CN111093657A - 用于治疗视网膜疾病的光感受器基因调节剂光调节素3 - Google Patents

Abstract

用于降低视网膜中视杆基因表达的方法，用于降低视网膜中视杆基因表达的蛋白产物的方法，用于治疗通过降低视网膜中视杆基因表达或其蛋白产物可治疗的疾病或病症的方法，和使用光调节素3(PR3)治疗受试者的视网膜疾病的方法。

Description

用于治疗视网膜疾病的光感受器基因调节剂光调节素3

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月10日提交的第62/543,782号美国申请的权益，将其全部内容以引用方式明确地并入本文。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此以引用方式并入说明书。包含序列表的文本文件的名称为67005_ST25.txt。文本文件为2KB；创建于2018年8月10日；并通过EFS-Web在提交说明书时一起递交。

政府许可权利的声明

本发明是在国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的授权号为P01 GM081619、R01 EY021374和R01 EY021482的政府支持下完成的。政府拥有对本发明的某些权利。

发明背景

色素性视网膜炎(RP)是一种遗传性视网膜变性疾病，具有每3000-5000名新生儿中1例的患病率。已确定了在约60个基因中多于3000个突变与RP相关。这些突变中的大多数都在视杆光感受器发育和功能所必需的基因中。当前没有有效的药物疗法来减缓或预防这些个体的视杆变性。

一种治疗视网膜变性的新兴方法是通过靶向调节视杆基因表达的因子。视网膜发育的研究已经确定了几种调节光感受器基因表达的转录因子。例如，视杆特异性转录因子Nr1或Nr2e3中的功能突变的丧失导致视杆获得更多视锥样特性。条件性敲除已表明，即使在成熟视杆中也必需Nrl来维持其正常的基因表达水平。此外，在条件性缺失或CRISPR-Cas9病毒缺失的情况下，由Nrl的缺失导致的视杆基因表达的降低足以促进RP模型中视杆的存活。

最近已有报道称，可以使用被称为光调节素(Photoregulin)的Nr2e3的小分子调节剂来调节该复合物。用光调节素1(PR1)处理发育中或成熟的视网膜降低视杆基因表达并提高一些视锥基因的表达，很像Nr2e3中功能突变的基因缺失。此外，用PR1处理两个RP小鼠模型Rho^P23H和Pde6b^Rd1突变体外减缓视杆变性。然而，PR1的体内分析受到该化合物在体内的效力、溶解度、稳定性的限制。

尽管PR1化合物的开发取得了进步，但仍存在对通过Nr2e3起作用但更适合体内研究的化合物的需求。本发明试图满足这种需求并提供另外的相关优点。

发明概述

一方面，本发明提供了一种用于降低视网膜中视杆基因表达的方法。在某些实施方案中，所述视杆基因是Nr、Nr2e3、Rho或Gnat1。

另一方面，本发明提供了一种用于降低视网膜中视紫红质表达的方法。

在上述方法中，使视网膜与式(I)的化合物或其药学上可接受的盐接触：

在上述方法的某些实施方案中，接触视网膜包括全身给予或玻璃体内注射。在某些实施方案中，视网膜是人受试者的视网膜。

另一方面，本发明提供了一种用于治疗通过降低视网膜中视杆基因表达可治疗的疾病或病症的方法。

又一方面，本发明提供了一种治疗受试者的视网膜疾病的方法。

在上述方法中，向有其需要的受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

在上述方法的某些实施方案中，所述疾病或病症或视网膜疾病是色素性视网膜炎、视网膜变性、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑营养不良、视网膜营养不良、Sorsby眼底营养不良、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑病变、早产儿视网膜病变和缺血再灌注相关的视网膜损伤。在某些实施方案中，所述疾病或病症或视网膜疾病是色素性视网膜炎。

在上述方法的某些实施方案中，给予所述化合物包括全身给予或玻璃体内注射。在某些实施方案中，所述受试者是人。

附图说明

当结合附图时，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更加容易理解，因为通过参考以下详细描述，本发明的前述方面和许多伴随的优点变得更好理解。

图1A示出了光调节素3(PR3)的化学结构。

图1B比较了PR1和PR3对解离的视网膜细胞培养物中视紫红质mRNA表达的剂量-响应关系。

图1C比较了PR1和PR3对解离的视网膜细胞培养物中视紫红质蛋白表达的剂量-响应关系。

图1D显示了将来自P11小鼠的完整视网膜外植到用于3DIV的含有DMSO或0.3μMPR3的培养基中，然后以整体封藏制备物进行S视蛋白(绿色)和DAPI染色。比例尺代表50μm。E.与DMSO处理的视网膜相比，PR3处理的视网膜在腹侧视网膜(ventral retina)中每100μmx 100μm视野中具有更多的S视蛋白+细胞(n＝3，*p<0.05，学生t检验)。

图1E是量化PR3对S-视蛋白表达的作用的图；处理条件与图1D中的那些相同。S-视蛋白+视锥主要存在于小鼠的腹侧视网膜中。与DMSO处理的视网膜相比，PR3处理的视网膜在腹侧视网膜中每100μm x 100μm视野中具有明显更多的S视蛋白+细胞(n＝3，*p<0.05，学生t检验)。

图1F示出了PR3与Nr2e3结合的等温滴定量热(ITC)研究。Nr2e3蛋白由表达载体pVP16表达为融合蛋白。将融合蛋白与TEV在4℃下孵育过夜，然后通过离子交换色谱将His8-MBP标签与Nr2e3分离。对于等温滴定量热法，将100mM PR3注入MicroCal ITC-200(Malvern)中的20mM Nr2e3中。ITC定性显示了PR3和Nr2e3之间的直接相互作用，使用单点模型估算的K_d为67μM。

图2A显示了RNA测序结果，其绘制了用DMSO溶媒或10mg/kg PR3处理的野生型小鼠的log倍数变化(logFC)相对于log RPKM的图，显示视杆光感受器基因的稳定降低(n＝每个条件2只小鼠)。

图2B显示了通过RNA测序评估的基因表达的最大变化(前100位)的基因本体分析(http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis)结果。

图2C比较了用10mg/kg PR3或DMSO溶媒处理的野生型小鼠视网膜切片的电子显微镜显微照片。与对照组相比，PR3视网膜已阻止了内节和外节的发育，并且ONL中的异染色质较不紧密。比例尺代表10μm(顶部)和2μm(底部)。

图3A示出了视紫红质^P23H小鼠中光感受器变性的时间轴和实验设计。

图3B比较了在来自视紫红质^P23H小鼠的视网膜切片上对视紫红质、S视蛋白、Otx2和视锥抑制蛋白的免疫荧光染色，并证实了用PR3处理，保留光感受器。比例尺代表50μm。

图3C比较了对中央和外周ONL中DAPI+细胞行的计数，并显示用PR3处理，光感受器的存活率更高(n≥7，*p<0.05，学生t检验)。

图3D比较了对来自用DMSO或PR3处理的视紫红质^P23H小鼠的整个视网膜的qPCR，并显示了用PR3处理，光感受器基因恢复蛋白、视紫红质和S视蛋白的表达更高(n≥6，*p<0.05，学生t检验)。

图4A比较了来自用10mg/kg PR3或DMSO溶媒处理的P21视紫红质^P23H小鼠的暗视b波振幅(n＝4-8，*p＜0.05，t-检验)。

图4B比较了来自单个DMSO溶媒小鼠的代表性暗视ERG波形。

图4C比较了来自单个PR3处理的小鼠的代表性暗视ERG波形。

图4D比较了来自用10mg/kg PR3或DMSO溶媒处理的P21视紫红质^P23H小鼠的明视b波振幅(n＝4-8，*p<0.05，t-检验)。

图4E比较了来自单个对照(DMSO)小鼠的代表性明视ERG波形。

图4F比较了来自单个PR3处理的小鼠的代表性明视ERG波形。

发明详述

本发明提供了用于降低视网膜中视杆基因表达的方法，用于降低视网膜中视杆基因表达的蛋白产物(例如视紫红质)的方法，用于治疗通过降低视网膜中视杆基因表达或其蛋白产物可治疗的疾病或病症的方法，以及用于治疗受试者的视网膜疾病的方法。在这些方法中，用光调节素3(PR3)处理视网膜或治疗受试者，以实现降低视杆基因表达的有利结果，从而降低其蛋白产物的表达，并因此治疗通过降低视杆基因表达或其蛋白产物可治疗的疾病或病症。如本文所述，结果证明PR3对于治疗视网膜疾病例如色素性视网膜炎(RP)有效。

降低视杆基因表达及其蛋白产物

一方面，本发明提供了一种用于降低视网膜中视杆基因表达的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括使视网膜与PR3，即式(I)的化合物或其药学上可接受的盐接触：

在本发明方法的实践中，其表达被有效降低的视杆基因包括Nrl、Nr2e3、Rho、Gnat1和Pde6b。

在上述方法的某些实施方案中，接触视网膜包括向受试者全身给予所述化合物或玻璃体内注射所述化合物。

另一方面，本发明提供了一种用于降低源自视杆基因的蛋白产物的表达的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于降低视网膜中视紫红质表达的方法。

在该方法的一个实施方案中，用如上所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理视网膜。

在上述方法的某些实施方案中，治疗视网膜包括向受试者全身给予所述化合物或玻璃体内注射所述化合物。

治疗通过降低视杆基因表达或其蛋白产物可治疗的疾病或病症

在本发明的另外的方面，提供了用于治疗通过降低视网膜中视杆基因表达或其蛋白产物可治疗的疾病或病症的方法。

在某些实施方案中，所述方法包括向有其需要的受试者给予治疗有效量的如上所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

通过降低视网膜中视杆基因表达或其蛋白产物可治疗的代表性疾病或病症包括色素性视网膜炎、视网膜变性、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑营养不良、视网膜营养不良、Sorsby眼底营养不良、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑病变、早产儿视网膜病变和缺血再灌注相关的视网膜损伤。在一个实施方案中，所述可治疗的疾病或病症是色素性视网膜炎。

在上述方法的某些实施方案中，给予化合物包括向受试者全身给予所述化合物或玻璃体内注射所述化合物。

治疗视网膜疾病

另一方面，本发明提供了用于治疗受试者的视网膜疾病的方法。

在某些实施方案中，所述方法包括向有其需要的受试者给予治疗有效量的如上所述的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

通过本发明的方法可治疗的代表性的视网膜疾病包括色素性视网膜炎、视网膜变性、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑营养不良、视网膜营养不良、Sorsby眼底营养不良、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑病变、早产儿视网膜病变和缺血再灌注相关的视网膜损伤。在一个实施方案中，所述可治疗的疾病或病症是色素性视网膜炎。

在上述方法的某些实施方案中，给予所述化合物包括向受试者全身给予所述化合物或玻璃体内注射所述化合物。

在作为治疗方法的本发明的方法中，术语“治疗有效量”是指在必需的剂量下和时间段内有效实现期望治疗结果，例如降低的视杆基因表达或其蛋白产物水平的量。化合物的治疗有效量可能根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述化合物在受试者中引起期望响应的能力的因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。治疗有效量也是这样的量，其中治疗有益效果超过给予的化合物的任何毒性或有害作用。

要注意的是，剂量值可以随着要减轻的病症的严重程度而变化。对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和给予组合物或监督组合物的给予的人员的专业判断随时间调整特定的剂量方案。本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并不限制医学从业者可以选择的剂量范围。组合物中活性化合物的量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。可以调节剂量方案以提供最佳的治疗响应。例如，可以给予单次推注，可以随时间给予几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。

在所述方法中，化合物的给予可以是局部给予(例如，向眼睛给予)或向受试者全身给予。术语“受试者”旨在包括哺乳动物机体。受试者的实例包括人和非人哺乳动物。在本发明的特定实施方案中，受试者是人。

术语“给予”、“接触”或“处理”包括将化合物或包含所述化合物的药物组合物递送至受试者的系统或受试者的特定区域(例如，眼睛)中的任何方法。

提高视锥基因表达的方法

在另外的方面，本发明提供了用于提高视网膜中视锥基因表达或其蛋白产物的方法。

在该方法的一个实施方案中，用如上所述的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理或接触视网膜。

在上述方法的某些实施方案中，处理或接触视网膜包括向所述受试者全身给予所述化合物或玻璃体内注射所述化合物。

在上述方法的某些实施方案中，处理或接触视网膜包括向所述受试者全身给予所述化合物或玻璃体内注射所述化合物。

药物组合物

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

合适的载体包括适合向动物(例如人受试者)给予的那些。适合注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(例如盐水、右旋糖)和分散液。

本发明的组合物可以与例如惰性稀释剂或载体一起，封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，或压制成片剂口服给予。对于口服治疗性给予，化合物和组合物可以与赋形剂组合，并以可摄取的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。这样的治疗有用的组合物中的活性化合物的量使得获得合适的剂量。

本发明的组合物可以肠胃外给予。化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可以在与添加剂如表面活性剂适当地混合的水中制备。分散液也可以在油中制备。

使用光调节素3(PR3)的方法

以下描述涉及用于本发明方法的光调节素3或PR3(Nr2e3a的小分子拮抗剂)。

Nr2e3是视网膜特异性核受体，是光感受器基因表达的关键调节器。对视杆基因表达的调节已成为治疗视网膜变性疾病如色素性视网膜炎(RP)的潜在治疗策略。光调节素1(PR1)是Nr2e3的小分子调节剂，其调节感光感受器特异性基因的表达。在RP的Rho^P23H和Pde6b^Rd1模型中，使用PR1操纵光感受器基因表达减缓视网膜变性的进展。然而，采用该系列的体内分析受到化合物在体内的效力、溶解度和稳定性的限制。如本文所述，已经确定了结构上不相关的化合物光调节素3(PR3)，其比PR1系列的化合物更有效。全身递送后，通过RNA测序分析，PR3对视杆光感受器基因表达(例如Nrl、视紫红质、Gnat1)有很大影响。为了确定PR3作为RP的潜在疗法的有效性，从出生后第12-14天(P12-14)到P20用PR3或溶媒处理Rho^P23H小鼠，并在P21评估视网膜结构和功能。PR3处理的Rho^P23H小鼠比同窝出生对照具有更大的暗视和明视ERG响应，此外还显著降低了光感受器的变性。总之，数据表明Nr2e3信号传导的药理学中断可能是用于治疗RP和其他视网膜变性疾病的在治疗上有利的策略。

本文所述的PR3处理证明Rho^P23H小鼠视网膜的解剖学和功能保留，为这种用于治疗RP的治疗策略提供了概念验证。

为了确定可能靶向Nr2e3的化合物，使用了化学信息学策略来筛选先前在基于萤光素酶的分析中确定的与转染的CHO-S细胞中的重组Nr2e3相互作用的命中化合物(PubChem论文编号：602229、624378、624394和651849)。作为初始命中的二次筛选，使用解离的原代视网膜细胞培养物并分析了视紫红质，因为视紫红质是Nr2e3信号传导的明确靶点，并且仅在视杆光感受器中高水平表达。将视网膜从出生后第5天(P5)的小鼠中分离出来，并将其在含有小分子的培养基中培养。处理2天后，收集细胞用于qPCR分析和定量视紫红质表达。与所有浓度的DMSO和PR1处理相比，一种化合物光调节素3(PR3；图1A)显示视紫红质的稳定降低(图1B)。采用检查来自P5小鼠的解离的视网膜培养物中视紫红质蛋白表达的免疫荧光测定法证实了这一发现。与qPCR结果相似，与DMSO溶媒和PR1相比，用PR3处理导致视紫红质的表达降低(图1C)。

Nr2e3中的突变导致S视蛋白+光感受器数量增加以及视杆基因表达降低。为了确定PR3处理是否也影响视锥基因表达，将完整的视网膜从P11野生型小鼠外植到包含DMSO或PR3的培养基中3天。完整的视网膜用于该实验以独立评估背侧和腹侧视网膜的变化。固定和整体封藏免疫染色后，对腹侧视网膜中的S视蛋白+细胞计数。与Nr2e3突变相似，用PR3处理导致腹侧视网膜S视蛋白+细胞数量增加(图1D-1E)。

PR3最初在基于荧光素酶的分析中被确定为Nr2e3的化学调节剂，该分析通过破坏Nr2e3-NCOR二聚体复合物确定了配体(PubChem论文编号：602229、624378、624394和651849)。为了确认直接的Nr2e3-PR3相互作用，使用了等温滴定量热法(ITC)。与其他分析一致，ITC定性显示了PR3和Nr2e3之间的直接相互作用(使用单点模型估算的K_d为67μM；图1F)。

Nr2e3信号传导对于视杆光感受器细胞命运、发育和成熟以及表达的维持很重要。为了确定PR3处理对有丝分裂后视网膜细胞中基因表达的影响，在P12用PR3或溶媒全身处理(腹膜内注射)野生型小鼠。在P13，在注射后24h，收集视网膜以通过RNA测序进行全转录组分析。观察到大多数视杆光感受器特异性转录物减少(图2A和2B)。与在有丝分裂后光感受器中条件性敲除Nrl和通过CRISPR/Cas9敲减Nrl相似，未观察到视锥基因表达的大范围和整体提高。然而，Nr2e3上游的视杆和视锥光感受器二者中表达的基因，如Crx和Otx2，在对照和PR3处理之间没有显示表达的差异。另外，未观察到在其他视网膜细胞类型中表达的基因的变化，表明PR3对光感受器的特异性，并且未观察到细胞死亡基因或细胞应激基因的增加，表明该化合物对视网膜细胞没有毒性。

使用电子显微镜(EM)对PR3处理后的光感受器形态进行超微结构分析。从P11开始，连续3天向野生型小鼠腹膜内注射溶媒或PR3。在P14，在第三次注射后24h，对小鼠实施安乐死并处理其视网膜以进行EM。在出生后第二周和第三周期间开始形成光感受器外节；Nr2e3中的基因功能丧失突变导致视杆外节形成受损。PR3处理阻止了外节的发育；与对照相比，PR3处理的光感受器的外节明显被截短(图2C)。在检查外核层(ONL)细胞核时，未观察到任何由PR3处理诱导的光感受器凋亡的迹象(图2C)，表明对视杆发育的影响并非由于细胞死亡的增加。有趣的是，与DMSO视网膜相比，PR3处理的视网膜的视杆细胞核包含较小的密集堆积的异染色质斑块(图2C)，这与具有更多视锥样特性的细胞一致。

最近已经显示，由PR1处理引起的视杆基因表达的降低足以减缓Rho^P23H光感受器的体外变性。Rho^P23H突变导致视杆光感受器中视紫红质的错误折叠，其导致未折叠的蛋白应答激活，并最终导致视杆和视锥死亡。在Rho^P23H小鼠中，大多数视杆光感受器在出生后第三周结束时经历凋亡。

为了确定是否可以阻止光感受器变性，在视杆光感受器死亡期间，从P12-P14直到P21用PR3或溶媒处理Rho^P23H小鼠(图3A)。在P21时，用ERG评估视觉功能，并对小鼠进行安乐死以进行组织学和qPCR分析。在P21，对照Rho^P23H小鼠的ONL中仅保留2-3行光感受器(图3B和3C)。视杆稀疏，并且几乎没有剩余的视锥(S视蛋白+和视锥抑制蛋白+光感受器)。通过ERG分析，对照Rho^P23H小鼠具有最小的暗视和明视b波振幅(图4A、4B、4D和4E)。相比之下，来自PR3处理的Rho^P23H小鼠的视网膜在ONL中有几排视杆和视锥光感受器(图3B和3C)。与DMSO对照视网膜相比，PR3处理的视网膜中存活的视锥更加伸长且更健康。采用qPCR的组织学结果在来自对照和PR3 Rho^P23H小鼠的视网膜上得到证实，并且发现处理的小鼠具有更高的恢复蛋白和视紫红质的表达，表明更多的光感受器存活(图3D)。与同窝出生对照相比，PR3处理的Rho^P23H小鼠的ERG分析显示，在大多数刺激强度下，暗视和明视b波振幅均显著升高(图4A、4C、4D和4F)。总之，这些数据支持这样的结论，即在该RP模型中，PR3处理防止了光感受器的结构和功能变性。

如本文所述，Rho^P23H小鼠中的光感受器变性被阻止，这是在体内用小分子成功治疗该RP模型的首次报道。通过用小分子调节剂靶向视杆特异性核受体Nr2e3，降低了光感受器基因的表达。用PR3处理降低了视杆基因表达，并且足以在功能和结构上保留Rho^P23H小鼠中的光感受器。先前的研究已经表明，视杆光感受器分化途径的基因操纵可能对多种RP模型的治疗有用。成年小鼠视杆中Nrl的条件性缺失防止隐性RP的Rho^-/-模型中的变性。最近，在三种不同的RP模型Rho^-/-、Pde6b^Rd10和Rho^P347S中，通过AAV-CRISPR/Cas9敲减Nrl使得光感受器得到了长期的组织学和功能保留。本文所述的结果表明，靶向该相同复合物的小分子在特别具有侵袭性的RP模型中对减缓视杆变性也有效，并且为视网膜变性的医学治疗提供了新的途径。

材料和方法

小鼠

以指定的月龄使用C57Bl/6(Jackson库存号：000664)和Rho^P23H(Jackson库存号：017628)。所有小鼠均由华盛顿大学比较医学系(the Department of ComparativeMedicine at the University of Washington)饲养，方案经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会(the University of Washington Institutional Animal Care and UseCommittee)批准。该研究是根据ARVO的眼科和视觉研究中使用动物声明进行的。

光调节素3

通过使用SciFinder和PubChem针对Nr2e3相互作用分子搜索先前的小分子筛选来确定光调节素3。它最初是从ChemDiv获得的，然后在初步筛选后在实验室中大量地合成和纯化。对于体内实验，以10mg/kg向小鼠腹膜内注射溶于DMSO的PR3。

解离的视网膜培养物

从出生后第5天(P5)的小鼠解剖视网膜，并通过在37℃下用无钙和镁的HBSS稀释的0.5％胰蛋白酶处理10分钟来解离。通过添加等体积的FBS使胰蛋白酶失活，并通过在4℃下离心使细胞成团，然后重悬于培养基(含有1％FBS、1％N₂、1％B27、1％Pen/Strep和0.5％L-谷氨酰胺的基础培养基A)中。对于qPCR，将细胞以1个视网膜/孔的密度铺板于24孔组织培养板中(请参见下面的qPCR部分)。对于免疫荧光分析，将细胞以1个视网膜/5个孔的密度铺板到96孔黑壁透明底组织培养板中。将小分子在培养基中稀释，并在解离后的那天添加。处理两天后，将细胞在室温下用4％PFA固定20分钟，在室温下用封闭溶液(在1X PBS中稀释的10％正常马血清和0.5％Triton X-100)封闭1小时，并且与在封闭溶液中稀释的针对视紫红质(1:250；Rho4D2,Robert Molday,University of British Columbia)产生的一抗在4℃下孵育过夜。第二天，用1X PBS洗涤孔，然后与在封闭溶液中稀释的适当种类的荧光标记的二抗在室温下孵育1小时。洗涤孔3次，用ToPro3复染，并且使用GE Typhoon FLA 9400成像仪对整个板成像。使用ImageJ软件由平板扫描获得光密度测量值，并将视紫红质表达归一化为ToPro3核染色。

定量实时PCR

使用TRIzol(Invitrogen)从视网膜中分离RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA。SSO Fast(Bio-Rad)用于定量实时PCR。为了分析，将值归一化为Gapdh(ΔCt)，将DMSO和化合物处理的样品之间的ΔΔCt表示为DMSO处理的对照(100*2^ΔΔCt)的百分比。对ΔCt值进行学生t检验。使用以下引物序列：Gapdh(F：GGCATTGCTCTCAATGACAA(SEQ ID NO:1)，R：CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG(SEQ ID NO:2))，视紫红质(F：CCCTTCTCCAACGTCACAGG(SEQ ID NO:3)，R：TGAGGAAGTTGATGGGGAAGC(SEQ ID NO:4))，Opn1sw(F：CAGCATCCGCTTCAACTCCAA(SEQ ID NO:5)，R：GCAGATGAGGGAAAGAGGAATGA(SEQ IDNO:6))，恢复蛋白(F：ACGACGTAGACGGCAATGG(SEQ ID NO:7)，R：CCGCTTTTCTGGGGTGTTTT(SEQID NO:8))。

视网膜外植体培养

将来自P11 C57Bl/6小鼠的无RPE的完整视网膜外植到包含DMSO或0.3μM光调节素3的培养基(包含1％FBS、1％N₂、1％B27、1％Pen/Strep和0.5％L-谷氨酰胺的基础培养基A)中的0.4μm孔组织培养嵌入物上。每隔一天进行完全的培养基更换。在室温下将外植体用4％PFA固定20分钟，并在室温下用封闭溶液(在1X PBS中稀释的10％正常马血清和0.5％Triton X-100)封闭1小时，并在4℃下与针对S视蛋白(1:400，SCBT，sc-14363)产生的一抗孵育过夜。第二天，用1X PBS洗涤外植体，然后与在封闭溶液中稀释的适当种类的荧光标记的二抗孵育过夜，然后用1X PBS洗涤和DAPI染色。将外植体转移到载玻片，并用Fluoromount-G(SouthernBiotech)盖上盖玻片。Olympus FluoView FV1000用于共聚焦显微镜检查。从在固定设置下拍摄的单平面共聚焦图像对细胞计数。

免疫荧光

在室温下，将眼杯(eyecup)在4％PFA的1X PBS溶液中固定20分钟，然后在4℃下在30％蔗糖的1X PBS溶液中冷冻保护过夜。将样品包埋在OCT(Sakura Finetek)中，在干冰上冷冻，然后在低温恒温器(Leica)上以16-18μm切片。在室温下，将载玻片用含10％正常马血清和0.5％Triton X-100的1X PBS溶液封闭1小时，然后在4℃下用在封闭溶液中稀释的一抗(来自Robert Molday的1:250的Rho4D2(University of British Columbia)，来自SCBT的1:400的S视蛋白：sc-14363，来自Millipore的1:1000的视锥抑制蛋白：AB15282，来自R&DSystems的1:200的Otx2：BAF1979)染色过夜。第二天，用1X PBS洗涤载玻片3次，然后在室温下在稀释于封闭溶液中的荧光标记的二抗中孵育2小时，用DAPI染色，洗涤，并使用Fluoromount-G(SouthernBiotech)盖上盖玻片。Olympus FluoView FV1000用于共聚焦显微镜检查。从在固定设置下拍摄的单平面共聚焦图像对细胞计数。在邻近视神经头(距腹侧的神经头50μm)处取得中央视网膜中的计数，在距腹侧的外周边缘50μm处取得外周视网膜中的计数。

等温滴定量热法

Nr2e3蛋白(aa 90-410)从表达载体pVP16(DNASU质粒编号：HsCD00084154)表达为His8-MBP-TEV融合蛋白。使大肠杆菌BL21(DE3)细胞生长至OD600为1，然后在16℃下用0.2mM IPTG诱导过夜。收获细胞，重悬于提取缓冲液(20mM pH 8的Tris，200mM NaCl，10％甘油，5mM 2-巯基乙醇和1:1000稀释的饱和PMSF)中，然后通过在冰上超声处理裂解。将裂解物在4℃下离心，并将上清液加载到含有5mL Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)的平衡柱上。用20mMTris pH 8、1M NaCl、5mM 2-巯基乙醇和40mM咪唑洗涤柱，然后用20mM pH 8的Tris、200mMNaCl、5mM2-巯基乙醇和100mM咪唑洗脱蛋白。将融合蛋白与TEV在4℃下孵育过夜，然后通过离子交换色谱从NR2E3中分离出His8-MBP标签。对于等温滴定量热法，将100μM PR3注入MicroCal ITC-200(Malvern)中的含50mM NaCl和0.5％DMSO的10mM pH 8的磷酸钠缓冲液中的20μM Nr2e3中，并使用Origin 7.0软件分析数据。

RNA测序

使用TRIzol(Invitrogen)从视网膜中分离RNA，并使用Agilent 4200TapeStation检查总RNA完整性，并使用Trinean DropSense96分光光度计定量。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina)和Sciclone NGSx工作站(PerkinElmer)由总RNA制备RNA-seq文库。使用Agilent 4200TapeStation验证了库大小分布。使用Life Technologies的InvitrogenQubit荧光计进行另外的文库质量控制、合并索引库的混合以及聚类优化。汇集RNA-seq文库(4-重)，并聚集到流动池泳道上。使用Illumina HiSeq 2500，以采用配对末端的50个碱基阅读长度(PE50)测序策略的快速模式进行测序。

电子显微镜检查

用CO₂对小鼠进行安乐死，然后用0.9％盐水灌注，接着灌注4％的戊二醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的溶液。将眼杯固定在4％戊二醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的溶液中，用0.1M二甲胂酸钠缓冲液洗涤，然后后固定在2％四氧化锇中。固定后，用水洗眼杯，通过一系列梯度的乙醇脱水，在环氧丙烷中孵育，然后在epon araidite中孵育，在60℃下聚合过夜，然后以70nm的厚度切片。使用JEOL JEM-1230电子显微镜获得图像。

ERG

使小鼠黑暗适应过夜(12-18小时)。所有后续步骤均在暗红色灯光下进行。将小鼠放在麻醉室中，并用1.5-3％的异氟烷气体麻醉。将小鼠从麻醉室转移到保持在37℃的加热平台上，并放置在鼻锥中，以保持恒定的异氟烷流量。将1％的托吡卡胺和2.5％的盐酸去氧肾上腺素滴加至每只眼睛。将参考针电极皮下放置在头顶，将接地针电极皮下放置在尾部。将1.5％甲基纤维素滴加到每只眼睛，并将接触透镜电极放在每只眼睛上。

关闭暗红色灯，并将平台放置在LKC Technologies UTAS BigShot ganzfeld内部，并以暗视方式递送一系列强度增加的闪光。在系列暗视闪光之后立即进行了一系列明视闪光。

尽管已经示出和描述了说明性实施方案，但是将理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在其中进行各种改变。

序列表

<110> 华盛顿大学（University of Washington）

J·大卫格莱斯顿研究所（The J. David Gladstone Institutes）

<120> 用于治疗视网膜疾病的光感受器基因调节剂光调节素3

<130> FIC20210005P

<150> 62/543,782

<151> 2017-08-10

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 引物序列

<400> 1

ggcattgctc tcaatgacaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 引物序列

<400> 2

cttgctcagt gtccttgctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 引物序列

<400> 3

cccttctcca acgtcacagg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 引物序列

<400> 4

tgaggaagtt gatggggaag c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 引物序列

<400> 5

cagcatccgc ttcaactcca a 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> 引物序列

<400> 6

gcagatgagg gaaagaggaa tga 23

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 引物序列

<400> 7

acgacgtaga cggcaatgg 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 引物序列

<400> 8

ccgcttttct ggggtgtttt 20

Claims (16)

1.一种用于降低视网膜中视杆基因表达的方法，包括使视网膜与式(I)的化合物或其药学上可接受的盐接触：

2.权利要求1所述的方法，其中所述视杆基因选自Nrl、Nr2e3、Rho和Gnat1。

3.权利要求1所述的方法，其中接触视网膜包括全身给予或玻璃体内注射。

4.权利要求1所述的方法，其中所述视网膜是人受试者的视网膜。

5.一种用于治疗通过降低视网膜中视杆基因表达可治疗的疾病或病症的方法，包括向有其需要的受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

6.权利要求5所述的方法，其中所述疾病或病症选自色素性视网膜炎、视网膜变性、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑营养不良、视网膜营养不良、Sorsby眼底营养不良、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑病变、早产儿视网膜病变和缺血再灌注相关的视网膜损伤。

7.权利要求5所述的方法，其中所述视网膜疾病是色素性视网膜炎。

8.权利要求5所述的方法，其中给予所述化合物包括全身给予或玻璃体内注射。

9.权利要求5所述的方法，其中所述受试者是人。

10.一种用于降低视网膜中视紫红质表达的方法，包括用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理视网膜：

11.权利要求10所述的方法，其中所述视网膜是人受试者的视网膜。

12.一种治疗受试者的视网膜疾病的方法，包括向有其需要的受试者给予治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

13.权利要求12所述的方法，其中所述视网膜疾病选自色素性视网膜炎、视网膜变性、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、Stargardt黄斑营养不良、视网膜营养不良、Sorsby眼底营养不良、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑病变、早产儿视网膜病变和缺血再灌注相关的视网膜损伤。

14.权利要求12所述的方法，其中所述视网膜疾病是色素性视网膜炎。

15.权利要求12所述的方法，其中所述受试者是人。

16.权利要求12所述的方法，其中所述给予所述化合物包括全身给予用或玻璃体内注射。

Images