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CN111108203A - 狂犬病病毒抗原构建体 - Google Patents

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CN111108203A
CN111108203A CN201880060285.4A CN201880060285A CN111108203A CN 111108203 A CN111108203 A CN 111108203A CN 201880060285 A CN201880060285 A CN 201880060285A CN 111108203 A CN111108203 A CN 111108203A
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hydrocarbon chain
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saturated
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unsaturated hydrocarbon
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K.哈希
P.马尔亚拉
M.萨姆萨
O.斯拉克
余东
A.斯托克斯
R.雅拉
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GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

编码狂犬病病毒抗原的基于核酸的疫苗构建体可用于预防和治疗疾病。编码狂犬病病毒抗原的自扩增RNA分子提供有效且持久的免疫力。

Description

狂犬病病毒抗原构建体
关于联邦资助的研究的声明
本发明用美国政府支持根据由DARPA授予的协议号HR0011-12-3-0001进行。政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明在治疗和预防病毒性疾病的领域中。具体而言，本发明涉及编码狂犬病病毒抗原的自扩增RNA分子。其包括狂犬病病毒抗原用于治疗和预防狂犬病的用途。
发明背景
狂犬病病毒是弹状病毒科(Rhabdoviridae)中的包膜单链RNA病毒。狂犬病病毒属的成员引起狂犬病并且具有所有已知人类病毒病原体的最高死亡率。狂犬病经由受感染的哺乳动物的唾液传播。它是一种嗜神经病毒，进入其宿主的神经系统，导致几乎总是致命的脑脊髓炎。目前，全世界每年约有60,000例狂犬病死亡，主要是由亚洲和非洲发展中国家的狗咬伤以及北美野生动物和蝙蝠引起的。
狂犬病以狂躁或瘫痪的形式呈现。潜伏期在约五天至几年之间变化，但通常在约20至90天之间。临床疾病最通常始于不适、厌食、疲劳、头痛和发烧的前驱症状，然后在暴露部位出现疼痛或感觉异常。在此期间，焦虑、激动或烦躁可能是突出的，随后是极度活跃、方向障碍、癫痫发作、恐水、多涎，并最终导致瘫痪、昏迷和死亡。
在实验上，RNA疫苗已衍生自亚基因组复制子，其缺乏病毒结构蛋白且表达异源抗原代替病毒结构蛋白。它们可以在包装细胞系中产生，其允许表达单轮感染性颗粒，其携带编码疫苗抗原的RNA。然后，细胞质中的RNA扩增产生数拷贝的编码抗原的mRNA，并产生双链RNA中间体，已知其为先天免疫的有效刺激剂。因此，复制子RNA疫苗可以在不使用活病毒的情况下实现瞬时高水平的抗原产生(Brito等人 (2015) Advances in Genetics 89:179-233)。
尽管将仅用缓冲剂配制的RNA(即裸RNA)插入细胞可以诱导基因表达和免疫应答两者，但裸RNA的体内不稳定性限制其作为疫苗的功效。此外，RNA的亲水性和强烈的负电荷阻碍其摄入细胞。然而，可以便于转移至细胞质中。已经表明合成的递送系统，诸如脂质纳米颗粒和阳离子纳米乳剂，将核酸(包括自扩增RNA)有效地转移至细胞质中，在细胞质中其可以扩增和表达编码的抗原。
仍然需要针对疾病(包括由狂犬病病毒引起的疾病)进行免疫的新型方法，其高度有效，安全，方便，成本有效，持久且诱导广泛范围的免疫应答。因此，需要可以有效地递送疫苗抗原、特别是狂犬病病毒抗原的载体。虽然目前可以进行狂犬病病毒预防，但在暴露前和暴露后都需要大量剂量，并且依从性(compliance)低，其降低了医疗利益。需要改进的狂犬病病毒疫苗，其具有简化的施用方案，增加的安全性和增强的制造特性。
发明概述
本发明人提供了可用作用于在受试者中诱导针对狂犬病病毒疾病的免疫应答的免疫原性组合物的组分的构建体，其用于治疗的方法及其制备方法。
本发明的第一个方面提供了基于核酸的疫苗构建体，其包含编码一种或多种多肽的核苷酸序列或由其组成，所述多肽包含全长狂犬病病毒蛋白或其免疫原性片段或由其组成。可替代地或另外，所述狂犬病病毒蛋白选自糖蛋白(G)、RNA聚合酶(L)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)和磷蛋白(P)。
可替代地或另外，所述多肽包含全长狂犬病病毒糖蛋白或其免疫原性片段。可替代地或另外，所述狂犬病病毒糖蛋白是在GenBank中指定为AGN9427.1的Flury高卵传代(“HEP”)狂犬病G蛋白。在另一个优选实施方案中，所述狂犬病病毒糖蛋白是在GenBank中指定为GU565703.1的Flury低卵传代(“LEP”)狂犬病G蛋白。可替代地或另外，所述狂犬病病毒糖蛋白是Flury LEP狂犬病G蛋白的密码子优化的形式。可替代地或另外，所述狂犬病病毒糖蛋白是Flury LEP狂犬病G蛋白的密码子对优化的形式。
本发明的第二个方面提供了包含基于核酸的疫苗构建体或由其组成的载体。
本发明的第三个方面提供了包含基于核酸的疫苗构建体或由其组成的自扩增RNA分子。本发明的自扩增RNA分子不包含在病毒粒子中，并且本发明的构建体不包含蛋白衣壳。通过避免形成衣壳的需要，本发明不需要包装细胞系，因此允许更容易地扩大规模用于商业生产，并且使无意地产生危险的感染性病毒的风险最小化。
本发明的第四个方面提供了编码自扩增RNA分子的DNA分子。
本发明的第五个方面提供了组合物，其包含如本文所述的构建体、载体或自扩增RNA分子中的一种或多种或由其组成。可替代地或另外，所述组合物包含免疫有效量的所述构建体、载体或自扩增RNA分子中的一种或多种或由其组成。
可替代地或另外，所述组合物包含基于RNA的疫苗或由其组成。
本发明的第六个方面提供了用于在有此需要的受试者中诱导针对狂犬病病毒的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的包含本文所述的构建体、载体、或自扩增RNA分子中的一种或多种的组合物。
本发明的第七个实施方案提供了用于产生基于RNA的疫苗的方法，其包括转录编码本文所述的自扩增RNA分子的载体或DNA分子以产生包含狂犬病病毒抗原的编码区的RNA的步骤。
本发明的第八个方面提供了通过本文所述的方法产生的组合物。
本发明的第九个方面提供了本文所述的构建体、载体、自扩增RNA分子或组合物用于在受试者中诱导针对由狂犬病病毒引起的疾病的免疫应答的用途。
本发明的第十个方面提供了本文所述的构建体、载体、自扩增RNA分子或组合物，其用于医药中。
本发明的第十一个方面提供了本文所述的构建体、载体、自扩增RNA分子或组合物，其用于在受试者中治疗或预防由狂犬病病毒引起的疾病(例如，通过诱导保护性免疫应答)。
本发明的第十二个方面提供了本文所述的构建体、载体、自扩增RNA分子或组合物在制备药物中的用途，所述药物在受试者中诱导针对狂犬病病毒的免疫应答。
本发明的第十三个方面提供了量为两微克或更少的人剂量的本文所述的构建体、载体、自扩增RNA分子或组合物，其在人中是免疫原性的。
附图描述
图1A.SAM狂犬病构建体的示意图。“NSP”表示编码非结构蛋白的病毒RNA。在NSP的3’编码狂犬病G抗原。构建体1：Flue HEP狂犬病G；构建体2：Flue LEP狂犬病G；构建体3：密码子优化的Flue LEP狂犬病G；构建体4：密码子对优化的Flue LEP狂犬病G。
图1B.构建体1-4的DNA序列的比对。该图最初是彩色的，且随后被修改为黑色和白色，其中规范是指与该图相关的颜色，以下关键字适用于该图：黄色 = 纯文本；蓝色 = 斜体；绿色 = 下划线；白色 = 粗体。
图2A.BHK细胞中的构建体1-4的狂犬病糖蛋白(G)抗原的Western印迹表达。
图2B.在用肽N-糖苷酶A (PNGase A)处理之前和之后，构建体1和3的狂犬病糖蛋白(G)抗原的Western印迹表达。
图3A.与在第35天的RABAVERT相比在第14天由用CNE或LNP配制的SAM构建体1-4在Balb/c小鼠中诱导的中和抗体(nAb)滴度，其通过快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)测定且表示为几何平均滴度(GMT)。
图3B.与在第35天的RABAVERT相比在第35天由用CNE或LNP配制的SAM构建体1-4在Balb/c小鼠中诱导的中和抗体(nAb)滴度，其通过快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)测定且表示为几何平均滴度(GMT)。
图4. 在免疫后持续六个月用CNE或LNP配制的构建体4的Balb/c小鼠中通过RFFIT测定的中和抗体(nAb)滴度。RABAVERT(圆形)；CNE中的1.5 ug构建体4 (正方形)；LNP中的0.15 ug 构建体4 (三角形)；LNP中的1.5 ug构建体4(倒置三角形)。
图5A.第14天. 用CNE或LNP配制的构建体4的Balb/c小鼠中通过RFFIT测定的中和抗体(nAb)滴度，其显示剂量应答与免疫原性的关系。上面的虚线指示100 IU/ml的基准，其为观察到由高剂量的RABAVERT引发的峰值nAb滴度。下面的虚线指示0.5 IU/ml的免疫原性阈值。
图5B.第35天. 用CNE或LNP配制的构建体4的Balb/c小鼠中通过RFFIT测定的中和抗体(nAb)滴度，其显示剂量应答与免疫原性的关系。上面的虚线指示100 IU/ml的基准，其为观察到由高剂量的RABAVERT引发的峰值nAb滴度。下面的虚线指示0.5 IU/ml的免疫原性阈值。
图6. 与在第0周、第1周和第3周的全人剂量的RABAVERT免疫相比，在第0周、第8周和第24周在构建体4免疫的非人灵长类动物中通过RFFIT测定的中和抗体(nAb)滴度。顶部小图显示四个剂量的在CNE中配制的构建体4的中和抗狂犬病抗体滴度。150 ug(正方形)；75 ug(三角形)；15 ug(倒置三角形)；3 ug(实心圆形)；RABAVERT(空心圆形)。上面的虚线指示免疫原性的保护性阈值，在log 0.1的下面的虚线指示定量下限(LLOQ)。
底部小图显示四个剂量的在LNP中配制的构建体4的中和抗狂犬病抗体滴度。75ug(三角形)；15 ug(倒置三角形)；3 ug(实心圆形)；RABAVERT(空心圆形)。上面的虚线指示免疫原性的保护性阈值，在log 0.1的下面的虚线指示定量下限(LLOQ)。
图7. 与在第0周、第1周和第3周的全人剂量的RABAVERT免疫相比，在第0周、第8周和第24周在构建体4免疫的非人灵长类动物中通过ELISA测定的IgG滴度。顶部小图显示四个剂量的在CNE中配制的构建体4的抗狂犬病IgG滴度。150 ug(正方形)；75 ug(三角形)；15ug(倒置三角形)；3 ug(实心圆形)；RABAVERT(空心圆形)。上面的虚线指示免疫原性的保护性阈值，在log 0.1的下面的虚线指示定量下限(LLOQ)。
底部小图显示四个剂量的在RV39 LNP中配制的构建体4的抗狂犬病IgG滴度。75ug(三角形)；15 ug(倒置三角形)；3 ug(实心圆形)；RABAVERT(空心圆形)。上面的虚线指示免疫原性的保护性阈值，下面的虚线在log 0.1指示定量下限(LLOQ)。
图8. 在范围为15 pg至1.5 ug的剂量的LNP或CNE 15 ug中的构建体4的小鼠中通过RFFIT测定的中和抗体滴度的剂量-应答。顶部小图显示在第1天单一剂量后持续六个月的中和抗体滴度。底部小图显示在第1天和第22天的两个剂量后持续六个月的中和抗体滴度。RABAVERT (空心圆形)；LNP 1.5 ug(空心正方形)；LNP 0.15 ug(空心三角形)；LNP0.015 ug(空心倒置三角形)；LNP 0.0015 ug(实心正方形)；LNP 0.00015 ug(实心三角形)；LNP 0.000015 ug(实心倒置三角形)；CNE 15 ug (实心圆形)。上面的虚线指示免疫原性的保护性阈值，在log 0.1下方的下面的虚线指示定量下限(LLOQ)。注意到以下观察。在较低的RNA剂量下，以剂量应答诱导与先前的狂犬病SAM研究相似的抗体水平。用低至15皮克的剂量的单次免疫诱导实质和稳定水平的狂犬病中和抗体，其在小鼠中测试的六个月时间得到维持。所述水平通过第二次免疫得到加强，并且仍显著大于三次RABAVERT免疫。
图9：通过在CNE中配制的单一15 ug剂量的构建体4在小鼠中的特异性多功能CD8+T细胞应答。狂犬病抗原肽刺激Th1细胞因子IL-2、TNFα、干扰素γ和CD107a。它们在CD4+和CD8+ T细胞中的表达分别显示在顶部和底部小图。将疫苗接种组(8只小鼠)与盐水对照组(5只小鼠)进行比较。将来自每组的细胞暴露于狂犬病抗原肽或培养基对照。
图10. 在两个剂量(第1天和第22天)后的六个月中，在范围为15 pg至0.15 ug的剂量下的构建体4的小鼠中通过RFFIT测定的中和抗体滴度的剂量-应答。用LNP RV39或LNPRV94配制构建体4。RABAVERT(空心圆形)；0.15 ug RV39(空心正方形)；0.15 ug RV94(虚线正方形)；0.0015 ug RV39空心三角形)；0.0015 ug RV94(虚线三角形)；0.000015 ug RV39(空心倒置三角形)；0.000015 ug RV94(虚线倒置三角形)。观察到，RV39和RV94 LNP制剂两者均产生相似的狂犬病nAb滴度，但对于RV39观察到的寿命更长。
图11. 在两个剂量(第1天和第22天)后持续六个月，在范围为15 pg至0.15 ug的剂量下的构建体4的小鼠中通过ELISA测定的IgG的剂量-应答。用LNP RV39或LNP RV94配制构建体4。RABAVERT(空心圆形)；0.15 ug RV39(空心正方形)；0.15 ug RV94(虚线正方形)；0.0015 ug RV39(空心三角形)；0.0015 ug RV94(虚线三角形)；0.000015 ug RV39(空心倒置三角形)；0.000015 ug RV94(虚线倒置三角形)。
序列的描述
SEQ ID NO:1 - 载体骨架 – VEE TC83 (空载体)
SEQ ID NO:2 - 构建体1编码序列
SEQ ID NO:3 - 构建体1氨基酸序列
SEQ ID NO:4 - 构建体2编码序列
SEQ ID NO:5 - 构建体2氨基酸序列
SEQ ID NO:6 - 构建体3编码序列
SEQ ID NO:7 - 构建体3氨基酸序列
SEQ ID NO:8 - 构建体4编码序列
SEQ ID NO:9 - 构建体4氨基酸序列。
发明详述
狂犬病病毒疫苗
狂犬病病毒属，弹状病毒科中的属，是一种具有单链反义RNA基因组的包膜病毒。其为一种嗜神经病毒，其通过中枢神经系统传播，导致大脑和脊髓的严重炎症。所述RNA编码五种基因，糖蛋白(G)、病毒RNA聚合酶(L)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)和磷蛋白(P)。G蛋白是保护性中和抗体的主要靶标。
狂犬病病毒属包含七种基因型，其中以下六种已经与人狂犬病病例相关：狂犬病病毒(RABV，基因型1)、莫科拉病毒(基因型3)、杜文海格病毒(基因型4)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒(基因型5)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒 2(基因型6)和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒 (基因型7)。一旦出现症状，狂犬病几乎百分之百致命。
疫苗接种是用于预防感染性疾病的最有效方法之一。然而，抗原的单次施用经常不足以赋予其完全免疫力和/或持久的应答。狂犬病目前需要多剂量疫苗接种。建立针对特定病原体的强烈和持久免疫力的方法包括将佐剂添加至佐剂和/或重复的疫苗接种，即通过施用一个或多个另外剂量的抗原来加强免疫应答。此类进一步施用可以用相同的疫苗(同源加强)或用不同的疫苗(异源加强)进行。用于同源加强的最常见方法不仅是施用相同的疫苗，而且还将其以与较早施用相同的剂量施用。
狂犬病疫苗目前主要用于暴露后预防，只有一小百分比狂犬病疫苗剂量用于暴露前预防。干预时间表由世界卫生组织根据病毒进入的伤口的严重程度和类型来定义，并且可以包括用抗狂犬病免疫球蛋白的额外治疗。暴露前预防通常涉及2至3次肌肉内剂量的2-3次随访，及根据暴露风险定时加强。暴露后预防通常涉及4-5次肌肉内剂量的3-5次随访或4次皮内剂量的4次随访。在一些欠发达国家，仍然通过在受感染动物的大脑中繁殖狂犬病病毒，灭活病毒并且提供每天皮下给予的14-21次注射到腹壁来进行免疫接种。
目前有几种狂犬病疫苗可用于人体暴露前和暴露后预防并且当在某些剂量方案中施用时由监管机构批准。IMOVAX (Sanofi Pasteur)作为从Wistar Institute获得的毒株PM-1503-3M制备的冷冻干燥的狂犬病病毒而提供。其从感染的人二倍体细胞收获然后灭活。暴露前和暴露后预防由在第0、7和21或28天肌肉内施用三次剂量组成。VERORAB(Sanofi Pasteur)作为从Wistar Institute获得的毒株PM/WI 38 1503-3M制备的冷冻干燥的狂犬病病毒提供。从Vero细胞收获然后灭活。暴露前预防由在第0、7和21或28天肌肉内施用三次剂量组成。暴露后预防由在第0、3、7、14和28天肌肉内施用五次剂量组成。VAXIRAB/ LYSSAVAC (Zydus Cadila/ Novavax)作为由狂犬病病毒的Pitman Moore毒株制备的冷冻干燥的狂犬病病毒提供。它在鸭胚细胞中产生然后灭活。暴露前预防由在第0、7和21或28天肌肉内施用三次剂量组成。暴露后预防由在第0、3、7、14和28天肌肉内施用五次剂量组成。暴露后预防也可以皮内施用，在第0、3、7和28天在两个部位的每一个处注射。RABAVERT (GSK)作为从Flury LEP(低胚传代)毒株制备的冷冻干燥的狂犬病病毒提供。它在鸡成纤维细胞的原代培养物中生长，然后灭活。暴露前预防由在第0、7和21或28天肌肉内施用三次剂量组成。暴露后预防由在第0、3、7、14和28天肌肉内施用五次剂量组成。
RABAVERT中存在的狂犬病病毒毒株Flury LEP从美国典型培养物保藏中心作为第59代卵获得。用于繁殖病毒的生长培养基是合成的细胞培养基，其中添加人白蛋白、处理的牛明胶(聚明胶肽(polygeline))和抗生素。该病毒用β-丙内酯灭活，并通过在蔗糖密度梯度中的区域离心进一步处理。在添加缓冲的聚明胶肽和谷氨酸钾的稳定剂溶液之后，将疫苗冻干。一个剂量(1.0 ml) RABAVERT的功效为近似2.5 IU狂犬病抗原。
过去已经尝试基于核酸的狂犬病疫苗，但已经证明其不如RABAVERT。将编码糖蛋白基因的狂犬病DNA疫苗和编码糖蛋白基因的狂犬病自扩增RNA疫苗直接与RABAVERT进行比较。与用表达狂犬病G蛋白的辛德比斯病毒RNA复制子或表达狂犬病G蛋白的DNA疫苗疫苗接种的那些相比，用RABAVERT疫苗接种的小鼠表明更稳健的T细胞增殖应答，增加的细胞因子产生和更高的抗体滴度。在针对狂犬病攻击进行保护中，辛德比斯病毒复制子疫苗也不如RABAVERT (Saxena等人 (2009) Veterinary Microbiol. 136:36)。
抗原、变体、片段和构建体
本发明提供了可用作免疫原性组合物的组分的构建体，其用于在受试者中诱导针对由狂犬病病毒引起的疾病的免疫应答。这些构建体可用于抗原的表达、其在治疗中的使用方法及其制备方法。“构建体”是基因工程改造的分子。“核酸构建体”是指基因工程改造的核酸，并且可以包含DNA、RNA或非天然存在的核酸单体。
在一些实施方案中，本文公开的构建体编码狂犬病病毒的野生型多肽序列、其变体或其片段。所述构建体可以进一步编码与狂犬病病毒的多肽序列异源的多肽序列。在一些实施方案中，所述构建体编码CVS11、CVS-N2C、Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA)、Flury、Pitman Moore或Wistar毒株的狂犬病病毒蛋白的多肽序列的野生型、变体和/或片段。此类抗原可以源自狂犬病病毒糖蛋白(G)、RNA聚合酶(L)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)和磷蛋白(P)。
多肽序列的“变体”包括当与参考序列相比时具有一个或多个氨基酸添加、取代和/或缺失的氨基酸序列。所述变体可以包含与全长野生型多肽、例如与根据SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。可替代地或另外，多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即，含有表位的片段)，其可以包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个或更多个与所述全长多肽的连续氨基酸序列相同的氨基酸的连续氨基酸序列或其组成。
在狂犬病病毒G抗原是野生型狂犬病病毒糖蛋白的变体的情况下，所述变体可以包含与全长野生型多肽、例如与根据SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列或由其组成。可替代地或另外，多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即，含有表位的片段)，其可以包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个或更多个与所述全长多肽的连续氨基酸序列相同的氨基酸的连续氨基酸序列或其组成。
如本文所用，术语“抗原”是指含有一个或多个表位(例如，线性、构象或两者)的分子，其将刺激宿主的免疫系统以产生体液和/或细胞抗原-特异性免疫应答(即，特异性识别天然存在的多肽的免疫应答)。“表位”是抗原的决定其免疫学特异性的该部分。
可以凭经验鉴定T-和B-细胞表位(例如，使用PEPSCAN或类似方法)。它们也可以通过已知方法(例如使用Jameson- Wolf抗原指数、基于矩阵的方法、TEPITOPE、神经网络、OptiMer & EpiMer、ADEPT、Tsites、亲水性或抗原指数预测。
可替代地或另外，本文的构建体编码狂犬病病毒G抗原。“狂犬病病毒G抗原”意指野生型狂犬病病毒糖蛋白、其变体或片段的氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。图1鉴定了几种全长狂犬病病毒G蛋白变体的核酸编码序列。
可替代地或另外，可以通过包含抗原的medoid序列来增加疫苗构建体的交叉保护性宽度。“medoid”是指与其他序列具有最小的差异性(dissimilarity)的序列。可替代地或另外，本发明的载体包含狂犬病G糖蛋白或其免疫原性片段的medoid序列。可替代地或另外，本发明的自扩增RNA构建体包含狂犬病G糖蛋白的medoid序列。可替代地或另外，medoid序列源自天然病毒毒株，其在NCBI数据库中注释的所有狂犬病G蛋白序列中具有最高的氨基酸同一性平均百分比。可替代地或另外，狂犬病G糖蛋白的medoid序列是NCBI毒株AGN94271。
作为遗传密码的冗余的结构，多肽可以由各种不同的核酸序列编码。偏爱编码，以与其他相比更多地使用一些同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。“密码子优化的”意指在不改变氨基酸序列的情况下对重组核酸的密码子组成进行修饰。密码子优化已用于通过使用生物体特异性的密码子使用频率来提高不同生物体中的mRNA表达。
除了密码子偏爱之外，且与密码子偏爱无关，比其他更频繁地使用一些同义密码子。此密码子对偏爱意味着一些密码子对被过度代表，而其他则被不足代表。密码子对去优化已被用于减少病毒毒力。例如，已报道，与野生型脊髓灰质炎病毒相比，经修饰以含有代表不足的密码子对的脊髓灰质炎病毒表明降低的翻译效率并且被减毒(WO 2008/121992;Coleman等人 (2008) Science 320:1784)。Coleman等人表明，通过密码子对去优化工程改造合成的减毒病毒可以产生编码与野生型相同的氨基酸序列、但使用同义密码子的不同成对排列的病毒。通过密码子对去优化减毒的病毒生成与野生型相比最多达1000倍减少的噬斑，产生更少的病毒颗粒，并且需要多达约100倍的病毒颗粒来形成噬斑。
相反，经修饰以含有在人基因组中过度代表的密码子对的脊髓灰质炎病毒以类似于野生型RNA的方式起作用，并且生成大小与野生型RNA相同的噬斑(Coleman等人 (2008)Science 320:1784)。发生这种情况，尽管存在以下事实：具有过度代表的密码子对的病毒含有与具有不足代表的密码子对的病毒类似数目的突变，并且表明与野生型相比增强的翻译。该观察表明，预期密码子对优化的构建体以类似于其非密码子对优化的对应物的方式起作用，并且不期望其提供功能优势。
可替代地或另外，本发明的构建体包含密码子优化的核酸序列。可替代地或另外，本发明的自扩增RNA构建体包含狂犬病糖蛋白或其免疫原性衍生物或片段的密码子优化的序列。可替代地或另外，本发明的自扩增RNA构建体包含Flury LEP野生型狂犬病糖蛋白或其免疫原性衍生物或片段的密码子优化的序列。
可替代地或另外，本发明的构建体包含密码子对优化的核酸序列。可替代地或另外，本发明的自扩增RNA构建体包含狂犬病糖蛋白或其免疫原性衍生物或片段的密码子对优化的序列或由其组成。可替代地或另外，本发明的自扩增RNA构建体包含Flury LEP野生型狂犬病糖蛋白或其免疫原性衍生物或片段的密码子对优化的序列或由其组成。
可替代地或另外，本文的构建体编码狂犬病病毒L抗原。“狂犬病病毒L抗原”意指已知的野生型狂犬病病毒RNA聚合酶、其变体或片段的氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。因此，在狂犬病病毒L抗原是野生型狂犬病病毒RNA聚合酶的变体的情况下，所述变体可以包含与全长野生型多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。可替代地或另外，多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即，含有表位的片段)，其可以包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个或更多个与所述全长多肽的连续氨基酸序列相同的氨基酸的连续氨基酸序列。
可替代地或另外，本文的构建体编码狂犬病病毒M抗原。“狂犬病病毒M抗原”意指已知的野生型狂犬病病毒基质蛋白、其变体或片段的氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。因此，在狂犬病病毒M抗原是野生型狂犬病病毒基质蛋白的变体的情况下，所述变体可以包含与全长野生型多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。可替代地或另外，多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即，含有表位的片段)，其可以包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个或更多个与所述全长多肽的连续氨基酸序列相同的氨基酸的连续氨基酸序列。
可替代地或另外，本文的构建体编码狂犬病病毒N抗原。“狂犬病病毒N抗原”意指野生型狂犬病病毒核蛋白、其变体或片段的氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。因此，在狂犬病病毒N抗原是野生型狂犬病病毒核蛋白的变体的情况下，所述变体可以包含与全长野生型多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。可替代地或另外，多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即，含有表位的片段)，其可以包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个或更多个与所述全长多肽的连续氨基酸序列相同的氨基酸的连续氨基酸序列。
可替代地或另外，本文的构建体编码狂犬病病毒P抗原。“狂犬病病毒P抗原”意指已知的野生型狂犬病病毒磷蛋白、其变体或片段的氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。因此，在狂犬病病毒P抗原是野生型狂犬病病毒磷蛋白的变体的情况下，所述变体可以包含与全长野生型多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。可替代地或另外，多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即，含有表位的片段)，其可以包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个或更多个与所述全长多肽的连续氨基酸序列相同的氨基酸的连续氨基酸序列。
可替代地或另外，构建体编码多肽的多于一种组分。所述组分紧挨着相邻组分并置，即没有任何间插氨基酸。可替代地或另外，在所述多肽组分中的一种或多种之间存在1、2、3、4或5个氨基酸的接头基团。
可替代地或另外，所述构建体含有包含一种或多种抗原的RNA核酸序列。多种抗原可以通过本发明的构建体共递送。本发明的构建体包含重组多顺反子核酸分子或由其组成，所述重组多顺反子核酸分子含有编码第一狂犬病病毒抗原和任选地第二抗原的第一序列，所述第二抗原可以是或可以不是狂犬病病毒抗原。如果期望，在重组RNA中可以存在一种或多种额外序列，其编码额外抗原，例如第三抗原、第四抗原、第五抗原等。可替代地或另外，本发明的构建体可以是多顺反子性的。
多肽
“多肽”意指定义为序列且通过酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。该术语与肽可互换使用。术语肽还包括通过化学或酶催化的反应引入的翻译后修饰，如本领域中所知。该术语可以指多肽的变体或片段。
可替代地或另外，本文的多肽呈非天然存在的形式(例如重组或修饰的形式)。本发明的多肽可以在C-末端和/或N-末端具有共价修饰。它们也可以采取各种形式(例如天然的，融合体，糖基化的，非糖基化的，脂质化的，非脂质化的，磷酸化的，非磷酸化的，肉豆蔻酰基化的，非肉豆蔻酰基化的，单体的，多聚的，颗粒的，变性的等)。所述多肽可以是天然或非天然糖基化的(即，所述多肽可以具有不同于在相应的天然存在的多肽中发现的糖基化模式的糖基化模式)。
除了狂犬病病毒抗原序列以外，本文的多肽的非天然存在的形式还可以包含一个或多个异源氨基酸序列(例如另一抗原序列，另一信号序列，可检测标签等)。例如，本文的多肽可以是融合蛋白。可替代地或另外，与天然存在的多肽序列相比，可以修饰所述多肽的氨基酸序列或化学结构(例如，具有一个或多个非天然氨基酸，通过共价修饰，和/或通过具有不同的糖基化模式，例如，通过除去或添加一个或多个糖基基团)。
可替代地或另外，所述构建体编码具有选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:9的序列的多肽。可替代地或另外，所述构建体编码与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的多肽。可替代地或另外，所述构建体编码包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的全长序列的片段的多肽，其中所述片段包含所述全长序列的氨基酸序列的连续延伸段，其比所述全长序列短最多达1、10、25、50、100、200、400、450或475个氨基酸。
核酸
术语“核酸”意指任何长度的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。其包括DNA、RNA和DNA/RNA杂合物。其还包括DNA或RNA类似物，诸如含有修饰的骨架(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。因此，本发明的核酸包括mRNA、DNA、cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体等。在所述核酸采取RNA的形式的情况下，其可以具有或可以不具有5'帽。
本发明人在本文公开了包含一种或多种编码狂犬病病毒抗原的核酸序列的核酸。如本文所公开的核酸可以采取各种形式(例如单链的，双链的，载体等)。核酸可以是环状或支链的，但通常是线性的。
本文使用的核酸优选以纯化或基本上纯化的形式提供，即基本上不含其他核酸(例如不含天然存在的核酸)，尤其不含其他狂犬病病毒或宿主细胞核酸，通常至少约50%纯(按重量计)，且通常至少约90%纯。
可以许多方式从基因组或cDNA文库制备核酸，例如，通过完全或部分化学合成(例如，DNA的亚磷酰胺合成)，通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸，通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)。
本文的核酸包含编码至少一种狂犬病病毒抗原的序列。通常，本发明的核酸将呈重组形式，即自然界中不存在的形式。例如，除了编码狂犬病病毒抗原的序列以外，所述核酸还可以包含一个或多个异源核酸序列(例如，编码另一抗原的序列和/或控制序列，诸如启动子或内部核糖体进入位点)。所述核酸可以是载体的一部分，即，经设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的一部分。载体可以是例如经设计以在宿主细胞中表达核苷酸序列的表达载体，或经设计以导致产生重组病毒或病毒样颗粒的病毒载体。
可替代地或另外，与编码狂犬病病毒抗原的天然存在的序列相比，可以修饰核酸的序列或化学结构。可以修饰所述核酸分子的序列，例如，以增加核酸的表达或复制的效力，或提供额外的稳定性或针对降解的抗性。可替代地或另外，本发明的疫苗构建体在体外测定中对RNA酶消化有抗性。
可以修饰编码上述多肽的核酸以增加翻译效力和/或半衰期。例如，所述核酸可以是密码子优化的或密码子对优化的。可以将聚A尾部(例如，约30个、约40个或约50个或更多个腺苷残基的)附接至RNA的3'末端以增加其半衰期。RNA的5'末端可以用具有结构m7G(5')ppp(5')N(帽0结构)的修饰的核糖核苷酸或其衍生物加帽，所述修饰的核糖核苷酸或其衍生物可以在RNA合成期间并入或可以在RNA转录之后酶促工程改造(例如，通过使用由以下组成的牛痘病毒加帽酶(VCE)：mRNA三磷酸酶、鸟苷基-转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构在维持RNA分子的稳定性和翻译效力中发挥重要作用。RNA分子的5'帽可以通过2'-O-甲基转移酶进一步修饰，其导致生成帽1结构(m7Gppp [m2 '-Ο] N)，其可进一步增加翻译效力。
所述核酸可以包含一种或多种核苷酸类似物或修饰的核苷酸。如本文所用，“核苷酸类似物”或“修饰的核苷酸”是指在核苷酸的含氮碱基(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))中或上含有一个或多个化学修饰(例如，取代)的核苷酸。核苷酸类似物可以在核苷的糖部分(例如，核糖、脱氧核糖、修饰的核糖、修饰的脱氧核糖、六元糖类似物或开链糖类似物)中或上或磷酸酯部分中或上含有另外的化学修饰。许多修饰的核苷和修饰的核苷酸是市售的。
可以并入修饰的核苷和核苷酸中且存在于RNA分子中的修饰的核碱基包括：m5C(5-甲基胞苷)；m5U (5-甲基尿苷)；m6A (N6-甲基腺苷)；s2U (2-硫尿苷)；Um (2'-0-甲基尿苷)；mlA (1-甲基腺苷)；m2A (2-甲基腺苷)；Am (2-1-O-甲基腺苷)；ms2m6A (2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A (N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A (2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A (N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A (2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A (N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷)；t6A (N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷)；ms2t6A (2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷)；m6t6A (N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰腺苷)；ms2hn6A (2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰腺苷)；Ar(p) (2'-0-核糖基腺苷(磷酸酯))；I (肌苷)；mil (1-甲基肌苷)；m'lm (l ,2'-0-二甲基肌苷)；m3C (3-甲基胞苷)；Cm (2T-0-甲基胞苷)；s2C (2-硫胞苷)；ac4C (N4-乙酰基胞苷)；f5C (5-fonnyl胞苷)；m5Cm (5,2-O-二甲基胞苷)；ac4Cm (N4乙酰基2TO甲基胞苷)；k2C (lysidine)；mlG(1-甲基鸟苷)；m2G (N2-甲基鸟苷)；m7G (7-甲基鸟苷)；Gm (2'-0-甲基鸟苷)；m22G (N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm (N2,2'-0-二甲基鸟苷)；m22Gm (N2,N2,2'-0-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2'-0-核糖基鸟苷(磷酸酯))；yW (怀丁苷)；o2yW (过氧怀丁苷)；OHyW (羟基怀丁苷)；OHyW* (修饰不足的羟基怀丁苷)；imG (怀俄苷)；mimG (甲基鸟苷)；Q (辫苷)；oQ (环氧辫苷)；galQ (半乳糖基-辫苷)；manQ (甘露糖基-辫苷)；preQo (7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQi(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G* (archaeosine)；D (二氢尿苷)；m5Um (5,2'-0-二甲基尿苷)；s4U (4-硫尿苷)；m5s2U (5-甲基-2-硫尿苷)；s2Um (2-硫基-2'-0-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U (5-羟基尿苷)；mo5U (5-甲氧基尿苷)；cmo5U (尿苷5-羟乙酸)；mcmo5U (尿苷 5-羟乙酸甲酯)；chm5U (5-(羧基羟基甲基)尿苷))；mchm5U (5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U (5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um (S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U (5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2U (5-氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5U (5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U (5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm5U (5-氨基甲酰甲基尿苷)；ncm5Um (5-氨基甲酰甲基-2'-0-甲基尿苷)；cmnm5U (5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cnmm5Um (5-羧基甲基氨基甲基-2-L- O甲基尿苷)；cmnm5s2U (5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；m62A (N6,N6-二甲基腺苷)；Tm (2'-0-甲基肌苷)；m4C (N4-甲基胞苷)；m4Cm (N4,2-0-二甲基胞苷)；hm5C (5-羟基甲基胞苷)；m3U (3-甲基尿苷)；cm5U (5-羧基甲基尿苷)；m6Am (N6,T-0-二甲基腺苷)；rn62Am (N6,N6,0-2-三甲基腺苷)；m2'7G (N2,7-二甲基鸟苷)；m2'2'7G (N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um (3,2T-0-二甲基尿苷)；m5D (5-甲基二氢尿苷)；£5Cm (5-甲酰基-2'-0-甲基胞苷)；mlGm (l ,2'-0-二甲基鸟苷)；m'Am (1 ,2-O-二甲基腺苷) irino甲基尿苷)；tm5s2U (S-牛磺酸甲基-2-硫尿苷))；iniG-14 (4-去甲基鸟苷)；imG2 (异鸟苷)；ac6A(N6-乙酰基腺苷)；次黄嘌呤；肌苷；8-氧代-腺嘌呤；其7-取代的衍生物，二氢尿嘧啶；假尿嘧啶；2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-氨基尿嘧啶；5-(Ci-Ce)-烷基尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶；5-(C2-Ce)-炔基尿嘧啶；5-(羟基甲基)尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羟基胞嘧啶；5-(Ci-C6 )-烷基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶；5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；N2-二甲基鸟嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤；7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤；7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤；7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤；8-羟基鸟嘌呤；6-硫鸟嘌呤；8-氧代鸟嘌呤；2-氨基嘌呤；2-氨基-6-氯嘌呤；2,4-二氨基嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；8-氮杂嘌呤；取代的7-脱氮嘌呤；7-脱氮-7-取代的嘌呤；7-脱氮-8-取代的嘌呤；氢(无碱基残基)；m5C；m5U；m6A；s2U；W；或2'-0-甲基-U。这些修饰的核碱基及其相应的核糖核苷中的许多可得自商业供应商。
可替代地或另外，所述构建体包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的DNA核酸序列。可替代地或另外，所述构建体包含与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列。可替代地或另外，所述构建物包含核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:8的全长序列的片段，其中所述片段包含所述全长序列的核酸序列的连续延伸段，其比所述全长序列短最多达1、10、25、50、100、200、300、400、450或475个核酸。
基于核酸的疫苗
本发明公开了包含核酸序列的组合物，所述核酸序列编码包含狂犬病病毒抗原、其变体或片段的多肽。此类组合物可以是基于核酸的疫苗。也可以提供包含编码一种或多种额外狂犬病病毒抗原的核酸序列的另外的组合物作为基于核酸的疫苗。可替代地或另外，组合物包含编码来自第一狂犬病病毒毒株的狂犬病病毒抗原的核酸序列和编码来自一种或多种狂犬病病毒的其他毒株的狂犬病病毒抗原的额外核酸序列。可替代地或另外，组合物包含编码狂犬病病毒抗原和额外狂犬病病毒抗原的核酸序列。或者，可以编码额外非狂犬病病毒抗原。
所述核酸可以例如是RNA(即，基于RNA的疫苗)或DNA(即，基于DNA的疫苗，诸如质粒DNA疫苗)。可替代地或另外，所述基于核酸的疫苗是基于RNA的疫苗。可替代地或另外，所述基于RNA的疫苗包含自扩增RNA分子。所述自扩增RNA分子可以是甲病毒衍生的RNA复制子。
如本文所用，术语“甲病毒”具有本领域中的其常规含义，并且包括各种物种，例如委内瑞拉马脑炎病毒(VEE，例如特立尼达驴、TC83CR等)，塞姆利基森林病毒(SFV)，辛德比斯病毒，罗斯河病毒，西部马脑炎病毒，东部马脑炎病毒，基孔肯雅病毒，S.A. AR86病毒，埃沃格雷病毒，Mucambo病毒，巴马森林病毒，米德尔堡病毒，皮舒纳病毒，阿尼昂尼昂病毒，盖塔病毒，鹭山病毒，比巴鲁病毒，马雅罗病毒，乌纳病毒，Aura病毒，瓦塔罗阿病毒，Banbanki病毒，孜拉加奇病毒，高地J病毒，Fort Morgan病毒，恩杜穆病毒和Buggy Creek病毒。术语甲病毒还可以包括含有来自多于一种甲病毒的基因组序列的嵌合甲病毒。
“甲病毒复制子颗粒”(VRP)或“复制子颗粒”是包装有甲病毒结构蛋白的甲病毒复制子。
“甲病毒复制子”(或“复制子”)是RNA分子，其可以在靶标细胞中指导其自身的体内扩增。所述复制子编码催化RNA扩增的一种或多种聚合酶，并且含有复制所需的顺式RNA序列，其被编码的一种或多种聚合酶识别和利用。甲病毒复制子通常含有以下有序元件：顺式复制所需的5'病毒序列，编码生物活性的甲病毒非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列，顺式复制所需的3'病毒序列以及聚腺苷酸束。甲病毒复制子还可以含有一个或多个指导异源核苷酸序列的表达的病毒亚基因组“接合区域”启动子，其可以进行修饰以便增加或减少待表达的亚基因组片段和一个或多个异源序列的病毒转录。
“自扩增RNA”和“ RNA复制子”可互换使用，以意指具有自我复制的能力的RNA。本发明的自扩增RNA分子包含编码一种或多种抗原的mRNA。该mRNA可以替代编码产生感染性病毒所需的结构蛋白的核酸序列。可以通过酶促转录在体外产生RNA，由此避免与疫苗的细胞培养产生相关的制备问题。用本发明的自扩增RNA分子免疫之后，在转染细胞的细胞质中发生RNA分子的复制和扩增，并且所述核酸没有整合至基因组中。由于RNA没有整合至基因组中并转化靶细胞，所以自扩增RNA疫苗不构成重组DNA疫苗面临的安全障碍。
自扩增RNA分子是本领域中已知的，并且可以通过使用衍生自例如甲病毒的复制元件并用编码目标蛋白的核苷酸序列取代结构病毒蛋白来产生。自扩增RNA分子通常是正链分子，其可以在递送至细胞之后直接翻译。该翻译提供了RNA-依赖性RNA聚合酶，其然后从递送的RNA产生反义和有义转录物。因此，递送的RNA导致产生多种子代RNA。这些子代RNA以及共线的亚基因组转录物可以自身翻译以提供编码的抗原(例如，狂犬病病毒抗原)的原位表达，或者可以转录以提供与递送的RNA同义的另外的转录物，然后将其翻译以提供所述抗原的原位表达。该转录序列的总体结果是引入的复制子RNA的数目的大量扩增，且因此编码的抗原变为细胞的主要多肽产物。
用于以这种方式实现自复制的一种合适系统是使用基于甲病毒的复制子。这些复制子是正链RNA，其导致在将其递送至细胞后复制酶(或复制酶-转录酶)的翻译。所述复制酶被翻译为多蛋白，其自动切割以提供复制复合物，所述复制复合物产生正链递送的RNA的基因组链拷贝。这些负链转录物本身可以被转录以产生正链亲代RNA的进一步拷贝，并且还产生编码所述抗原的亚基因组转录物。所述亚基因组转录物的翻译导致感染的细胞原位表达所述抗原。合适的甲病毒复制子可以使用来自辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可以使用突变型或野生型病毒序列，例如，已经在复制子中使用VEEV的减毒TC83突变体。
自扩增RNA含有mRNA的基本元件，即，帽、5’UTR、3’UTR和聚(A)尾部。它们额外包含编码非结构病毒基因的大开放阅读框(ORF)和一个或多个亚基因组启动子。非结构基因(包括聚合酶)形成细胞内RNA复制工厂并以高水平转录亚基因组RNA。编码一种或多种疫苗抗原的该mRNA在细胞中扩增，产生高水平的mRNA和抗原表达。
可替代地或另外，本文所述的自扩增RNA分子编码(i)可以从自扩增RNA分子转录RNA的RNA-依赖性RNA聚合酶和(ii)狂犬病病毒抗原。所述聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如，包含非结构甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一种或多种。
尽管天然的甲病毒基因组除了非结构复制酶多蛋白以外还编码结构病毒粒子蛋白，但可替代地或另外，所述自扩增RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，所述自扩增RNA可以导致其自身在细胞中的基因组RNA拷贝的产生，但不导致含有RNA的病毒粒子的产生。无法产生这些病毒粒子意味着，与野生型甲病毒不同，所述自扩增RNA分子无法以感染性形式自我永存。在野生型病毒中永存所必需的甲病毒结构蛋白在本发明的自扩增RNA中不存在，并且它们的位置被编码目标免疫原的基因采用，使得所述亚基因组转录物编码免疫原而不编码结构甲病毒病毒粒子蛋白。
因此，可用于本发明的自扩增RNA分子可以具有两个开放阅读框。第一开放阅读框编码复制酶；第二开放阅读框编码抗原。可替代地或另外，所述RNA可以具有一个或多个额外(例如下游)开放阅读框，例如编码另外的抗原或编码辅助多肽。
可替代地或另外，本文公开的自扩增RNA分子具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增强RNA的体内翻译。可替代地或另外，必须选择所述自扩增RNA分子的5'序列以确保与编码的复制酶的相容性。
自扩增RNA分子可以具有3'聚-A尾部。其还可以在其3'末端附近包括聚-A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。
自扩增RNA分子可以具有各种长度，但其通常为5000-25000个核苷酸长。自扩增RNA分子将通常是单链的。单链RNA通常可以通过结合TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR来起始佐剂作用。以双链形式递送的RNA(dsRNA)可以结合TLR3，并且该受体也可以由dsRNA触发，所述dsRNA在单链RNA的复制期间或在单链RNA的二级结构内形成。
可以通过体外转录(IVT)方便地制备所述自扩增RNA。IVT可以使用这样的cDNA模板，其以质粒形式在细菌中产生和繁殖，或者例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程改造方法合成产生。例如，DNA-依赖性RNA聚合酶，诸如噬菌体T7、T3或SP6 RNA聚合酶，可用于从DNA模板转录自扩增RNA。可以根据需要使用适当的加帽和聚-A添加反应(尽管所述复制子的聚-A通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶可以对转录的一个或多个5'核苷酸具有严格的要求，并且在一些实施方案中，这些要求必须与编码的复制酶的要求相匹配，以确保IVT-转录的RNA可以作为其自身编码的复制酶的底物有效地发挥功能。
除了任何5'帽结构以外，所述自扩增RNA可以包括一个或多个具有修饰的核碱基的核苷酸。理想地，用于本发明的RNA仅在核苷之间包括磷酸二酯键，但在一些实施方案中，其可以含有氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯键。
所述自扩增RNA分子可以编码单一异源多肽抗原(即，狂犬病病毒抗原)，或任选地，以所述序列各自当表示为氨基酸序列时保留其同一性(例如，串联连接)的方式连接在一起的两个或更多个异源多肽抗原。从所述自扩增RNA生成的异源多肽然后可以作为融合多肽产生，或以使得产生分开的多肽或肽序列的方式进行工程改造。
可以将本文所述的自扩增RNA分子进行工程改造以从两个或更多个开放阅读框表达多个核苷酸序列，由此允许蛋白、诸如一种、两种或更多种狂犬病病毒抗原(例如一种、两种或狂犬病病毒抗原)与细胞因子或其他免疫调节剂(其可以增强免疫应答的生成)一起共表达。这种自扩增RNA分子例如在同时产生各种基因产物(例如，蛋白)、例如作为二价或多价疫苗中可能尤其有用。
如果期望，可以使用本领域技术人员已知的各种体外或体内测试方法来筛选或分析所述自扩增RNA分子，以证实其治疗和预防特性。例如，快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)可以测量狂犬病病毒中和活性的水平。可以测试包含自扩增RNA分子的疫苗对诱导的特定目标淋巴细胞类型(例如，B细胞、T细胞、T细胞系或T细胞克隆)的增殖或对其效应功能的作用。例如，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞，并且测试细胞毒性T淋巴细胞裂解含有编码狂犬病病毒抗原的自扩增RNA分子的自体靶标细胞的能力。另外，T辅助细胞分化可以通过如下分析，通过ELISA或通过细胞质细胞因子染色和流式细胞术直接在CD4+ T细胞中测量TH1(IL-2和IFN-γ)和/或TH2(IL-4和IL-5)细胞因子的增殖或产生。
还可以测试编码狂犬病病毒抗原的自扩增RNA分子诱导体液免疫应答的能力，如例如通过对于目标狂犬病病毒抗原特异性的抗体的B细胞产生的诱导所证明。可以使用例如来自免疫个体的外周B淋巴细胞进行这些测定。此类测定方法是本领域技术人员已知的。可用于表征自扩增RNA分子的其他测定法可以涉及检测由靶标细胞对编码的狂犬病病毒抗原的表达。例如，荧光活化的细胞分选(FACS)可用于检测在细胞表面上或细胞内的抗原表达。FACS选择的另一个优点是可以分选不同表达水平，有时可能期望较低的表达水平。用于鉴定表达特定抗原的细胞的其他合适方法涉及使用板上的单克隆抗体的淘选或使用包被有单克隆抗体的磁珠的捕获。
可替代地或另外，提供了编码自扩增RNA分子的DNA序列，并且可以选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。可替代地或另外，编码自扩增RNA分子的DNA序列包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的序列。可替代地或另外，编码自扩增RNA分子的DNA序列包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的全长序列的片段或由其组成，其中所述片段包含所述全长序列的核酸序列的连续延伸段或由其组成，所述连续延伸段比全长序列短最多达1、10、25、50、100、200、300、400、450或475个核酸。
基于脂质的递送系统
本发明的基于核酸的疫苗可以包含非病毒递送系统，例如基于脂质的递送系统。这些系统可以将自扩增RNA疫苗有效地递送至细胞的内部，然后可以在细胞的内部复制并表达编码的一种或多种抗原。
所述递送系统可以具有佐剂作用，其增强编码的狂犬病病毒抗原的免疫原性。例如，可以将所述核酸分子封装在脂质体或无毒的可生物降解的聚合物微粒中。可替代地或另外，基于核酸的疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)递送系统。可替代地或另外，所述核酸分子可以作为阳离子纳米乳剂(CNE)递送。可替代地或另外，所述基于核酸的疫苗可以包含裸核酸，诸如裸RNA(例如mRNA)，但基于脂质的递送系统是优选的。
“脂质纳米颗粒(LNP)”是其中可以封装核酸分子(例如RNA)的非病毒粒子脂质体颗粒。LNP递送系统和无毒的可生物降解的聚合物微粒及其制备方法是本领域中已知的。所述颗粒可以包括一些外部RNA(例如在颗粒的表面上)，但至少一半的RNA(且优选其中全部)被封装。脂质体颗粒可以例如由两性离子、阳离子和阴离子脂质的混合物形成，所述脂质可以是饱和或不饱和的，例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)(两性离子的，饱和的)，1,2-二亚油基氧基(dilinoleyoxy)-3-二甲基氨基丙烷(DlinDMA)(阳离子的，不饱和的)和/或1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油(DMG)(阴离子的，饱和的)。用于本发明的优选的LNP包括两性离子脂质，其可以形成脂质体，任选地与至少一种阳离子脂质(诸如N- [1-(2,3-二油酰氧基)丙基] –N,N,N-三甲基铵甲基硫酸-酯(DOTAPBis(2-甲基丙烯酰基)氧基乙基二硫化物(DSDMA)、2,3-二油基氧基-1-(二甲基氨基)丙烷(DODMA)、1,2-二亚油基氧基(dilinoleyoxy)-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)等)。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物是尤其有效的。可替代地或另外，所述LNP为RV01脂质体。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
可替代地或另外，所述LNP包含中性脂质、阳离子脂质、胆固醇和聚乙二醇(PEG)，且形成涵盖自扩增RNA的纳米颗粒。在一些实施方案中，本文的阳离子脂质包含式I的结构：
Figure 132244DEST_PATH_IMAGE002
式I
其中n = 1至3的整数，且
(i)R1为CH3，R2和R3均为H，且Y为C；或
(ii) R1和R2共同地为CH2–CH2，且与氮一起形成五元、六元或七元杂环烷基，R3为CH3，且Y为C；或
(iii)R1为CH3，R2和R3均不存在，且Y为O；
其中o为0或1；
其中X为：
(i)
Figure DEST_PATH_IMAGE003
，其中R4和R5独立地为在ω 6和9位置中的一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的C10-20烃链；或
(ii)–CH(–R6)–R7，其中
(1)R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8或–Cp–R8；
(2)R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’或–Cp’–R8’，
(3)p和p’独立地为0、1、2、3或4；且
(4)R8和R8’独立地为
(A)在ω 6和9位置中的一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；
(B)–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；
(C)–C6-16饱和烃链；
(D)–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；
(E)–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；和
(F)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，R1为CH3，R2和R3均为H，且Y为C。在一些实施方案中，R1和R2共同地为CH2–CH2，且与氮一起形成五元、六元或七元杂环烷基，R3为CH3，且Y为C。在一些实施方案中，R1为CH3，R2和R3均不存在，且Y为O。
在一个实施方案中，X为
Figure 49385DEST_PATH_IMAGE004
，其中R4和R5独立地为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的C10-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
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在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
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在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
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在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
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在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；R8为–C6-16饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为在ω 6和9位置中的任一个或两个处具有一个或两个顺式烯基的–C8-20烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，X为–CH(–R6)–R7，R6为–Cp–R8，R7为–Cp’–R8’，p和p’独立地为0、1、2、3或4；且R8为–C6-16饱和或不饱和烃链；且R8’为–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV28：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV31：
Figure 891439DEST_PATH_IMAGE006
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV33：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV37：
Figure 348965DEST_PATH_IMAGE008
。
在一个实施方案中，所述LNP包含阳离子脂质RV39，即2,5-双(4-(二甲基氨基)丁酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)苄酯)：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV42：
Figure 163337DEST_PATH_IMAGE010
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV44：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV73：
Figure 48117DEST_PATH_IMAGE012
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV75：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV81：
Figure 315150DEST_PATH_IMAGE014
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV84：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV85：
Figure 576367DEST_PATH_IMAGE016
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV86：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV88：
Figure 331000DEST_PATH_IMAGE018
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV91：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV92：
Figure 324364DEST_PATH_IMAGE020
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV93：
Figure DEST_PATH_IMAGE021
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是二辛酸2-(5-((4-((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧杂戊基)丙烷-1,3-二基酯( RV94)，其具有以下结构：
Figure 141010DEST_PATH_IMAGE022
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV95：
Figure DEST_PATH_IMAGE023
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV96：
Figure 878022DEST_PATH_IMAGE024
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV97：
Figure DEST_PATH_IMAGE025
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV99：
Figure 463724DEST_PATH_IMAGE026
。
在一个实施方案中，示例性阳离子脂质是具有以下结构的RV101：
Figure DEST_PATH_IMAGE027
。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质选自：RV39、RV88和RV94。
用于合成具有式I和RV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99和RV101的化合物的组合物和方法可以在2014年12月17日提交的PCT/US2014/070882(公开号WO/2015/095340)和PCT/US2014/070891(公开号WO/2015/095346)；以及在2015年9月4日提交的PCT/US2015/048535(公开号WO/2016/037053)中找到。
RNA与脂质的比率可以变化。核苷酸(N)与磷脂(P)的比率可以在以下范围内：例如1N:1P、2N:1P、3N:1P、4N:1P、5N:1P、6N:1P、7N:1P、8N:1P、9N:1P或10N:1P。核苷酸(N)与磷脂(P)的比率可以在以下范围内：例如1N:1P至10N:1P，2N:1P至8N:1P，2N:1P至6N:1P或3N:1P至5N:1P。可替代地或另外，核苷酸(N)与磷脂(P)的比率为4N:1P。
可替代地或另外，基于核酸的疫苗包含阳离子纳米乳剂(CNE)递送系统。阳离子水包油乳剂可用于将带负电荷的分子(诸如RNA分子)递送至细胞内部。乳剂颗粒包含疏水性油核和阳离子脂质，其后者可以与RNA相互作用，由此将其锚定至乳剂颗粒。在CNE递送系统中，将编码抗原的核酸分子(例如，RNA)与阳离子水包油乳剂的颗粒复合。
因此，在本发明的基于核酸的疫苗中，可以将编码狂犬病病毒抗原的RNA分子与阳离子水包油乳剂的颗粒复合。所述颗粒通常包含在25℃下呈液相的油核(例如植物油或角鲨烯)，阳离子脂质(例如磷脂)和任选表面活性剂(例如脱水山梨醇三油酸酯，聚山梨酯80)；也可以包括聚乙二醇。可替代地或另外，所述CNE包含角鲨烯和阳离子脂质，诸如1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)。在一个实施方案中，所述CNE是用聚山梨酯稳定的DOTAP和角鲨烯的水包油乳剂。
本发明的LNP和CNE递送系统在引发体液和细胞免疫应答中可以尤其有效。这些递送系统的优点还包括不存在限制性的抗载体免疫应答。
药物组合物、免疫原性组合物
本发明提供了包含核酸的组合物，所述核酸包含编码狂犬病病毒多肽、例如狂犬病病毒抗原的序列。所述组合物可以是药物组合物，例如，免疫原性组合物或疫苗组合物。因此，所述组合物还可以包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述狂犬病病毒是狂犬病病毒。
“药学上可接受的载体”包括本身不诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体的任何载体。本发明的组合物还可以含有药学上可接受的稀释剂，诸如水、无菌无热原水、盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、甘油等。另外，可以存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
药物组合物可以包括在普通水(例如注射用水“w.f.i.”)中或在缓冲液、例如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中在本文别处描述的构建体、核酸序列和/或多肽序列。缓冲盐将通常包括在5-20 mM范围内。药物组合物可以具有在5.0和9.5之间、例如在6.0和8.0之间的pH。组合物可以包括钠盐、例如氯化钠，以提供张力。10 ± 2 mg/ml NaCl的浓度是典型的，例如约9 mg/ml。组合物可以包括金属离子螯合剂。这些可以通过除去可以加速磷酸二酯水解的离子来延长RNA稳定性。因此，组合物可以包括EDTA、EGTA、BAPTA、戊酸等中的一种或多种。此类螯合剂通常以10 -500μM之间、例如0.1 mM存在。柠檬酸盐，诸如柠檬酸钠，也可以充当螯合剂，同时有利地还提供缓冲活性。
药物组合物可以具有在200 mOsm/kg和400 mOsm/kg之间、例如在240-360 mOsm/kg之间或在290-310 mOsm/kg之间的重量摩尔渗透压浓度。药物组合物可以包括一种或多种防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。无汞的组合物是优选的，并且可以制备无防腐剂的疫苗。药物组合物可以是防腐的或无菌的。药物组合物可以是无热原的，例如，含有<1 EU(内毒素单位，一种标准量度)/剂量，且优选<0.1 EU/剂量。药物组合物可以无谷蛋白。药物组合物可以以单位剂型制备。可替代地或另外，单位剂量可以具有在0.1 - 2.0 ml之间、例如约1.0或0.5 ml的体积。
本发明的组合物可以与或不与佐剂一起施用。可替代地或另外，所述组合物可以包含一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)或与一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)结合施用，具体而言其中所述组合物包含免疫有效量的编码狂犬病病毒抗原的核酸。
“佐剂”意指增强、刺激、活化、加强或调节对组合物的活性成分的免疫应答的试剂。佐剂作用可以在细胞或体液水平或两者上发生。佐剂刺激免疫系统对实际抗原的应答，但本身没有免疫作用。可替代地或另外，本发明的佐剂组合物可以包含一种或多种免疫刺激剂。“免疫刺激剂”意指无论是与抗原一起施用还是单独施用均诱导受试者的免疫应答的总体暂时性增加的试剂。
使用方法
提供了用于在有此需要的受试者中诱导针对由狂犬病病毒引起的疾病的免疫应答的方法，其包括施用免疫有效量的如本文所公开的构建体或组合物的步骤。在一些实施方案中，提供了本文公开的构建体或组合物用于在有此需要的受试者中诱导针对狂犬病病毒抗原的免疫应答的用途。在一些实施方案中，提供了如本文所公开的构建体或组合物在制备在受试者中诱导针对狂犬病病毒的免疫应答的药物中的用途。
“受试者”意为脊椎动物，诸如哺乳动物，例如人或兽医哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。
施用途径
本文公开的组合物通常将直接施用于受试者。直接递送可以通过肠胃外注射、例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、真皮内注射或注射至组织的间隙来完成。可以将编码狂犬病病毒抗原的自扩增RNA预防性或治疗性给予所有年龄的个体。当预防性给予、例如施用于狂犬病流行地区的居民或至狂犬病流行地区的旅客时，给药时间表可以由三个剂量、两个剂量或一个剂量组成。可替代地或另外，预防性施用一个剂量。当治疗性给予、例如在狂犬病暴露之后施用时，给药时间表可以由五个剂量、四个剂量、三个剂量、两个剂量或一个剂量组成。在一个优选实施方案中，治疗性施用一个或两个剂量。
如本文所用，施用组合物、“随后”施用组合物表示在施用第一组合物和施用第二组合物之间已经经过时间间隔，而无论第一和第二组合物是相同还是不同。
制备和配制的方法
可替代地或另外，制备自扩增RNA的方法包括体外转录(IVT)的步骤。在一些实施方案中，制备自扩增RNA的方法包括IVT以产生RNA、随后将5’二核苷酸m7G(5’)ppp(5’)G反应加帽的步骤，并且进一步包括组合RNA与非病毒递送系统的步骤。可替代地或另外，制备自扩增RNA的方法包括IVT以产生RNA的步骤，并且进一步包括组合RNA与基于脂质的递送系统的步骤。
序列同一性
关于序列的同一性在本文中定义为，在比对序列并按需要引入空位以达到最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分以后与参考氨基酸序列相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。
序列同一性可以通过标准方法确定，所述标准方法通常用于比较两个多肽的氨基酸位置的相似性。使用计算机程序诸如BLAST或FASTA，比对两个多肽以使它们各自的氨基酸最佳匹配(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预定部分)。程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，以及评分矩阵、诸如PAM 250或swgapdnamt可以与计算机程序结合使用。在一个实施方案中，空位开放罚分为15，空位延伸罚分为6.66，空位分离罚分范围为8，且比对延迟的同一性百分比为40。通过实例的方式，百分比同一性可以计算为相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和引入较短序列中以便比对两个序列的空位数之和。
在本发明通过参考UniProt或GenBank登录码指代序列的情况下，所指的序列是截至本申请的提交日期的当前版本。
技术人员会认识到，改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对蛋白的个别取代、缺失或添加是这样的"免疫原性衍生物"，其中所述改变导致在功能上类似的氨基酸对氨基酸的取代或者不会影响免疫原性功能的残基的取代/缺失/添加。
提供在功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域中众所周知的。一般而言，此类保守取代将落入下文详细说明的氨基酸分组之一中，尽管在一些情况下，其他取代也会是可能的，而不实质上影响所述抗原的免疫原性特性。以下八组各自含有通常彼此保守取代的氨基酸：
1) 丙氨酸 (A)、甘氨酸 (G)；
2) 天冬氨酸 (D)、谷氨酸 (E)；
3) 天冬酰胺 (N)、谷氨酰胺 (Q)；
4) 精氨酸 (R)、赖氨酸 (K)；
5) 异亮氨酸 (I)、亮氨酸 (L)、甲硫氨酸 (M)、缬氨酸 (V)；
6) 苯丙氨酸 (F)、酪氨酸 (Y)、色氨酸 (W)；
7) 丝氨酸 (S)、苏氨酸 (T)；和
8) 半胱氨酸 (C)、甲硫氨酸 (M)。
合适地，此类取代不发生在表位区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。
免疫原性衍生物还可以包括与参考序列相比在其中插入了另外氨基酸的那些。合适地，此类插入不发生在表位区域中，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。插入的一个实例包括组氨酸残基的短延伸段(例如2-6个残基)以帮助目标抗原的表达和/或纯化。
免疫原性衍生物包括与参考序列相比其中已经缺失氨基酸的那些。合适地，这样的缺失不发生在表位区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。
技术人员会认识到，特定的免疫原性衍生物可以包含取代、缺失和添加(或它们的任意组合)。
除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。单数术语"一个/种(a)"、"一个/种(an)"和"所述/该"包括复数指示对象，除非上下文清楚地另外指示。类似地，词语"或"意在包括"和"，除非上下文清楚地另外指示。术语"复数"是指两个/种或更多。另外，关于物质的浓度或水平(例如溶液组分浓度或其比率)和反应条件(例如温度、压力和循环时间)给出的数值限制旨在是近似的。本文使用的术语“约”意指量±10％。
现在将通过以下非限制性实施例的方式进一步描述本发明。在以下实施例中显示的结果表明，当在各种脂质组合物中配制时，编码狂犬病病毒抗原的自扩增RNA可以传递有效且持久的免疫力。它们易于制备、低剂量的有效性以及优于现有疫苗的优势在狂犬病预防和暴露后治疗中提供了重大突破。
实施例
实施例1：具有狂犬病病毒抗原的SAM的构建设计
本发明人使用衍生自甲病毒复制子的合成的自扩增mRNA (“SAM”)开始对狂犬病病毒疫苗的工作。选择衍生自VEE TC-83 (SEQ ID NO:1)的SAM载体作为用于克隆的骨架。通过该载体表达目标狂犬病病毒抗原，并使用体外和体内模型评估其稳健的抗原产生、免疫原性和效力。
表1. SAM-狂犬病G蛋白构建体
Figure 955885DEST_PATH_IMAGE028
本发明的SAM狂犬病构建体通过表1和图1A中描述的构建体举例说明。这些构建体都表达狂犬病全长糖蛋白(“G”)。构建体1编码medoid G蛋白序列，并且与狂犬病病毒的Flury-HEP和ERA菌株密切相关。构建体2编码Flury-LEP菌株(其为许可的RABAVERT疫苗的菌株)的野生型序列(GenBank GU565703.1)。构建体3和4衍生自Flury-LEP菌株的野生型序列。构建体3使用由GENEWIZ提供的专有生物信息学平台进行密码子优化。基于Coleman等人(2008) Science 320:1784描述的用于密码子对去优化的表格，将构建体4进行密码子对优化。使用由Coleman等人鉴定的高评分，手动进行密码子对优化而不使用生物信息学工具或计算算法。构建体1-4的DNA序列的比对比较显示于图1B中。
实施例2：SAM狂犬病病毒抗原的体外表达
进行Western印迹分析以确定转基因是否从SAM狂犬病构建体表达。BHK细胞(1 x 106)用2.5 ug来自构建体1-4的RNA进行转染。20小时后，收集细胞提取物，并通过SDS凝胶电泳、随后用小鼠抗狂犬病糖蛋白抗体MAB8727 (Millipore Sigma, BillericaMassachusetts, US)的western印迹分析，来分析狂犬病G蛋白的产生。与一抗孵育之后，将膜洗涤，且然后与过氧化物酶缀合的抗小鼠抗体115-035-003 (Jackson ImmunoResearchLaboratories, Inc., West Grove Pennsylvania, US)孵育。最后，通过电化学发光(ECL)使用标准技术(GE Healthcare RPN2106, Little Chalfont, UK)开发测定法。
图2A表明用构建体1-4转染的BHK细胞都表达狂犬病G蛋白。在印迹的左侧指示显示39 kDa、51 kDa和64 kDa蛋白的位置的分子量标准。39 kDa的较低条带是肌动蛋白，并且用作每个泳道中的蛋白的总量的标准。四种构建体各自都表达狂犬病G蛋白，如前四个泳道中所示。由构建体1表达的蛋白的分子量低于由构建体2-4表达的蛋白的分子量。该差异归因于潜在不同的糖基化模式。生物信息学分析预测，构建体1含有两个N-糖基化位点和两个O-糖基化位点，并且构建体2、3和4含有三个或四个N-糖基化位点和五个O-糖基化位点。
图2B表明用肽N-糖苷酶A (PNGase A)处理这些样品以除去N-连接的碳水化合物链显著降低分子量的差异，表明N-糖基化的差异是观察到的分子量差异中的至少一些的原因。
实施例3：体内免疫原性
在BALB/c小鼠中与RABAVERT平行评估SAM狂犬病构建体的免疫原性(图3A和图3B)。图1A和表1中显示的四种构建体各自用阳离子纳米乳剂(CNE)或脂质纳米颗粒(LNP)配制。根据许可的RABAVERT给药时间表，将动物在第0天和第21天用SAM疫苗构建体免疫，并且在第0天、第7天和第21天用RABAVERT免疫。每组由10只小鼠组成。在第14天和第35天收集血清，以评估动物针对狂犬病的免疫原性。通过用于狂犬病的微量快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)进行血清学，以测定抗狂犬病中和抗体(nAb)的滴度(Smith等人 Bull. World HealthOrgan. 48:535 (1973))。世界卫生组织(WHO)指南推荐使用RFFIT来测定nAb滴度，并认为0.5 IU/ml的Ab滴度是针对狂犬病疫苗的充分应答(WHO Position Paper (2010) Vaccine28:7140)。
图3A显示在第14天、即在单一剂量的SAM狂犬病疫苗后两周或在第0天、第7天和第21天给予三个剂量的RABAVERT后35天检测中和抗狂犬病抗体的血清学测试的结果。免疫后十四天，一个剂量的包含构建体2、3和4且用LNP配制的SAM狂犬病疫苗在引发中和抗体方面与三个剂量的RABAVERT一样有效，即产生近似100 IU/ml的nAb滴度。在免疫后14天，所有测试的构建体的nAb滴度都超过0.5 IU/ml的滴度，即针对天然存在的狂犬病感染的保护的有效性的阈值的替代标志。该免疫原性阈值已被记录为与人和新生猪中的保护效力相关，并且在使用小鼠模型的最近出版物中也已被引用(Schnee等人 (2016) PLoS Negl. Trop.Dis. 10:e0004746，例如在第15页)。加星号线(图的顶部)表明，在第14天，0.15 ug剂量的LNP中的构建体4比0.15 ug剂量的LNP中的构建体2统计学显著更有效。
图3B显示在第35天、即在第0天和第21天施用的两个剂量的SAM狂犬病疫苗或在第0天、第7天和第21天施用的三个剂量的RABAVERT后两周检测中和抗体的血清学测试的结果。虚线表示对RABAVERT的nAb滴度(近似100 IU/ml)。(注意，图3A和图3B之间的RFFIT滴度的规模的差异。)在第35天，0.15 ug剂量的构建体1、2、3和4都比RABAVERT统计学显著更有效。
免疫后三十五天，两个剂量的用1.5 ug CNE配制的包含构建体2、3和4的SAM狂犬病疫苗在引发中和抗体方面与三个剂量的RABAVERT一样有效。两个剂量的用0.15或1.5 ugLNP RV39配制的SAM狂犬病构建体2、3和4显著优于RABAVERT，产生近似高十倍滴度的中和抗体。
实施例4：SAM狂犬病疫苗提供长期免疫原性
检查SAM狂犬病疫苗赋予长期免疫原性的能力，并且结果显示于图4中。构建体4以1.5ug的量用CNE(正方形)配制，以0.15 ug的量用LNP(三角形)配制或以1.5 ug的量用LNP(倒置三角形)配制。在第0天、第7天和第21天以三个剂量以稀释倍数为1/25的人临床剂量施用RABAVERT(圆形)。在免疫后第56天、第90天和第180天，通过RFFIT测量用这些制剂各自免疫的小鼠的中和抗体滴度。虚线表示0.5 IU/ml的狂犬病疫苗的免疫原性的阈值。
在第14天，用CNE配制的1.5 ug构建体4 RNA、用LNP配制的0.15 ug构建体4 RNA或用LNP配制的1.5 ug构建体4 RNA引发针对狂犬病的中和抗体，其水平远高于有效性的免疫原性阈值。到第35天和在随后的时间点，LNP-配制的SAM载体引发等于或大于RABAVERT的的滴度的滴度。在第35天和随后的时间点，SAM构建体4载体各自都表明等于或优于RABAVERT的免疫原性。LNP配制的载体表明剂量依赖性作用，用RV39配制的1.5 ug剂量比0.15 ug剂量更有效。到第56天，RABAVERT滴度开始下降。相反，SAM狂犬病构建体的滴度保持恒定。
在剂量范围研究中进一步检查免疫原性，并且结果显示于图5中。在该研究中，用LNP或CNE配制递减剂量的构建体4。构建体4用LNP以4.5 ug、1.5 ug、0.5 ug、0.167 ug、0.055 ug、0.0185 ug、0.006 ug、0.002 ug或0.0007 ug RNA的递减量或用CNE以15或1.5ug RNA的量配制。Balb/c小鼠在第0天和第21天用构建体4以所示剂量免疫，或在第0天、第7天和第21天用RABAVERT免疫。每组由10只小鼠组成。在第14天和第35天收集血清，并通过RFFIT分析其中和抗体。有效性的免疫原性阈值由较低虚线指示，并且历史观察到的峰值RABAVERT滴度由两个小图中的上面虚线指示。
图5A表明在免疫后14天，一个剂量的用LNP配制的0.055至4.5 ug RNA的量的SAM狂犬病与RABAVERT一样有效。甚至在2.0 ng和0.7 ng RNA的非常低剂量下，用以LNP配制的SAM狂犬病免疫的小鼠产生远高于有效性的免疫原性阈值的中和抗体，当用CNE配制时，用15 ug或1.5 ug RNA的量的SAM狂犬病免疫的小鼠也是如此。相反，当稀释一千倍时，RABAVERT的有效性几乎降至无效水平(数据未显示)。
图5B显示在第35天、即在第0天和第21天施用的两个剂量的SAM狂犬病疫苗或在第0天、第7天和第21天施用的三个剂量的RABAVERT后检测中和抗体的血清学测试的结果。与在第14天观察到的水平相比，SAM狂犬病疫苗的功效在所有剂量和用两种脂质制剂都增加。在第35天，两个剂量的用LNP配制的SAM狂犬病疫苗(0.7 ng直至4.5 ug RNA的非常低的量)显著胜过RABAVERT的三剂量方案。以15 ug RNA的剂量在CNE中配制的SAM狂犬病疫苗也胜过RABAVERT。
实施例6：非人灵长类动物中的体内免疫原性
SAM LNP和SAM CNE制剂两者在非人灵长类动物中均被良好耐受并诱导功能性免疫应答。35只三岁和四岁半之间(>4.3 kg体重)的雌性猕猴用RABAVERT、用CNE配制的构建体4或用LNP配制的构建体4以表2中所示的剂量肌肉内注射。RABAVERT剂量是完全人剂量，且给药时间表与人中使用的给药时间表相同，即第0周、第1周和第3周。在第1天、第8天、第15天、第22天、第36天、第57天、第71天、第85天、第113天、第141天、第169天、第183天和第197天收集血清，用于RFFIT中和研究和通过ELISA测量总IgG。在第1天、第22天、第36天、第57天、第71天、第113天、第141天、第169天、第183天和第197天从全血获得外周血单核细胞(PBMC)用于T细胞细胞内细胞因子染色(ICS)测定。
表2. 非人灵长类动物中的SAM-狂犬病G蛋白免疫原性
Figure DEST_PATH_IMAGE029
如图6中所示，在CNE中配制的SAM狂犬病和在LNP中配制的SAM狂犬病两者均诱导高和持久水平的狂犬病中和抗体，如通过RFFIT测量。
图6的顶部小图显示与RABAVERT相比的四个剂量的在CNE中配制的构建体4的中和抗狂犬病抗体滴度。所有四个剂量都诱导远高于保护性阈值(虚线)的抗体水平。通过第二次和第三次SAM疫苗接种加强抗体水平，且加强的滴度优于用RABAVERT实现的滴度。观察到剂量应答；150 ug(空心正方形)和75 ug(空心三角形)剂量产生比15剂量(倒置空心三角形)和3 ug(实心圆形)剂量更高的抗体滴度。甚至在3 ug RNA的非常低剂量下，在CNE中配制的构建体4引发高且持久的中和抗狂犬病抗体滴度，水平高于RABAVERT(空心圆形)。
图6的底部小图显示与RABAVERT相比的四个剂量的在LNP中配制的构建体4的中和抗狂犬病抗体滴度。SAM LNP滴度高于SAM CNE滴度。所有三个剂量都诱导远高于保护性阈值(虚线)的抗体水平。通过第二次和第三次SAM疫苗接种加强抗体水平，且加强的滴度优于用RABAVERT实现的滴度。用75 ug(空心三角形)、15 ug(倒置空心三角形)和3 ug(实心圆形)观察到剂量应答。甚至在3 ug RNA的非常低剂量下，在LNP中配制的构建体4引发高且持久的中和抗狂犬病抗体滴度，水平高于RABAVERT(空心圆形)。
如图7中所示，通过标准ELISA方法测量，SAM-RG-CNE和SAM-RG-LNP两者均诱导高且持久水平的抗狂犬病IgG。IgG应答遵循与中和抗体应答的IgG应答相似的模式。
图7的顶部小图显示与RABAVERT相比，由在CNE中配制的构建体4诱导的狂犬病IgG结合抗体水平。所有四个剂量都诱导远高于保护性阈值(虚线)的IgG水平。通过第二次和第三次SAM疫苗接种加强IgG水平，且加强的滴度优于用RABAVERT实现的滴度。观察到剂量应答；150 ug(空心正方形)和75 ug(空心三角形)剂量产生比15 ug剂量(倒置空心三角形)和3 ug(实心圆形)剂量更高的抗体滴度。甚至在3 ug RNA的非常低剂量下，在CNE中配制的SAM-RG-co2引发高且持久的抗狂犬病抗体滴度，水平高于RABAVERT(空心圆形)。
图7的底部小图显示与RABAVERT相比的四个剂量的在LNP中配制的构建体4的抗狂犬病IgG滴度。SAM LNP滴度高于SAM CNE滴度。所有三个剂量都诱导远高于保护性阈值(虚线)的抗体水平。通过第二次和第三次SAM疫苗接种加强抗体水平，且加强的滴度优于用RABAVERT实现的滴度。用75 ug(空心三角形)、15 ug(倒置空心三角形)和3 ug(实心圆形)观察到剂量应答。甚至在3 ug RNA的非常低剂量下，在LNP中配制的构建体4引发高且持久的抗狂犬病IgG滴度，水平高于RABAVERT(空心圆形)。
实施例7：通过RFFIT和ELISA的构建体4的剂量应答
实验1
雌性Balb/C小鼠(6-8周龄)通过肌肉内注射在第1天、第8天和第22天用临床剂量的十分之一的RABAVERT疫苗接种，在第1天用构建体4，或在第1天和第22天用构建体4以表3中所示的剂量疫苗接种。在第15天、第36天、第57天、第91天和第181天收集血清，并进行RFFIT病毒中和测定。
表 3：与CNE相比的LNP的剂量应答
组 疫苗 剂量 制剂 注射　　　　　　　　　　　　(天)
1 RABAVERT 1/10临床 LNP 1、8、22
2 构建体4 1.5 ug LNP 1
3 构建体4 0.15 ug LNP 1
4 构建体4 0.015 ug LNP 1
5 构建体4 0.0015 ug LNP 1
6 构建体4 0.00015 ug LNP 1
7 构建体4 0.000015 ug LNP 1
8 构建体4 15 ug CNE 1
9 构建体4 1.5 ug LNP 1、22
10 构建体4 0.15 ug LNP 1、22
11 构建体4 0.015 ug LNP 1、22
12 构建体4 0.0015 ug LNP 1、22
13 构建体4 0.00015 ug LNP 1、22
14 构建体4 0.000015 ug LNP 1、22
15 构建体4 15 ug CNE 1、22
RFFIT测定的结果显示于图8中。上面的虚线显示0.5 IU/ml中和抗体的保护性阈值，且下面的虚线显示测定的定量下限(LLOQ)(低于log 0.1)。用一种和两种剂量方案两者均观察到剂量-应答关系。用非常低剂量的SAM RNA(至少低至15皮克)的单次免疫诱导非常高且稳定水平的中和抗体(顶部小图)。所述水平通过第二次免疫加强，并且保持显著高于由三个剂量的RABAVERT诱导的中和抗体水平(底部小图)。
ELISA测定的结果显示于图8中，并且与用RFFIT观察到的那些相似。上面的虚线显示0.5 IU/ml中和抗体的保护性阈值，且下面的虚线显示测定的定量下限(LLOQ)(低于log0.1)。用一种和两种剂量方案两者均观察到剂量-应答关系。用非常低剂量的SAM RNA(至少低至15皮克)的单次免疫诱导非常高且稳定水平的狂犬病IgG(顶部小图)。所述水平通过第二次免疫加强，并且保持显著高于由三个剂量的RABAVERT诱导的中和抗体水平(底部小图)。
从用一个15ug剂量的CNE中配制的构建体4免疫的五只小鼠移取脾脏。用布雷菲德菌素A刺激脾T细胞，并通过流式细胞术检测细胞内细胞因子。细胞介导的免疫应答显示于图9中。一个剂量的SAM狂犬病CNE疫苗诱导高水平的Th1细胞因子IL2、TNFα、干扰素γ和CD107a，主要来自CD8+ T细胞(顶部小图)，且也来自CD4+ T细胞(底部小图)，因此T细胞应答是多功能的。Th2应答(IL-4、IL-13)和Th17应答(IL-17A、IL-17F)应答是可忽略不计的。
实验2
雌性Balb/C小鼠(6-8周龄)通过肌肉内注射在第1天、第8天和第22天用临床剂量的十分之一的RABAVERT疫苗接种，在第1天用构建体4或在第1天和第22天用构建体4以表4中所示的剂量(且用LNP RV29或LNP RV94配制)疫苗接种。在第15天、第36天、第57天、第91天和第181天收集血清，并进行RFFIT病毒中和测定和总IgG的ELISA测定两者。
表 4：LNP RV29和LNP RV94的剂量应答
组 疫苗 剂量 制剂 注射　　　　　　(天)
1 RABAVERT 1/10临床 1、8、22
2 构建体4 0.15 ug LNP RV29 1、22
3 构建体4 0.0015 ug LNP RV29 1、22
4 构建体4 0.000015 ug LNP RV29 1、22
5 构建体4 0.15 ug LNP RV94 1、22
6 构建体4 0.0015 ug LNP RV94 1、22
7 构建体4 0.000015 ug LNP RV94 1、22
RFFIT测定的结果显示于图10中。上面的虚线显示0.5 IU/ml中和抗体的保护性阈值，且下面的虚线显示测定的定量下限(LLOQ)(低于log 0.1)。与实验1中的结果相似，非常低剂量的SAM RNA(至少低至15皮克)诱导非常高且稳定水平的中和抗体。LNP RV39和LNPRV94制剂诱导相似的高中和抗体水平。
ELISA测定的结果显示于图11中，并且，如实验1中，与用RFFIT观察到的那些相似。上面的虚线显示0.5 IU/ml中和抗体的保护性阈值，且下面的虚线显示测定的定量下限(LLOQ)(低于log 0.1)。非常低剂量的SAM RNA(至少低至15皮克)诱导非常高且稳定水平的狂犬病IgG。
在动物中通过肌肉内注射施用的治疗剂应根据相对体重针对人按比例调整(FDAGuidance for Industry:Estimating the Maximum Safe Starting Dose in InitialClinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (2005) US Dept.Health and Human Services; Nair等人 J Basic Clin. Pharma. 7:27-31 (2016))。50kg的平均成人体重和20克的平均小鼠体重用于基于体重转化使用SAM LNP平台向成人施用的低剂量(即15皮克)的mRNA。使用这些平均体重，获得2500的按比例调整系数(50,000克/20克= 2500)。基于体重使用该按比例调整系数将小鼠的疫苗剂量转化为人中的等效剂量，小鼠中的15皮克的低剂量等效于38纳克(3.8 X 10-8克)的人剂量。计算为：15皮克 X 2500= 38纳克。
因此，基于上面显示的小鼠中生成的体内数据以及该小鼠向人的转化，使用SAMLNP疫苗平台的疫苗在成人中以纳克范围内的剂量生成适当且有效的免疫应答。
实施例8：SAM狂犬病疫苗针对致命的狂犬病攻击进行保护
测试SAM疫苗针对致命的狂犬病病毒攻击进行保护的能力，并与盐水对照进行比较。PsP4蝙蝠分离株活狂犬病病毒的致死剂量通过滴定测定，并且在1 x 104组织培养感染剂量50% (TCID50/ml)的浓度下测定为储备病毒的1:2.5稀释度，其肌肉内注射。从第7天至第12天观察到狂犬病的临床体征，并且在第12天尸检时通过脑部的直接荧光抗体(DFA)测试证实。
以表5中显示的制剂和剂量方案，将近似4-6周龄的雌性ICR小鼠在8组中用SAM狂犬病疫苗进行免疫。
表 5：致命的狂犬病攻击
组 疫苗 剂量 制剂 给药方案　　　　　　　　　(天)
1 RABAVERT 1/10临床剂量 N/A 1、8、22
2 盐水 - - 1、22
3 构建体4 1.5 ug LNP RV39 1、22
4 构建体4 1.5 ug LNP RV94 1、22
5 构建体4 1.5 ug CNE56 1、22
6 构建体4 1.5 ug LNP RV39 1
7 构建体4 1.5 ug LNP RV94 1
8 构建体4 1.5 ug CNE56 1
第一次免疫后60天，小鼠用致死剂量的Ps P4蝙蝠分离株活狂犬病(在1 x 104组织培养感染剂量50% (TCID50/ml)的浓度下，储备病毒的1:2.5稀释度，其肌肉内注射)攻击。盐水组中的所有小鼠都显示狂犬病的临床体征，并且在第8天观察到100%死亡率。疫苗接种的小鼠无一显示狂犬病的任何临床体征，并且当它们在攻击后第31天处死时，DFA测试证实其脑中不存在狂犬病病毒。
所有SAM制剂都是安全的且被良好耐受。监测体重，并且未观察到其显著的异常变化。在每个剂量后6、24和48小时监测注射部位反应，并且根据改良的Draize方法分级。对于所有LNP制剂，所有制剂都被良好耐受，并且Draize评分为零(无水肿或红斑和焦痂形成)。
进行RFFIT和ELISA测定，并且结果与上面显示的那些相似。一次免疫诱导高水平的中和抗体和IgG。LNP RV39和LNP94制剂两者在诱导中和抗体方面均比CNE56更有效。LNPRV39和LNP RV94诱导相似水平的中和抗体。IgG水平与中和抗体水平相关。
Figure IDA0002414270100000011
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Claims (36)

1.基于核酸的构建体，其编码包含选自以下的一种或多种抗原的多肽：全长狂犬病病毒糖蛋白(G)、RNA聚合酶(L)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)或磷蛋白(P)、其免疫原性衍生物或免疫原性片段。
2.权利要求1的构建体，其中所述核酸是包含所述抗原的编码区的RNA。
3.权利要求1或2的构建体，其包含狂犬病病毒糖蛋白(G)序列。
4.权利要求1或2的构建体，其包含狂犬病病毒核蛋白(N)序列。
5.权利要求1-4中任一项的构建体，其中所述构建体包含选自以下的核酸序列：
(a) 编码包含SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽的核酸序列；
(b) 包含SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的DNA序列的核酸序列；和
(c) (a)或(b)的变体或片段。
6.权利要求1-5中任一项的构建体，其中所述构建体是密码子优化的。
7.权利要求1-5中任一项的构建体，其中所述构建体是密码子对优化的。
8.载体，其包含权利要求1-7中任一项的构建体。
9.自扩增RNA分子，其包含权利要求1-7中任一项的构建体。
10.编码抗原的自扩增RNA分子，其中所述自扩增RNA分子包含选自SEQ ID NO:2；SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的核酸序列。
11.DNA分子，其编码权利要求9或10的自扩增RNA分子。
12.组合物，其包含免疫有效量的权利要求1-7中任一项的构建体；权利要求8的载体或权利要求9或10的自扩增RNA分子中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的组合物，其包含基于RNA的疫苗。
14.根据权利要求13所述的组合物，其包含自扩增RNA分子。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含基于脂质的非病毒递送材料。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述基于脂质的非病毒递送材料包含脂质纳米颗粒递送系统。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒(LNP)递送系统选自RV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99和RV101。
18.根据权利要求15所述的组合物，其中所述基于脂质的非病毒递送材料包含脂质阳离子微乳剂递送系统。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述脂质阳离子微乳剂递送系统包含CNE56。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含编码额外抗原的核酸序列和/或所述组合物进一步包含额外抗原。
21.根据权利要求12-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物对于与另外的组合物组合施用于受试者是药学上可接受的，所述另外的组合物包含核酸，所述核酸包含编码额外抗原的序列；和/或所述组合物对于与另外的组合物组合施用于受试者是药学上可接受的，所述另外的组合物包含额外抗原。
22.根据权利要求12-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种佐剂。
23.根据权利要求12-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含2 ug或更少、诸如1.5 ug、1.0 ug、500 ng、250 ng、125 ng、75 ng、50 ng或25 ng的所述基于核酸的构建体。
24.组合物，其包含编码抗原的自扩增RNA分子，其中所述自扩增RNA分子包含选自SEQID NO:2；SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的核酸序列，且包含2 ug或更少、诸如1.5 ug、1.0 ug、500 ng、250 ng、125 ng、75 ng、50 ng或25 ng的所述核酸构建体。
25.在有此需要的受试者中诱导针对由狂犬病病毒引起的疾病的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的包含权利要求1-7的构建体；权利要求8的载体；权利要求9或10的自扩增RNA分子中的一种或多种的组合物；或权利要求12-22中任一项的组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者是人。
27.用于产生基于RNA的疫苗的方法，其包括转录权利要求8的载体或权利要求11的DNA以产生包含所述抗原的编码区的RNA的步骤。
28.权利要求27的方法，其中所述转录是体外的。
29.权利要求27的方法，其中所述转录是体内的。
30.权利要求27-29中任一项的方法，其进一步包括用递送系统配制包含所述抗原的编码区的RNA的步骤。
31.权利要求30的方法，其中所述递送系统包含脂质纳米颗粒递送系统。
32.权利要求30的方法，其中所述递送系统包含阳离子纳米乳剂递送系统。
33.权利要求27-32中任一项的方法，其进一步包括将包含所述抗原的编码区的RNA与包含佐剂的额外组合物组合的步骤。
34.权利要求1-7中任一项的构建体；权利要求8的载体；权利要求9-10中任一项的自扩增RNA分子；或权利要求12-14中任一项的组合物用于在受试者中诱导针对狂犬病病毒疾病的免疫应答的用途。
35.权利要求1-7中任一项的构建体；权利要求8的载体；权利要求9-10中任一项的自扩增RNA分子；或权利要求12-14中任一项的组合物在制备药物中的用途，所述药物在受试者中诱导针对狂犬病病毒疾病的免疫应答。
36.基本上如本文所述的组合物、构建体、载体、DNA分子、自扩增RNA分子、方法、方法或用途。
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