CN111154772B

CN111154772B - 梨糖转运基因PbSWEET4及其应用

Info

Publication number: CN111154772B
Application number: CN202010083362.7A
Authority: CN
Inventors: 吴俊�; 泥江萍; 李甲明; 张绍铃; 朱荣香; 刘海楠; 薛程; 张明月; 刘月园; 李晓龙
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-02-09
Filing date: 2020-02-09
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-02-09
Also published as: CN111154772A

Abstract

本发明公开了梨糖转运基因PbSWEET4及其重组表达载体的应用。一种分离自砀山酥梨具有糖外排功能的结构基因PbSWEET4，该基因的核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。将本发明所述的基因PbSWEET4转化到二倍体森林草莓并进行功能验证，以野生型草莓作为对照，获得的转基因草莓植株叶片蔗糖含量显著降低，并且叶片呈现出早衰的现象。表明本发明所克隆的PbSWEET4基因是编码糖转运蛋白的功能结构基因，具有外排可溶性糖的功能，在叶片糖积累中起负调控作用，同时还参与调控叶片的衰老进程。

Description

梨糖转运基因PbSWEET4及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨糖转运基因PbSWEET4及其重组表达载体和应用。具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个参与梨糖转运相关的SWEEET家族成员PbSWEET4基因及其应用。

背景技术

梨(Pyrus)是蔷薇科(Rosaceae)梨属(PyrusL.)多年生落叶果树，在世界范围内广泛种植，具有重要的经济和社会价值。梨果实的食用品质是决定其价值的重要因素,因此提高梨的食用品质具有重要的意义。梨果实食用品质受诸多因素影响,其中糖是果实品质构成的重要指标之一，提高梨果实的糖含量,对梨品质改善至关重要。近年来,我国梨的主栽品种由于品种退化或是管理不善等原因,出现果实含糖量下降、风味变淡等问题，严重影响果实品质和经济价值。因此,梨果实糖含量的品质改良已经成为现代梨育种的重要目标之一。然而在梨果实糖含量的研究大多集中在不同梨品种糖含量的评估上，对于糖相关基因的功能研究亟待加强。

糖首先由叶片通过光合作用合成，然后通过韧皮部以共质体途径或质外体途径运输至库中(Oparka,1990)。叶片作为植物产生糖的主要场所，对多数植物的生长必不可少。叶片衰老是叶片发育的最后阶段，也是落叶果树生命周期的重要组成部分。该过程涉及一系列有序的变化，包括大分子(例如蛋白质)降解、营养物质向活跃生长的器官(如嫩叶，发育中的种子和果实)的运输等。叶片衰老决定果实的产量和品质。如果衰老发生得过早，则植物吸收CO₂的总能力会降低，最终导致光合效率下降(Wingler et al.,2006)。反之，则衰老相关的养分循环就会受到抑制(Himelblau and Amasino,2001)，这对于果实的发育具有重要影响。在拟南芥中，抑制AtTOR(雷帕霉素靶蛋白)和SID2(缺失水杨酸合成酶基因)的表达导致叶片早衰且减少了种子的产量，而过表达NahG(表达水杨酸羟化酶并能够水解水杨酸)的转基因植株也表现为叶片衰老和种子减产(Deprost et al.,2007；Abreu andMunne-Bosch,2009)。另外，过表达SlNAP2(NAC基因家族促进衰老基因)的转基因番茄植株呈现叶片早衰，进而导致果实产量和可溶性糖含量下降(Ma et al.,2018)。RNA干扰INVINH1(转化酶抑制剂)转基因番茄中细胞壁转化酶活性升高，延迟了叶片衰老，同时提高了种子重量和糖含量(Jin et al.,2009)。综上，叶片发育对于果实的产量和品质至关重要。然而，目前有关叶片衰老对果实品质影响的调控机制研究还比较欠缺。因此，进一步探讨叶片衰老与糖代谢的关系，对揭示叶片衰老对果实品质影响的机制、改善梨果实品质具有重要的理论和现实意义。

众所周知，糖可以参与信号转导、维持渗透压、组成碳骨架，或者以特定形式贮存在果实中。除此之外，糖还在逆境胁迫中起着重要作用。糖含量由合成、降解、转运和贮存等过程共同决定,其中转运是较为关键的过程(Katz et al.,2007)。目前，已经发现三类真核生物的糖转运蛋白，分别是：葡萄糖转运蛋白(GLUT)，钠葡萄糖转运蛋白(SGLTs)和SWEETs(Chen et al.,2015)，其中SWEET是一类新发现的糖转运蛋白。目前尚未见梨中SWEET功能的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种具有糖外排和促进衰老功能SWEET基因。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种分离自梨具有糖外排功能的结构基因PbSWEET4，属于SWEET基因家族。该基因的核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，包含918bp的开放阅读框；编码305个氨基酸，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，等电点为7.17，分子量为34.2KDa。

含有本发明所述PbSWEET4基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选以pMDC32为出发的载体，将权力要求1所述基因PbSWEET4通过Gateway反应插入pMDC32所得。

含有本发明所述PbSWEET4基因的宿主菌。

克隆本发明所述PbSWEET4基因cDNA序列的引物对，上游引物PbSWEET4-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PbSWEET4-R1序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述PbSWEET4的重组表达载体在促进梨叶片糖外排和衰老中的应用。

所述的应用，构建所述的梨糖转运基因PbSWEET4的植物超表达载体并转化二倍体森林草莓，以野生型草莓作为对照，获得的转基因草莓植株叶片蔗糖含量显著降低，并且叶片呈现出早衰的现象。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1.PbSWEET4基因的发现，为促进梨糖分转运的分子育种和实现绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现农业友好。

2.本发明构建PbSWEET4基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将梨PbSWEET4基因转化二倍体草莓，获得的转基因植株经生物学功能分析，表明本发明克隆的PbSWEET4基因促进草莓叶片糖的外排，同时促进叶片衰老。通过对该基因的超表达或，可以起到调节转基因植物叶片可溶性糖和衰老的作用。

附图说明：

图1为本发明克隆的梨PbSWEET4基因在不同梨品种叶片发育过程中的表达模式分析。(A)：‘丰水’(Pyrus pyrifolia N.cv.Hosui)；(B)：‘库尔勒香梨’(Pyrussinkiangensis Yu)；(C)：‘鸭梨’(Pyrus bretschneideri Rehd.cv.Yali)；(D):‘南果’(Pyrus ussuriensis Maxim)。以‘丰水’、‘库尔勒香梨’、‘鸭梨’和‘南果’梨为试材，分析PbSWEET4基因在不同发育程度(图中的1-4代表由幼嫩到成熟的程度)的叶片中的表达模式。

图2为本发明克隆的梨PbSWEET4基因2kb启动子控制下的转基因拟南芥在不同发育时期GUS染色定性分析结果。(A)：播种后14天；(B)：播种后18天；(C)：播种后30天；(D)：播种后42天。

图3为本发明克隆的梨PbSWEET4基因在烟草表皮细胞的亚细胞定位结果图。(A)：35S::YFP(对照)在荧光下的成像；(B)：35S::YFP(对照)在明场下的成像；(C)：(A)、(B)叠加后的成像；(D)：35S::YFP-PbSWEET4在荧光下的成像；(E)：35S::YFP-PbSWEET4在明场下的成像；(F)：(D)、(E)叠加后的成像。

图4为过表达PbSWEET4基因对草莓叶片生长的影响。(A)：PbSWEET4转基因植株的鉴定。(B)：过表达PbSWEET4基因植株与野生型对照；(C)：过表达PbSWEET4基因植株与野生型叶片对照。

图5为过表达PbSWEET4基因对草莓叶片可溶性糖和叶绿素含量的影响。(A)：PbSWEET4基因在草莓植株中过量表达对叶片可溶性糖的影响；(B)：PbSWEET4基因在草莓植株中过量表达对叶片叶绿素的影响。*表示转PbSWEET4基因株系与野生对照的差异达显著水平(P≤0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。

实施例1，梨PbSWEET4基因在梨叶片发育过程中的表达模式分析。

从‘砀山’梨叶片中提取RNA，RNA的提取采用CTAB法(Gasic et al.,2004)，经DNase I(Invitrogen)消化去除RNA中的基因组DNA污染，然后通过TOYOBO反转录试剂盒(购自TakaRa公司，按照试剂盒说明书操作)，使用1μg的RNA来进行第一链cDNA的合成。经反转录得到的第一链cDNA用于PbSWEET4的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。用梨PbTublin(Pbr042345.1)作为内参对照，引物的核苷酸序列如下：

正向引物TUB-F:5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’(SEQ ID No.5)

反向引物TUB-R:5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(SEQ ID No.6)

利用Primer 5.0在PbSWEET4基因的开放阅读框内设计基因特异的qRT-PCR引物对,引物的核苷酸序列如下：

正向引物PbSWEET4-F2:5’-GAGTGCCGTTATGTGGTTTGC-3’(SEQ ID No.7)

反向引物PbSWEET4-R2:5’-TCCTGCTTTCGGTTTCGGTA-3’(SEQ ID No.8)

qRT-PCR采用SYBR Green试剂盒(购自Roche公司，按照试剂盒说明书操作)。20μLqRT-PCR反应体系包括：10μL 2×SYBR Premix ExTaq，0.25μL正向引物，0.25μL反向引物，0.3μLcDNA，9.2μL无菌双蒸水。使用96孔qRT-PCR板(购自Roche公司)，运用qRT-PCR仪(型号：LightCycler 480，Roche公司)进行PCR。qRT-PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸20秒，40个热循环。每个样品重复3次，计算出每个cDNA样品的平均Ct值，再通过2^-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)计算出PbSWEET4基因的相对表达量。

前人的研究结果表明，PbSWEET4在叶片发育后期表达量较高(Li et al.,2017)，为了验证是否这一现象普遍存在于梨叶片中，我们检测了PbSWEET4在不同品种的梨叶片中的表达模式。图1为PbSWEET4在不同发育时期不同品种梨叶片中的表达模式图。如图所示，随着叶片的发育进程，PbSWEET4在四个不同的梨品种中都表现出相同的表达模式：在嫩叶中的表达量较低，在成熟叶片中表达显著增加(图1)。根据以上结果，我们推测PbSWEET4可能与叶片发育相关。

实施例2，梨PbSWEET4基因及其启动子的克隆及载体构建

1.梨叶片总RNA的提取、cDNA合成的方法同实施例1。扩增PbSWEET4的正向引物序列为PbSWEET4-F1：5’-ATGGCTACAGTAGCAGACAGTCAC(SEQ ID No.3)，反向引物序列为PbSWEET4-R1：5’-TCACACTGCTGATGGTGTTTCAT(SEQ ID No.4)。用于基因克隆的高保真DNA聚合酶(

Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1))购自诺唯赞生物科技公司。扩增的反应体系为50μL，其中包括cDNA 200ng，2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，10μM上述引物各2μL，加ddH₂O至50μL。PCR反应在Eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司，中国)回收特异PCR扩增片段，步骤参照使用说明。采用TA克隆技术将回收纯化的DNA插入至TOPO载体中。采用热击法转化至DH5α大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞中(购自百斯凯科技有限公司，中国)，并在含有100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中进行培养，筛选阳性克隆，进行扩繁并测序(由生工生物工程股份有限公司完成)。测序正确的质粒通过LR酶将带有PbSWEET4全长序列的TOPO载体重组到pMDC32(用于草莓转化)和pEarlyGate104(用于亚细胞定位)过表达载体中，再次采用热击法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中进行培养，筛选阳性克隆，进行扩繁并测序。测序结果表明，PbSWEET4基因全长为918bp，其核酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示，该基因编码305个氨基酸，等电点为7.17，分子量为34.2KDa。BLAST的结果分析证明从梨中新得到的基因为一个SWEET基因家族成员，并且关于这个基因的具体功能研究还未见相关文献报道，因此，我们将这个基因命名为PbSWEET4。重组载体分别命名为pMDC32-PbSWEET4和pEarlyGate104-PbSWEET4。

2.采用CTAB法(陈林杨et al.,2014)从‘砀山’梨叶片中提取DNA，用于PbSWEET4基因上游启动子的扩增(2kb)。扩增PbSWEET4启动子的正向引物是pPbSWEET4-F3：5’-TAGCTGAGGATGGTCAATGGGTTTA(SEQ ID No.9)，反向引物是pPbSWEET4-R3：5’-ACCCTTTCCAGAAAATCAGCACACTGA(SEQ ID No.10)。用于启动子克隆的高保真DNA聚合酶(

Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1))购自诺唯赞生物科技公司。扩增的反应体系为50μL，其中包括cDNA 200ng，2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，10μM上述引物2μL，加ddH2O至50μL。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸2分钟，35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司，中国)回收特异扩增片段，步骤参照使用说明。采用TA克隆技术将回收纯化的DNA插入至TOPO载体中。采用热激法转化DH5α大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞中(购自百斯凯科技有限公司，中国)，并在含有100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中进行培养，筛选阳性克隆，进行扩繁并测序(由生工生物工程股份有限公司完成)。测序正确的质粒通过LR酶将带有PbSWEET4启动子序列的TOPO载体重组到pMDC107过表达载体中，再次采用热激法转化大肠杆菌，并在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中进行培养，筛选养性克隆，进行扩繁并测序。得到的核酸序列如序列表SEQ ID No.11所示，重组载体命名为pMDC107-pPbSWEET4。

实施例3，梨PbSWEET4基因2kb启动子控制下的转基因拟南芥在不同发育时期GUS染色定性分析

PbSWEET4启动子载体pMDC107-pPbSWEET4的构建方式同实施例1。通过冷冻－融化方法将最终的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101中，然后在带有50μg/mL卡那霉素,100μg/mL利福平的LB固体培养基中培养，然后用10mL灭菌离心管将鉴定正确的农杆菌菌株扩大繁殖，直至OD₆₀₀值为1-1.2左右，6000rpm离心10min收集菌液。然后通过蘸花法将该载体转化野生型拟南芥植株(Clough and Bent,1998)。使用GUS染液(购自索莱宝，中国)，按照说明书对拟南芥从4片莲座叶完全发育(播种后14天)到拟南芥完全成熟(播种后42天)的四个时期进行染色。最后，用25％，50％，70％，95％的乙醇洗脱植物并观察。

PbSWEET4pro::GUS揭示了拟南芥植物发育每个阶段的GUS活性。随着拟南芥叶片的发育，染色程度不断加深，说明成熟叶片中GUS活性高于幼叶(图2)，表明PbSWEET4启动子在老叶中具有更高的活性，这与PbSWEET4在叶片发育过程中的表达模式相符。

实施例4，PbSWEET4基因的亚细胞定位

pEarlyGate104-PbSWEET4载体的构建方法同实施例1。通过冷冻-融化方法将最终的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101中，然后在带有50μg/mL卡那霉素,100μg/mL利福平的LB培养基中培养，然后用10mL灭菌离心管将鉴定正确的农杆菌菌株扩大繁殖，直至OD₆₀₀值为1-1.2左右，6000rpm离心10min收集菌液。根据Sperschneider的方法(Sperschneider etal.，2017)具体操作步骤如下：将收集的农杆菌重悬于侵染液(10mM MgCl₂、10mM EMS，pH5.7、200mM乙酰丁香酮)中，最终OD₆₀₀为0.8-1.2。然后，将重悬的菌液放在室温(25℃)的摇床上诱导4小时，之后将重悬液用1mL注射器注射至3-4周龄小叶烟草叶背面。将注射后的烟草在22℃下培养3-4天后，使用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM 700，Germany)观察注射后的烟草叶片表皮细胞，拍照并保存片。

图3为PbSWEET4的亚细胞定位图。在35S-PbSWEET4-YFP融合载体的细胞膜上可观察到YFP信号，而空载对照在细胞质和细胞核中显示荧光(图3)。我们的结果表明，PbSWEET4编码膜蛋白。

实施例5，草莓的遗传转化

农杆菌介导的草莓遗传转化方法参照Slovin等人的方法(Slovin et al.,2009)，具体操作步骤如下：

1.茎和叶柄的消毒灭菌：先在70％乙醇中消毒30秒，然后用无菌水洗涤3遍，再用1％次氯酸钠(20％漂白剂)消毒10分钟，最后用无菌水洗涤4遍。

2.根癌农杆菌的培养：按照实施例1构建pMDC32-PbSWEET4载体，通过冷冻－融化方法将最终的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101中，然后在带有50μg/mL卡那霉素,100μg/mL利福平的LB培养基中培养，然后用10mL灭菌离心管将鉴定正确的农杆菌菌株在50mL液体培养基中，28℃、220rpm过夜培养，直至OD₆₀₀值为0.5左右。

3.侵染转化：将事先培养好的农杆菌6000rpm离心10min收集菌液，然后用共培养液体培养基(1×MS，pH 5.8，2％蔗糖，50μM乙酰丁香酮)重悬沉淀至OD₆₀₀为0.1，将重悬的农杆菌转至无菌锥形瓶，将外植体浸入加入菌液的共培养培养基，并在室温下孵育20分钟。然后用无菌滤纸吸干并转移到固体培养基中(表1)，在25℃的黑暗环境中培养两天。

潮霉素筛选抗性芽：在含有4mg/L潮霉素B的筛选培养基上选择转基因芽。在冷白荧光灯下，在16小时光照，8小时黑暗光周期下再生外植体。每天检查外植体是否有污染，每2周进行继代培养。

生根诱导与移栽：当草莓外植体形成不同的枝条芽时，将整个团块转移至无激素的生根培养基中，该培养基由0.5×MS培养基(pH 5.8)，1％葡萄糖和1％琼脂粉组成。在几天到一个月内形成根，然后可以从新芽中解剖出单个植株。从生根培养基中取出根系生长良好的草莓再生植株，用自来水将其根系冲洗干净，并移栽至营养土中，25℃自然光照生长。

表1.草莓遗传转化体系所用培养基

实施例6，PbSWEET4转基因草莓植株的鉴定和生理指标的测定

1.阳性植株的筛选

按照实施例5上述方法得到草莓再生植株，并按照实施例1中所述方法提取野生型草莓和转基因草莓叶片的总DNA。

阳性植株的鉴定步骤如下：用PbSWEET4扩增引物(正向引物1和反向引物1，如SEQID No.7和SEQ ID No.8所示)对上述DNA进行PCR扩增鉴定阳性苗，以未作侵染转化的草莓叶片的DNA作为对照。PCR反应程序与体系按照实施例1中所述方法进行。如图4-A所示，未做侵染转化的草莓叶片未扩增出目的条带，能扩增出目的条带的再生草莓植株被初步鉴定为阳性转基因草莓株系。

2.PbSWEET4基因过表达对草莓植株生长的影响

与野生型草莓植株相比，处于相同生长时期的PbSWEET4转基因草莓植株出现叶片早衰表型，主要表现为叶片边缘黄化(图4)。表明本发明克隆的梨PbSWEET4基因能够使叶片提早衰老。

3.PbSWEET4基因过表达对草莓叶片可溶性糖含量的影响

以野生型草莓叶片作为对照，测定了PbSWEET4转基因草莓植株叶片的可溶性糖含量。

可溶性糖的提取步骤如下：参照刘伦等人(Liu et al.,2016)的方法，具体操作步骤如下：准确称取5.0g叶片于预冷的研钵，用液氮研磨成粉末，转移至10mL试管后，加入8mL80％乙醇，37℃水浴25分钟(每5分钟摇动混匀)，超声波充分提取10分钟，12000rpm离心10分钟，将上清转移至25mL容量瓶中，重复以上步骤三次并定容。取2mL提取液,用旋转蒸发器(型号：RE-3000,上海亚荣生化仪器厂)蒸干,然后用1mL无菌双蒸水溶解,最后用0.45μm的水系滤器过滤,滤液即用于测定可溶性糖的含量。可溶性糖含量的测定采用高效液相色谱法,仪器为高效液相色谱UPLC ACQUITY H-Class(Waters),流动相为乙腈(1％氨水)：水＝85:15，流速为0.2mL/min，柱温45℃，进样时间15分钟，进样体积2μL；检测器为ELSD，载气为氮气，压强为25Psi，漂移管55℃，喷雾器25℃；色谱柱为UPLC ACQUITY BEH Amide 1.7um2.1*100mm。根据样品峰面积和各碳水化合物的标准曲线计算其含量。分析结果表明,与野生型草莓叶片相比，转基因草莓的蔗糖含量显著降低。

4.PbSWEET4基因过表达对草莓叶片叶绿素的影响

叶绿素随着叶片的衰老而降解(Hortensteiner,2006)，因此为了进一步验证梨PbSWEET4基因对叶片衰老的作用，我们以野生型草莓叶片作为对照，用叶绿素仪(购自柯尼卡美能达，型号为SPAD-502)测定了30片转基因草莓叶片的叶绿素含量(即SPAD值)，并绘制了箱型图(图5)。分析结果表明，PbSWEET4转基因草莓叶片的叶绿素含量显著低于野生对照。

综合分析表明，PbSWEET4过表达草莓株系叶片中的蔗糖含量和叶绿素含量显著降低，植株叶片出现早衰的现象,表明梨PbSWEET4基因具有促进糖外排，同时促进叶片衰老的功能。

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序列表

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<120> 梨糖转运基因PbSWEET4及其应用

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<210> 1

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<212> DNA

<213> ‘砀山’梨(Pyrus)

<400> 1

atggctacag tagcagacag tcaccatcct ttggcattta catttggagt tctaggaaat 60

ctagtctcaa ccatggttta cttagcccca gtgccgacat tttatcgaat ttacaggaaa 120

aaatcgacag aaggattcca ctcggtgcca tatctggtag caatgttcag ttccatgctt 180

tggttctatt atgcgtcgct aaaaaagaat gctatgctgc tcatcaccat taactcattc 240

ggaagttttg cagagatgac ctacatcgtc atcttcgttg tgtatgcacc aagggatgct 300

aggaagctta cagtgaaatt atttggtatt atgaacgtgg gacttttcac cttgatcctt 360

gtcgtgtctc actttctagt gagtcgtgcg taccgggtcc cagttcttgg atggattaat 420

gttgccattt ctaccagtgt ttttgctgcg cccttaagca ttgtggcaca agttatccga 480

acaagaagtg tcgaattcat gccatttagg ttatcatttt tcctcactct gagtgccgtt 540

atgtggtttg catatggatt gttcctcaag gacatatgta ttgcaattcc aaacgttctg 600

ggttttgtgt tgggactgct tcagatgctg ctgtatgcga tgtaccgaaa ccgaaagcag 660

gagatactag aagatcatga gaaaaagcta ccggctgcta caccagatca cgtgaacaac 720

attgtgatca tagccacatt agcagcttcc gaggttcatc cggtggatgc tcaaccgaac 780

aatcgcaatg atgatggtga cgttaataat aacgcggtcg ttacagaggc aaaggagcat 840

gaacaaacgg atgatcatcg tcatgtggaa aatgcttccg tcgagcttca acctaatgaa 900

acaccatcag cagtgtga 918

<210> 2

<211> 305

<212> PRT

<213> ‘砀山’梨(Pyrus)

<400> 2

Met Ala Thr Val Ala Asp Ser His His Pro Leu Ala Phe Thr Phe Gly

1 5 10 15

Val Leu Gly Asn Leu Val Ser Thr Met Val Tyr Leu Ala Pro Val Pro

20 25 30

Thr Phe Tyr Arg Ile Tyr Arg Lys Lys Ser Thr Glu Gly Phe His Ser

35 40 45

Val Pro Tyr Leu Val Ala Met Phe Ser Ser Met Leu Trp Phe Tyr Tyr

50 55 60

Ala Ser Leu Lys Lys Asn Ala Met Leu Leu Ile Thr Ile Asn Ser Phe

65 70 75 80

Gly Ser Phe Ala Glu Met Thr Tyr Ile Val Ile Phe Val Val Tyr Ala

85 90 95

Pro Arg Asp Ala Arg Lys Leu Thr Val Lys Leu Phe Gly Ile Met Asn

100 105 110

Val Gly Leu Phe Thr Leu Ile Leu Val Val Ser His Phe Leu Val Ser

115 120 125

Arg Ala Tyr Arg Val Pro Val Leu Gly Trp Ile Asn Val Ala Ile Ser

130 135 140

Thr Ser Val Phe Ala Ala Pro Leu Ser Ile Val Ala Gln Val Ile Arg

145 150 155 160

Thr Arg Ser Val Glu Phe Met Pro Phe Arg Leu Ser Phe Phe Leu Thr

165 170 175

Leu Ser Ala Val Met Trp Phe Ala Tyr Gly Leu Phe Leu Lys Asp Ile

180 185 190

Cys Ile Ala Ile Pro Asn Val Leu Gly Phe Val Leu Gly Leu Leu Gln

195 200 205

Met Leu Leu Tyr Ala Met Tyr Arg Asn Arg Lys Gln Glu Ile Leu Glu

210 215 220

Asp His Glu Lys Lys Leu Pro Ala Ala Thr Pro Asp His Val Asn Asn

225 230 235 240

Ile Val Ile Ile Ala Thr Leu Ala Ala Ser Glu Val His Pro Val Asp

245 250 255

Ala Gln Pro Asn Asn Arg Asn Asp Asp Gly Asp Val Asn Asn Asn Ala

260 265 270

Val Val Thr Glu Ala Lys Glu His Glu Gln Thr Asp Asp His Arg His

275 280 285

Val Glu Asn Ala Ser Val Glu Leu Gln Pro Asn Glu Thr Pro Ser Ala

290 295 300

Val

305

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctacag tagcagacag tcac 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacactgct gatggtgttt cat 23

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggctttgc tcctcttac 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcctgctttc ggtttcggta 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagtgccgtt atgtggtttg c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcctgctttc ggtttcggta 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tagctgagga tggtcaatgg gttta 25

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accctttcca gaaaatcagc acactga 27

<210> 11

<211> 2000

<212> DNA

<213> ‘砀山’梨(Pyrus)

<400> 11

ccctttccag aaaatcagca cactgaccta cagttctggc ttttggggtg aggaaaagaa 60

acttattttt cccaaatttg tcaaaatatc aacctaccta gcttagatta ctaatcaagc 120

acttggttga atatactgct caaattaaaa gtctgaaaaa cgcacgtatc aattagctct 180

taatttagct gtatttatct ttccaaatta gaaaatgtct caagttcaca tttcttgtta 240

tttcctcatt aatcaatgac gagttgttag tctagttatg aaacttgttt aaattttatc 300

atgcttacgt cgcgccttct cattgatcaa taacgagttg ttactctaat attattaaag 360

taacataact tataaaggat ctaaactcca gaaaaataaa agtatatcgc aaccaaatca 420

cacaaattaa tgaacgtcga tggaaatagc catgtacata tctagcaatc tgtccaaagg 480

ctcccagggt gtccacctag cattctcgaa tcccagccaa atgatagaga caagaacgag 540

taacaacatc atgattgtct tgtggctcat ctttaattat tcttttgtca taacttaaaa 600

cctccctccc tccgtcccca tctcataacc gcaaaaaata tgaaaaaagc tggccaggct 660

gcttggattg tggaatttga ttacttgaag aagaaaaaag tcagtcagat gaacccccga 720

tgcacacgaa accctctaaa tattgcatga acattgaagc actaccaaac aaacattcaa 780

cggcatagaa caaaagcttt gtgaacaata ttgtaaatct ttgagtgtgt gacttggaaa 840

gattgtttgt tgtaattgaa atattgtcag gttgtgttat tcaattcaat ttataataag 900

tatatttatt tgtgaggctc tacaagttga acatatcaaa tttgttgtct atattcttaa 960

gaaattatta ttgtcatttc aagaatttaa ttgtgcaatc caaactttct atatttaaaa 1020

aaatttatga gaagtgcata attaattttt ttagattgct aataataata atttattatt 1080

attataacac gtcgtggcaa gtgttccgag agtatatata tacaactata ttgtctgcgt 1140

gtgacttgtg agaatttaca agtgacaact agggctgaag cctgacgcgc caaggcgtgt 1200

ttcgtttagg gttttagaag atggagagaa acggtccaaa caatggccat acagtatgca 1260

ctagtgcttg gaattagaga tatagaagtc acgtgaatcg ggctctactc tggacagctt 1320

tgcggtctta gaagagatga gtaacgtaaa aaatcatatt cttattttag ttggaagaag 1380

ccacttgttt tttttttcaa agagcgtgga attcatgttt gattagaaaa aactcataaa 1440

aaattagtaa attagtgtcg attaaccaaa actataacta tataactctt cctaattcgc 1500

agttatggtg aaattaatta tttgaataat tatggtgatg atttggggga ctaccctaat 1560

tcctatccaa agtagtgtca agaagtgtgg tgaataatgc tctgcttttt ttttcttttt 1620

ttcttttttt ttgtggccgt tggatggagg ttacgcacac gtgatagagg ggcacgtgga 1680

acttggattt gtggttcatt gaatgagttc gttgagtagc ttttcattgt acgggaacat 1740

gacctggtac accaaatgtt ataatactag tgatttgata ttaaattttt ttttcccaat 1800

cacttgtatt atgacacttg atgtattaga cagtgttccc ggcacattga aaaaattctc 1860

gagagcatgg tacaccacct actaatcctc catctgtcat gcagccacaa tgagttcaat 1920

acgcacaccc tatttctttt tctttcactt tttgtgtgta tataaacaag ctgcgtaaac 1980

ccattgacca tcctcagcta 2000

Claims

1.核酸序列如SEQ ID No.1所示的基因PbSWEET4在调节草莓叶片可溶性糖和衰老中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于构建含所述梨糖转运蛋白基因PbSWEET4的植物超表达载体并转化二倍体森林草莓，以野生型草莓作为对照，获得的转基因草莓植株的叶片蔗糖含量显著降低，并且叶片呈现出早衰的现象。

3. 含有核酸序列如SEQ ID No.1所示的基因PbSWEET4的重组表达载体在降低草莓叶片可溶性糖含量和促进叶片衰老中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体，其特征在于以pMDC32为出发的载体，将权利要求1所述基因PbSWEET4通过Gateway反应插入pMDC32所得。