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CN111100851B - 醇脱氢酶突变体及其在手性双芳基醇化合物合成中的应用 - Google Patents

醇脱氢酶突变体及其在手性双芳基醇化合物合成中的应用 Download PDF

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CN111100851B
CN111100851B CN201811252380.2A CN201811252380A CN111100851B CN 111100851 B CN111100851 B CN 111100851B CN 201811252380 A CN201811252380 A CN 201811252380A CN 111100851 B CN111100851 B CN 111100851B
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Abstract

本发明公开了醇脱氢酶突变体及其在手性双芳基醇化合物合成中的应用。本发明的醇脱氢酶突变体是将位于醇脱氢酶TbSADH的催化中心口袋中的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质，具体是将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第39位和/或第42位和/或第84位和/或第85位和/或第86位和/或第104位和/或第110位和/或第294位的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。本发明应用定向进化技术和方法对醇脱氢酶TbSADH进行了酶改造，获得了对以(4‑氯苯基)吡啶‑2‑甲酮为代表的双芳基酮类有酶活的一系列突变体，并将其应用于光学纯手性双芳基醇化合物的生物催化合成中。

Description

醇脱氢酶突变体及其在手性双芳基醇化合物合成中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及应用定向进化技术和方法对来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶进行酶改造获得的醇脱氢酶突变体以及这些突变体作为生物催化剂在不对称还原制备光学纯手性双芳基醇化合物中的应用。
背景技术
手性双芳基仲醇作为一类重要的砌块结构可用于多种手性药物的合成，而且由前手性双芳基酮经不对称还原反应合成手性双芳基醇的工艺具有原子经济性高的优点。其中，(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇是一种抗组胺药物合成手性前体，可用来合成抗组胺类药物卡比沙明(Barouh et al.,J.Med.Chem.,1971,14(9):834-836)和苯磺酸贝他斯汀(Takahashi et al.,Clin.Exp.Dermatol.,2004,29(5):526-532)。
目前，化学法不对称还原合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的方法主要有：以2-腈基吡啶为起始底物在4-氯苯溴化镁、浓硫酸和金属催化剂Pd(Phe3P)4等的作用下经三步合成，ee值可以达到98％，但是其中吡啶环上的N-基团需要进行保护和去保护(Corey&Helal,Tetrahedron Letters,1996,37(32):5675-5678)。近几年来使用较多的还有Noyori有机金属催化剂，如：Ru和Rh复合体等可通过直接加氢还原前手性酮底物(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮为手性醇，ee值达到97-99％(Tao et al.,J.Org.Chem.,2012,77(1):612-616；Yang etal.,Org.Lett.,2015,17(17):4144-4147)。虽然这些化学合成法可以获得高ee值的产物，但是整个过程需要用到诸如浓硫酸、H2(8-10bar)、高压和有机金属试剂等，不仅会对环境造成伤害，而且劳动保护要求较高。
生物法不对称还原合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的方法主要有：利用藻酸钙固定化面包酵母通过不对称还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮合成相应的产物，或者通过选择性水解(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇醋酸酯获得手性产物(Takemoto&Achiwa,Chem.Pharm.Bull.,1994,42(4):802-805；Takemoto et al.,Phytochemistry,1996,42(2):423-426)，但是(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇产物的ee值只有28％。同时该作者也报道了利用固定化植物细胞催化前手性酮(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的研究，ee值最高达到48％(Takemoto et al.,Phytochemistry,1996,42(2):423-426；Takemoto et al.,Chem.Pharm.Bull.,1998,46(3):419-422)。但这些全细胞转化方法效率较低，而且都没有相关酶的氨基酸序列的报道。2007年Truppo等报道了采用商业化的羰基还原酶(ketoreductase，KRED)不对称还原前手性酮合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的研究，但是ee值只有60％，酶蛋白序列未知，物种来源也未见报道(Truppo et al.,Org.Lett.,2007,9(2):335-338)。Ni等2012年通过传统富集培养筛选到一株克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.CCTCCM2011385)，该酵母可催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇(86.7％ee)(CN102559520A)。然而野生菌中活性酶的含量低，最高仅能催化2g/L底物，产物浓度也较低，且分离成本高，因而不能满足实际应用。李哲等于2013年研究了一种来源于毕赤酵母GS115的羰基还原酶PasCR，该酶可不对称还原催化双芳基甲酮类化合物，转化率最高只有50％(李哲等，生物工程学报，2013,29：68-77)。Zhou等2016年对来源于克鲁维酵母的醇脱氢酶(命名为KpADH)进行了分离纯化，并通过蛋白质工程改造筛选得到KpADH突变体M131F、S196Y和S237A，野生型醇脱氢酶KpADH和三个突变体均可催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，转化率最高可达99％，(R)-产物ee值为74.7％-96.1％(Zhou et al.,Catal.Sci.Technol.,2016,6(16):6320-6327)。2018年，Xu等通过HCSM设计改造KpADH，可催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，其ee％达99.4％(Xu et al,ACS Catalysis.,2018,8,8330-8345)。但是由于(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇才是合成药物中间体所需前体，因此目前无优良酶可高效催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成立体选择性高的(S)-产物。
醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)作为生物催化剂被广泛应用于前手性化合物不对称还原合成重要医药中间体手性醇，尤其是经过定向进化改造过的醇脱氢酶突变体用于手性药物的合成。来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH是工业上比较感兴趣的超耐热酶，可以耐受高于86℃的高温，通过半理性定向进化改造的突变体被用来催化还原化学法难以实现的C＝O两侧较近似α-和α′取代基的羰基的不对称还原反应。同时TbSADH也可以接受羰基两侧取代基有明显区别的底物，虽然TbSADH的底物谱比较广，但是不接受二芳基类大底物，如：二苯甲酮类衍生物，因此开展对该酶的定向进化改造进一步拓展其底物谱，使其接受以(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮为模式底物的大环化合物合成相应的手性醇产物，具有重要的科学意义和应用价值。
发明内容
本发明应用定向进化技术和方法对来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterbrockii)的醇脱氢酶TbSADH进行酶改造，获得了对以(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮为代表的双芳基酮类底物有酶活的一系列醇脱氢酶TbSADH突变体，并将其应用于光学纯手性双芳基醇化合物的生物催化合成中。
第一方面，本发明保护醇脱氢酶TbSADH突变体。
本发明的醇脱氢酶TbSADH突变体是将位于醇脱氢酶TbSADH催化中心口袋的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。
所述醇脱氢酶TbSADH催化中心口袋的氨基酸残基为醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第39位、第42位、第84位、第85位、第86位、第101位、第104位、第110位、第294位和第295位所示的氨基酸残基。
其中，所述第39位、所述第42位和所述第110位氨基酸残基均位于醇脱氢酶TbSADH催化中心的大口袋；所述第84位、所述第85位、所述第86位、所述第101位、所述第104位、所述第294位和所述第295位氨基酸残基均位于醇脱氢酶TbSADH催化中心的小口袋。这些氨基酸残基均是影响醇脱氢酶TbSADH对于底物对映体选择性和酶催化活性的关键位点，通过改造这些氨基酸残基可提高底物的转化率及选择性地获得不同手性的醇产物。
进一步的，所述醇脱氢酶TbSADH突变体是将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第39位和/或第42位和/或第84位和/或第85位和/或第86位和/或第104位和/或第110位和/或第294位所示的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。
更进一步的，所述醇脱氢酶TbSADH突变体包括如下至少一种突变：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第39位由丝氨酸突变为苏氨酸、将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位由组氨酸突变为苏氨酸或丙氨酸或缬氨酸或天冬氨酸、将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位由脯氨酸突变为丙氨酸或缬氨酸或丝氨酸或苏氨酸或色氨酸、将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位由丙氨酸突变为甘氨酸或亮氨酸或缬氨酸或丝氨酸或半胱氨酸或组氨酸或天冬氨酸、将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位由异亮氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸或半胱氨酸或赖氨酸或缬氨酸或亮氨酸或丙氨酸或谷氨酰胺或谷氨酸或甘氨酸或苏氨酸或精氨酸、将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第104位由甘氨酸突变为丝氨酸、将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第110位由苏氨酸突变为丙氨酸、将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第294位由亮氨酸突变为异亮氨酸或苯丙氨酸或蛋氨酸。
在本发明的具体实施例中，所述醇脱氢酶TbSADH突变体为如下(1)-(40)中任一种：
(1)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(2)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(3)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(4)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸突变为苏氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(5)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸突变为色氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(6)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(7)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(8)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(9)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为赖氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(10)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为谷氨酰胺后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(11)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为谷氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(12)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为甘氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(13)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为苏氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(14)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为精氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(15)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(16)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(17)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(18)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(19)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(20)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(21)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(22)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(23)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为半胱氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(24)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(25)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(26)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为组氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(27)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为天冬氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(28)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，且将第104位氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(29)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(30)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为丙氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(31)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为缬氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(32)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为天冬氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(33)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，且将第110位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(34)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第39位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(35)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第110位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(36)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(37)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为苯丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(38)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为蛋氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(39)将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第110位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(40)在(1)-(39)中任一所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述醇脱氢酶TbSADH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述标签可为下表中所示的标签。
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子为如下1)-41)所述的基因：
1)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基G后得到的DNA分子；
2)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基G、且将第251位由碱基C突变为碱基T、且将第252位由碱基A突变为碱基T后得到的DNA分子；
3)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基A、且将第251位由碱基C突变为碱基G、且将第252位由碱基A突变为碱基T后得到的DNA分子；
4)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基A后得到的DNA分子；
5)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基T、且将第251位由碱基C突变为碱基G、且将第252位由碱基A突变为碱基G后得到的DNA分子；
6)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
7)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
8)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
9)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第257位由碱基T突变为碱基A、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
10)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基A、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
11)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基A、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
12)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
13)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
14)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
15)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G后得到的DNA分子；
16)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基C后得到的DNA分子；
17)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
18)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
19)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的将第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
20)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
21)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基C后得到的DNA分子；
22)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基C后得到的DNA分子；
23)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基T、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
24)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
25)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
26)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基G突变为碱基A、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
27)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基A、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的DNA分子；
28)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基C、且将第310位由碱基G突变为碱基A后得到的DNA分子；
29)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基A、且将第125位由碱基A突变为碱基C、且将第126位由碱基T突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
30)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基G、且将第125位由碱基A突变为碱基C、且将第126位由碱基T突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
31)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基G、且将第125位由碱基A突变为碱基T、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
32)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基G、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
33)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第328位由碱基T突变为碱基G、且将第329位由碱基G突变为碱基C、且将第330位由碱基G突变为碱基A后得到的DNA分子；
34)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第115位由碱基T突变为碱基A、且将第117位由碱基G突变为碱基A、且将第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的DNA分子；
35)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第328位由碱基T突变为碱基G、且将第329位由碱基G突变为碱基C、且将第330位由碱基G突变为碱基A后得到的DNA分子；
36)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基A、且将第882位由碱基A突变为碱基T后得到的DNA分子；
37)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基T、且将第882位由碱基A突变为碱基T后得到的DNA分子；
38)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基A、且将第882位由碱基A突变为碱基G后得到的DNA分子；
39)将醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第328位由碱基T突变为碱基G、且将第329位由碱基G突变为碱基C、且将第330位由碱基G突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基A、且将第882位由碱基A突变为碱基T后得到的DNA分子；
40)在1)-39)限定的DNA分子的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；
41)与1)-40)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的DNA分子。
所述醇脱氢酶TbSADH野生型基因如SEQ ID No.1所示。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核酸分子90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核酸分子并且等同于本发明的序列，均属于本发明的保护范围。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
第二方面，本发明保护下述a1)-a4)中的任一种生物材料：
a1)含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的表达盒；
a2)含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的重组载体；
a3)含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的重组微生物；
a4)含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的转基因细胞系。
进一步的，a1)所述的含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述醇脱氢酶TbSADH突变体的DNA，该DNA不但可包括启动醇脱氢酶TbSADH突变体编码基因转录的启动子，还可包括终止醇脱氢酶TbSADH突变体编码基因转录的终止子。更进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。
a2)所述的含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的重组载体可为携带有所述醇脱氢酶TbSADH突变体编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。
a3)所述的含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的重组微生物可为携带有所述醇脱氢酶TbSADH突变体编码基因的酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌等。
a4)所述的含有编码上述醇脱氢酶TbSADH突变体的核酸分子的转基因细胞系不包括繁殖材料。
第三方面，本发明保护上述醇脱氢酶TbSADH突变体或上述核酸分子或上述生物材料的新用途。
本发明保护上述醇脱氢酶TbSADH突变体或上述核酸分子或上述生物材料在如下b1)-b5)中任一种应用：
b1)合成或制备手性双芳基醇化合物；
b2)合成或制备(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；
b3)合成或制备(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；
b4)催化双芳基酮底物生成双芳基醇化合物；
b5)催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇。
所述双芳基酮底物可为如下任一种：(2-吡啶基)苯基甲酮、(4-氟苯基)吡啶-2-甲酮、(4-甲苯基)吡啶-2-甲酮、(4-甲氧苯基)吡啶-2-甲酮、(2-甲苯基)吡啶-2-甲酮、(3-氯苯基)吡啶-2-甲酮、4-氯二苯甲酮和4-硝基二苯甲酮。
所述双芳基醇化合物可为如下任一种：(2-吡啶基)苯基甲醇、(4-氟苯基)吡啶-2-甲醇、(4-甲苯基)吡啶-2-甲醇、(4-甲氧苯基)吡啶-2-甲醇、(2-甲苯基)吡啶-2-甲醇、(3-氯苯基)吡啶-2-甲醇、4-氯二苯甲醇和4-硝基二苯甲醇。
第四方面，本发明保护一种(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的合成方法。
本发明提供的(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的合成方法包括如下步骤：以上述醇脱氢酶TbSADH突变体作为生物酶催化底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；
所述底物为(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮。
在所述方法中，所述醇脱氢酶TbSADH突变体可以粗酶液、粗酶液冻干粉或全细胞的形式发生催化作用。
进一步的，所述醇脱氢酶TbSADH突变体全细胞可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述醇脱氢酶TbSADH突变体，得到的重组细胞即所述全细胞；
裂解所述重组细胞获得所述粗酶液；
将所述粗酶液冷冻干燥后获得所述粗酶液冻干粉；
再进一步的，所述重组细胞具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：将醇脱氢酶TbSADH突变体的编码基因导入宿主细胞，经诱导培养后获得表达所述醇脱氢酶TbSADH突变体的所述重组细胞。
更进一步的，所述醇脱氢酶TbSADH突变体的编码基因是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。其中，所述重组载体可为携带有所述醇脱氢酶TbSADH突变体的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将所述醇脱氢酶TbSADH突变体的编码基因替换pRSFDuet-1的NcoI和AvrII酶切位点之间的小片段后得到的重组质粒。所述醇脱氢酶TbSADH突变体的编码基因为上述1)-41)所述的基因。
在所述方法中，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。
进一步的，所述原核细胞具体可为细菌；所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。
更进一步的，所述宿主细胞具体为大肠杆菌。
在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.05-1.0mmol/L(如0.1mmol/L)，20-30℃(如20℃)诱导培养10-20小时(如18小时)。
在所述方法中，在以所述醇脱氢酶TbSADH突变体作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，反应体系中除了含有所述底物和所述醇脱氢酶TbSADH突变体外，还可含有异丙醇和所述醇脱氢酶TbSADH突变体的辅酶。
进一步的，所述辅酶可为NADP+或NAD+。
更进一步的，以所述醇脱氢酶TbSADH突变体作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应是在浓度为0.001-0.1mol/L(如0.05mol/L)，pH 6-8(如pH7.4)的磷酸盐缓冲液中进行的。
所述底物在所述反应体系中浓度为1-50mmol/L(如5mmol/L)；所述醇脱氢酶TbSADH突变体粗酶粉在所述反应体系中浓度为1-10g/L(如10g/L)；所述醇脱氢酶突变体全细胞在所述反应体系中的浓度为50-500g/L(如100g/L)；所述异丙醇在所述反应体系中的体积百分含量为10-30％(如10％)；所述NADP+或所述NAD+在所述反应体系中的浓度为0.1-1.0mmol/L(如1.0mmol/L)。
在所述方法中，在以所述醇脱氢酶TbSADH突变体作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，所述反应的温度可为20-35℃，具体可为30℃；所述反应的时间以反应完全为准，一般可为1-24小时，具体可为24小时。
在所述方法中，反应结束后还包括按本领域常规方法从反应液中萃取(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的步骤。
本发明应用定向进化技术和方法对醇脱氢酶TbSADH进行了酶改造，获得了对以(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮为代表的双芳基酮类有酶活的一系列突变体，该突变体可高效不对称还原催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，该方法具有产率高、ee值高、辅酶使用量少、不需额外添加如葡萄糖脱氢酶等用以辅因子循环的酶、反应条件温和、操作简单等优点。通过实验证明：改造前野生型醇脱氢酶TbSADH对底物(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮无活性，而改造后的最优(S)特异性突变体可催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，其转化率98％，ee％>99％(S)，最优(R)特异性突变体可催化CPMK生成(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，其转化率63％，ee％49％(R)。
附图说明
图1为醇脱氢酶TbSADH在20℃,0.1mM IPTG诱导条件下的蛋白SDS-PAGE检测图。M表示蛋白Marker；1表示TbSADH全细胞破碎液SDS-PAGE结果；2表示TbSADH离心后上清液SDS-PAGE结果；3表示TbSADH离心后沉淀SDS-PAGE结果；4表示阴性对照pRSFDuet-1全细胞破碎液SDS-PAGE结果；5表示pRSFDuet-1离心后上清液SDS-PAGE结果；6表示pRSFDuet-1离心后沉淀SDS-PAGE结果。
图2为醇脱氢酶TbSADH突变体催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇示意图。
图3为醇脱氢酶TbSADH突变体催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇反应的HPLC检测结果图谱。A：(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮及混旋(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇标准品液相色谱结果；B：阴性对照组反应液液相色谱结果；C：实验组1(突变体催化)反应液液相色谱结果；D：实验组2(突变体催化)反应液液相色谱结果。图中的阴性对照是空载体质粒pRSFDuet-1催化的反应；突变体1为TbSADH突变体A85G/I86L；突变体2为TbSADH突变体I86P/L294I。
图4为TbSADH突变体全细胞催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应过程图。横坐标为反应时间，纵坐标为底物转化率。所测试的突变体包括A85G/I86A、A85G/I86L及A85V/I86S。
图5为TbSADH突变体粗酶粉催化其它双芳基酮底物的转化率及对映体选择性结果。所测试的突变体包括A85G/I86L及A85V/I86S。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、醇脱氢酶TbSADH及其突变体序列
本实施例中的醇脱氢酶TbSADH的的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本实施例中醇脱氢酶TbSADH突变体具体为如下(1)-(39)中任一种：
(1)醇脱氢酶TbSADH突变体P84A：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸(P)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(2)醇脱氢酶TbSADH突变体P84V：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸(P)突变为缬氨酸(V)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(3)醇脱氢酶TbSADH突变体P84S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(4)醇脱氢酶TbSADH突变体P84T：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸(P)突变为苏氨酸(T)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(5)醇脱氢酶TbSADH突变体P84W：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第84位氨基酸由脯氨酸(P)突变为色氨酸(W)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(6)醇脱氢酶TbSADH突变体I86S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(7)醇脱氢酶TbSADH突变体I86P：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(8)醇脱氢酶TbSADH突变体I86C：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为半胱氨酸(C)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(9)醇脱氢酶TbSADH突变体I86K：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为赖氨酸(K)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(10)醇脱氢酶TbSADH突变体I86Q：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为谷氨酰胺(Q)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(11)醇脱氢酶TbSADH突变体I86E：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为谷氨酸(E)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(12)醇脱氢酶TbSADH突变体I86G：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为甘氨酸(G)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(13)醇脱氢酶TbSADH突变体I86T：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(14)醇脱氢酶TbSADH突变体I86R：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为精氨酸(R)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(15)醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86V：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(16)醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86L：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(17)醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86C：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为半胱氨酸(C)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(18)醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86C：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为亮氨酸(L)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为半胱氨酸(C)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(19)醇脱氢酶TbSADH突变体A85V/I86C：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为半胱氨酸(C)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(20)醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86C：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为半胱氨酸(C)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(21)醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86L：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(22)醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86L：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为亮氨酸(L)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(23)醇脱氢酶TbSADH突变体A85C/I86S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为半胱氨酸(C)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(24)醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(25)醇脱氢酶TbSADH突变体A85V/I86S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(26)醇脱氢酶TbSADH突变体A85H/I86S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为组氨酸(H)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(27)醇脱氢酶TbSADH突变体A85D/I86S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为天冬氨酸(D)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(28)醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86L/G104S：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为亮氨酸(L)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)，且将第104位氨基酸由甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(29)醇脱氢酶TbSADH突变体H42T/A85G/I86A：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸(H)突变为苏氨酸(T)，且将第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(30)醇脱氢酶TbSADH突变体H42A/A85G/I86A：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸(H)突变为丙氨酸(A)，且将第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(31)醇脱氢酶TbSADH突变体H42V/A85G/I86A：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸(H)突变为缬氨酸(V)，且将第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(32)醇脱氢酶TbSADH突变体H42D/A85G/I86A：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸(H)突变为天冬氨酸(D)，且将第85位氨基酸由丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(33)醇脱氢酶TbSADH突变体I86A/W110A：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)，且将第110位氨基酸由色氨酸(W)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(34)醇脱氢酶TbSADH突变体S39T/I86P：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第39位氨基酸由丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)，且将第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(35)醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/W110A：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，且将第110位氨基酸由色氨酸(W)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(36)醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294I：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，且将第294位氨基酸由亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(37)醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294F：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，且将第294位氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(38)醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294M：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，且将第294位氨基酸由亮氨酸(L)突变为蛋氨酸(M)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
(39)醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/W110A/L294I：将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，且将第110位氨基酸由色氨酸(W)突变为丙氨酸(A)，且将第294位氨基酸由亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
实施例2、醇脱氢酶TbSADH基因或其突变体的工程菌的制备
一、醇脱氢酶TbSADH基因野生型基因工程菌株的制备
1、醇脱氢酶TbSADH基因序列的优化
将来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH基因以大肠杆菌为宿主细胞进行密码子优化，优化后全基因合成，优化后的醇脱氢酶TbSADH基因序列如SEQ ID No.1所示。
2、重组载体pRSFDuet-1-TbSADH的构建
使用引物pRSF-NcoI(ggt ata tct cct tat taa agt taa aca aaa tta ttt ctacag g)和pRSF-AvrII(taa cct agg ctg ctg cca ccg ctg agc aat aac)将SEQ ID No.1所示DNA片段同源重组到pRSFDuet-1质粒上。将经测序后表明pRSFDuet-1质粒的酶切位点NcoI和AvrII之间的小片段为SEQ ID No.1所示DNA片段的重组质粒命名为pRSFDuet-1-TbSADH。
3、重组菌的构建
将重组载体pRSFDuet-1-TbSADH电转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素(Kan)抗性的LB固体平板中倒置培养12-16h，挑选阳性转化子进行菌落PCR及DNA测序验证，验证正确的转化子即为醇脱氢酶TbSADH基因野生型基因工程菌株。
二、醇脱氢酶TbSADH基因突变体工程菌株的制备
分别构建表达实施例1中各个醇脱氢酶TbSADH突变体的醇脱氢酶TbSADH基因突变体工程菌株。部分醇脱氢酶TbSADH突变体是通过设计兼并引物构建突变库筛选获得，另外一部分醇脱氢酶TbSADH突变体是通过设计突变引物获得。设计的兼并引物和突变引物序列分别如表1和表2所示。
表1、突变库构建所用引物序列
Figure BDA0001841982250000141
表2、突变体及所用引物序列
Figure BDA0001841982250000151
注：下划线代表突变位点。
具体构建方法如下：
1、PCR反应
以步骤一中构建的重组载体pRSFDuet-1-TbSADH为模板，分别采用各突变体对应的引物进行两轮PCR反应。PCR反应体系及程序如下：
第一轮PCR体系为50μL，包括如下组分：模板(pRSFDuet-1-TbSADH)50ng；PrimeStar DNA polymerase(2.5U/μL)0.5μL；dNTP(2.5mmol/L)4μL；2×PS Buffer 25μL；dd H2O 18.5μL；前引物(10μM)1μL；后引物(10μM)1μL。各突变体所用引物具体序列如表1及表2中所示。
第一轮PCR程序：预变性95℃，2分钟；变性95℃，30秒；退火56℃，15秒；延伸72℃，40秒；终延伸72℃，10分钟。循坏次数32次。
第二轮PCR体系为50μL，包括如下组分：模板(pRSFDuet-1-TbSADH)50ng；PrimeStar DNA polymerase(2.5U/μL)0.5μL；dNTP(2.5mmol/L)4μL；2×PS Buffer 25μL；dd H2O 18.5μL；第一轮PCR产物2μL。
第二轮PCR程序：预变性95℃，2分钟；变性95℃，30秒；退火60℃，15秒；延伸72℃，7分钟；终延伸72℃，10分钟。循坏次数28次。
2、醇脱氢酶TbSADH基因突变体工程菌株的获得及筛选
完成步骤1后，向各反应体系中加入Dpn I酶2μL，37℃消化2小时，并取1μL电转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，放入37℃培养箱倒置培养12-16小时，待转化子长出，挑取转化子进行测序验证，测序验证正确的转化子即为醇脱氢酶TbSADH基因突变体工程菌株，分别将其命名为重组菌P84A、重组菌P84V、重组菌P84S、重组菌P84T、重组菌P84W、重组菌I86S、重组菌I86P、重组菌I86C、重组菌I86K、重组菌I86Q、重组菌I86E、重组菌I86G、重组菌I86T、重组菌I86R、重组菌A85G/I86V、重组菌A85G/I86L、重组菌A85G/I86C、重组菌A85L/I86C、重组菌A85V/I86C、重组菌A85S/I86C、重组菌A85S/I86L、重组菌A85L/I86L、重组菌A85C/I86S、重组菌A85S/I86S、重组菌A85V/I86S、重组菌A85H/I86S、重组菌A85D/I86S、重组菌A85L/I86L/G104S、重组菌H42T/A85G/I86A、重组菌H42A/A85G/I86A、重组菌H42V/A85G/I86A、重组菌H42D/A85G/I86A、重组菌I86A/W110A、重组菌S39T/I86P、重组菌I86P/W110A、重组菌I86P/L294I、重组菌I86P/L294F、重组菌I86P/L294M和重组菌I86P/W110A/L294I。
重组菌P84A是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84A的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基G后得到的载体。
重组菌P84V是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84V的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84V的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基G、且将第251位由碱基C突变为碱基T、且将第252位由碱基A突变为碱基T后得到的载体。
重组菌P84S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84S的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基A、且将第251位由碱基C突变为碱基G、且将第252位由碱基A突变为碱基T后得到的载体。
重组菌P84T是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84T的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84T的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基A后得到的载体。
重组菌P84W是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84W的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84W的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第250位由碱基C突变为碱基T、且将第251位由碱基C突变为碱基G、且将第252位由碱基A突变为碱基G后得到的载体。
重组菌I86S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86S的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌I86P是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86C是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86C的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86C的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌I86K是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86K的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86K的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第257位由碱基T突变为碱基A、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86Q是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86Q的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86Q的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基A、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86E是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86E的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86E的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基A、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86G是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86G的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86G的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌I86T是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86T的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86T的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86R是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86R的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86R的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85G/I86V是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86V的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86V的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85G/I86L是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86L的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86L的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基C后得到的载体。
重组菌A85G/I86C是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86C的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85G/I86C的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85L/I86C是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86C的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85V/I86C是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85V/I86C的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85V/I86C的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85S/I86C是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86C的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86C的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85S/I86L是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86L的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86L的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基C后得到的载体。
重组菌A85L/I86L是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86L的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86L的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基C后得到的载体。
重组菌A85C/I86S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85C/I86S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85C/I86S的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基T、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85S/I86S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85S/I86S的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85V/I86S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85V/I86S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85V/I86S的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第254位由碱基C突变为碱基T、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85H/I86S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85H/I86S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85H/I86S的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基G突变为碱基A、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85D/I86S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85D/I86S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体P84A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的将第254位由碱基C突变为碱基A、且将第257位由碱基T突变为碱基G后得到的载体。
重组菌A85L/I86L/G104S是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86L/G104S的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体A85L/I86L/G104S的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第253位由碱基G突变为碱基C、且将第254位由碱基C突变为碱基T、且将第256位由碱基A突变为碱基C、且将第310位由碱基G突变为碱基A后得到的载体。
重组菌H42T/A85G/I86A是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42T/A85G/I86A的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42T/A85G/I86A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基A、且将第125位由碱基A突变为碱基C、且将第126位由碱基T突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌H42A/A85G/I86A是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42A/A85G/I86A的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42A/A85G/I86A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基G、且将第125位由碱基A突变为碱基C、且将第126位由碱基T突变为碱基A、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌H42V/A85G/I86A是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42V/A85G/I86A的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42V/A85G/I86A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基G、且将第125位由碱基A突变为碱基T、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌H42D/A85G/I86A是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42D/A85G/I86A的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体H42D/A85G/I86A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第124位由碱基C突变为碱基G、且将第254位由碱基C突变为碱基G、且将第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86A/W110A是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86A/W110A的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86A/W110A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基G、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第328位由碱基T突变为碱基G、且将第329位由碱基G突变为碱基C、且将第330位由碱基G突变为碱基A后得到的载体。
重组菌S39T/I86P是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体S39T/I86P的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体S39T/I86P的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第115位由碱基T突变为碱基A、且将第117位由碱基G突变为碱基A、且将第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86P/W110A是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/W110A的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/W110A的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第328位由碱基T突变为碱基G、且将第329位由碱基G突变为碱基C、且将第330位由碱基G突变为碱基A后得到的载体。
重组菌I86P/L294I是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294I的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294I的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基A、且将第882位由碱基A突变为碱基T后得到的载体。
重组菌I86P/L294F是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294F的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294F的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基T、且将第882位由碱基A突变为碱基T后得到的载体。
重组菌I86P/L294M是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294M的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/L294M的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基A、且将第882位由碱基A突变为碱基G后得到的载体。
重组菌I86P/W110A/L294I是将表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/W110A/L294I的载体导入宿主菌中得到的菌。表达醇脱氢酶TbSADH突变体I86P/W110A/L294I的载体是将pRSFDuet-1-TbSADH中醇脱氢酶TbSADH野生型基因的第256位由碱基A突变为碱基C、且将第257位由碱基T突变为碱基C、且将第258位由碱基T突变为碱基A、且将第328位由碱基T突变为碱基G、且将第329位由碱基G突变为碱基C、且将第330位由碱基G突变为碱基A、且将第880位由碱基C突变为碱基A、且将第882位由碱基A突变为碱基T后得到的载体。
实施例3、醇脱氢酶TbSADH基因或其突变体的表达及全细胞、粗酶液与粗酶粉的制备
将实施例2步骤一制备的醇脱氢酶TbSADH基因野生型基因工程菌株及步骤二中制备的39个醇脱氢酶TbSADH基因突变体工程菌株进行诱导表达，得到野生型醇脱氢酶TbSADH及实施例1中的各个醇脱氢酶TbSADH突变体。具体步骤如下：
分别挑取含有醇脱氢酶TbSADH基因或其突变体的重组质粒的重组菌E.coli BL21(DE3)转化子至含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡过夜12-16小时，按照1％(体积百分含量)接种量分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.7时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃、220rpm诱导表达18h后，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体，并将收集的菌体用磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.4)重悬得到醇脱氢酶TbSADH全细胞，然后在冰浴条件下超声破碎菌体细胞，得到超声破碎后的样品(即为粗酶液)。破碎后样品一部分用于SDS-PAGE检测，另一部分于4℃、12000rpm离心10min后取上清液用于冷冻干燥以制备粗酶粉。
用垂直电泳进行SDS-PAGE检测收集到的蛋白样品，SDS-PAGE的胶浓度为12％，先用80V电压进行浓缩电泳，再改为150V进行分离电泳。结果表明构建并表达纯化得到的醇脱氢酶TbSADH及其突变体蛋白为可溶性表达，且大小均在37kDa左右(图1)，与预期大小一致。
实施例4、醇脱氢酶TbSADH及其突变体粗酶粉催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇
分别用实施例3制备的野生型醇脱氢酶TbSADH及各个醇脱氢酶TbSADH突变体催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，以测定其对不对称还原前手性双芳基酮(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮的催化效果。催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的示意图如图2所示。
不对称还原反应体系的各组分及其在体系中的浓度分别如下：底物((4-氯苯基)吡啶-2-甲酮)10mmol/L、重组醇脱氢酶TbSADH(醇脱氢酶TbSADH突变体，粗酶粉，实施例3中制备)10g/L、异丙醇10％(体积分数)、NADP+1mmol/L、磷酸盐缓冲液50mmol/L，pH 7.4。不对称还原反应的条件为30℃反应24小时。
反应结束后，计算转化率并进行立体选择性分析。具体方法如下：取500μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡1～2min，12000rpm离心2～5min，取上清到离心管中，加入无水硫酸钠，4℃过夜干燥，之后取上清到离心管中，待有机相自然挥发完全，加入500μL色谱级异丙醇，进行液相分析转化率和ee值。HPLC检测条件如下：Chiralpak AD-H(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷：异丙醇(90:10，V/V)，流速1mL/min，柱温30℃，紫外检测波长220nm，进样量1μL。
醇脱氢酶TbSADH突变体催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇反应的HPLC检测结果图谱如图3所示。保留时间(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇为9.8min，(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇为12.2min。产物光学纯度通过对映体过量值(ee)来评价：ee＝(AS-AR)/(AS+AR)×100％；AS：液相色谱分析获得的(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的峰面积值；AR：液相色谱分析获得的(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的峰面积值。
检测结果如表3所示。由表3可知，醇脱氢酶TbSADH突变体可以催化不对称还原催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，转化率为0.7-99％，立体选择性为20-99％。
表3、醇脱氢酶TbSADH及其突变体不对称还原催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮的转化率及立体选择性分析
Figure BDA0001841982250000211
Figure BDA0001841982250000221
注：表中WT代表野生型TbSADH，“-”代表转化率过低ee值没有列出。
实施例5、醇脱氢酶突变体全细胞催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇
分别用表3中转化率较高的醇脱氢酶TbSADH突变体(A85G/I86A、A85G/I86L、A85V/I86S)全细胞催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，以测定其对不对称还原前手性双芳基酮(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮的催化效果。催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的示意图如图1所示。
不对称还原反应体系的各组分及其在体系中的浓度分别如下：底物((4-氯苯基)吡啶-2-甲酮)50mmol/L、重组醇脱氢酶TbSADH(醇脱氢酶TbSADH突变体，全细胞，实施例3中制备)100g/L、异丙醇10％(体积分数)、NADP+0.1mmol/L、磷酸盐缓冲液50mmol/L，pH 7.4。不对称还原反应的条件为30℃，根据不同突变体催化速率反应至底物完全转化。
反应结束后，计算转化率并进行立体选择性分析。具体方法如下：取500μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡1～2min，12000rpm离心2～5min，取上清到离心管中，加入无水硫酸钠，4℃过夜干燥，之后取上清到离心管中，待有机相自然挥发完全，加入500μL色谱级异丙醇，进行液相分析转化率和ee值。HPLC检测条件如下：Chiralpak AD-H(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷：异丙醇(90:10，V/V)，流速1mL/min，柱温30℃，紫外检测波长220nm，进样量1μL。
TbSADH突变体反应过程中的底物转化率如图4所示，由图4可知，TbSADH突变体A85G/I86L反应速率最快，反应至4个小时就可达到底物(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮的完全转化(1.09g)，而其余两个突变体反应速率较慢，反应至40个小时后也只能达到92-97％的转化率。
实施例6、醇脱氢酶突变体粗酶粉催化其它双芳基酮底物
分别用实施例3制备的野生型醇脱氢酶TbSADH及醇脱氢酶TbSADH突变体(A85G/I86L、A85V/I86S)粗酶粉催化其它双芳基酮底物，以拓宽突变体的底物谱。双芳基酮底物分别为(2-吡啶基)苯基甲酮(3a)、(4-氟苯基)吡啶-2-甲酮(3b)、(4-甲苯基)吡啶-2-甲酮(3c)、(4-甲氧苯基)吡啶-2-甲酮(3d)、(2-甲苯基)吡啶-2-甲酮(3e)、(3-氯苯基)吡啶-2-甲酮(3f)、4-氯二苯甲酮(3g)和4-硝基二苯甲酮(3h)，对应生成的产物分别为(2-吡啶基)苯基甲醇、(4-氟苯基)吡啶-2-甲醇、(4-甲苯基)吡啶-2-甲醇、(4-甲氧苯基)吡啶-2-甲醇、(2-甲苯基)吡啶-2-甲醇、(3-氯苯基)吡啶-2-甲醇、4-氯二苯甲醇和4-硝基二苯甲醇。
不对称还原反应体系的各组分及其在体系中的浓度分别如下：底物10mmol/L、重组醇脱氢酶TbSADH(醇脱氢酶TbSADH突变体，粗酶粉，实施例3中制备)10g/L、异丙醇10％(体积分数)、NADP+1mmol/L、磷酸盐缓冲液50mmol/L，pH 7.4。不对称还原反应的条件为30℃反应24小时。
反应结束后，计算转化率并进行立体选择性分析。具体方法如下：取500μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡1～2min，12000rpm离心2～5min，取上清到离心管中，加入无水硫酸钠，4℃过夜干燥，之后取上清到离心管中，待有机相自然挥发完全，加入500μL色谱级异丙醇，进行液相分析转化率和ee值。HPLC检测条件如下表4所示。
表4、醇脱氢酶TbSADH及其突变体不对称还原催化其它双芳基酮底物的HPLC检测方法
Figure BDA0001841982250000231
Figure BDA0001841982250000241
a检测条件：流速1mL/min；温度30℃；检测波长220nm；
M1：TbSADH突变体A85G/I86L；M2：TbSADH突变体A85V/I86S。
HPLC检测结果如图5和表5所示。由图5及表5可知，醇脱氢酶TbSADH突变体除了对底物(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮有很好的催化活性及对映体选择性之外，对其它双芳基酮底物同样具有良好的催化活性。
表5、TbSADH及其突变体不对称还原催化其它双芳基酮底物的转化率及立体选择性分析
Figure BDA0001841982250000242
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>醇脱氢酶突变体及其在手性双芳基醇化合物合成中的应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1059
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgaaaggtt ttgcaatgct cagtatcggt aaagttggct ggattgagaa ggaaaagcct 60
gctcctggcc catttgatgc tattgtaaga cctctagctg tggccccttg cacttcggac 120
attcataccg tttttgaagg agccattggc gaaagacata acatgatact cggtcacgaa 180
gctgtaggtg aagtagttga agtaggtagt gaggtaaaag attttaaacc tggtgatcgc 240
gttgttgtgc cagctattac ccctgattgg cggacctctg aagtacaaag aggatatcac 300
cagcactccg gtggaatgct ggcaggctgg aaattttcga atgtaaaaga tggtgttttt 360
ggtgaatttt ttcatgtgaa tgatgctgat atgaatttag cacatctgcc taaagaaatt 420
ccattggaag ctgcagttat gattcccgat atgatgacca ctggttttca cggagctgaa 480
ctggcagata tagaattagg tgcgacggta gcagttttgg gtattggccc agtaggtctt 540
atggcagtcg ctggtgccaa attgcgtgga gccggaagaa ttattgccgt aggcagtaga 600
ccagtttgtg tagatgctgc aaaatactat ggagctactg atattgtaaa ctataaagat 660
ggtcctatcg aaagtcagat tatgaatcta actgaaggca aaggtgtcga tgctgccatc 720
atcgctggag gaaatgctga cattatggct acagcagtta agattgttaa acctggtggc 780
accatcgcta atgtaaatta ttttggcgaa ggagaggttt tgcctgttcc tcgtcttgaa 840
tggggttgcg gcatggctca taaaactata aaaggcgggc tatgccccgg tggacgtcta 900
agaatggaaa gactgattga ccttgttttt tataagcgtg tcgatccttc taagctcgtc 960
actcacgttt tccggggatt tgacaatatt gaaaaagcct ttatgttgat gaaagacaaa 1020
ccaaaagacc taatcaaacc tgttgtaata ttagcataa 1059
<210>2
<211>352
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu
50 55 60
Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg
65 70 75 80
Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln
85 90 95
Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe
100 105 110
Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp
115 120 125
Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala
130 135 140
Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly
165 170 175
Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly
180 185 190
Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys
195 200 205
Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu
210 215 220
Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val
245 250 255
Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu
260 265 270
Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys
275 280 285
Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg
290 295 300
Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val
305 310 315 320
Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu
325 330 335
Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala
340 345 350

Claims (7)

1.一种蛋白质，为如下（1）-（28）中任一种：
（1）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（2）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（3）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为赖氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（4）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为谷氨酰胺后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（5）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（6）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（7）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（8）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为半胱氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（9）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（10）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（11）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为半胱氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（12）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（13）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（14）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为组氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（15）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为天冬氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（16）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第85位氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，且将第104位氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（17）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（18）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为丙氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（19）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为缬氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（20）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第42位氨基酸由组氨酸突变为天冬氨酸，且将第85位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（21）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，且将第110位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（22）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第39位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸，且将第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（23）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第110位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（24）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（25）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为苯丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（26）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为蛋氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（27）将醇脱氢酶TbSADH的氨基酸序列的第86位氨基酸由异亮氨酸突变为脯氨酸，且将第110位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸，且将第294位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（28）在（1）-（27）中任一所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述醇脱氢酶TbSADH 氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.下述a1）-a4）中的任一种生物材料：
a1）含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；
a2）含有权利要求2所述核酸分子的重组载体；
a3）含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物；
a4）含有权利要求2所述核酸分子的转基因细胞系。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在如下b1）-b5）中任一种应用：
b1）制备手性双芳基醇化合物；
b2）制备(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；
b3）制备(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；
b4）催化双芳基酮底物生成双芳基醇化合物；
b5）催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇。
5.一种(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的合成方法，包括如下步骤：以权利要求1所述的蛋白质作为生物酶催化底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；
所述底物为(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述催化的反应条件为20-35 ℃反应1-24h。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述底物在反应体系中浓度为1-500mmol/L。
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