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CN111122535B - 一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统 - Google Patents

一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种对分子振动模式的高光谱快速成像系统，包括：光梳光源，用于产生作为宽场相干拉曼散射过程的泵浦光、斯托克斯光和探测光；宽场相干拉曼散射显微光路，用于将所述光梳光源产生的光形成大光斑光束照射样品，使样品在相干拉曼散射效应作用下产生反斯托克斯光信号；以及高速面阵光电探测器，用于收集来自于所述样品发出的反斯托克斯光信号，并进行快速高光谱成像。本发明能够同时进行光谱测量和成像，并大幅度提高成像速度，满足活体生物样品的成像要求。

Description

一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统
技术领域
本发明涉及相干拉曼散射显微成像领域，尤其涉及一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统。
背景技术
相干拉曼散射是一种基于分子振动能级的非线性光学过程，对分子官能团的振动和转动具有指纹识别能力，非常适合进行无标记生物成像，而且相对于具有同样功能的红外光谱具有更高的空间分辨率。其主要包括相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS)和受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering，SRS)。与自发拉曼散射相比，其通过相干激励极大地增强了拉曼信号，具有较高的探测灵敏度。
相干反斯托克斯拉曼散射是一种三阶非线性光学过程，通过共振激发大大提高了单分子探测的灵敏度。CARS显微镜系统通常采用一束波长可调谐激光作为泵浦光ωp，另外一束固定波长光作为斯托克斯光ωS。可以通过扫描泵浦波长测量分子的振动光谱，也可以将泵浦光调谐至共振频率，在2ωp-ωS探测进行CARS成像。CARS信号强度高,并且CARS信号的波长相对于激发光蓝移，因此CARS显微成像技术能够在高荧光背景条件下工作，并具有较高的探测灵敏度。与使用光栅光谱仪获得拉曼信号并采用逐点扫描的方式进行成像的显微拉曼成像技术相比，CARS成像过程中不测量振动光谱，而只对某一振动频率(ωp-ωS)进行成像，极大地提高了成像速度，在活体细胞和组织成像方面也获得了广泛的应用。
作为两大类重要的光学分析研究技术，光谱技术和光学显微技术具有各自的侧重点。光谱技术以分析样品的功能及变化为主，而光学显微镜以观察其空间分布为主。近期，兼具这两种技术优势的高光谱成像技术受到大家的广泛关注。高光谱成像就是在光谱维度上对图像进行详细分割。振动光谱具有分子指纹识别能力，因此，对分子振动模式的高光谱成像可以同时检测生命体内多种功能分子的变化，将极大的推动生命科学领域研究方法学的革新。但是，到目前为止尚不存在一种可以对生物分子振动模式高光谱成像，而且成像速度能够满足进行活体生物样品观测(秒量级)的显微成像方法。要实现此目的，必须要有光谱和显微成像方法学上的创新。
近年发展起来的光梳光谱技术为此提供了一种新思路。光梳频域上整齐分布着一系列间距相等、数量众多的光谱谱线，是进行光谱分析的天然精密“刻线”，而且每个“刻线”宽度都极其窄细，这提供了极高的光谱分辨率。利用光梳作为光源，提供激发样品所需的泵浦光、斯托克斯光和探测光，将光电探测器采集到的时域干涉图样进行傅里叶变换数据处理后即可获得分子的超精细光谱。2013年，T.Ideguchi等人将双光梳与CARS光谱测量与成像技术联用，证明了采用双光梳技术对分子振动模式的高光谱成像的可行性。2016年，清华大学K.Chen等人利用在此技术基础上与显微成像方式相结合，实现了对植物表面结构的高光谱相干拉曼显微成像。但是，由于其采用了逐点扫描成像方式，该方法仍然具有扫描像素少、成像时间长等缺点，无法满足活体生物样品快速成像的要求。
因此需要一种能够快速进行光谱测量和成像的对分子振动模式的高光谱成像测量系统。
发明内容
针对上述现有技术的缺点，本发明提出了一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统，该系统利用光梳作为相干拉曼散射显微成像光路的光源，采用大光斑照射样品，并通过光学干涉的方式在面阵光电探测器上同时进行快速的光谱测量和二维成像。通过将光梳光源与宽场相干拉曼散射成像光路相结合，利用两束具有相位延时的大光斑光束同时照射样品表面，在相干拉曼效应作用下，产生反斯托克斯光信号，并通过面阵光电探测器进行探测与成像；面阵探测器上的每个像素点输出的是反斯托克斯光信号，通过对该信号随时间的变化记录下来，再经过傅里叶变换即可获取该像素点对应的样品位置处的光谱信息；从而可以实现对分子振动模式的高光谱快速成像测量。
实现本发明的具体技术方案是：
一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统包括：
光梳光源，用于产生作为宽场相干拉曼散射过程的泵浦光、斯托克斯光和探测光；
宽场相干拉曼散射显微光路，用于将所述光梳光源产生的光形成大光斑光束照射样品，使样品在相干拉曼散射效应作用下产生反斯托克斯光信号；以及
高速面阵光电探测器，用于收集来自于所述样品反斯托克斯光信号，并进行快速高光谱成像。
优选地，所述光梳光源由单光梳、反射镜、分束镜和含控制相位的延迟线装置的迈克尔逊干涉仪构成。
优选地，所述光梳光源由双光梳、反射镜和分束镜构成。
优选地，其特征在于，根据待测样品的不同，所述宽场相干拉曼散射显微光路采用前向或背向探测方式获得样品的反斯托克斯光信号。
优选地，所述前向探测方式中，所述宽场相干拉曼散射显微光路依次由第一显微镜、第二显微镜、高通滤波片和聚焦透镜构成，所述样品位于第一显微镜和第二显微镜之间。
优选地，所述背向探测方式中，所述宽场相干拉曼散射显微光路依次由分束镜、显微镜、高通滤波片和聚焦透镜构成，所述样品位于所述显微镜后。
优选地，对所述相干拉曼散射成像中高速面阵光电探测器的每个像素收集到的不同时间的反斯托克斯光信号进行傅里叶变换，可获得该像素对应的振动光谱，即实现对分子振动模式的高光谱成像。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明与传统的CARS显微成像相比，通过光梳光源与宽场相干拉曼散射显微光路，能够实现快速的高光谱成像。
2、本发明通过面阵光电探测器进行快速成像，将大大提高成像速度，满足活体生物样品的成像要求。
附图说明
图1是本发明实施例1的一种对分子振动模式的高光谱成像测量系统的结构示意图。
图2是本发明实施例2的一种对分子振动模式的高光谱成像测量系统的结构示意图。
图3是本发明实施例3的一种对分子振动模式的高光谱成像测量系统的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式，其目的仅在于更好地理解本发明的研究内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1
如图1所示，为本发明的实施例1的一种对分子振动模式的高光谱成像测量系统，包括：光梳光源，用于产生作为宽场相干拉曼散射过程的泵浦光、斯托克斯光和探测光；宽场相干拉曼散射显微光路，用于将所述光梳光源产生的光形成大光斑光束照射样品，使样品在相干拉曼散射效应作用下产生反斯托克斯光信号；以及高速面阵光电探测器，用于收集来自于所述样品发出的反斯托克斯光信号，并进行快速高光谱成像。
所述光梳光源由单光梳11、分束镜13和含控制相位的延迟线装置的迈克尔逊干涉仪14构成。单光梳11产生的光经过分束镜13进行分光后进入迈克尔逊干涉仪14。其中，迈克尔逊干涉仪14包括参考臂和扫描臂。迈克尔逊干涉仪14参考臂上的光经过第一反射镜12a反射，扫描臂上的光经过控制相位的延迟线装置141。控制相位的延迟线装置141包括色散元件142、聚焦元件143以及扫描镜144、第二反射镜12b。色散元件142例如光栅，聚焦元件例如聚焦透镜。色散元件142、聚焦元件143以及扫描镜144构成一个4f系统。在4f系统中，色散元件142以及扫描镜144的枢轴位置分别位于聚焦元件143的一倍焦距f处，色散元件142距离扫描镜144枢轴位置的距离刚好为2f。扫描镜144所在的平面也称为傅里叶变换平面，使得经过色散后的光束的每个光谱成分能够在扫描镜144的位置上实现空间分离。实现空间分离的光束，再次经过聚焦元件143，聚焦到色散元件142处，形成一个完整的4f系统。经过4f系统的光通过第二反射镜12b进行反射，并沿同一路径返回。通过改变扫描镜144的枢轴位置和扫描角频率，可以调整延迟线装置141所增加的相位延迟和群延迟，从而实现任意改变奈奎斯特定理权衡制约下的扫描速度、光谱宽带和光谱分辨率。
迈克尔逊干涉仪12的参考臂和扫描臂上的这两束具有一定延迟时间的光，分别作为宽场相干拉曼散射显微成像光路的泵浦光、斯托克斯光和探测光，进入宽场相干拉曼散射显微光路2，以前向探测的相干拉曼散射光路的方式照射样品，在样品处产生空间重叠的光信号。
本实施例中，宽场相干拉曼散射显微光路为前向探测的宽场相干拉曼散射显微光路。该光路依次由第一显微镜15、第二显微镜16、高通滤波片17、聚焦透镜18构成。样品19位于第一显微镜15和第二显微镜16之间。第一显微镜15将两束平行光聚焦到样品19处。根据透镜成像规律，通过调整显微镜的放大倍数以及样品19与第一显微镜15之间的距离，可以使光斑在样品处放大成像，从而实现大光斑光束照射样品。在相干拉曼散射效应作用下，样品19产生的反斯托克斯光信号通过第二显微镜16变成平行光。反斯托克斯光信号比原来的光信号的频率高，因此可以通过高通滤波片17将反斯托克斯光信号与原来的光信号进行分离。该反斯托克斯光信号进一步通过聚焦透镜18，聚焦入射到高速面阵光电探测器20上进行快速成像。该反斯托克斯光信号携带了样品分子的振动模式的信息，能够实现样品的振动光谱测量和相干拉曼散射成像。
高速面阵光电探测器20收集该反斯托克斯光信号并进行快速成像。对高速面阵光电探测器的每一像素收集到的不同时间的反斯托克斯光信号进行傅里叶变换，即可得到相对应的振动光谱，实现对分子模式的高光谱成像。
与共聚焦的方式对样品进行成像相比，本发明的宽场相干拉曼散射显微光路可以实现大光斑光束照射样品。另外，本发明的快速面阵光电探测器，与点阵光电探测器或者线阵光电探测器相比，能够获得更高的光通量和像素分辨率。每个像素点都能够收集到随着时间变化的反斯托克斯光信号，因此本发明能够在短时间内多通道地对样品被大光斑光束照射的整个区域进行信号收集和成像，使成像速度大大提高，从而满足活体生物样品的成像要求。
实施例2
如图2所示，为本发明的实施例2的一种对分子振动模式的高光谱成像测量系统，包括：光梳光源，用于产生作为宽场相干拉曼散射过程的泵浦光、斯托克斯光和探测光；宽场相干拉曼散射显微光路，用于将所述光梳光源产生的光形成大光斑光束照射样品，使样品在相干拉曼散射效应作用下产生反斯托克斯光信号；以及高速面阵光电探测器，用于收集来自于所述样品发出的反斯托克斯光信号，并进行快速高光谱成像。
与实施例1不同的是，本实施例中光梳光源由双光梳21(即光梳1和光梳2)、反射镜22、分束镜23构成。双光梳光源的重复频率f1和f2有微小差异Δf，满足f2＝f1±Δf，每一台光梳均可作为宽场相干拉曼散射显微成像光路的泵浦光、斯托克斯光和探测光。由于两个光梳脉冲序列的重复频率不同，因此在时间上呈现为一脉冲序列对另一序列的延时扫描，其效果等效于迈克尔逊干涉光谱仪，其不同之处在于此时无需机械扫描与脉冲延时控制，从而可以实现快速的拍频。双光梳产生的光，分别经过反射镜22和分束镜23，产生空间重叠的光信号。这两束有一定时间延迟但空间重叠的光，进入宽场相干拉曼散射显微光路2，以前向探测的相干拉曼散射光路的方式照射样品，在样品处产生空间重叠的光信号。
本实施例中，宽场相干拉曼散射显微光路为前向探测的宽场相干拉曼散射显微光路。该光路依次由第一显微镜15、第二显微镜16、高通滤波片17、聚焦透镜18构成。样品19位于第一显微镜15和第二显微镜16之间。第一显微镜15将两束平行光聚焦到样品19处。通过调整样品19与第一显微镜15之间的距离，可以实现大光斑光束照射样品。在相干拉曼散射效应作用下，样品19产生的反斯托克斯光信号通过第二显微镜16变成平行光。反斯托克斯光信号比原来的光信号的频率高，因此可以通过高通滤波片17将反斯托克斯光信号与原来的光信号进行分离。该反斯托克斯光信号进一步通过聚焦透镜18，聚焦入射到高速面阵光电探测器20上进行快速成像。该反斯托克斯光信号携带了样品分子的振动模式的信息，能够实现样品的振动光谱测量和相干拉曼散射成像。
高速面阵光电探测器20收集该反斯托克斯光信号并进行快速成像。对高速面阵光电探测器的每一像素收集到的不同时间的反斯托克斯光信号进行傅里叶变换，即可得到相对应的振动光谱，实现对分子模式的高光谱成像。
本实施例的双光梳的CARS光谱快速成像测量系统中，相干信号的出现周期(即光谱数据更新速率的倒数)为：1/Δf。将双光梳的相干信号随时间的变化记录后，经过傅里叶变化，可获得CARS光谱，相应光谱的分辨率为A·(f1/Δf)/t/c，单位为cm-1，其中，c为光速，t为相干信号的时间长度，A为傅里叶变换选用的切趾窗函数对应的系数(为常数)。双光梳CARS中，若采用光梳光谱谱宽为Δω(单位为cm-1)，则可测量的拉曼信号谱范围为：0-Δω。
实施例3
如图3所示，为本发明的实施例3的一种对分子振动模式的高光谱成像测量系统，包括：光梳光源，用于产生作为宽场相干拉曼散射过程的泵浦光、斯托克斯光和探测光；宽场相干拉曼散射显微光路，用于将所述光梳光源产生的光形成大光斑光束照射样品，使样品在相干拉曼散射效应作用下产生反斯托克斯光信号；以及高速面阵光电探测器，用于收集来自于所述样品发出的反斯托克斯光信号，并进行快速高光谱成像。
本实施例中的光梳光源为双光梳光源，与实施例2相同，在此不再赘述。
本实施例中，与实施例1和2不同的是，根据不同的待测样品，在宽场相干拉曼散射显微成像光路中，以背向探测的方式照射样品。实施例1和2中前向探测的光路能够以较小的光功率激发样品，适用于能够产生较大振动信号的分子的成像。而背向探测的光路则对尺寸接近或小于光波长的待测样品具有很强的探测灵敏度。背向探测的宽场相干拉曼散射显微光路依次由第二分束镜31、显微镜32、高通滤波片33和聚焦透镜34构成。所述样品位于所述显微镜32后。不同于前向探测时，样品产生的反斯托克斯光信号以透射的方式到达样品后的显微镜。背向探测的光路中，样品产生的反斯托克斯光信号将以反射的方式，再次经过样品前的显微镜32。
具体地，双光梳光源产生的两束光经过第二分束镜31反射到显微镜32，显微镜32透过的光到达样品35。在相干拉曼效应作用下，样品35产生的反斯托克斯光信号和原来的光信号一起透过第二分束镜31，再通过高通滤波片33将反斯托克斯光信号和原来的光信号分离。并通过聚焦透镜34将反斯托克斯光信号聚焦到高速面阵光电探测器20上进行快速成像。对高速面阵光电探测器20的每一像素收集到的不同时间的反斯托克斯光信号进行傅里叶变换，即可得到相对应的振动光谱，从而能够实现对分子模式的高光谱成像。
显然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，上述实施例仅用于说明本发明，而并非用作对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对上述实施例的变化、变型均不排除在本发明的权利要求书范围之外。

Claims (6)

1.一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统，其特征在于，包括：
光梳光源，用于产生作为宽场相干拉曼散射过程的泵浦光、斯托克斯光和探测光；
宽场相干拉曼散射显微光路，用于将所述光梳光源产生的光形成大光斑光束照射样品，使样品在相干拉曼散射效应作用下产生反斯托克斯光信号；以及
高速面阵光电探测器，用于收集来自于所述样品发出的反斯托克斯光信号，并对所述高速面阵光电探测器中每个像素收集到的不同时间的反斯托克斯光信号进行傅里叶变换，从而获得所述每个像素对应的振动光谱，因此实现对分子振动模式的高光谱成像。
2.根据权利要求1所述的一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统，其特征在于，所述光梳光源由单光梳、分束镜和含控制相位的延迟线装置的迈克尔逊干涉仪构成。
3.根据权利要求1所述的一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统，其特征在于，所述光梳光源由双光梳、反射镜和分束镜构成。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统，其特征在于，根据待测样品的不同，所述宽场相干拉曼散射显微光路采用前向或背向探测方式获得样品的反斯托克斯光信号。
5.根据权利要求4所述的一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统，其特征在于，所述前向探测方式中，所述宽场相干拉曼散射显微光路依次由第一显微镜、第二显微镜、高通滤波片和聚焦透镜构成，所述样品位于第一显微镜和第二显微镜之间。
6.根据权利要求4所述的一种对分子振动模式的高光谱快速成像测量系统，其特征在于，
所述背向探测方式中，所述宽场相干拉曼散射显微光路依次由分束镜、显微镜、高通滤波片和聚焦透镜构成，所述样品位于所述显微镜后。
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