CN111118029B

CN111118029B - 一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6及其应用

Info

Publication number: CN111118029B
Application number: CN202010063470.8A
Authority: CN
Inventors: 徐立安; 叶友菊; 胥猛; 倪州献; 黄彬; 辛月; 田雅婷
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111118029A

Abstract

本发明公开了一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述的调控马尾松开花的关键基因PmARF6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其表达的蛋白产物氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，为马尾松ARF转录因子。本发明通过转化拟南芥，得到超表达PmARF6基因的拟南芥，其植株的开花显著延迟，说明了PmARF6基因维持营养生长、抑制生殖转变(开花)，为马尾松开花的负调控因子，可应用于调控植物营养生长与生殖生长时间：过表达该基因，营养生长时间延长或生殖生长时间推迟；敲除该基因，营养生长时间缩短或生殖生长时间提前。该基因在林木育种领域有重要应用价值。

Description

一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6及其应用。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana Lamb.)为我国特有树种。它分布广、适应性强、生长快、用途大，是我国南方的主要造林树种与重要的工业树种。马尾松不仅可以作为重要的制浆造纸原料，其花粉也具有较高的经济价值，已被广泛的应用于药品、化妆品和饲料添加剂等领域。马尾松的扩大繁殖方式主要是通过有性繁殖进行，而人们大规模获取遗传改良的种子，主要是依靠马尾松种子园建设来实现的。自1980年以来建立的众多马尾松无性系种子园，由于童期长，雌球花、雄球花的着生量不均衡，花期同步性不长，难以为大面积造林提供足够的优质种子。研究其开花规律是良种生产研究的重要内容之一，可以优化种子园建设，提高花粉和种子产量，可望创造更大的经济利益。

生长素转录因子(Auxin response factors，ARFs)是与早期生长素应答基因启动子中TGTCTC应答元件结合的转录因子。ARF基因在拟南芥中得到了克隆，其后ARF家族的许多成员在其他植物中也已有报道。目前已经发现ARF基因在水稻中有48个、玉米有62个、毛杨98个、桉树17个。之前对拟南芥ARF基因家族的研究表明，ARF基因在不同器官中特异性表达从而调控生长，主要表达于成熟器官中，包括根、莲座叶、茎叶和花。ARF在植物开花中起着重要作用。例如，ARF5参与维管发育，ARF7参与下胚轴向光性、引力性和顶端维护等不同生长反应。此外，ARF3对于雌蕊生长素依赖模式的形成也是必要的。ARF6的一些研究表明，ARF6通过生长素信号参与多种调控活动。AtARF6在所有花器官的多个花期均有表达，在调节花的成熟过程中起着至关重要的作用AtARF6在所有花器官的不同时期均有表达，在调控花的成熟过程中起着至关重要的作用。

开花发育既是植物器官发生和形态形成中最为基本的理论问题，又是植物器官繁殖方面重要的实践问题，因此成为近年来植物功能研究的一个热点。可以看出，ARF在调控植物开花方面存在复杂的调控模式，一些ARF转录因子被鉴定为开花调控的关键因子。ARF基因家族在植物开花发育过程中起着非常重要的作用。目前，尚未有马尾松的ARF转录因子相关报道，克隆和开发利用马尾松ARF转录因子，在马尾松中克隆和开发利用这些基因资源，不仅有助于阐明植物开花发育的分子调节机制，而且可以为马尾松开花遗传育种提供理论基础和分子工具，促进林业优良品系的快速繁殖和获得高产高质的种子，有提高种子园产量的重要应用价值，对林业的发展具有不可估量的价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6。本发明所要解决的另一技术问题提供所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6的载体、重组菌或宿主细胞。本发明所要解决的最后技术问题在于提供前述调控马尾松开花的关键基因PmARF6的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6的载体、重组菌或宿主细胞。

进一步地，所述载体为植物重组表达载体。

进一步地，所述植物重组表达载体为PBI121GW-PmARF6。

进一步地，所述PBI121GW-PmARF6在PmARF6基因的5＇端组装启动子P35S。

进一步地，所述PBI121GW-PmARF6含有attR1和attR2元件、LB和RB序列或卡那霉素抗性基因NPTII。

所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6在调控植物营养生长时间与生殖生长时间中的应用。

进一步地，所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6在调控植物营养生长时间与生殖生长时间中的应用，包括以下步骤：

1)构建调控马尾松开花的关键基因PmARF6的载体；

2)将所构建的调控马尾松开花的关键基因PmARF6的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到营养生长时间延长或生殖生长时间推迟的植株。

进一步地，调控马尾松开花的关键基因PmARF6在调控植物营养生长时间与生殖生长时间中的应用，所述植物为马尾松，所述应用包括以下步骤：

1)制备调控马尾松开花的关键基因PmARF6敲除载体；

2)敲除马尾松中调控马尾松开花的关键基因PmARF6；

3)培育筛选，得到营养生长时间缩短或生殖生长时间提前的马尾松植株。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本申请公开了一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6，将PmARF6基因转入拟南芥，植株的抽薹开花显著延迟，其总体表现出维持营养生长、抑制生殖转变(开花)的功能特征，说明了PmARF6基因为马尾松开花的负调控因子，可应用于调控植物营养生长与生殖生长时间：在植物中过表达该PmARF6基因，营养生长时间延长或生殖生长时间推迟，开花时间推迟；在马尾松中敲除该基因，营养生长时间缩短或生殖生长时间提前，开花时间提前。

植物中，营养生长为生殖生长提供所需养分，生殖生长为下一代的营养生长提供条件，另外又相互制约，营养生长与生殖生长存在养分的竞争，当营养生长过旺时则生殖生长受到抑制，当生殖生长过旺时，则营养生长不良。因此，借助于植物基因工程，利用本发明提供的PmARF6基因能按需处理植物的营养生长与生殖生长的关系，在植物育种领域，尤其林木育种领域有重要应用价值。

附图说明

图1是植物超表达载体PBI121GW的结构示意图；

图2是PmARF6在马尾松原生质体中的亚细胞定位图；

图3是转基因拟南芥DNA中PmARF6检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；

图4是超表达PmARF6的拟南芥的苗期发育(右为野生型对照)图；

图5是超表达PmARF6基因的拟南芥形态(野生型为对照)图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：通过RACE技术克隆PmARF6基因

基于马尾松RNA-seq数据的PmARF6序列，设计5＇和3＇的RACE引物，通过巢式PCR扩增两段特异性产物，通过T-载体克隆测序，测序结果通过重叠区拼接，得到cNDA全长。

具体如下：

I.引物设计

3＇RACE正向引物为：

Outer Primer F：5＇-CGCCGTGCTGCTGAGAAAGTGT-3＇；

Inner Primer F：5＇-ATGACATTACAGCCGTTAAA-3＇：

3＇RACE反向引物为：

Outer PrimerR：5＇-GAGATTGGGATGATGAGAGCTG-3＇；

Inner PrimerR：5-＇GAATTCATAGAGAACCCAGA-3＇；

5＇RACE正向引物为

Outer PrimerF：5＇-GAGATTGGGATGATGAGAGCTG-3＇；

Inner PrimerF：5＇-GAATTCATAGAGAACCCAGA-3＇：

5＇RACE反向引物为：

Outer Primer R：5＇-CGCCGTGCTGCTGAGAAAGTGT-3＇；

Inner Primer R：5＇-ATGACATTACAGCCGTTAAA-3＇；

II.3＇RACE反应过程：

(1)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：

1μg Total RNA，4μL dNTP Mix，2μL 3＇RACE Adapter，2μL 10×RT Buffer，1μLRNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补至20μL。

(2)轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物；

(3)3＇RACE巢式PCR；

Outer 3＇RACE反应体系(50μL)为：5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μLMgCl₂(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，2.0μL 3＇RACE Outer PrimerF(10μM)，2.0μL 3＇RACE Outer PrimerR(10μM)，1μL RT reaction product，0.5μL TakaRa LA Taq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。

Inner 3＇RACE反应体系(50μL)为：5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μLMgCl₂(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，2.0μL 3＇RACE Inner PrimerF(10μM)，2.0μL 3＇RACE Inner PrimerR(10μM)，1μL Outer 3＇RACE PCR product，0.5μL TakaRa LATaq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。

反应程序：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃7min。

(4)纯化片段与克隆载体的连接反应

采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进。

反应体系(5μL)：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19Simple Vector，2.5μLSolution I。反应条件：16℃30分钟；4℃过夜。

(5)大肠杆菌转化

1)将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；

2)取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；

3)42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；

4)加入800μL LB液体培养基，37℃&100rmp摇菌1h；

5)4000rmp离心3min，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；

6)将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜；

7)阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。

反应体系(20.0μL)：2.0μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺free)，1.5μL MgCl₂(25mM)，1.3μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，1.0μL 3＇RACE gene specific inner primer(10μM)，1.0μL 3＇RACE Inner Primer(10μM)，0.1μL菌液，1.0μL rTaq，12.1μL Milli-Q Water。反应程序：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃7min。

菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定。

III.5’RACE反应程序

(1)RNA处理(RNA Processing)

1)CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：

10μg Total RNA，2μL 10×CIP buffer，2μL Calf Intestine AlkalinePhosphatase(CIP)，Nuclease-free Water补足至20μL。

2)轻轻混匀，短暂离心；37℃温育1h；

3)加入以下试剂到CIP反应离心管：

15μL Ammonium Acetate Solution，115μL Nuclease-free Water，150μL acidphenol：chloroform。

4)充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5min；

5)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL氯仿，充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5min；

6)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL异丙醇，充分涡旋，冰浴10min；

7)最大转速离心20min，用0.5mL预冷的70％乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀；

8)以11μL Nuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存；

9)TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：

5μL CIP’d RNA(from f above)，1μL 10×TAP buffer，2μL Tobacco AcidPyrophosphatase(TAP)，2μL Nuclease-free Water；

10)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得CIP/TAP-treated RNA；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物；

11)5＇RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：

2μL CIP/TAP-treated RNA，1μL 5＇RACE Adapter，1μL 10×RNA Ligase Buffer，2μL T4 RNA Ligase(2.5U/μL)，4μL Nuclease-free Wate.

12)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

(2)反转录(Reverse Transcription)

1)将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中；

2μL Ligated RNA，4μL dNTP Mix，2μL Random Decamers，2μL 10×RT Buffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补足至20μL.

2)轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1h，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物；

3)5＇RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3＇RACE的巢式PCR一致。

IV.ORF扩增

对3＇RACE和5＇RACE序列进行拼接，并利用NCBI-ORF finder工具预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行PmARF6基因的全长克隆。其中，PmARF6 ORF正向引物：5＇-ATGACATTACAGCCGTTAAA-3＇，PmARF6 ORF反向引物：5＇-GAATTCATAGAGAACCCAGA-3＇，高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer5.0μL；2.5mMdNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg²⁺5.0μL；LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL；正向引物(10μM)2μL；反向引物(10μM)2μL；模板(柽柳cDNA)1μL；加无菌ddH₂O补足50μL。反应程序：预变性94℃3分钟-(94℃40秒-55℃30秒-72℃30秒)×35个循环-72℃10分钟。

PmARF6全长cDNA序列为3013bp，其序列如SEQ ID No.1所示，包含一个2043bp的完整阅读框，对应的PmARF6蛋白的氨基酸序列为681aa，其序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：PmARF6基因植物稳定表达载体PBI121GW构建

利用通路克隆技术构建PmARF6基因的过量表达载体。使用特异PCR引物(实施例1的PmARF6 ORF引物)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将PmARF6基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR8/GW/TOPOTM vector(Invitrogen)。反应体系为：Fresh PCR product(purified)10-20ng；Salt solution 1μL；pCR8/GW/TOPOTM vector 1μL；加无菌ddH2O补足6μL。反应程序为：室温静置30分钟。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行测序验证，阳性入门载体与植物表达载体PBI121GW进行LR反应。载体质粒如图1所示。反应体系为：入门载体100ng；PBI121GW vector(100ng/μL)1.5μL；LR Clonase II enzyme mix 2μL；加TE(pH 8.0)补足10μL。反应条件：25℃1小时。经LR反应后，PmARF6基因导入植物表达载体PBI121GW中。PBI121GW组装有通路克隆attR1和attR2元件，快速组装PmARF6基因表达框并确保准确翻译；组装有LB和RB序列，促使组装于其间的PmARF6基因和筛选标记基因NPTII整合至侵染的拟南芥染色体中。另外，在PmARF6基因的5＇端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PmARF6高效表达。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为PBI121GW-PmARF6，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PmARF6可在植物体内高效表达。

实施例3：PmARF6基因植物瞬时表达载体P2FGW构建

PmARF6基因植物表达载体P2FGW实施步骤同实施例2，本实施例中植物表达载体为P2FGW，所构建的瞬时转化载体为P2FGW-PmARF6。

实施例4：PmARF6基因在马尾松中亚细胞定位

取5-25天马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用；配制5mL组合酶液体：0.6M甘露醇、20mM MES、50mM KCl、组合酶，10mM CaCl₂和0.1M％BSA；配制完成后利用0.45μm滤膜过滤灭菌。灭菌完成后将细条状针叶放入酶液中浸透，28℃静置4-6h。酶解时间达到后，在反应液中加入与酶液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心5min，吸出上清，再加入1-2mL W5溶液，轻柔摇匀，并用血球计数板计数；置于冰上黑暗静置15min，使原生质体沉于管底吸出上清，并加入MMG或WI将原生质体溶液的细胞浓度稀释成10⁴-10⁶个/mL，并重悬；在EP管中加入5-25μg P2FGW-PmARF6质粒，获得原生质体悬混液后加入110μL 20-50wt％PEG溶液；轻柔混匀，室温孵育15-45min；加入1mL W5溶液，混匀后于1000rpm水平离心5min，吸出上清；并加入100μL WI溶液，并于25℃暗培16-24h。暗培结束后于荧光显微镜下进行观察。图2为P2FGW-PmARF6转化进马尾松原生质体后的荧光观测结果，说明PmARF6为马尾松细胞核定位。

实施例5：PmARF6基因在拟南芥中遗传转化

通过液氮冻融法将所构建的过量表达载体PBI 121GW-PmARF6转入农杆菌菌株EHA105，通过农杆菌的花絮侵染法将PmARF6基因转入野生型拟南芥，在卡那抗生素的MS固体培养基上筛选阳性拟南芥，图3为拟南芥转基因检测，6株拟南芥DNA中均检测到PmARF6插入片段，证实得到超表达PmARF6的阳性拟南芥；通过阳性拟南芥的种子发芽率测定、苗期观测和植株表型观察，探究其基因功能。

与野生型相比，超表达PmARF6拟南芥的种子萌发率无明显差异，且苗期发育进度和表型相似(图4)，推测PmARF6基因不影响前期生长发育(营养生长期)；图5为超表达PmARF6拟南芥植株表型，与野生型相比，基因拟南芥抽薹较晚、开花延迟，说明PmARF6基因过量表达导致开花受到显著抑制，推测马尾松PmARF6基因通过抑制营养生长向生殖转变，负调控植物开花。在应用层面，PmARF6及其过量表达技术可以作为高效的分子工具维持植物营养生长进程。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6及其应用

<130> 100

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3013

<212> DNA

<213> Pinus massoniana Lamb.

<400> 1

tctgctgctg taattgctgt tgggagccgt gttgtatatt ttcctcaagg tcacagtgag 60

caggtggctg cctcaacaaa caaggaggtt gatgctcaca ttcctaacta tccaaatctt 120

ccaccacaat taatctgcca gctacacaat gttactctgc aggcagatgt ggagacagat 180

gaagtatatg ctcaaatgac attacagccg ttaaacactc aagagcaaaa ggagtcttat 240

ctagctcctg atattggcac gcaaagcaga cagccaacta attacttctg taaaacgcta 300

acagcaagtg acaccagcac tcatggtgga ttctcaattc cacgccgtgc tgctgagaaa 360

gtgtttccac cactggattt cactcagcag cctcctgttc aagagcttgt tgctagggat 420

cttcatgaca atgagtggaa atttcggcat atttatcggg gtcagcccaa gcggcatctg 480

ctgacaacag gatggagtgt atttgttagt gcaaagagac tcagtgctgg tgatgctgtg 540

ctttttatta ggaatgagaa aggacagtta ctgctgggaa tcaggcgagc aaaccgatcc 600

caaacagtta tgccatcatc agtgctgtcc agtgatagca tgcacatagg tgttcttgcg 660

gctgcagctc atgctgcttc aacaaattgc cgcttcacta ttttctacaa tccaagggca 720

agtccatcag aatttgtcat accattgtct aagtatgaaa aggcagttta tcacacacga 780

gtttcagttg gaatgcgctt ccggatgctg tttgagacag aagaatcaac tgtacgaagg 840

tacatgggta caattactgg cataggtgac ttggatcctg ctcgctggcc aaattcacaa 900

tggcgttcaa ttaaggttgg ttgggatgaa tcaacggcag gtgagaggca gccacgagta 960

tctttgtggg agattgaacc tttgaccacg tttctgatgt atcccccacc ctatcctcta 1020

ggactaaaac gatcatggcc gcaactacaa ggaataactt ctctttatgg cagtgatgat 1080

ggcagtttca ggaggccatt catgtcagag aggggggata atggggagca aggccttcag 1140

accttgaatt ttcaaacaat aagtatggat ccatggatgc agatgcagca aagatttgaa 1200

ccttctttat cagggatcca gtccactgca taccatggaa tgcctacaac tgtcttgcag 1260

cagacaggga atcttaatca atcgaaacag ctgaagtttc agccgcagca gcctgtacag 1320

tctgaacaac ttcagtgcag gccgcaggta caattaccaa ggaatgttat tgagcaacaa 1380

caacagcatc agcttcagca gcaagttgtt aacttagagc aacatcaacc acaaaatcat 1440

cttttgcaac agcaattaca gcagcagaca ttgcagcaac aagcagtgca tcagcagctg 1500

cagaatgcaa ttaatgaaca gcagcagtca tcatttcagc atcaacaaaa caagcaacag 1560

gcatttcaag ttccaaatgt cgtcagttca ttcacacagc tctcatcatc ccaatctcag 1620

tctccattaa gtgatatttc ttctgtgacc tcacgaccag tctttacaaa tactggtgct 1680

accattgcct cacctaagag ctcatctagt gcatctcctt tacaaagcat cttagactca 1740

ttgacttcag agggagcttc tacctattta agtgtgcccc gaccaagtca atctgttgtg 1800

cagcaaccag ctgaaacttg gtcttgcgtt actcaggatc agcaagttgc tgcaccatgg 1860

ttttcttcca aaagaatgtc aactaatcag attccttgtc ttccatctgg tcagactgaa 1920

gcctctcttc ctactggtag tcatcgtatc ctgtcccaaa ctgaacctaa aagtcagact 1980

aatgttccag cccaatcaat gccactgcct caatttcctt taagagattg tcctacagaa 2040

caggaaggag tccagtctga ttcccagagc aatcttcttt ttggtgttaa tatagataac 2100

ccaactttgg ctattcctga tacggtttct agtgcaaagg aatgtgggca atggtgctta 2160

tgtagccagt tcattttctg ttacggactt actgaatgtg cctccttgtg ctcctgtctc 2220

tgggttctct atgaattcta acatgggtgt gtctggaggt ctagatgaaa gtgggttttc 2280

acagcctccc accaaatttt gcaaagatga atgctcccac gagaacattc actaaggttt 2340

acaagttagg ttctgttggg aggtcagtgg atgtaacacg tttcaggggc tatccagatc 2400

tgcgtgccga gcttgaccgt atgtttggtc tagaaggcca gctggagaac ccaagatcaa 2460

actggcaact tgtatttgtt gacaaggaga aggatgttct tccccttggg gatgatcctt 2520

gggaggagtt tgtcaataat gttcgattta ttaagatact atctccccca gaagtgcaac 2580

agatgagtca ggaagatttg gagttttgga gttttattcc aacccaacaa cagacaaaca 2640

gtagttcaga agactgtgta actagaaatt cttctcccaa caacagttca gttctcccat 2700

cggctggatc cctggagtat taagtgtagt tcaattgtac tatatcccca gttttgttgt 2760

gtctttaaag ggggctcgta aaaaatgaga tgtacttcaa ttcataactc ttaggtatcc 2820

cccataatat gttcgtccag gatatttaaa tgatgaagtg gtatttagcg tcattttctt 2880

tgattgaagt tgataacttg ctccattgtt ttagaaccgt atttgaaaaa aattcccttg 2940

tatccctgtt tatactcccg ttttatcttt tgttgcaaga atgaataatt ttttactcct 3000

gaaaaaaaaa aaa 3013

<210> 2

<211> 681

<212> PRT

<213> Pinus massoniana Lamb.

<400> 2

Met Thr Leu Gln Pro Leu Asn Thr Gln Glu Gln Lys Glu Ser Tyr Leu

1 5 10 15

Ala Pro Asp Ile Gly Thr Gln Ser Arg Gln Pro Thr Asn Tyr Phe Cys

20 25 30

Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe Ser Ile

35 40 45

Pro Arg Arg Ala Ala Glu Lys Val Phe Pro Pro Leu Asp Phe Thr Gln

50 55 60

Gln Pro Pro Val Gln Glu Leu Val Ala Arg Asp Leu His Asp Asn Glu

65 70 75 80

Trp Lys Phe Arg His Ile Tyr Arg Gly Gln Pro Lys Arg His Leu Leu

85 90 95

Thr Thr Gly Trp Ser Val Phe Val Ser Ala Lys Arg Leu Ser Ala Gly

100 105 110

Asp Ala Val Leu Phe Ile Arg Asn Glu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Gly

115 120 125

Ile Arg Arg Ala Asn Arg Ser Gln Thr Val Met Pro Ser Ser Val Leu

130 135 140

Ser Ser Asp Ser Met His Ile Gly Val Leu Ala Ala Ala Ala His Ala

145 150 155 160

Ala Ser Thr Asn Cys Arg Phe Thr Ile Phe Tyr Asn Pro Arg Ala Ser

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Val Ile Pro Leu Ser Lys Tyr Glu Lys Ala Val Tyr

180 185 190

His Thr Arg Val Ser Val Gly Met Arg Phe Arg Met Leu Phe Glu Thr

195 200 205

Glu Glu Ser Thr Val Arg Arg Tyr Met Gly Thr Ile Thr Gly Ile Gly

210 215 220

Asp Leu Asp Pro Ala Arg Trp Pro Asn Ser Gln Trp Arg Ser Ile Lys

225 230 235 240

Val Gly Trp Asp Glu Ser Thr Ala Gly Glu Arg Gln Pro Arg Val Ser

245 250 255

Leu Trp Glu Ile Glu Pro Leu Thr Thr Phe Leu Met Tyr Pro Pro Pro

260 265 270

Tyr Pro Leu Gly Leu Lys Arg Ser Trp Pro Gln Leu Gln Gly Ile Thr

275 280 285

Ser Leu Tyr Gly Ser Asp Asp Gly Ser Phe Arg Arg Pro Phe Met Ser

290 295 300

Glu Arg Gly Asp Asn Gly Glu Gln Gly Leu Gln Thr Leu Asn Phe Gln

305 310 315 320

Thr Ile Ser Met Asp Pro Trp Met Gln Met Gln Gln Arg Phe Glu Pro

325 330 335

Ser Leu Ser Gly Ile Gln Ser Thr Ala Tyr His Gly Met Pro Thr Thr

340 345 350

Val Leu Gln Gln Thr Gly Asn Leu Asn Gln Ser Lys Gln Leu Lys Phe

355 360 365

Gln Pro Gln Gln Pro Val Gln Ser Glu Gln Leu Gln Cys Arg Pro Gln

370 375 380

Val Gln Leu Pro Arg Asn Val Ile Glu Gln Gln Gln Gln His Gln Leu

385 390 395 400

Gln Gln Gln Val Val Asn Leu Glu Gln His Gln Pro Gln Asn His Leu

405 410 415

Leu Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Thr Leu Gln Gln Gln Ala Val His

420 425 430

Gln Gln Leu Gln Asn Ala Ile Asn Glu Gln Gln Gln Ser Ser Phe Gln

435 440 445

His Gln Gln Asn Lys Gln Gln Ala Phe Gln Val Pro Asn Val Val Ser

450 455 460

Ser Phe Thr Gln Leu Ser Ser Ser Gln Ser Gln Ser Pro Leu Ser Asp

465 470 475 480

Ile Ser Ser Val Thr Ser Arg Pro Val Phe Thr Asn Thr Gly Ala Thr

485 490 495

Ile Ala Ser Pro Lys Ser Ser Ser Ser Ala Ser Pro Leu Gln Ser Ile

500 505 510

Leu Asp Ser Leu Thr Ser Glu Gly Ala Ser Thr Tyr Leu Ser Val Pro

515 520 525

Arg Pro Ser Gln Ser Val Val Gln Gln Pro Ala Glu Thr Trp Ser Cys

530 535 540

Val Thr Gln Asp Gln Gln Val Ala Ala Pro Trp Phe Ser Ser Lys Arg

545 550 555 560

Met Ser Thr Asn Gln Ile Pro Cys Leu Pro Ser Gly Gln Thr Glu Ala

565 570 575

Ser Leu Pro Thr Gly Ser His Arg Ile Leu Ser Gln Thr Glu Pro Lys

580 585 590

Ser Gln Thr Asn Val Pro Ala Gln Ser Met Pro Leu Pro Gln Phe Pro

595 600 605

Leu Arg Asp Cys Pro Thr Glu Gln Glu Gly Val Gln Ser Asp Ser Gln

610 615 620

Ser Asn Leu Leu Phe Gly Val Asn Ile Asp Asn Pro Thr Leu Ala Ile

625 630 635 640

Pro Asp Thr Val Ser Ser Ala Lys Glu Cys Gly Gln Trp Cys Leu Cys

645 650 655

Ser Gln Phe Ile Phe Cys Tyr Gly Leu Thr Glu Cys Ala Ser Leu Cys

660 665 670

Ser Cys Leu Trp Val Leu Tyr Glu Phe

675 680

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 3'RACE Outer Primer F(Artificial)

<400> 3

cgccgtgctg ctgagaaagt gt 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 3'RACE Inner Primer F(Artificial)

<400> 4

atgacattac agccgttaaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 3' RACE Outer PrimerR(Artificial)

<400> 5

gagattggga tgatgagagc tg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 3' RACE Inner PrimerR(Artificial)

<400> 6

gaattcatag agaacccaga 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 5'RACE Outer PrimerF(Artificial)

<400> 7

gagattggga tgatgagagc tg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 5'RACE Inner PrimerF(Artificial)

<400> 8

gaattcatag agaacccaga 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 5'RACE Outer Primer R(Artificial)

<400> 9

cgccgtgctg ctgagaaagt gt 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 5'RACE Inner Primer R(Artificial)

<400> 10

atgacattac agccgttaaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> PmARF6 ORF正向引物(Artificial)

<400> 11

atgacattac agccgttaaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> PmARF6 ORF反向引物(Artificial)

<400> 12

gaattcatag agaacccaga 20

Claims

1.一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。

2.权利要求1所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID No .2所示。

3.含有权利要求1所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6的载体或重组菌。

4.根据权利要求3所述的载体或重组菌，其特征在于：所述载体为植物重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的载体或重组菌，其特征在于：所述植物重组表达载体为PBI121GW-PmARF6。

6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于：所述PBI121GW-PmARF6在PmARF6基因的5'端组装启动子P35S。

7.权利要求1所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6在调控植物营养生长时间与生殖生长时间中的应用。

8.根据权利要求7所述调控马尾松开花的关键基因PmARF6在调控植物营养生长时间与生殖生长时间中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建调控马尾松开花的关键基因PmARF6的过表达载体；

2)将所构建的调控马尾松开花的关键基因PmARF6的载体转化到植物中；

9.根据权利要求7所述的调控马尾松开花的关键基因PmARF6在调控植物营养生长时间与生殖生长时间中的应用，其特征在于，所述植物为马尾松，所述应用包括以下步骤：

1)制备调控马尾松开花的关键基因PmARF6敲除载体；

2)敲除马尾松中调控马尾松开花的关键基因PmARF6；