧条件下与人IL-33的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制消化道癌细胞增值活性的人IL-33的多核苷酸序列、其60％及以上同一性的多核苷酸序列或其互补序列；

进一步地，所述编码人IL-33的外源基因序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

进一步地，本发明所述的重组溶瘤痘苗病毒可被进一步修饰，所述重组溶瘤痘苗病毒上还携带有用于表达治疗消化道癌的蛋白活性成分。示例性地，本发明中用于表达的治疗癌症的蛋白活性成分是p53。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体、用于治疗癌症的其他活性成分。示例性地，所述其他活性成分是紫杉醇。药学上可接受的载体包括促进重组溶瘤痘苗病毒加工成制剂的赋形剂和助剂。

进一步地，所述药物的形式为固体或注射液。优选的，所述的药物是包装在药盒中的；更优选的，所述药盒还含有所述药物组合物的使用说明书。

进一步地，所述消化道癌包括胃癌、结肠癌和胰腺癌。

本发明的有益效果是：

1、本发明将恶性肿瘤的基因治疗与病毒治疗有效结合起来，制备了可高效表达IL-33的溶瘤痘苗病毒，相对于单纯的基因疗法或病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。

2、本发明采用了肿瘤靶向治疗策略，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性增殖。从而大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

3、本发明采用病毒复制相关基因缺失的方式，确保病毒在肿瘤内特异性复制，大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

4、本发明通过构建携带人IL-33的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好的抗胃癌、结肠癌和胰腺癌的效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是酶标仪检测携带GFP的重组溶瘤痘苗病毒感染HGC-27、SW-480和ASPC-1细胞中GFP的表达水平。

图2是RT-PCR检测携带IL-33的重组溶瘤痘苗病毒感染HGC-27、SW-480和ASPC-1细胞，IL-33的表达水平。

图3-1和图3-2是MTT法检测细胞存活率分析图，数据以剂量梯度相对于PBS组的百分率表示。

图4是OVV和OVV-IL-33对HGC-27、SW-480和ASPC-1细胞荷瘤小鼠的肿瘤大小随时间变化图。

具体实施方式

本发明提供的一种重组溶瘤痘苗病毒OVV-IL-33在制备用于治疗消化道癌的药物中的应用，所述重组溶瘤痘苗病毒上携带编码人白细胞介素33的外源基因。通过在溶瘤痘苗病毒插入编码人IL-33的外源基因获得携带编码人白细胞介素33的外源基因的重组溶瘤痘苗病毒；

具体而言，本发明所述的人IL-33的编码序列是任何能够编码人IL-33的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQ ID NO.1或其互补序列。另一方面，本发明所述的人IL-33的编码序列可为在严紧条件下与人IL-33的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制胃癌、结肠癌和胰腺癌细胞增值活性的人IL-33的多核苷酸或其互补序列；

本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的的严紧度。

除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码SEQ ID NO.1的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(Altschul SF,et al:JMol Biol215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数优选为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数优选为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。

任选地，本发明的重组病毒表达已知能抑制胃癌、结肠癌和胰腺癌细胞增殖的其他蛋白，例如p53。本发明的药物组合物还可以含有其他治疗胃癌、结肠癌和胰腺癌的活性成分，例如紫杉醇。

本发明的作为活性成分的携带IL-33编码基因的重组溶瘤痘苗病毒可以连同药学上可接受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可以包含合适的药学上可接受的载体，包括促进本发明的重组病毒加工成制剂的赋形剂和助剂。

例如适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的(冻干)条件，在立即使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。

本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

本发明的活性成分的有效量可为治疗胃癌、结肠癌和胰腺癌，或缓解上述三种癌症症状或抑制上述三种癌症细胞的任何量，其可以是相当于约1x10¹¹-1x10¹²v.p重组病毒。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。

根据本发明，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射施用至荷瘤部位。

应当理解本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症(例如胃癌、结肠癌、胰腺癌)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制；其中所使用的细胞、培养基等来源附注与相对应的细胞、培养基后的括号中，但不限于此。除特别说明外，本发明可采用本领域常规技术。

实施例1、重组溶瘤痘苗病毒的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、通过基因合成方法，得到编码IL-33的DNA序列(SEQ ID NO.1)；

2)、将编码IL-33的序列装载于穿梭质粒pCB上，得到pCB-IL-33(SEQ ID NO.2)，其中所述的穿梭质粒pCB根据如下文献制备：房有荣，李红玉，陈科达，周文硕，阎辉.Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建，国际流行病学传染病学杂志，2012年6月第39卷第3期；需要说明的是，本发明也可用其他的pCB，例如没有选择标记的穿梭质粒pCB。

3)、将质粒pCB-IL-33和野生型痘苗病毒(购自美国ATCC公司)转入HEK293细胞，在HEK293细胞(人胚胎肾细胞系，购自中国科学院细胞库)中，质粒pCB-IL-33与野生型痘苗病毒发生同源重组，编码IL-33的DNA序列插入野生型痘苗病毒胸苷激酶(TK)基因中；

4)、经霉酚酸药物筛选后，得到纯化的重组溶瘤痘苗病毒OVV-IL-33。

实施例2：流式细胞仪检测携带GFP(绿色荧光蛋白)的重组溶瘤痘苗病毒OVV-IL-33-GFP分别感染人HGC-27、SW-480、ASPC-1细胞(分别为人胃癌、结肠癌、胰腺癌细胞系)中GFP的表达水平。

六孔板中分别接种2×10⁵个/mL的HGC-27、SW-480、ASPC-1细胞(购自购自中国科学院细胞库)，分别加入0.1 MOI、0.5 MOI、1MOI、5MOI和10 MOI的携带GFP的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-IL-33-GFP)，对照组中加入等量的PBS，37℃、5％CO₂培养。24h后收集细胞，采用流式细胞仪(BioRad)分析各组样品的GFP表达率。结果见图1，随着OVV-IL-33剂量的增加，GFP表达水平随之增加，表明重组溶瘤痘苗病毒对胃癌、结肠癌和胰腺癌细胞可有效侵袭。

实施例3：PCR检测携带人细胞因子IL-33编码基因的重组溶瘤痘苗病毒感染人HGC-27、SW-480、ASPC-1细胞中人细胞因子IL-33的表达水平。

携带人细胞因子IL-33编码基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-IL-33)以4MOI的剂量感染HGC-27、SW-480、ASPC-1细胞，37℃，5％CO₂条件下培养24小时。按TRIZOL法提取细胞总RNA，以抽提的总RNA为模板逆转录成cDNA，使用Primer 5.0软件设计引物(SEQ ID NO：3)。cDNA通过SYBR qPCR Mix进行荧光定量PCR，扩增体系为20μL。

扩增参数为：95℃1min，95℃15s，60℃1min，40个循环。结果由AppliedBiosystems7300 real-time PCR仪软件分析。结果见图2，OVV-IL-33处理HGC-27、SW-480和ASPC-1细胞后，在mRNA水平上，IL-33表达水平显著增高，表明OVV-IL-33能在胃癌、结肠癌和胰腺癌细胞中稳定表达IL-33。

实施例4：携带IL-33的重组溶瘤痘苗病毒对胃癌、结肠癌和胰腺癌细胞HGC-27、SW-480和ASPC-1增殖活性的影响。

HGC-27、SW-480、ASPC-1细胞分别在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640或DMEM(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO₂、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定溶瘤痘苗病毒组(OVV)、携带IL-33编码基因的重组溶瘤痘苗病毒组(OVV-IL-33)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入OVV(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)和OVV-IL-33(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡l0 min后，在Thermo Varioskan Flash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图3-1，随着剂量的增加，OVV和OVV-IL-33对胃癌、结肠癌和胰腺癌细胞HGC-27、SW-480和ASPC-1增殖抑制效应愈加显著，且OVV-IL-33对HGC-27、SW-480和ASPC-1增殖抑制效应强于OVV。

实施例5：携带IL-33编码基因的重组溶瘤痘苗病毒对人正常细胞增殖活性的影响。

人肝正常细胞QSG-7701(购自中国科学院细胞库)在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO₂、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定对照组、溶瘤痘苗病毒组(OVV)和携带IL-33编码基因的重组溶瘤痘苗病毒组(OVV-IL-33)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入OVV(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)和OVV-IL-33(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡l0 min后，在Thermo Varioskan Flash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图3-2，随着剂量的增加，OVV和OVV-IL-33对人肝正常细胞QSG-7701无明显抑制效应。

实施例6：携带IL-33的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-IL-33)和OVV对胃癌、结肠癌和胰腺癌细胞HGC-27、SW-480和ASPC-1荷瘤模型动物肿瘤大小。

使用4-6w裸鼠，分别皮下接种5*10⁶个HGC-27、SW-480、ASPC-1细胞，待肿瘤体积成长至150mm³左右后分别在瘤内注射1*10⁷pfu的OVV和OVV-IL-33及等体积的PBS，并于0、3、7、14、21天使用游标卡尺测量肿瘤大小并计算体积。体积计算公式为V＝(length x width²)/2，其中Length为肿瘤长径，Width为肿瘤短径。结果见图4，OVV-IL-33和OVV处理组均能强烈抑制肿瘤生长，且OVV-IL-33处理后，其肿瘤不再生长，其抑制肿瘤生长作用更加显著。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州荣谷生物科技有限公司

<120> 重组溶瘤病毒在制备治疗消化道癌药物中的用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 435

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagccta aaatgaagta ttcaaccaac aaaatttcca cagcaaagtg gaagaacaca 60

gcaagcaaag ccttgtgttt caagctggga aataaggtgt tactgagtta ctatgagtct 120

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<210> 2

<211> 5290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 2520

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 2580

cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 2640

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 2700

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 2760

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 2820

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 2880

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 2940

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 3000

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 3060

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 3120

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 3180

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 3240

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 3300

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 3360

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 3420

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 3480

ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 3540

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 3600

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 3660

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 3720

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cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 3840

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 3900

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 3960

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 4020

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 4080

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 4140

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 4200

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ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct gttgataccg ggaagccctg ggccaacttt 4320

tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca actttcacca taatgaaata 4380

agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa 4440

atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 4500

cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagagcttt 4560

tgggatcaat aaatggatca caaccagtat ctcttaacga tgttcttcgc agatgatgat 4620

tcatttttta agtatttggc tagtcaagat gatgaatctt cattatctga tatattgcaa 4680

atcactcaat atgtagctag actttctgtt attattattg atccaatcaa aaaataaatt 4740

agaagccgtg ggtcattgtt atgaatctct ttcagaggaa tacagacaat tgacaaaatt 4800

cacagacttt caagatttta aaaaactgtt taacaaggtc cctattgaca gatggaaggg 4860

tcaaacttaa taaaggatat ttgttcgact ttgtgattag tttgatgcga ttcaaaaaag 4920

aatcctctct agctaccacc gcaatagatc ctgttagata catagatcct cgtcgcaata 4980

tcgcattttc taacgtgatg gatatattaa agtcgaataa agtgaacaat aattaattct 5040

ttattgtcat catgaacggc ggacatattc agttgataat cggccccatg ttttcaggta 5100

aaagtacaga attaattaga cgagttagac gttatcaaat agctcaatat aaatgcgtga 5160

ctataaaata ttctaacgat aatagatacg gaacgggact atggacgcat gataagaata 5220

attttgaagc attggaagca actaaactat gtgatctctt ggaatcaatt acagatttct 5280

ccgtgatagg 5290

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaccaccaaa aggccttcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaggcaaag cactccacag 20

Claims

1.一种重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗消化道癌的药物中的应用，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒上携带编码人白细胞介素33的外源基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒上携带编码人白细胞介素33的外源基因通过如下方法实现：在溶瘤痘苗病毒中插入编码人IL-33的外源基因；所述编码人IL-33的外源基因可为在严紧条件下与人IL-33的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制消化道癌细胞增值活性的人IL-33的多核苷酸序列、其60％及以上同一性的多核苷酸序列或其互补序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述编码人IL-33的外源基因为SEQ IDNO.1所示的序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒上还携带有用于表达治疗消化道癌的蛋白活性成分。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白活性成分为p53。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体、用于治疗癌症的其他活性成分。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述其他活性成分是紫杉醇。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，药学上可接受的载体包括促进重组溶瘤痘苗病毒加工成制剂的赋形剂和助剂。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的形式为固体或注射液。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述消化道癌包括胃癌、结肠癌和胰腺癌。