CN111093681B - 人类口腔粘膜干细胞分泌蛋白质组 - Google Patents

Abstract

本发明提供了源自人类口腔粘膜干细胞(hOMSC)的分泌蛋白质组(secretome)以及包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物。还提供了用于获得、操纵hOMSC源性分泌蛋白质组的方法以及在疗法、美容和组织再生中使用hOMSC源性分泌蛋白质组的方法。

Description

人类口腔粘膜干细胞分泌蛋白质组

发明领域

本发明属于干细胞和再生医学领域。特别地，本发明提供了源自人类口腔粘膜干细胞的分泌蛋白质组(secretome)的组合物。还提供了用于获得、操纵干细胞分泌蛋白质组的方法以及在疗法中使用干细胞分泌蛋白质组的方法。

发明背景

人口腔粘膜源性干细胞(hOMSC)是源自口腔粘膜的固有层的独特干细胞群(Marynka-Kalmani等2010)。hOMSC表达由胚胎干细胞、神经嵴干细胞和间充质干细胞的标志物组成的独特免疫表型。全基因分析鉴定出，hOMSC从体内向体外的转移引起在哺乳动物生物体的胚胎和胎儿发育阶段期间参与神经嵴细胞谱系的发育的基因的差异表达。

神经嵴是一种短暂的发育结构，产生外胚层和间充质起源的多种细胞谱系，分别包括神经元谱系和胶质细胞谱系以及成软骨细胞谱系、成骨细胞谱系、脂肪细胞谱系和成纤维细胞谱系。还已经显示出hOMSC在体外和体内分化成这些细胞谱系(Marynka-Kalmani等2010、Treves-Manushevitz等2013、Ganz等2014a、2014b)。

发现分化为多巴胺能样神经元细胞或星形胶质细胞样细胞并且移植在体内的hOMSC在动物模型中具有治疗作用(Ganz等2014a、2014b)。此外，显示出具有一定治疗活性的幼稚hOMSC(hOMSC)甚至在这些动物模型中无效，它们的治疗作用与安慰剂的治疗作用相似。

最近，已经显示出胚胎干细胞和成体干细胞也是细胞外囊泡的一个延伸来源(Desrochers等2016、Konala等2016)。细胞外囊泡(EV)是由真核细胞的细胞质释放的大小范围从50nm至1.5微米-2微米的囊泡。

EV按照其生物发生和大小主要分为2个主要类别：具有50nm-1500nm的大小范围的微囊泡或脱落微囊泡；和具有30nm-120nm的大小范围的外泌体(exosome)。外泌体是源自多泡体的腔膜的脂双层膜囊泡，其通过与细胞膜融合组成性释放。微囊泡和外泌体的生物发生是不同的。微囊泡通过出芽和从膜分裂在质膜处形成。外泌体源自内体和高尔基体系统并且至少部分通过转运所需要的内体分选复合物植根于细胞表面，在细胞表面它们经历胞吐作用。

细胞外囊泡包含含有蛋白、脂质、核酸的货物(cargo)(Desrochers等2016、Xu等2016)。取决于细胞的起源、它的生理和病理状态以及细胞释放部位，EV内容物是异质的并且处于动态状态中。由于货物被选择性地分选到外泌体中，外泌体的组成可以与它们起源的细胞不同。除了经典的细胞-细胞接触方式和用于旁分泌和自分泌作用的可溶性因子的分泌之外，已经显示出EV的货物用作用于细胞-细胞通讯的一种方法。关于EV生物作用的大多数知识源自对癌细胞完成的工作。体外和体内已经显示出，EV的货物诱导癌细胞增殖和存活和血管生成以及肿瘤成纤维细胞迁移、存活和生长(Antonyak等2015)。外泌体已经被证明是遗传物质的载体并且被推荐为用于癌症诊断和预后的生物标志物并且被提出用于监测治疗效力。目前，基于外泌体递送肿瘤疫苗和药物被评价为用于癌症的治疗策略(Gue等,2017)。

发现来自源自骨髓和脂肪组织的成体干细胞的条件培养基在心脏缺血中和伤口愈合中具有治疗潜力(Lai等2010、Hu等2016)。

存在越来越多的证据证明，微囊泡和外泌体之间的货物的内容物有差异并且该差异受细胞的起源控制(Kanada等2015)。此外，最近的数据指示，货物的性质对由多种类型的癌细胞释放的EV和对由不同类型的干细胞释放的那些EV二者是细胞特异性的(Villarroya-Beltri等2014、Lopez-Verrilli MA等2016)。

WO 2008/132722公开了胃肠道的粘膜并且特别是口腔粘膜的固有层作为多能成体干细胞(pluripotent adult stem cell)的来源。

WO 2013076726公开了源自口腔粘膜的固有层的干细胞(OMSC)作为用于选择性分化成不同神经谱系的来源，以及它们在诱导或保存神经发生中的以及用于神经退行性和精神紊乱的疗法的以及在由于创伤引起的神经组织损失中的用途。

US2016/0256496涉及牙龈成纤维细胞源性产物例如条件培养基，及其在用于预防或治疗骨科病理诸如骨关节炎和类风湿性关节炎的方法中的用途。

Med Cell Ltd.的WO/2017/001649、WO/2016/082882和WO/2016/083500公开了产生由间充质干细胞或树突状细胞分泌的分泌蛋白质组的特定方法。

WO/2014/057097公开了一种用于通过在适当的培养基中共培养成体人类间充质干细胞和成体完全分化心肌细胞以获得预处理的(preconditioned)成体人类间充质干细胞来调节成体人类间充质干细胞的分泌蛋白质组的方法。

仍然存在对可用于预防和治疗疾病和紊乱以及促进组织再生的组合物的未满足的需求。这样的组合物可以有益地源自独特、可扩增和容易可及的来源。

发明概述

源自口腔粘膜的固有层的人类干细胞(hOMSC)的条件培养基或分泌蛋白质组现在被公开作为治疗性组合物。本发明部分基于以下发现：幼稚hOMSC分泌蛋白质组的组合物是独特的并且因此具有独特的治疗潜力，其优于源自其他来源的幼稚干细胞的分泌蛋白质组。此外，hOMSC刺激可能引起反映为分泌蛋白质组内容物的变化并且因此反映为它的治疗能力的细胞应答。还设想了从所述hOMSC刺激得到的分泌蛋白质组对hOMSC刺激的细胞是独特的，并且如果应用到由其他来源衍生的成体干细胞，相同的刺激将导致不同的分泌蛋白质组。

本文首次公开了幼稚hOMSC的分泌蛋白质组具有在存在、不存在或相对量的细胞因子、趋化因子和核酸方面与其他干细胞的分泌蛋白质组不同的独特特征。

本文还公开了hOMSC和包含源自其的分泌蛋白质组的无细胞组合物能够促进糖尿病伤口愈合，表明hOMSC分泌蛋白质组在促进新血管系统、细胞增殖和结缔组织形成中的潜在用途。出乎意料地，hOMSC及其在伤口愈合中的分泌蛋白质组活性优于源自其他来源的干细胞和分泌蛋白质组。

根据本发明的源自可及的、可再生的和可消耗的幼稚hOMSC细胞来源的分泌蛋白质组易于获得和使用，而不需要诱导细胞的分化。

根据一个方面，本发明提供了一种无细胞组合物，所述无细胞组合物包含由人类口腔粘膜干细胞分泌的物质(hOMSC源性分泌蛋白质组)连同至少一种载体、赋形剂或稀释剂。

包含根据本发明的hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物在它们的内容物方面是独特的并且与其他来源的干细胞的分泌蛋白质组不同。

根据一些实施方案，hOMSC是幼稚的。

根据一些实施方案，无细胞组合物包含：

(i)来自由以下组成的组的至少一种蛋白：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C(CST3)、半乳凝素-1(LGALS1)、胶质细胞源性连接蛋白(SERPINE2)、胰岛素样生长因子II(IGF2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白3片段(LTBP3)、潜伏转化生长因子β结合蛋白4(LTBP4)、神经母细胞分化相关蛋白(AHNAK)和色素上皮源性因子((SERPINF1/PEDF)；或

(ii)选自由以下组成的组的至少一种蛋白：肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞炎性蛋白-3(MIP-3a)、生长调节性癌基因-α(GRO-a或CXCL1)、巨噬细胞源性/CCL22趋化因子(MDC或CCL22)、生长调节性癌基因(GRO)、IGFBP-2、神经营养因子-4(NT-4)、单核细胞趋化蛋白2(MCP-2/CCL8)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2(IL-2)和脑源性神经营养因子(BDNF)；或

(iii)选自由以下组成的组的至少一种蛋白：1SV，3SV，ACTG2，ADAM10，ADAMTSL1，ADM，ANXA4，APOD，CALM2，CD109，CD59，CDH6，CFD，COL15A1，COL1A2，COLEC12，CTHRC1，CTSC，CTSL，CXCL12，DCD，DDAH2，DKK1，DSG1，DSP，DSTN，ECH1，EDIL3，EFEMP1，ELN，FLG，GNB2，GREM2，H3F3B，HBA1，HIST1H2AH，HIST1H2BK，HIST1H4A，HMGN2，HNRNPAB，HSP90AA1，HSPA1A，HSPG2，IGFBP5，JUP，KHSRP，LDHA，MNB2，LTBP4，MAN1A1，MFAP4，MMP1，MMP14，MT2A，NBL1，OMD，PFN1，P116，PSG5，PSMB6，PTGDS，RARRES2，SLIT3，SPOCK1，SPTBN4，STOM，TMSB10，TMSB4X，TNFAIP6，TNXB，TPI1，TUBA1C，UBC，VIT和WNT5A；或

(iv)选自由以下组成的组的至少一种微小hsa-miR-4454+hsa-miR-7975，hsa-miR-23a-3p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-612，hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-3144-3p，hsa-miR-199a-3p+hsa-miR-199b-3p，hsa-miR-191-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-1260a，hsa-miR-378h，hsa-miR-379-5p，hsa-miR-376a-3p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-526a+hsa-miR-518c-5p+hsa-miR-518d-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-28-5p，hsa-miR-758-3p+hsa-miR-411-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-1206，hsa-miR-1286，hsa-miR-514a-3p，hsa-miR-548ah-5p.hsa-miR-184，hsa-miR-543.hsa-miR-626，hsa-miR-339-3p，hsa-miR-1234-3p，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-888-5p，hsa-miR-542-3p，hsa-miR-514b-5p，hsa-miR-548m，hsa-miR-30e-5p和hsa-miR-1290。

或其组合。

根据一些实施方案，无细胞组合物包含来自(i)、(ii)、(iii)或(iv)的多于一种物质。

根据又其他实施方案，无细胞组合物包含来自(i)的至少一种蛋白、来自(ii)的至少一种蛋白、(iii)中的至少一种蛋白以及任选地来自(iv)的至少一种miRNA。

根据一些特定实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物包含选自由以下组成的组的至少一种因子：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和血管内皮生长因子(VEGF)。

根据其他实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物包含选自由以下组成的组的至少一种微小RNA分子：hsa-miR-4454+hsa-miR-7975，hsa-miR-23a-3p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-612，hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-3144-3p，hsa-miR-199a-3p+hsa-miR-199b-3p，hsa-miR-191-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-1260a，hsa-miR-378h，hsa-miR-379-5p，hsa-miR-376a-3p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-526a+hsa-miR-518c-5p+hsa-miR-518d-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-28-5p，hsa-miR-758-3p+hsa-miR-411-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-1206，hsa-miR-1286，hsa-miR-514a-3p，hsa-miR-548ah-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-543，hsa-miR-626，hsa-miR-339-3p，hsa-miR-1234-3p，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-888-5p，hsa-miR-542-3p，hsa-miR-514b-5p，hsa-miR-548m，hsa-miR-30e-5p和hsa-miR-1290。

根据一些特定实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物包含选自由以下组成的组的至少六种微小RNA分子：hsa-miR-4454+hsa-miR-7975，hsa-miR-23a-3p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-612，hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-3144-3p，hsa-miR-199a-3p+hsa-miR-199b-3p，hsa-miR-191-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-1260a，hsa-miR-378h，hsa-miR-379-5p，hsa-miR-376a-3p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-526a+hsa-miR-518c-5p+hsa-miR-518d-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-28-5p，hsa-miR-758-3p+hsa-miR-411-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-1206，hsa-miR-1286，hsa-miR-514a-3p，hsa-miR-548ah-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-543，hsa-miR-626，hsa-miR-339-3p，hsa-miR-1234-3p，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-888-5p，hsa-miR-542-3p，hsa-miR-514b-5p，hsa-miR-548m，hsa-miR-30e-5p和hsa-miR-1290。

根据一些实施方案，无细胞组合物包含比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中所述蛋白的浓度显著更高的浓度的至少一种蛋白。根据一些特定实施方案，无细胞组合物包含以比由其他干细胞来源衍生的分泌蛋白质组中的浓度显著更高的浓度的(i)、(ii)或(iii)中的至少一种蛋白。

根据一些实施方案，比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更高的浓度存在于hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物中的至少一种蛋白，选自由以下组成的组：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1,P48061)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1,P00441)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF,P55145)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和血管内皮生长因子(VEGF)。

根据某些实施方案，分泌蛋白质组包含比源自皮肤干细胞或骨髓干细胞的分泌蛋白质组中的所述蛋白的浓度显著更高的浓度的选自由以下组成的组的至少一种蛋白：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、生长调节性癌基因(GRO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞炎性蛋白-3(MIP-3a)、生长调节性癌基因-α(GRO-a或CXCL1)、巨噬细胞源性/CCL22趋化因子(MDC或CCL22)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、神经营养因子-4(NT-4)、还被称为趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)的单核细胞趋化蛋白2(MCP-2)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C(CST3)、半乳凝素-1(LGALS1)、胶质细胞源性连接蛋白(SERPINE2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白3(LTBP3)、潜伏转化生长因子β结合蛋白4(LTBP4)、神经母细胞分化相关蛋白(AHNAK)、色素上皮源性因子(SERPINF1)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

根据某些实施方案，分泌蛋白质组包含比源自皮肤干细胞或骨髓干细胞的分泌蛋白质组中的所述蛋白的浓度显著更高的浓度的选自由以下组成的组的至少一种蛋白：肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和血管内皮生长因子(VEGF)。

根据其他实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组包含比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的所述蛋白的浓度显著更低浓度的至少一种蛋白。

根据一些实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物包含比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更低的浓度的至少一种蛋白。

根据某些实施方案，以比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更低的浓度存在的至少一种蛋白，选自由比源自皮肤干细胞或骨髓干细胞的分泌蛋白质组中的所述蛋白的浓度显著更低的浓度的以下组成的组：单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3/CCL7)、上皮-中性粒细胞活化肽或C-X-C基序趋化因子5(ENA-78或CXCL5)、瘦蛋白、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3配体)、白细胞介素-6(IL-6)、由γ干扰素诱导的单核因子(MIG或CXCL9)和白细胞介素8(IL-8)。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据一些实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组的蛋白和核酸内容物与任何其他干细胞的分泌蛋白质组的蛋白和核酸内容物不同。

根据某些实施方案，分泌蛋白质组包含参与神经系统的内稳态的至少一种蛋白。

根据一些实施方案，参与神经系统的内稳态的至少一种蛋白可以选自：半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C、半乳凝素-1、胶质细胞源性连接蛋白、胰岛素样生长因II(IGF2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白3(LTBP3)、潜伏转化生长因子β结合蛋白4(LTBP4)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、神经母细胞分化相关蛋白(AHANK)、色素上皮源性因子(PEDF)、基质细胞源性因子1(SDF1)和超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SODC)。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据本发明的hOMSC源性分泌蛋白质组包含分泌或释放到它们在其中生长或维持的培养基中的物质。这样的培养基在本文中被称为条件培养基。

根据一些实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组和无细胞组合物包含细胞外囊泡(EV)。

根据一些实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组和无细胞组合物包含微囊泡。

根据其他实施方案，hOMSC原性分泌蛋白质组和无细胞组合物包含外泌体。

根据一些实施方案，hOMSC源性分泌蛋白质组和无细胞组合物包含微囊泡和外泌体。

根据一些实施方案，组合物hOMSC源性分泌蛋白质组和无细胞组合物包含可溶性因子。

根据一些实施方案，可溶性因子选自由以下组成的组：蛋白、肽、激素、DNA和RNA种类、寡核苷酸和多核苷酸及其组合。

根据一些实施方案，可溶性因子是具有1,000道尔顿(Da)或更高的分子大小的分子。

根据一些特定实施方案，可溶性因子是具有例如1,000Da-10,000Da；1,000Da-3000Da；1,000Da-5,000Da；2,000Da-6,000Da；5,000Da-10,000Da；7,000Da-10,000Da、10,000Da-30,000Da；10,000Da-50,000Da等之间的分子大小的分子，或甚至更高的分子大小的分子。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据一些实施方案，hOMSC的条件培养基使用本领域已知的方法浓缩，以产生包含比条件培养基中的浓度更高浓度的成分的hOMSC分泌蛋白质组。

根据一些实施方案，分泌蛋白质组源自经受影响分泌蛋白质组的内容物的刺激或条件的hOMSC。

根据一些实施方案，刺激或条件可以包括但不限于：化学刺激、物理刺激、底物刺激和/或生物刺激。

根据一些实施方案，无细胞组合物是包含hOMSC源性分泌蛋白质组连同药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

根据一些实施方案，无细胞组合物是包含hOMSC源性分泌蛋白质组连同适用于美容应用的可接受的载体、赋形剂或稀释剂的美容组合物。

根据一些实施方案，包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物用于在组织重塑或组织再生中使用。

根据一些实施方案，提供了根据本发明的药物组合物，用于在促进伤口愈合、预防或降低疤痕形成、促进疤痕愈合或促进软骨形成或骨形成中使用。

根据一些实施方案，包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物用于在促进或加速糖尿病伤口愈合中使用。

根据另一个方面，本发明提供了一种由hOMSC产生无细胞分泌蛋白质组的方法，并且其中该方法包括以下步骤：

i.通过外植或酶消化分离hOMSC；

ii.在培养基中扩增hOMSC；

iii.用基础培养基代替培养基；

iv.将hOMSC在基础培养基中培养范围从1小时至120小时的时间段；

v.从培养物收获培养基；和

vi.任选地，将培养基浓缩1.1倍-10,000倍。

根据一些实施方案，分离的hOMSC是幼稚细胞。

根据一些实施方案，在步骤(iv)期间或之后，hOMSC经历影响分泌蛋白质组的内容物的刺激或条件。根据一些实施方案，所述刺激选自由化学刺激、物理刺激、底物刺激或生物刺激组成的组。

根据本发明的用于产生分泌蛋白质组和无细胞组合物的幼稚或经刺激的hOMSC以未分化状态在组织培养中被维持和扩增。

根据本发明的包含hOMSC源性分泌蛋白质组的药物无细胞组合物和美容无细胞组合物可以被用于修复和再生被机械创伤、化学损伤、辐射和热或任何其他类型的医源性损伤完全或部分破坏的器官和组织。这样的损伤的实例包括但不限于：中枢神经系统的挫伤、脊髓损伤、脊髓的切伤、周围神经压伤或切伤、烧伤、由化学疗法引起的神经病变和心脏病、骨折、腱和韧带断裂。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据一些实施方案，本发明的组合物包含源自自体hOMSC的分泌蛋白质组，即，治疗的个体充当用于产生分泌蛋白质组的hOMSC的供体。

根据其他实施方案，本发明的组合物包含源自同种异体hOMSC的分泌蛋白质组，即，与患者不相关的供体充当用于产生分泌蛋白质组的hOMSC的供体。

根据又另外的方面，本发明提供了一种预防或治疗疾病或紊乱的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物。

适于用干细胞预防或治疗的任何疾病或紊乱可以用根据本发明的组合物治疗或预防。

根据一些实施方案，适于用本发明的组合物预防或治疗的疾病或紊乱选自由以下组成的组：

i.炎性疾病(例如骨关节炎)；

ii.自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、硬皮病)；

iii.血管疾病(例如动脉炎/Buerger病)；

iv.心脏病(例如心肌梗塞、慢性心力衰竭)；

v.呼吸系统疾病(例如慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化)；

vi.骨骼系统疾病(例如骨再生、缺血性坏死、骨髓炎、软骨修复、肌腱修复、肌营养不良)；

vii.胃肠道疾病(例如瘘管、溃疡、食管狭窄、肝硬化、失禁、克罗恩病(Crohn’sdisease))；

viii.肾脏疾病(kidney disease)(例如肾病(nephropathy))；

ix.尿道疾病(例如失禁)；

x.皮肤病(例如足部溃疡、大疱性表皮松解症、天疱疮、糖尿病溃疡、静脉淤血溃疡、慢性压疮)；

xi.衰老相关疾病；

xii.周围神经疾病和骨骼肌疾病(例如慢性炎性脱髓鞘多发性神经根神经病、吉兰巴雷综合征(Guillan Barre syndrome)、肌营养不良)；

xii.中枢神经系统疾病(例如神经退行性疾病，诸如脱髓鞘疾病(多发性硬化)、阿尔茨海默病、帕金森病、延髓脊髓萎缩(bulbospinal atrophy)、脑卒中、脊髓缺血、自主神经系统疾病，如多系统萎缩)；

xiv.眼病(例如视网膜病(老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病、动脉硬化性视网膜病)、视神经炎)；

xv.内分泌系统疾病(例如糖尿病及其并发症：[血管紊乱、神经病变、慢性溃疡、肾病])；和

xvi.牙科疾病和口腔疾病(例如牙髓相关疾病、牙周病、牙槽骨缺陷、由免疫疾病引起的口腔粘膜溃疡)。

每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据一个特定实施方案，紊乱是糖尿病伤口。

根据一些实施方案，紊乱是美容紊乱。

根据一些实施方案，治疗的方法包括组织重塑、组织修复或组织再生，并且包括向有相应需要的受试者施用包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物，所述组合物可以是药物组合物或美容组合物。

根据一些实施方案，提供了一种用于促进或加速糖尿病伤口愈合的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物。

根据又另一个方面，本发明提供了一种用于组织修复和再生的方法，该方法包括施用包含根据本发明的由人类口腔粘膜干细胞(hOMSC)分泌的物质的至少一种无细胞组合物。

根据一些实施方案，修复或再生方法针对由机械创伤、化学损伤、辐射和热或任何其他类型的医源性损伤完全或部分破坏的器官和组织。这样的损伤的实例包括但不限于：中枢神经系统的挫伤、脊髓损伤、脊髓的切伤、周围神经压伤或切伤、烧伤、由化学疗法引起的神经病变和心脏病、骨折、腱和韧带断裂。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据一些实施方案，组织修复或再生与选自由伤口愈合、退行性疾病、先天性缺陷、衰老相关缺陷和医源性缺陷组成的组的状况、疾病或紊乱关联。

根据一个特定实施方案，干细胞是同种异体的或自体的。

本发明的组合物可以经由任何合适的施用途径施用到有相应需要的受试者，所述施用途径包括但不限于局部、皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、关节内、病灶内、肿瘤内或胃肠外。根据一些实施方案，对于伤口愈合，可以使用局部施用。因此，根据本发明的药物组合物和美容组合物被配制成适合所使用的特定施用途径。例如，对于局部施用，可以使用本领域已知的方法将组合物配制成乳膏、泡沫、凝胶、洗剂和软膏。

根据一些实施方案，组合物被局部地施用到受损的组织。

根据本发明的包含hOMSC源性分泌蛋白质组的组合物可以根据任何治疗方案施用到受损的组织。例如，组合物可以一次或多次施用到相同或不同的位置。

根据一些实施方案，将本发明的包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物作为包含至少一种另外的药剂或美容剂或治疗的治疗方案的一部分施用到有相应需要的受试者。

现有技术中已知或设计的关于干细胞的基本上所有用途可以用源自hOMSC的本发明的分泌蛋白质组来实现。这些用途包括预防技术和治疗技术。

本发明的可适用性的另外的实施方案和全部范围将从下文给出的详细描述变得明显。然而，应当理解，详细描述和特定实例，虽然指示本发明的优选的实施方案，但仅通过说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修改从该详细描述对本领域技术人员将是明显的。

附图简述

图1.hOMSC和包皮干细胞(hSkin)的干细胞标志物谱之间的比较。结果表示为相对于管家基因GAPDH的-ΔCt(循环阈值)。较高的负值意味着较低的表达水平。

图2根据用针对多能(pluripotency)干细胞标志物和神经嵴相关干细胞标志物的抗体免疫荧光染色的hOMSC分泌蛋白质组和hSkin SC分泌蛋白质组之间的蛋白表达的相对差异。

图3.hOMSC和hSkin SC中选择的标志物的表达比率。

图4.从年轻人类骨髓获得的间充质干(基质)细胞的分泌蛋白质组的蛋白表达。数据从Park等,International Journal of Stem Cells,2009获取。

图5.左上图示出了受伤前缝合到糖尿病db/db小鼠的背部皮肤的圈形环(donut-shaped ring)。右上图描绘了刚受伤后的部位。左下图图示了皮内注射的部位。右下图示出了切除的皮肤的组织学。

图6A和6B.图示了用hOMSC或hSkin SC或用PBS媒介物(未治疗的)治疗的db/db糖尿病小鼠的组中糖尿病伤口愈合的速率的定量图(6A)和代表性定性照片(6B)。

图7.用hOMSC治疗的db/db糖尿病小鼠、db/db糖尿病未治疗的小鼠或野生型(WT)-未治疗的小鼠的组中糖尿病伤口愈合的速率的定量图示。

图8.WT-未治疗的小鼠、WT-hOMSC治疗的小鼠、db/db-未治疗的小鼠、db/db-hOMSC治疗的小鼠和db/db hADSC(人类脂肪组织源性干细胞)治疗的小鼠中伤口完全闭合需要的平均时间。计算的t-检验p值为：WT-未治疗的对比db-hOMSC＝0.19533；db-hOMSC治疗的对比db-未治疗的＝5.34E-6；db-hOMSC治疗的对比db-hADSC治疗的＝0.00044；db-未治疗的对比db-hADSC治疗的＝0.48983；WT-未治疗的对比db-hOMSC治疗的＝1.9933E-5；WT-未治疗的对比db-未治疗的＝2.262E-5。

图9.用hOMSC、hSkin SC、hADCS或用PBS媒介物(未治疗的)治疗的db/db糖尿病小鼠的组中糖尿病伤口愈合的速率的定量图示。

图10.用hOMSC、hOMSC源性无细胞分泌蛋白质组、hSkin干细胞或用PBS媒介物(未治疗的)治疗的db/db糖尿病小鼠的组中糖尿病伤口愈合的速率的定量图示。

图11.通过质谱鉴定的369种hOMSC分泌蛋白质组蛋白和它们的平均相对丰度(强度)。

图12.与关于源自BMSC、ASC或DPSC的分泌蛋白质组所列出的1534种蛋白共有的294种hOMSC分泌蛋白质组蛋白。

发明详述

本发明提供了用于治疗和预防疾病和紊乱的来自人类口腔粘膜的成体干细胞的分泌蛋白质组。

hOMSC是神经嵴(NC)源性干细胞类型，其在发育中的集落中共表达多能性标志物Oct4、Nanog和Sox2以及NC-SC标志物，Snail、Slug、Sox10、Twist和Notch 1(Marynka-Kalmani等2010；Widera等2009)。NC是脊椎动物胚胎的短暂的神经外胚层结构。在其胚胎存在期间，它产生迁移性专干细胞(multipotent stem cell)，其填充(populate)多种原基组织(primordial tissue)，在原基组织中迁移性专干细胞分化成神经谱系和/或具有被称为外胚层间质(ectomesenchyme)或中外胚层的间充质表型的谱系。这些NC-SC中的一些在成体中保持相对未分化的状态，甚至在间充质起源的组织诸如真皮和骨髓中具有神经分化的倾向。

经典的全部成体群体(whole adult population)包含少量的干细胞，并且因此干细胞的扩增和分离是费力的、漫长的并且通常不是有效的。已经证明，由源自口腔粘膜的固有层的原代全部群体和扩增的全部细胞群体主要(多于80％)由幼稚干细胞组成。显示出从三个不同供体的口腔粘膜获得的高比例(80％-90％)的细胞群体表达间充质干细胞标志物。Marynka-Kalmani等2010年(同上)的研究已经证明，从以可忽略不计的发病率获得的3-4×2×1mm的活组织检查高成本效益地并且可重复地产生了数万亿hOMSC。

从用于临床利用的实体组织分离干细胞的经典方法包括通过酶消化或通过外植由细胞外基质释放细胞；扩增原代全部群体以获得足够大的群体；和从全部群体分离干细胞。

来自口腔粘膜固有层的分离的干细胞群体的质量和数量很大程度上不受衰老的影响，并且可以在体外扩增而不损失其多能性，并且因此是用于将分泌蛋白质组再施用到有相应需要的受试者以有效实现组织再生和其他治疗过程的安全且可靠的来源。

定义

口腔粘膜是口腔的粘膜内衬(lining)，即：颊部和牙槽嵴，包括牙龈和腭、舌、口底、和唇的口腔部分。口腔粘膜由外胚层起源的上皮组织和固有层(LP)组成，固有层是外胚层间质起源的结缔组织。与口腔中外胚层间质起源的结缔组织相似，口腔粘膜固有层(OMLP)的细胞源自胚胎外胚层神经嵴。人类口腔粘膜中的伤口主要通过再生愈合。愈合的速率比皮肤或其他结缔组织中快，并且看起来受年龄和性别的影响可忽略不计(Szpaderska,A.M.等,J Dent Res,2003,82,621-626)。

“干细胞”(SC)是未分化的细胞，其可以产生一系列成熟的功能细胞。

“胚胎干(ES)细胞”是源自胚胎胚泡的内细胞团的细胞，是多能的，因此具有发育成任何器官或组织类型或者至少潜在发育成完整的胚胎的能力。

“成体干细胞”是生物体出生后源自生物体的组织、器官或血液的出生后干细胞。

“多能干细胞”是能够产生三个胚胎细胞层及其衍生物细胞谱系和组织的干细胞；

“专能干细胞”是能够形成构成整个组织或器官的多个(multiple)细胞谱系的干细胞；

根据本发明的分泌蛋白质组是包含其多种形式的由人类口腔粘膜源性干细胞分泌或释放到培养基中的可溶性物质和不溶性物质的组合物。这些物质尤其包括：

2.可溶性分子如：

a.蛋白

b.肽

c.激素

d.多种DNA和RNA种类

e.核酸的寡聚物(oligomer)

f.具有高于1,000道尔顿的分子量的其他分子

3.包含以下的细胞外囊泡：

a.蛋白：生长因子、细胞因子、激素、细胞表面受体、胞质蛋白和核蛋白、代谢酶、受体配体、粘附蛋白、内体相关蛋白、四次穿膜蛋白(tetraspanins)、脂筏相关蛋白、抗原等

b.RNA种类：mRNA、miRNA、tRNA、rRNA、siRNA、和lncRNA以及其他可能的RNA种类

c.DNA：线粒体DNA(mtDNA)、单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)

d.脂质：胆固醇、鞘磷脂、己糖神经酰胺等

e.凝集素、多糖、蛋白聚糖、糖蛋白。

细胞外囊泡是携带上文提及的可溶性物质和不溶性物质的货物的膜结合颗粒。术语“细胞外囊泡”是指多种种类的分泌的或脱落的囊泡的组。这些被分为以下亚型(Xu等JIC2016)：

1.微囊泡或脱落微囊泡；大小范围–50nm-1500nm

2.外泌体；大小范围–30nm–120nm

3.囊泡；大小范围<500nm

培养培养基或扩增培养基是其中hOMSC被培养和扩增的培养基。根据本发明的一些实施方案的培养培养基/扩增培养基包含至少一种以下组分：低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(LGDMEM)、链霉素、青霉素、庆大霉素、两性霉素B、谷氨酰胺和血清，例如胎牛血清(FCS)。

根据一些实施方案，培养培养基/扩增培养基包含补充有100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素(Biological Industries,Beit-Haemek,Israel)、2mM谷氨酰胺(Invitrogen)和10％胎牛血清(FCS,Gibco)的LGDMEM。

基础培养基是不具有血清的培养基。

根据本发明的条件培养基是指从hOMSC培养物收集的培养基，其包含分泌或释放到hOMSC生长或维持的培养基中的hOMSC源性物质。

包含hOMSC分泌蛋白质组的条件培养基可以任选地使用本领域已知的方法浓缩以增加分泌蛋白质组成分的浓度并且然后保存，例如以冷冻状态保存。可选地，条件培养基可以被冻干并且分泌蛋白质组作为冷冻粉末保存，并且在注射用水或盐水或本领域已知的其他注射用溶液中重构。

根据一些实施方案，包含分泌蛋白质组或冻干的分泌蛋白质组的浓缩的条件培养基可以补充有本领域已知的任何添加剂或防腐剂，并且然后在一定条件和温度储存以将物质以其天然且有效的形式进行维持。

本发明的分泌蛋白质组可以与同样是熟知的至少一种赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体是药学上可接受的并且与分泌蛋白质组的成分相容。合适的赋形剂是例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Plasma Lyte、右旋糖、甘油、乙醇、聚乙二醇、矿化赋形剂诸如羟基磷灰石颗粒和磷酸三钙灰泥或颗粒、及其组合。赋形剂和载体还可以包括细胞外基质组分诸如蛋白(胶原蛋白、弹性蛋白、附着蛋白，例如纤连蛋白、玻连蛋白、白蛋白等)；糖蛋白(骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、血小板反应蛋白、生腱蛋白等)；蛋白聚糖和糖胺聚糖(透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素等)。其他合适的赋形剂和载体是本领域技术人员熟知的。

此外，如果是期望的，组合物可以包含少量的辅助物质，诸如乳化剂、pH缓冲剂等。

如本文使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施二者。需要治疗的那些包括已经具有紊乱的那些，以及其中紊乱待防治的那些。

术语向受试者“施用(administering)”或“施用(administration of)”组合物可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种来进行。例如，组合物可以被肠内地或肠胃外地施用。肠内地是指经由胃肠道，包括口服、舌下或直肠的施用。肠胃外施用包括静脉内、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、眼部、舌下、鼻内、通过吸入、脊柱内、脑内以及经皮(通过吸收，例如通过皮肤导管(skin duct))的施用。组合物还可以通过可再充装或生物可降解的聚合物装置或其他装置(例如贴剂和泵)或制剂适当地引入，所述装置或制剂提供化合物或剂的延长、缓慢或受控释放。施用还可以进行例如一次、多于一次和/或在一个或更多个延长的时间段内进行。在一些实施方案中，施用包括直接施用(包括自我施用)和间接施用(包括给药物开处方的行为)二者。例如，如本文使用的，指导患者自我施用药物或由另一个人施用药物和/或向患者提供药物处方的医师正向患者施用药物。

以下实施例意图说明如何制备和使用本发明的化合物和方法，并且决不被理解为限制。尽管现在本发明将结合其特定实施方案描述，但明显的是，许多修改和变化形式对于本领域技术人员将是明显的。因此，意图包括落在所附权利要求的精神和宽广范围内的所有这样的修改和变化形式。

实施例

下文描述的结果部分地从源自为口腔的口腔粘膜内衬的组成部分的人类牙龈的固有层(不包括上皮部分)的细胞群体的分泌蛋白质组获得。从腭和牙槽粘膜(alveolarmucosa)分离的hOMSC展示出相同性质。

hOMSC分离和培养

如上文和WO 2008/132722中描述的，从口腔粘膜活组织检查，特别是从来自25岁-80岁的供体起源的牙龈的活组织检查获得hOMSC。

简而言之，如由Marinka-Kalmani等2010(同上)描述的，牙龈或牙槽粘膜活组织检查3-4×2×1mm被切碎，并且将外植体培养在25cm²组织培养瓶中在补充有100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素(Biological Industries,Beit-Haemek,Israel)、2mM谷氨酰胺(Invitrogen)和10％胎牛血清(FCS)(Gibco)的低葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(LGDMEM)中。该培养基被称为培养培养基或扩增培养基。在一些情况下，链霉素和青霉素被庆大霉素代替，并且两性霉素B也包含在扩增培养中。

分泌蛋白质组产生

在扩增培养基中扩增的具有5倍-80倍之间的积累群体的hOMSC的培养物被用于产生hOMSC分泌蛋白质组。去除扩增培养基，并且用PBS彻底洗涤培养物，并且然后添加基础培养基或LGDMEM。在24小时-120小时后，收集培养基并且离心以去除任何死亡的细胞。上清液包含分泌蛋白质组。

可以通过使用本领域已知的设计和方法将上清液浓缩来增加分泌蛋白质组组分的浓度。如本文示出的，根据一些实施方案，可以设计范围从1.1倍-10,000倍的浓度比以可用于并且有效用于实现期望的治疗效果。

蛋白和分子水平上的阵列分析指示，hOMSC分泌蛋白质组具有之前尚未在源自其他来源包括皮肤源性干细胞和骨髓源性干细胞的干细胞分泌蛋白质组中被发现的独特组成特征。

分泌蛋白质组组成可以通过使hOMSC经受多种培养条件和刺激来改变。这样的培养刺激和条件的实例包括但不限于：

·化学的：例如低氧、高氧、化学药物、多种类别的化学刺激剂或抑制剂或多种途径、低离子浓度或高离子浓度例如Ca⁺⁺和/或葡萄糖、多种化学药物如他汀类(statins)、双膦酸盐等；

·物理的：例如超声波、机械振动、电刺激、连续或间歇应变、光、辐射；

·底物：例如附着蛋白、三维基质、用于悬浮细胞培养物的珠；

·生物制品：例如生长因子、细胞因子、激素刺激、分化因子、DNA和RNA种类、遗传操纵。

实施例1.hOMSC与那些或其他来源的干细胞标志物的比较

如先前描述地(Marynka-Kalmani等2010和WO 2008/132722)获得hOMSC。通过酶消化从8日龄婴儿的包皮分离包皮SC(hSkin SC)。使两种细胞类型生长在T-75细胞瓶中在补充有必需氨基酸、抗生素和胎牛血清的低葡萄糖DMEM中。

通过RT-PCR和免疫化学评估hOMSC和包皮干细胞(hSkin SC)的干细胞标志物(Marinka-Kalmani等2010，同上和未发表的数据)。

如图1中示出的，hOMSC被赋予比hSkin SC更高的多能性相关标志物和神经嵴相关标志物的表达。

标志物OCT4、SOX2和NANOG是特征性多能性相关标志物；c-MYC和KLF4二者是多能性相关标志物和早期神经嵴标志物；并且SNAIL是特征性神经嵴干细胞标志物。

分子数据通过用针对多能性相关干细胞标志物和神经嵴相关干细胞标志物的抗体免疫荧光染色在蛋白水平上确认。指示标志物NANOG、SOX2、C-MYC、KLF4和SNAIL在hOMSC中比在hSkin SC中更丰富。还发现hOMSC中的染色限于核，表明这些转录因子的功能活性。因此得出结论，这些标志物在hOMSC中存在与hSkin SC相比明显更高的表达。

实施例2.hOMSC分泌蛋白质组的整体分析

hOMSC分泌蛋白质组的独特特征通过确定它的蛋白和核酸内容物确认。使用三种不同方法来获得广谱的hOMSC分泌蛋白质组组分：蛋白阵列、质谱(MS)和微小RNA(miRNA)表征。

如上文描述的，在扩增培养基中产生hOMSC并扩增。通过质谱和通过商购可得的蛋白阵列试剂盒评估条件培养基中的蛋白的谱。包含在hOMSC分泌蛋白质组内的RNA种类的测序使用本领域已知的方法进行以确定hOMSC分泌蛋白质组的遗传货物。

蛋白的谱

通过MS和蛋白阵列分析hOMSC分泌蛋白质组的蛋白内容物。

MS分析：如上文描述地制备来自4种不同hOMSC培养物(每一种源自单独的供体)的4种分泌蛋白质组。0.1ml样品被胰蛋白酶消化，通过LC-MS/MS在Q exactive plus(ThermoFisher)上分析，并且通过Discoverer软件1.4版针对人类和牛uniprot数据库(对于胎牛血清)分析。使用靶-诱饵策略针对肽水平和蛋白水平上的错误发现率(FDR)<0.01过滤鉴定出的蛋白。

将蛋白过滤以消除常见的污染物和单肽鉴定(single peptideidentification)。通过计算每一种肽的峰面积完成半定量。蛋白的面积是来自每一种蛋白的三种最强肽的平均值。

在hOMSC分泌蛋白质组内鉴定出总计369种蛋白(图11)，包括细胞外基质蛋白、糖蛋白、蛋白受体、针对细胞外基质蛋白的蛋白水解酶和蛋白水解酶抑制剂、参与代谢的蛋白、参与应激响应的蛋白诸如热休克蛋白、核蛋白、参与组织发育和修复的蛋白、整合细胞膜蛋白(integral cell membrane protein)如整合素以及包括外泌体标志物CD63的分化(CD)蛋白的簇、免疫调节蛋白和其他蛋白的簇。

值得注意的是参与神经系统的内稳态、保护和修复的13种蛋白的簇，在表1中详细描述：

表1.参与神经系统的内稳态的hOMSC分泌蛋白质组蛋白。

令人特别感兴趣的是hOMSC分泌蛋白质组中存在SOD1和中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)。这些蛋白抑制细胞内应激，细胞应激为神经退行性疾病的标志和细胞死亡的原因。此外，已经显示出MANF在动物模型中治疗帕金森病是有效的(Voutilainen等2015)。

如通过MS确定的，hOMSC分泌蛋白质组的蛋白组成是独特的。当hOMSC分泌蛋白质组与源自人类骨髓(BMSC)、脂肪组织(ASC)或牙髓(DPSC)的间充质干细胞的分泌蛋白质组比较时(Tachida等2015)，发现hOMSC分泌蛋白质组包含未在任何分泌蛋白质组中检测到的75种蛋白。

鉴定出的75种独特的蛋白在表2中列出。

表2.独特的hOMSC分泌蛋白质组蛋白。

蛋白	登录号	蛋白	登录号	蛋白	登录号
						1SV	E7ENT3	DSTN	F6RFD5	MFAP4	P55083
3SV	HOYAE9	ECH1	M0R248	MMP1	P03956
						ACTG2	P63267	EDIL3	O43854	MMP14	P50281
ADAM10	014672	EFEMP1	A0A0U1RQV3	MT2A	P02795
						ADAMTSL1	Q8N6G6	ELN	E7ETP7	NBL1	A3KFI5
ADM	EP9L83	FLG	P20930	OMD	Q99983
						ANXA4	Q6P452	GNB2	C9JIS1	PFN1	P07737
APOD	P05090	GREM2	G9H772	PI16	Q6UXB8
						CALM2	P0DP24	H3F3B	K7EMV3	PSG5	E7EQY3
CD109	Q6YHK3	HBA1	P69905	PSMB6	P28072
						CD59	E9PNW4	HIST1H2AH	Q96KK5	PTGDS	P41222
CDH6	DHRF86	HIST1H2BK	O60814	RARRES2	Q99969
						CFD	P00746	HIST1H4A	P62805	SLIT3	A0A0A0MSC8
COL15A1	A0A087X0K0	HMGN2	P05204	SPOCK1	Q08629
						COL1A2	A0A087WTA8	HNRNPAB	D6R9P3	SPTBN4	M0QZQ3
COLEC12	Q5KU26	HSP90AA1	P07900	STOM	P27105
						CTHRC1	Q96CG8	HSPA1A	P0DMV8	TMSB10	P63313
CTSC	H0YCY8	HSPG2	P98160	TMSB4X	P62328
						CTSL	P07711	IGFBP5	P24593	TNFAIP6	P98066
CXCL12	P48061	JUP	P14923	TNXB	A0A087WWA5
						DCD	P81605	KHSRP	M0R0I5	TPI1	P60174
DDAH2	O95865	LDHA	P00338	TUBA1C	Q9BQE3
						DKK1	O94907	LMNB2	Q03252	UBC	F5H6Q2
DSG1	Q02413	LTBP4	A0A0C4DH07	VIT	Q6UXI7
						DSP	P15924	MAN1A1	P33908	WNT5A	P41221

蛋白CXCL12是hOMSC分泌蛋白质组特有的，已知在干细胞募集到受损的器官中起作用并且促进神经祖细胞的增殖和迁移(Wu等2009)。这种蛋白在hOMSC分泌蛋白质组中高度丰富，在369种蛋白中排在第58位，即在检测到的蛋白的前20％。

周围组织在由疾病或损伤引起应激时分泌CXCL12以从骨髓募集内皮祖细胞和间充质干(基质)细胞。该过程在受损的糖尿病组织中被基本上抑制(Rodrigues等2015、Tepper等2010)。包含作为受损的组织处的主要营养因子的CXCL12的hOMSC分泌蛋白质组的施用，通常促进伤口愈合并且特别是促进糖尿病个体中的伤口愈合。

如图12中示出的，总计294种hOMSC分泌蛋白质组蛋白是与关于源自BMSC、ASC或DPSC的分泌蛋白质组所列出的1534种蛋白共有的。然而，分泌蛋白质组的独特特征不仅通过它的组分，还通过这些组分的相对丰度来确定。例如，胰岛素生长因子2(IGF2)(属于生长因子的胰岛素家族并且在组织内稳态和修复中具有多效功能)是hOMSC分泌蛋白质组的主要组分，但在BMSC中几乎未检测到并且在ASC和DPSC中未检测到。

蛋白阵列：通过80种蛋白的蛋白阵列试剂盒(G-Series CytokineArray,RayBiotech,Inc,USA)进一步分析hOMSC的分泌蛋白质组的蛋白组分并且与hSkinSC的分泌蛋白质组的蛋白组分进行比较。蛋白分析揭示了至少21种蛋白的分泌的差异，所述至少21种蛋白在hOMSC分泌蛋白质组中与hSkin SC的相比过表达或表达不足(图2和3)。值得注意的是在hOMSC中，与hSkin SC中相比，蛋白PlGF、MSCF、VEGF和HGF是过丰富的细胞因子，并且蛋白瘦蛋白、ENA-78和MCP-3丰度不足。

hOMSC和hSkin SC的分泌蛋白质组还与已发表的源自年轻人类骨髓的人类间充质干细胞的分泌蛋白质组进行比较，所述已发表的源自年轻人类骨髓的人类间充质干细胞的分泌蛋白质组使用与上文描述的(Park等2009)被用于确定hOMSC和hSkin SC的分泌蛋白质组的相同抗体阵列试剂盒。考虑到检测下限值为50，图2和4中的表的比较显示出，如PlGF、EGF、SDF-1、BDNF、GDNF、IGF1、血管生成素和许多其他的生长因子和神经营养剂在骨髓源性间充质干细胞的分泌蛋白质组中是检测不到的，但在hOMSC中表达。

因子和剂中的一些，诸如，例如，HGF，在hOMSC中高度表达。hOMSC分泌蛋白质组和皮肤SC的分泌蛋白质组之间的差异在图3中示出，图3图示了hOMSC分泌蛋白质组和皮肤SC分泌蛋白质组内的多种趋化因子的量之间的比例。图1-4中展示的数据清楚地证明，3种干细胞类型具有与测试的蛋白不同的分泌谱。

微小RNA分析：条件培养基从三种不同hOMSC培养物(每一种源自不同的供体)收集，如上文描述地用于制备分泌蛋白质组，但不进行浓缩步骤。将条件培养基在4℃以12000G离心4分钟，根据下文的程序提取总miRNA：

1.将7ml的Trizol^TM试剂添加到10ml的样品并且涡旋。然后将样品在室温放置静置5分钟。

2.添加1.4ml的氯仿并且将样品剧烈摇动15秒。

3.将样品在4℃以15,300G离心15分钟。

4.将上层水相转移到新管，小心地避开中间相。

5.按照制造商的方案，使用mirVana^TMPARIS miRNA分离试剂盒分离miRNA。mirVana^TM试剂盒利用两个连续的GFF。

将miRNA洗脱在50μl无RNA酶的水中。

使用NanoDrop^TM光分光光度计(NanodropTechnologies,Willmington,DE,USA)评估miRNA的浓度和纯度。如表3中示出的波长依赖性的消光系数代表溶液中所有RNA的微组分：

表3.波长依赖的消光系数值

样品编号	ng/μl	体积(μl)	260/280nm处的消光系数
				1	38.5	17	2.11
2	30.9	17	2.15
				3	40.7	17	2.1

微小RNA表达的表征

miRNA表达谱分析(profiling)使用nCounter miRNA表达测定(在https://www.nanostring.com中描述)进行，该测定提供了一种用于检测800个miRNA的方法，而不需要使用逆转录或通过使用被称为nCounter报告物探针的分子条形码扩增。所有数据分析和归一化使用nSolver^TM软件分析(从NanoString Technologies免费下载)进行，其中特定的miRNA计数针对基于跨越所有实验样品或使用加标(Spike-in)对照计算的CVS统计量的稳定表达的miRNA的选择进行归一化。

表4中示出的归一化数据指示39种miRNA在各自源自不同的供体的3种hOMSC分泌蛋白质组中表达。该miRNA中的每一种具有高于20的相对表达值，当使用上文描述的方法学时，其是公认的用于miRNA检测的较低阈值。

表4.在3种独特的hOMSC分泌蛋白质组中鉴定出的具有>20的相对值的miRNA。

将这39种miRNA的谱与骨髓源性间充质干细胞(BMSC)和脂肪源性间充质干细胞(ASC)的已发表的miRNA的谱(Baglio等,2015)比较。结果证明hOMSC分泌蛋白质组miRNA谱是独特的。hOMSC分泌蛋白质组miRNA与BMSC分泌蛋白质组和ASC分泌蛋白质组中检测到的miRNA之间分别仅共享5种和3种miRNA。由hOMSC分泌蛋白质组和BMSC分泌蛋白质组共享的5种miRNA中的3种还与ASC分泌蛋白质组共享。因此，34种miRNA不包含在被认为赋予高治疗能力的成体BMSC分泌蛋白质组和ASC分泌蛋白质组的miRNA组成内。

实施例3.hOMSC在伤口愈合中的治疗能力

糖尿病患者中的伤口愈合由于受损的局部和全身信号传导以及对伤口愈合信号(cue)的不适当组织响应而被延迟。这种多因子受损的伤口愈合过程带来了延迟的细胞迁移，降低的新血管和结缔组织形成。干细胞因为其多因子分泌蛋白质组已经被提出作为用于治疗糖尿病伤口的前沿工具。

缺乏瘦蛋白受体、增加了食物摄取并且因此变得肥胖并且发展II型糖尿病的转基因小鼠(db/db小鼠)因具有与人类中的II型糖尿病相似的疾病病原学而被使用。在小鼠中的其他已知糖尿病模型中，糖尿病db/db小鼠展示出最慢的皮肤伤口闭合的速率(MichaelsJ等2007)。

在糖尿病(血糖>300mg/dcl)db/db小鼠的背上进行直径为6mm的全层皮肤损伤(Full thickness dermal wound)。将具有8mm的内径的硅圈形环缝合在伤口周围以防止伤口收缩，并且用作标准参考对象以在宏观水平计算伤口闭合的速率。将动物分成3组，每一组5只-10只动物：i)用充当细胞递送的媒介物的PBS注射的阴性对照组；ii)hOMSC治疗的组；和iii)hSkin SC治疗的组。细胞在4个等距离部位处皮内注射，5×10⁵个细胞/部位。每2天-4天给动物拍照以确定伤口闭合的速率。为此，通过对照片的图像分析来确定每一个时间点每一只动物中的伤口面积，并且通过确定由在相同照片上出现的圈形环的内圆周所描绘的面积来归一化伤口面积(图5)。

图6A(定量结果)和6B(代表性定性照片)中证明的结果指示，与未治疗的(PBS媒介物)或hSkin SC治疗的动物相比，hOMSC治疗的动物中直到伤口闭合之前的伤口愈合速率是统计学上显著(p<0.05)更高的。用hOMSC治疗的所有动物中伤口闭合发生在受伤后16天，而未治疗的组的所有动物中伤口完全闭合发生在受伤后26天。此外，在未治疗的组和hSkinSC治疗的组之间没有观察到显著的统计学差异。

在一项单独的研究中，还在健康的未治疗的野生型(WT)动物中测试了伤口愈合的自然速率。出于该目的，使用了与上文描述相同的实验设置。动物与它们的db/db对应物年龄匹配。

如图7中描绘的，在hOMSC治疗的小鼠中，伤口愈合的速率与该WT-未治疗的小鼠相似。在用hOMSC治疗的db/db糖尿病小鼠中，伤口完全闭合的平均时间为14.3±1.4天，WT-未治疗的动物的伤口完全闭合的平均时间为15.14±1.06天，并且db/db糖尿病未治疗的小鼠的伤口完全闭合的平均时间为22.75±2.16天。这些数据指示出，hOMSC具有克服糖尿病状态对伤口愈合的有害影响并且将糖尿病伤口愈合的速率逆转至正常的能力。

hSkin SC缺乏对糖尿病伤口愈合的刺激作用是出乎意料的，并且因此在相同的实验设置中测试了另一种SC群体即脂肪组织源性干细胞(hADSC)的能力。图8和图9中示出的结果证明，hADSC治疗的动物中伤口愈合的速率比hOMSC治疗的动物中伤口愈合的速率统计学上显著更低，但高于未治疗的动物或hSkin SC治疗的动物的伤口愈合的速率(p<0.05)。尽管如此，在所有用hADSC治疗的动物中，与用hSkin SC治疗的动物一样，伤口完全愈合发生在受伤后24天。

因此得出结论，在促进糖尿病伤口愈合中，幼稚hOMSC优于其他干细胞。

实施例4.hOMSC分泌蛋白质组的治疗潜力

为了测试hOMSC的治疗作用是否至少部分归因于它们的独特分泌蛋白质组，将1×10⁶个hOMSC在无血清培养基中维持24小时。

然后，收集培养基并且用具有1,000道尔顿的截止值(cutoff)的浓缩过滤器(Amicon)浓缩。浓缩的培养基包含幼稚hOMSC的分泌蛋白质组的组分，如通过MS分析的。将这种hOMSC来源的浓缩的条件培养基注射到实施例2和图5中描述的糖尿病伤口愈合模型中。每一只糖尿病db/db小鼠在图5中由箭头标记的每一个部位处用50μl的条件培养基(代表24小时的时间段内分泌2×10⁵个hOMSC)注射。因此，将总计200μl的浓缩的条件培养基注射到每一只动物的伤口周围。条件培养基的施用仅在实验时间段开始时进行。如上文描述的，肉眼追踪动物并且在闭合时处死。包括硅环的伤口区域被取出并且进行组织学分析。

伤口闭合的速率在图10中示出。结果指示，一次性施用限于浓缩的hOMSC条件培养基内的hOMSC-分泌蛋白质组与hOMSC一样有效促进糖尿病伤口愈合。愈合的伤口的中央的血管的数目和胶原蛋白的量的组织形态计量分析(histomorphometric analysis)揭示：i)hOMSC治疗的动物和hOMSC分泌蛋白质组治疗的动物中的胶原结缔组织的量之间无统计学差异；和ii)hOMSC分泌蛋白质组治疗的动物中的血管的数目与未治疗的动物或hSkin SC治疗的动物相比增加，并且血管的数目与hOMSC治疗的动物相比降低。

不希望受任何理论或作用模式的约束，揭示了与用会继续分泌物质的干细胞治疗相比，用分泌蛋白质组的继续或多次治疗将是需要的。尽管如此，分泌蛋白质组组合物比细胞更安全并且更易于操纵、表征、维持和施用。

总之，结果指示hOMSC分泌蛋白质组保持了hOMSC促进糖尿病足部溃疡的愈合的效率，并且因此它们可以被用作独立的治疗工具或作为用于细胞疗法的辅助物，特别是在需要新生血管形成的任何时候。

以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，容易地为多种应用修改和/或调整这样的特定实施方案而不需要过度实验并且不背离一般概念，并且因此，这样的调整和修改应当并且意图被包含在本公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应理解的是，本文采用的措辞或术语是出于描述并且非限制的目的。用于实施多种本公开的功能的手段、材料和步骤可以采取多种替代形式而不背离本发明。

参考文献：

·Antonyak MA，Cerionee RA(2015)Emerging picture of the distincttraits and functions of microvesicles and exosomes.PNAS 112(12)，3589-3590.

·Baglio SR，Rooijers K，Koppers-Lalic D，.Verweij FJ，MP，Zini N，Naaijkens B，Perut F，Niessen HWM，Baldini N and Pegtel DM(2015).Human bonemarrow-and adiposemesenchymal stem cells secrete exosomes enriched indistinctive miRNA and tRNA species.6，127-147.

·Desrochers LM，Antonyak MA，Cerione RA(2016)Extracellular vesicles:Satellites of information transfer in cancer and stem cellbiology.Development Cell 37，301-309.

·DiPietro LA(2003).Differential injury responses in oral mucosal andcutaneous wounds.J.Dent.Res.82，621-626.

·Ganz J，Arie I，Ben-Zur T，Dadon-Nachum M，Pour S，Araidy S，Pitaru S，Offen D (2014).Astrocyte-like cells derived from human oral mucosa stem cellsprovide neuroprotection in vitro and in vivo.Stem Cells Transl.Med.3，375-86.

·Ganz J，Arie I，Buch S，Zur TB，Barhum Y，Pour S，Araidy S，Pitaru S，OffenD(2014).Dopaminergic-like neurons derived from oral mucosa stem cells bydevelopmental cues improve symptoms in the hemi-parkinsonian rat model.PLoSOne 9(6)，e100445.

·Gue W.，Gao Y.，Li N.，Shao F.，Wang C.，Wang P.，Yang Z.，Li R.，and He J.(2017).Exosomes:New players in cancer(Review).Oncology Reports 38：665-675.

·Hu L，Wang J，Zhou X，Xiong Z，Zhao J，Yu R，Huang F，Zhang H，Chen L(2016).Exosomes derived from human adipose mesenchymal stem cells acceleratescutaneous wound healing via optimizing the characteristics offibroblasts.Scientific Reports 6，32993.

·Kanada M，Bachmann MH，Hardy JW，Frimannson DO，Bronsart L，Wang A，Sylvester MD，Schmidt TL，Kaspar RL，Butte MJ，Matin AC，Contag CH(2015).Differential fates of biomolecules delivered to target cells viaextracellular vesicles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112，E1433-E1442.

·Konala VB，Mamidi MK，Bhonde R，Das AK，Pochampally R，Pal R(2016).Thecurrent landscape of the mesenchymal stromal cell secretome:A new paradigmfor cell-free regeneration.Cytotherapy 18(1)，13-24.

·Lai，R.C.，Arslan，F.，Lee，M.M.，Sze，N.S.K.，Choo，A.，Chen，T.S.，Salto-Tellez，M.，Timmers，L.，Lee，C.N.，El Oakley，R.M.，et al.(2010).Exosome secreted byMSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem Cell Res.4，214-222.

·Lopez-Verrilli MA，Caviedes A，Cabrera A，Sandoval S，Wyneken U，KhouryM(2016)Mesenchymal stem cell-derived exosomes from different sourcesselectively promote neuritic outgrowth.Neuroscience 320，129-139.

·Marynka-Kalmani K，Treves S，Yafee M，Rachima H，Gafni Y，Cohen MA，Pitaru S (2010).The lamina propria of adult human oral mucosa harbors a novelstem cell population.Stem Cells 28(5)，984-95.

·Michaels J 5th，Churgin SS，Blechman KM，Greives MR，Aarabi S，GalianoRD，Gurtner GC(2007).db/db mice exhibit severe wound-healing impairmentscompared with other murine diabetic strains in a silicone-splinted excisionalwound model.Wound Repair Regen.15(5)，665-70

·Park CW，Kim KS，Bae S，Son HK，Myung PK，Hong HJ，Kim H(2009).Cytokinesecretion profiling of human mesenchymal stem cells by antibody array.Int JStem Cells2(1)，59-68.

·Rodrigues M，Wong VW，Rennert CR，Davis CR，Longaker MT，Gurtner GC(2015).Progenitor cell dysfunction underlie some diabetic complications.TheAmerican Journal of Pathology 2015，85(8).

·Skog J，Würdinger T，van Rijn S，Meijer DH，Gainche L，Sena-Esteves M，Curry WT Jr，Carter BS，Krichevsky AM，Breakefield XO(2008).Glioblastomamicrovesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth andprovide diagnostic biomarkers.Nat.Cell.Biol.10(12)，1470-6.

·Tachida Y，Sakurai H，Okutsu J，Suda K，Sugita R，Yaginuma Y，Ogura Y，Shimada K，Isono F，Kubota K and Kobayashi H.(2015).Proteomic Comparison of theSecreted Factors of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow，Adipose Tissueand Dental Pulp.Journal of Proteomics and Bioinformatics；8(12)，266-273.

·Tepper OM，Car J，′Robert J.Allen Jr，Chang CC，″Li CD，Tanaka R，GuptaSM，Levine JP，Saa deh PB，Warren SM.(2010).Decreased circulating cell numberand failed mechanisms of stromal cell-derived factor-1α mediated bone marrowmobilization impair diabetic tissue repair.Diabetes 59，1974-1983.

·Treves-Manusevitz S，Hoz L，Rachima H，Montoya G，Tzur E，Vardimon A，Narayanan AS，Amar S，Arzate H，Pitaru S(2013).Stem cells of the lamina propriaof human oral mucosa and gingiva develop into mineralized tissues invivo.J.Clin.Periodontol.40(1)，73-81.

·Villarroya-Beltri C，Baixauli F，Gutierrez-Vazquez C，Sanchez-MadridF，Mittelbrunn M(2014)Sorting it out:regulation of exosome loading.SeminCancer Biol 28，3-13.

·Voutilainen MH，Arumae U，Airavaara M，Saarma M.(2015).Therapeuticpotential of the endoplasmatic reticulum located and secreted CDNF/MANFfamily of neurotrophic factors in Parkinson’s Disease FEBS Letter 589，3739-3748.

·Wu Y.，Peng H.，Cui M.，Whitney N.P.，Huang Y.，and Zheng C.(2009)，CXCL2increases human neural progenitor cell proliferation through Akt-1/FOXO3a signaling pathway.Journal of Neurochemistry 109，1157-1167.

·Xu R，Greening DW，Zhu HJ，Takahashi N，Simpson RJ(2016).Extracellularvesicle isolation and characterization:toward clinical application.J，Clin，Invest.；126(4)，1152-62.

·Zander C，Heidbreder M，Kasperek Y，Noll T，Seitz O，Saldamli B，SudhoffH，Sader R，Kaltschmidt C，Kaltschmidt B(2009).Adult Palatum as a Novel Sourceof Neural Crest-Related Stem Cells.Stem Cells；27，1899-1910.

·Zhang Q，Nguyen P，Xu Q，Park W，Lee S，Furuhashi A，Le AD(2017).NeuralProgenitor-Like Cells Induced from Human Gingiva-Derived Mesenchymal StemCells Regulate Myelination of Schwann Cells in Rat Sciatic NerveRegeneration.Stem Cells Transl.Med.6(2)，458-470。

Claims (33)

1.一种无细胞组合物在制备用于治疗伤口的药物中的用途，其中所述无细胞组合物包含由人类口腔粘膜干细胞分泌的物质hOMSC源性分泌蛋白质组连同至少一种赋形剂，其中所述无细胞组合物能够通过包括以下步骤的方法获得：

i.在培养基中扩增通过外植或酶消化分离的hOMSC；

ii.将所述培养基更换为基础培养基；

iii.将hOMSC在所述基础培养基中培养范围从1小时至120小时的时间段；

iv.从培养物收获培养基；

v.用具有1,000道尔顿截止值的过滤器过滤所述培养基，以及

vi.添加至少一种赋形剂。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述赋形剂是载体。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述赋形剂是稀释剂。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述方法包括将所述培养基浓缩1.1倍-10,000倍的步骤。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物源自自体hOMSC或同种异体hOMSC，或其中所述hOMSC是幼稚细胞。

6.如权利要求1-5中任一项所述的用途，所述无细胞组合物包含：

(i)来自由以下组成的组的至少一种蛋白：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C(CST3)、半乳凝素-1(LGALS1)、胶质细胞源性连接蛋白(SERPINE2)、胰岛素样生长因子II(IGF2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白3片段(LTBP3)、潜伏转化生长因子β结合蛋白4(LTBP4)、神经母细胞分化相关蛋白(AHNAK)和色素上皮源性因子(SERPINF1/PEDF)；或

(ii)选自由以下组成的组的至少一种蛋白：肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞炎性蛋白-3(MIP-3a)、生长调节性癌基因-α(GRO-a或CXCL1)、巨噬细胞源性/CCL22趋化因子(MDC或CCL22)、生长调节性癌基因(GRO)、IGFBP-2、神经营养因子-4(NT-4)、单核细胞趋化蛋白2(MCP-2/CCL8)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2(IL-2)和脑源性神经营养因子(BDNF)；或

(iii)选自由以下组成的组的至少一种蛋白：

1 SV，3 SV，ACTG2，ADAM10，ADAMTSL1，ADM，ANXA4，APOD，CALM2，CD109，CD59，CDH6，CFD，COL15A1，COL1A2，COLEC12，CTHRC1，CTSC，CTSL，CXCL12，DCD，DDAH2，DKK1，DSG1，DSP，DSTN，ECH1，EDIL3，EFEMP1，ELN，FLG，GNB2，GREM2，H3F3B，HBA1，HIST1H2AH，HIST1H2BK，HIST1H4A，HMGN2，HNRNPAB，HSP90AA1，HSPA1A，HSPG2，IGFBP5，JUP，KHSRP，LDHA，MNB2，LTBP4，MAN1A1，MFAP4，MMP1，MMP14，MT2A，NBL1，OMD，PFN1，PI16，PSG5，PSMB6，PTGDS，RARRES2，SLIT3，SPOCK1，SPTBN4，STOM，TMSB10，TMSB4X，TNFAIP6，TNXB，TPI1，TUBA1C，UBC，VIT

和WNT5A；或

(iv)选自由以下组成的组的至少一种微小RNA(miRNA)：

hsa-miR-4454+hsa-miR-7975，hsa-rmiR-23a-3p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-612，hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-3144-3p，hsa-miR-199a-3p+hsa-rmiR-199b-3p，hsa-miR-191-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-1260a，hsa-miR-378h，hsa-miR-379-5p，hsa-miR-376a-3p，hsa-let-7i-5phsa-miR-526a+hsa-rniR-518c-5p+hsa-rniR-518d-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-28-5p，hsa-miR-758-3p+hsa-miR-411-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-1206，hsa-miR-1286，hsa-miR-514a-3p，hsa-miR-548ah-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-543，hsa-miR-626，hsa-miR-339-3p，hsa-miR-1234-3p，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-888-5p，hsa-miR-542-3p，hsa-miR-514b-5p，hsa-miR-548m，hsa-miR-30e-5p和hsa-miR-1290：

或其组合。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述无细胞组合物包含来自(i)、(ii)、(iii)或(iv)的多于一种物质。

8.如权利要求6所述的用途，其中所述无细胞组合物包含来自(i)的至少一种蛋白、来自(ii)的至少一种蛋白、(iii)中的至少一种蛋白以及任选地来自(iv)的至少一种miRNA。

9.如权利要求6至8中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含选自由以下组成的组的至少一种因子：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和血管内皮生长因子(VEGF)。

10.如权利要求6至8中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含选自由以下组成的组的至少六种微小RNA：hsa-miR-4454+hsa-miR-7975，hsa-miR-23a-3p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-612，hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-3144-3p，hsa-miR-199a-3p+hsa-miR-199b-3p.hsa-miR-191-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-1260a，hsa-miR-378h，hsa-miR-379-5p，hsa-miR-376a-3p，hsa-let-7i-5p.hsa-miR-526a+hsa-miR-518c-5p+hsa-miR-518d-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-28-5p，hsa-miR-758-3p+hsa-miR-411-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-1206，hsa-miR-1286，hsa-miR-514a-3p，hsa-miR-548ah-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-543，hsa-miR-626，hsa-miR-339-3p，hsa-miR-1234-3p，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-888-5p，hsa-rniR-542-3p，hsa-miR-514b-5p，hsa-miR-548m，hsa-miR-30e-5p和hsa-miR-1290。

11.如权利要求6至9中任一项所述的用途，其中(i)、(ii)或(iii)中的至少一种蛋白比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更高的浓度存在。

12.如权利要求11所述的用途，其中比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更高的浓度存在的所述至少一种蛋白选自由以下组成的组：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1，P48061)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1，P00441)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF，P55145)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和血管内皮生长因子(VEGF)。

13.如权利要求1至12中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更低的浓度的至少一种蛋白。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述至少一种蛋白选自由以下组成的组：白细胞介素-8(IL-8)、由γ干扰素诱导的单核因子(MIG/CXCL9)、白细胞介素-6(IL-6)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3配体)、瘦蛋白、上皮源性中性粒细胞活化肽78(ENA-78/CXCL5)和单核细胞趋化蛋白3(MCP-3/CCL7)。

15.如前述权利要求中任一项所述的用途，所述无细胞组合物包含参与神经系统的内稳态的至少一种蛋白，其中所述蛋白选自由以下组成的组：半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C、半乳凝素-1、胶质细胞源性连接蛋白、胰岛素样生长因II(IGF2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)；潜伏转化生长因子β结合蛋白3(LTBP3)；潜伏转化生长因子β结合蛋白4(LTBP4)；中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、神经母细胞分化相关蛋白(AHANK)、色素上皮源性因子(PEDF)、基质细胞源性因子1(SDF1)和超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SODC)。

16.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含细胞外囊泡(EV)。

17.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含微囊泡。

18.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含外泌体。

19.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含具有1,000道尔顿或更高的分子大小的可溶性因子。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述可溶性因子选自由以下组成的组：蛋白、肽、激素、DNA和RNA种类、寡核苷酸和多核苷酸及其组合。

21.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含可溶性因子、微囊泡和外泌体。

22.如权利要求1所述的用途，其中所述伤口为糖尿病伤口。

23.如权利要求1至22中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含源自自体hOMSC的分泌蛋白质组。

24.如权利要求1至22中任一项所述的用途，其中所述无细胞组合物包含源自同种异体hOMSC的分泌蛋白质组。

25.如权利要求1至24中任一项所述的用途，其中所述组合物经由选自由以下组成的组的途径向有相应需要的受试者施用：局部、皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、鞘内、静脉内或直接注射于任何组织中有需要的部位处。

26.如权利要求1至24中任一项所述的用途，其中所述组合物被局部地施用到受损的组织。

27.如权利要求1至24中任一项所述的用途，其中所述组合物被全身地施用。

28.一种由hOMSC产生无细胞分泌蛋白质组在制备用于治疗伤口的药物中的用途，其中所述由hOMSC产生的无细胞分泌蛋白质组通过包括以下步骤的方法产生：

i.在培养基中扩增通过外植或酶消化分离的hOMSC；

ii.将所述培养基更换为基础培养基；

iii.将hOMSC在所述基础培养基中培养范围从1小时至120小时的时间段；

iv.从培养物收获所述培养基；

v.用具有1,000道尔顿截止值的浓缩过滤器浓缩所述培养基，和

vi.任选地，将所述培养基浓缩1.1倍-10,000倍。

29.如权利要求28所述的用途，其中在步骤(iv)期间或之后，所述hOMSC经受影响所述分泌蛋白质组的内容物的刺激或条件。

30.如权利要求28或29所述的用途，其中所述伤口是糖尿病伤口。

31.如权利要求28至30中任一项所述的用途，其中所述药物经由选自由以下组成的组的途径向有相应需要的受试者施用：局部、皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、鞘内、静脉内或直接注射于任何组织中有需要的部位处。

32.如权利要求28至30中任一项所述的用途，其中所述药物被局部地、表面地或肠胃外地施用到受损的组织。

33.如权利要求28至30中任一项所述的用途，其中所述药物被全身地施用。